一種酪胺人工抗原和抗體及其制備方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于小分子化合物免疫化學(xué)和痕量殘留分析技術(shù)領(lǐng)域；涉及有機(jī)合成，免 疫化學(xué)，生物化學(xué)及物化測(cè)試技術(shù)等；特別涉及生物胺類小分子化合物酪胺半抗原、人工抗 原的設(shè)計(jì)合成，和免疫動(dòng)物特異性抗體的制備及其免疫分析方法的建立。
【背景技術(shù)】
[0002] 酪胺是存在于生物機(jī)體內(nèi)的有效生理活性物質(zhì)，是一種血管活性胺，在生物機(jī)體 的正常代謝中起著不可替代生理功能。微量的酪胺對(duì)大腦皮層及其精神活動(dòng)具備重要的調(diào) 節(jié)作用，而且對(duì)血管和肌肉的松弛、收縮效果明顯。另外，酪胺、苯乙胺等具有清除自由基、 抗氧化等作用，并可以抑制不飽和脂肪酸的氧化。通常情況下，人體攝入少量的酪胺不會(huì)對(duì) 人體產(chǎn)生影響，而當(dāng)攝入過(guò)量的酪胺、組胺（尤其是同時(shí)攝入多種生物胺）時(shí)，會(huì)產(chǎn)生頭痛、 惡心、心率加快、血壓升高、呼吸急促等不良反應(yīng)，嚴(yán)重的還會(huì)危害生命。酪胺還會(huì)引起外周 血管收縮，增加血糖的濃度，誘導(dǎo)去甲腎上腺素的分泌，引起患者血壓升高以及偏頭疼等。 EFSA指出，攝入酪胺、苯乙胺、色胺等，在其代謝消耗30min至數(shù)小時(shí)之后會(huì)引起血管收縮、 高血壓，并伴有頭痛、出汗、惡心、嘔吐、瞳孔擴(kuò)張等臨床癥狀。正常情況下，可在24h逐漸恢 復(fù)。研究表明富含酪胺的食物可誘發(fā)偏頭痛，攝食酪胺的含量如果超過(guò)l〇〇mg會(huì)導(dǎo)致血壓 升高以及偏頭痛，如果超過(guò)1080mg/kg會(huì)引發(fā)急性中毒性腫脹。
[0003] 酪胺廣泛存在于肉類及其制品、水產(chǎn)品以及啤酒、醬油、奶酪等各類發(fā)酵食品中， 其含量水平常常作為新鮮度以及衛(wèi)生狀況的評(píng)定指標(biāo)，因此很多國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)酪胺的分離 檢測(cè)方法進(jìn)行了研究。常見的檢測(cè)胺類物質(zhì)的方法有色譜法、毛細(xì)管電泳法以及生物傳感 器法等。傳統(tǒng)儀器方法存在前處理復(fù)雜，儀器和相應(yīng)配套費(fèi)用昂貴，分析速度慢等缺點(diǎn)，難 以滿足實(shí)際分析的需要，因此迫切要求發(fā)展簡(jiǎn)便、快速、靈敏的分析技術(shù)。
[0004] 但是與大分子不同，小分子化合物免疫分析有自身特點(diǎn)：
[0005] (1)小分子化合物lOOOdolton) -般不具有人工抗原性，不能直接免疫動(dòng) 物產(chǎn)生特異性抗體、必須合成突出分子立體結(jié)構(gòu)特異性部位的半抗原，并與大分子載體連 接構(gòu)成接合物，才能免疫動(dòng)物產(chǎn)生針對(duì)這一目標(biāo)小分子化合物的特異性抗體。這種半抗原 與大分子載體的結(jié)合物稱為人工抗原。人工抗原的制備不是任意的，包括結(jié)合位點(diǎn)、結(jié)合方 式、載體種類、以及半抗原與目標(biāo)分析物任何結(jié)構(gòu)上的差異如大小、形狀、成份、構(gòu)型、構(gòu)象、 極性、電子云密度等等在內(nèi)的諸因素，都可能極大地影響著相應(yīng)抗體的性質(zhì)，因此它們是決 定產(chǎn)生其特異性抗體和建立免疫分析方法的關(guān)鍵。
