專利名稱：：葛根素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子urat1抑制藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及黃酮類單體化合物葛根素的新用途，具體是涉及葛根素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1抑制藥物中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：尿酸排出減少或生成增加，可導(dǎo)致血液中尿酸濃度增髙，直接或間接引起相關(guān)疾病。尿酸的排泄是一復(fù)雜過程，尿酸隨血液循環(huán)流入腎小球時，游離型的尿酸將全部濾過；在近端腎小管約99%尿酸鹽被重吸收(DiamondHS,MeiselAD.Postsecretoryreabsorptionofurateinman.ArthritisAndRheumatism,1975,18(6):805-809.)。位于近曲小管的尿酸轉(zhuǎn)運子(蛋白)URAT1參與尿酸重吸收過程，通過與陰離子的交換將尿酸鹽由管腔轉(zhuǎn)運入細胞。URAT1蛋白主要分布于腎皮質(zhì)近曲小管上皮細胞向腔膜，是一個電中性的尿酸轉(zhuǎn)運蛋白。URAT1基因由Enomoto等于2002年首先從人腎臟克隆出來，位于染色體1lql3，由SLC22A12基因編碼，由10個內(nèi)含子9個外顯子組成，擁有12個跨膜結(jié)構(gòu)域，其cDNA全長2642bp，編碼區(qū)1659bp，編碼含555個氨基酸的蛋白質(zhì)。原發(fā)性腎低尿酸血癥(hypouricemia)病人的SLC22A12基因缺陷病例進一步證明人的URATl(hURATl)參與尿酸的重吸收(AtsushiEnomoto，HiroakiKimura，ArthitChairoungdua,YasuhiroShigeta,etal.Molecularidentificationofarenalurate-anionexchangerthatregulatesblooduratelevels.Nature2002,417(6887):447-452)。葛根素結(jié)構(gòu)式、分子式和美國化學(xué)文摘收錄號(CASNo.)見下C2iH20O93681-99-0葛根素可由天然產(chǎn)物中分離得到，例如文獻綜述報道了利用溶劑法、酸水解法、鹽析法、絡(luò)合萃取法、大孔吸附樹脂法、聚酰胺柱層析吸附法、環(huán)糊精鍵合固定相技術(shù)等由葛根分離純化得到葛根素(梅林，石開云，楊元娟，李隨麗.葛根中葛根素的分離純化技術(shù)進展.廣州化學(xué)2007;32(l):73-76);也有報道由化學(xué)改構(gòu)/合成得到葛根素(Lee,DavidY.W.;Zhang,Wu-Yan;Karnati，VishnuVardhanR.Totalsynthesisofpuerarin,anisoflavoneC-glycoside.TetrahedronLetters(2003)，44(36)，6857-6859.)。葛根素已見有多種生理和藥理活性的報道，包括擴張冠狀血管的作用、對抗烏頭堿和氯化鋇誘發(fā)的心律失常作用、對心臟功能和心肌代謝的影響、改善微循環(huán)障礙、抑制血小板聚集、降血糖等作用(覃開羽，吳敏，葛根素的藥理作用及不良反應(yīng)分析.中國藥業(yè)2007;16(3):60-61)。但化合物單體葛根素用于制備針對尿酸轉(zhuǎn)運子URATl的抑制藥物，則未見報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供單體化合物葛根素的新用途，具體是葛根素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的技術(shù)解決方案之一是提供單體化合物葛根素用于制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物的新用途。該新用途包括了以本發(fā)明所述的葛根素，配以本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的藥用輔料(賦形劑、助溶劑、控釋劑等)，制成本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的劑型(包括口服液、注射劑、膠囊劑、片劑、顆粒劑、微囊劑等)，用于制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物。本發(fā)明的優(yōu)點是，提供了對尿酸轉(zhuǎn)運子URATl具有確切抑制調(diào)節(jié)作用的葛根素，用于制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物，可用于治療與尿酸轉(zhuǎn)運子URATl異常高表達相關(guān)疾病。與針對痛風(fēng)或者高尿酸血病癥的發(fā)明比較，本發(fā)明提供的單體化合物葛根素制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物新用途具有3個明顯的進步和優(yōu)點1、有效成分確切(單體化合物)；2、作用靶點明確(尿酸排泄過程中重吸收作用的尿酸轉(zhuǎn)運子URATl);3、調(diào)節(jié)作用明確(抑制調(diào)節(jié))。本發(fā)明利用高尿酸血動物模型在基因轉(zhuǎn)錄水平和蛋白表達水平上科學(xué)地評價并確定了單體化合物葛根素對尿酸轉(zhuǎn)運子URATl的抑制調(diào)控作用。本發(fā)明所涉及的單體化合物葛根素對模型動物表達異常增高的尿酸轉(zhuǎn)運子URATl具有確切的抑制作用；而對正常動物的正常水平尿酸轉(zhuǎn)運子表達無顯著抑制作用，具有很好的安全性。為了更好的理解本發(fā)明的實質(zhì)，下面將用單體化合物葛根素的藥理實驗及結(jié)果來說明其在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URATl抑制藥物中的應(yīng)用。具體實施例方式以下實施例僅作為進一步闡述發(fā)明之用，不能用來限制本發(fā)明。實施例h單體化合物葛根素對尿酸轉(zhuǎn)運子URATl的抑制調(diào)節(jié)作用實驗動物昆明種小鼠，15-20克，雄性藥物配制葛根素均勻分散于生理鹽水中，用于灌胃給藥，給藥劑量為20mg/kg實驗材料TrizolReagment(Invigen)，氯仿，異丙醇，無水乙醇，DEPC，M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶，PCR試劑盒，RIPA裂解液等實驗儀器高速冷凍離心機，高速勻漿機，Bio-rad垂直電泳槽，MBI-PCR儀、水平電泳槽等實驗?zāi)Ｐ托∈蟾吣蛩嵫Y模型。實驗方法1、模型的建立動物適應(yīng)環(huán)境l周后，灌胃給予氧嗪酸鉀鹽250mg/kg;對照給予等體積生理鹽水，造模周期10天。2、給藥造模期間同時給藥，在給予氧嗪酸鉀鹽造模/生理鹽水對照lh后，灌胃給予單體化合物葛根素20mg/kg;對照給予生理鹽水。3、小鼠處死及組織的保存小鼠于灌胃給予葛根素/生理鹽水l小時后處死，冰臺上分離腎臟組織，腎組織經(jīng)液氮冷凍后保存于-8(TC。4、蛋白質(zhì)印跡法(Western-blotting):取組織約100mg加入lml的RIPA裂解液勻漿提取，12000g4'C離心15分鐘，得腎臟組織總蛋白提取液，Bradford法測蛋白濃度，稀釋蛋白樣品至終濃度為5ug/ul。混合上樣緩沖液變性上樣，SDS-PAGE凝膠電泳后PVDF轉(zhuǎn)膜，封閉液封閉1小時后加入mURATl抗體(根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫mURATl蛋白序列制備，使用濃度1:4000)4'C孵育過夜，二抗(1:4000)室溫搖床孵育1小時，HRP-ECL發(fā)光，暗室曝光顯影。膠片掃描后對圖片進行灰度分析。5、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR):提取小鼠腎臟總RNA，逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA模板，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫的mURATl基因設(shè)計引物，進行mURATl目的基因擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后UV成像，對圖片進行灰度分析。實驗結(jié)果a.蛋白質(zhì)印跡法Western-Blotting<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>T〈0.01與空白+生理鹽水組比較尸<0.01與模型+生理鹽水組比較連續(xù)10天灌胃給予氧嗪酸鉀鹽250mg/kg造模造成小鼠腎組織中URAT1蛋白高水平表達，灰度值達到96.3，顯著高于空白對照55.3。灌胃給予20mg/kg的單體化合物葛根素可顯著抑制模型小鼠腎組織中URAT1蛋白的高水平表達，灰度值為60.7，接近空白對照水平。說明單體化合物葛根素顯著抑制模型動物異常增高的尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1蛋白表達。灌胃給予單體化合物葛根素對空白小鼠腎組織中URAT1蛋白表達水平無顯著影響，說明單體化合物葛根素對小鼠腎組織正常水平的URAT1蛋白無顯著抑制作用，具有較好的安全性。b.逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)RT-PCRGroup空白+生理鹽水空白+葛根素模型+生理鹽水模型+葛根素n=5灰度值26.6±7.125.9±10.858.4±17.6"^28.8±12.4**戶<0.01與空白+生理鹽水組比較戶<0.01與模型+生理鹽水組比較連續(xù)10天灌胃給予氧嗪酸鉀鹽250mg/kg造模造成小鼠腎組織中URATlmRNA高水平表達，灰度值達到58.4，顯著高于空白對照26.6。灌胃給予20mg/kg的單體化合物葛根素可顯著抑制模型小鼠腎組織中URATlmRNA的高水平表達，灰度值為28.8，接近空白對照水平。說明單體化合物葛根素可在轉(zhuǎn)錄水平上抑制異常增高的尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1mRNA表達。灌胃給予單體化合物葛根素的空白小鼠腎組織中URATlmRNA表達水平為25.9，相對于空白對照組無顯著變化，說明單體化合物葛根素對小鼠腎組織正常水平的URAT1mRNA無顯著抑制作用，具有較好的安全性。實施例2:將單體化合物葛根素按照常規(guī)制劑方法，加入水及適量增溶劑(聚乙二醇400)溶解，分裝，滅菌，制備成規(guī)格為20mg/ml的葛根素口服液；將單體化合物葛根素按照常規(guī)制劑方法，軟膠囊材質(zhì)選用明膠和山梨醇，制備成規(guī)格為20mg/粒的葛根素膠囊；將單體化合物葛根素按照常規(guī)制劑方法，加入賦形劑環(huán)糊精，混合均勻，制粒，壓片，制備成規(guī)格為20mg/片的葛根素片劑。權(quán)利要求1.黃酮類單體化合物葛根素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1抑制藥物中的應(yīng)用。全文摘要本發(fā)明涉及黃酮類單體化合物葛根素的新用途，具體是涉及葛根素在制備尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1抑制藥物中的應(yīng)用。動物試驗結(jié)果表明葛根素對高尿酸血模型動物表達異常增高的尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1具有確切的抑制作用，而對正常動物正常水平的尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1表達無顯著抑制作用，具有很好的安全性，利用葛根素配以相關(guān)的藥用輔料，用常規(guī)的制劑方法可制成葛根素口服液、膠囊劑、片劑、顆粒劑等尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1的抑制藥物，可用于治療與尿酸轉(zhuǎn)運子URAT1異常高表達相關(guān)的疾病。文檔編號A61K31/7048GK101181287SQ20071019013公開日2008年5月21日申請日期2007年11月15日優(yōu)先權(quán)日2007年11月15日發(fā)明者孔令東,李建梅,穎潘,闖王申請人:南京大學(xué)