[0006] (2)雖然小分子化合物不具有人工抗原性，但具有反應(yīng)原性，即具有與相應(yīng)抗體發(fā) 生免疫學(xué)反應(yīng)的能力，并可進(jìn)行體外定量，遵循質(zhì)量作用定律。
[0007] 免疫分析技術(shù)被引入小分子殘留分折領(lǐng)域，成為一種最有發(fā)展和應(yīng)用潛力的定量 分析技術(shù)之一，受到廣泛的重視。該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)、合成和人工全抗 原及抗體的制備。因此，目標(biāo)分析物分子免疫學(xué)特性，以及如何通過(guò)化學(xué)或生化技術(shù)突出和 利用這些特性，是該領(lǐng)域重要的研究?jī)?nèi)容。這一技術(shù)目前已成為微量分析研究的一個(gè)嶄新 領(lǐng)域，可與傳統(tǒng)分析方法并列作為一項(xiàng)新的分析途徑。酪胺人工抗原和特異性抗體以及以 此為基礎(chǔ)建立免疫分析方法尚未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是通過(guò)設(shè)計(jì)合成酪胺半抗原及相應(yīng)的人工抗原和抗體。本發(fā)明的另 一個(gè)目的是提供酪胺的半抗原及相應(yīng)的人工抗原和抗體的制備方法。本發(fā)明再一個(gè)目的是 提供酪胺的半抗原及相應(yīng)的人工抗原和抗體的應(yīng)用。其中酪胺的人工抗原包括人工抗原和 包被原。
[0009] 本發(fā)明的獨(dú)特之處在于突出了酪胺分子特異性抗原決定簇，又克服了化學(xué)合成的 困難，免疫動(dòng)物誘導(dǎo)產(chǎn)生親合性很高的特異性抗體；并以此為基礎(chǔ)建立了 ELISA方法即快 速免疫分析方法，準(zhǔn)確檢測(cè)食品中的酪胺含量。
[0010] 本發(fā)明利用目標(biāo)分析物半抗原與載體蛋白質(zhì)偶聯(lián)，制備有效人工抗原，免疫動(dòng)物 制備對(duì)小分子分析物特異性抗體，利用抗原抗體的特異性免疫學(xué)反應(yīng)，從而定性定量地檢 測(cè)樣本中超微量小分子目標(biāo)分析物，即可用于樣本測(cè)定。其選擇性決定于免疫學(xué)反應(yīng)的特 異性，其靈敏度取決于抗體的親合性和標(biāo)記物的可檢性。因此可以快速準(zhǔn)確地分析檢測(cè)酪 胺在樣本中的含量。該技術(shù)研究的關(guān)鍵是半抗原的分子設(shè)計(jì)、合成和人工全抗原及抗體的 制備。
[0011] 人工抗原是合成半抗原與載體蛋白的偶聯(lián)物，若用于免疫動(dòng)物，即為人工抗原，若 用于免疫分析中包被反應(yīng)板，即為包被原。對(duì)于同一種目標(biāo)分子，人工抗原和包被原通常不 用同一種偶聯(lián)物，目的是減少抗體對(duì)包被原的非特異性結(jié)合，提高分析的特異性和靈敏度。 因?yàn)槿斯た乖庖邉?dòng)物所產(chǎn)生的抗體，不僅能識(shí)別半抗原，也能識(shí)別載體蛋白。因此，人工 抗原和包被原所用的載體蛋白一般是不相同的，載體蛋白的結(jié)構(gòu)和分子質(zhì)量差異越大，非 特異性結(jié)合反應(yīng)越弱，分析靈敏度越高。另外人工抗原和包被原中半抗原結(jié)構(gòu)有差異也有 利于提高方法靈敏度。本發(fā)明在人工抗原和包被原的制備中采用不同的方法為的是獲得提 高方法靈敏度。
[0012] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的：
[0013] -種酪胺半抗原的分子結(jié)構(gòu)如下所示：
[0015] -種酪胺人工抗原，是由酪胺半抗原與陽(yáng)離子化的牛血清蛋白相連接合成，所述 酪胺人工抗原分子結(jié)構(gòu)式為：
[0016]
[0017] -種酪胺包被原，是由酪胺半抗原與卵清蛋白相連接合成，所述酪胺包被原分子 結(jié)構(gòu)式為：
[0019] -種酪胺抗體，是能與人工抗原或包被原發(fā)生特異性免疫反應(yīng)的IgG抗體。
[0020] 酪胺人工抗原的制備方法采用甲醛法充分暴露酪胺所有抗原決定簇，包括以下步 驟：
[0021] (1)陽(yáng)離子化BSA(cBSA)的制備：
[0022] 準(zhǔn)確量取20mL PBS，冰浴下邊攪拌邊緩慢加入18. Omg乙二胺（EDA)，用lmol/LHCl 調(diào)pH至7. 4 ;稱取1. 00g BSA和56. Omg EDC加入上述溶液中，室溫反應(yīng)2h ;用玻沙漏斗抽 濾，取上清液裝入透析袋中；用0. 〇lmol/L的PBS于4°C連續(xù)透析3天，然后在-20°C下，用 真空冷凍機(jī)進(jìn)行干燥，最后凍存于_20°C冰箱。
[0023] (2)酪胺與載體蛋白cBSA的連接：
[0024] 準(zhǔn)確稱取20.0 mgcBSA于25mL圓底燒瓶，加入4mL 0· 01mol/L的PBS將其溶解，準(zhǔn) 確稱取4. 2mg酪胺于5mL小棕瓶中，加入200 μ LDMS0將其溶解。將酪胺緩慢加入溶解的蛋 白中。加入5yL 37%的甲醛水溶液，30°C水浴磁力攪拌8h。反應(yīng)液澄清，裝入透析袋中， 用0· 01mol/L的PBS于4°C連續(xù)透析3天，然后分裝，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0025] 酪胺包被原的制備方法采用戊二醛一步連接法，包括以下步驟：
[0026] 準(zhǔn)確稱取20.0 mg 0VA于25mL圓底燒瓶，加入4mL 0. 01M的PBS將其溶解，準(zhǔn)確稱 取4. 2mg酪胺于5mL小棕瓶中，加入200 μ L DMS0將其溶解。將酪胺緩慢加入溶解的0VA 中。緩慢加入15 yL 25%的戊二醛水溶液，4°C下磁力攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)液裝入透析袋中， 用0· 01mol/L的PBS于4°C連續(xù)透析3天，然后分裝，-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0027] 酪胺抗體的制備方法，包括以下步驟：
[0028] (1)免疫：免疫動(dòng)物選用雌性大白兔，首次免疫采用背部多點(diǎn)皮下注射和腿部肌 肉注射免疫，加強(qiáng)免疫采用背部多點(diǎn)皮下注射免疫。初免后進(jìn)行四次加強(qiáng)免疫，具體做法分 別是：
[0029] 初次免疫：取lmg上述人工抗原溶于0. 9 %的NaCl溶液和弗氏完全佐劑等體積所 配制的溶液中，進(jìn)行動(dòng)物免疫；
[0030] 加強(qiáng)免疫：用0. 5mg上述人工抗原溶于0. 9%的NaCl溶液和弗氏不完全佐劑等體 積所配制的溶液，進(jìn)行動(dòng)物免疫；加強(qiáng)免疫分別于初次免疫后2周、4周和6周后免疫三次， 此后間隔一個(gè)月。第五次免疫后9天時(shí)由兔子的耳緣靜脈取血，進(jìn)行效價(jià)檢測(cè)；
[0031] (2)抗體純化：定時(shí)監(jiān)測(cè)動(dòng)物抗體效價(jià)，當(dāng)抗體對(duì)上述述的酪胺包被原效價(jià)達(dá)到 較高水平時(shí)，采集血液，并離心獲得抗血清，使用ProteinA-Sepharose4B蛋白親和層析柱 對(duì)抗血清進(jìn)行純化，制備得到上述的IgG抗體。
[0032] 所述的酪胺抗體應(yīng)用于生物胺酪胺含量的免疫檢測(cè)，所述的免疫檢測(cè)為酶聯(lián)免疫 吸附劑測(cè)定，即ELISA。
[0033] 酪胺抗體應(yīng)用于生物胺酪胺含量的免疫檢測(cè)，包括如下步驟：
[0034] (1)包被：用包被液把包被抗原適當(dāng)稀釋，然后以100 μ L/well包被于96孔酶標(biāo) 板上，4°C孵育過(guò)夜或37°C孵育3h。
[0035] (2)洗板：加入洗滌液PBST，250 μ L/孔，于振蕩器上振蕩2min，棄去PBST，重復(fù)洗 板3次；
[0036] ⑶封閉：每孔加入200 μ L封閉液，于37°C封閉lh，然后棄去封閉液，用PBST重 復(fù)洗板3次；
[0037] (4)加樣：每孔先加入50 μ L的酪胺標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣品溶液，然后各加入50 μ L的抗 體，加樣完畢后，在37°C下競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)lh，然后用PBST重復(fù)洗板4次；
[0038] (5)加羊抗兔HRP標(biāo)記二抗：把羊抗兔HRP標(biāo)記二抗用PBS稀釋適當(dāng)濃度，100 μ L/ well加樣，37°C下孵育30min，用PBST重復(fù)洗板5次。
[0039] (6)顯色：每孔加入100 μ L混勻后的底物液，37°C下反應(yīng)15-20min ;
[0040] (7)終止：每孔加入50 μ L的硫酸終止液，終止顯色反應(yīng)。
[0041] (8)讀數(shù)：在雙波長(zhǎng)方式（450nm為測(cè)定波長(zhǎng)，650nm為參比波長(zhǎng)）下用酶標(biāo)儀測(cè)定 各孔的吸光度值。抑制率的計(jì)算公式如式所示：
[0043] 式中：0D對(duì)照：加 PBS和抗體的微孔的吸光值；
[0044] 0D空白：只加 PBS的微孔的吸光值；
[0045] 本發(fā)明制備出酪胺的高靈敏度、特異性強(qiáng)的抗體，建立簡(jiǎn)單、快速的酪胺酶聯(lián)免疫 檢測(cè)方法，為食品新鮮度的檢測(cè)提供了一種可靠的技術(shù)支撐。
[0046] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0047] (1)該設(shè)計(jì)、合成的人工抗原與目標(biāo)待測(cè)物相似程度高，對(duì)待測(cè)物的特征結(jié)構(gòu)保留 完整，充分暴露酪胺抗原決定簇，為制備特異性良好的抗體奠定了基礎(chǔ)；采用不同合成方法 制備有結(jié)構(gòu)差異的包被原，與抗體組成抗原抗體競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)系統(tǒng)，利用抗體識(shí)別差異化提高 方法靈敏度。
[0048] (2)其抗體具有良好的特異性和靈敏度，檢測(cè)極限達(dá)到0· 02mg/L。
[0049] (3)因此，本發(fā)明合成人工抗原的方法與其他方法相比較，更加易于推廣普及。并 且提供的快速檢測(cè)方法操作簡(jiǎn)便、快速，而且檢測(cè)的精確度可達(dá)90%以上，非常適合現(xiàn)場(chǎng)檢 測(cè)的需要。因此，本發(fā)明不僅在實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中表現(xiàn)出色，并為開發(fā)出成本低廉、檢測(cè)效率高、 操作簡(jiǎn)便的酶聯(lián)免疫快速檢測(cè)工具，奠定了