一種三氯生人工抗原及其合成方法和抗體制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于有機(jī)合成、免疫化學(xué)及生物化學(xué)領(lǐng)域，涉及三氯生人工抗原及其合成 方法和抗體的制備。
【背景技術(shù)】
[0002] 三氯生（Triclosan，TCS)是目前廣泛使用的廣譜高效抗菌劑，對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌、革 蘭氏陰性菌、酵母及病毒以及對(duì)抗抗生素菌、非抗抗生素菌均有廣泛高效的殺滅及抑制作 用，廣泛應(yīng)用于家庭與個(gè)人護(hù)理產(chǎn)品中，如牙膏、洗面奶、洗發(fā)劑、肥皂等，結(jié)構(gòu)式如下：
[0003] TCS最初一直被認(rèn)為是安全、無(wú)毒的，然而近年來(lái)牙膏中TCS致癌引起熱議，同時(shí) 美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局重啟對(duì)TCS安全性的評(píng)估，使得TCS再次引起廣泛的關(guān)注；研究表 明TCS可以通過(guò)生活污水進(jìn)入環(huán)境水體，隨著人類日用品使用量的急劇上升和分析檢測(cè)手 段的不斷提高，在污泥、地表水和生活污水中均有TCS檢出的報(bào)道，在污水處理廠附近的藻 類、軟體動(dòng)物等水生生物體內(nèi)有TCS及其代謝物甲基TCS檢出，甚至在人類母乳中也發(fā)現(xiàn)有 TCS殘留，TCS在水體環(huán)境中大量存在，使得TCS的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)日益受到關(guān)注。
[0004] 目前現(xiàn)有的三氯生檢測(cè)方法主要采用高效液相色譜法、高效液相色譜、GC-MS法、 分光光度法等，但這些儀器分析方法存在儀器昂貴、操作復(fù)雜、對(duì)操作人員要求高等弊端； 免疫分析方法因其快速、操作簡(jiǎn)單、靈敏度高等優(yōu)勢(shì)，已成為有毒有害殘留物快速檢測(cè)的主 要方法之一，而免疫分析方法建立的前提是獲得高親和力和高靈敏度的抗體，而小分子半 抗原結(jié)構(gòu)的設(shè)計(jì)又直接影響相應(yīng)抗體的特性，因此設(shè)計(jì)并合成小分子半抗原并制備相應(yīng)的 抗體是建立免疫分析方法的基礎(chǔ)。
[0005]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供一種三氯生半抗原化合物。
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種由上述半抗原化合物制備而來(lái)的人工抗原化 合物。
[0008] 本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種操作簡(jiǎn)單的三氯生半抗原化合物和三氯生人 工抗原的制備方法。
[0009] 本發(fā)明的第四個(gè)目的在于提供一種效價(jià)高、特異性識(shí)別三氯生的多克隆抗體。
[0010] 本發(fā)明的技術(shù)方案： 本發(fā)明提供了一種三氯生半抗原化合物，如化合物I所示；化合物I既最大程度的保 留了 TCS的特征結(jié)構(gòu)，又具有可以和大分子物質(zhì)偶聯(lián)的活性基團(tuán)。
[0011] 化合物I。
[0012] 本發(fā)明還提供了一種三氯生人工抗原化合物，如化合物II所示。
[0013] 化合物II。
[0014] 所述蛋白為大分子蛋白，具體為：牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白0VA、人血清白蛋 白HSA、牛甲狀腺球蛋白BTG和血匙藍(lán)蛋白KLH中的一種。
[0015] -種三氯生人工抗原的合成方法，三氯生和丁二酸酐按1:1. 2的摩爾比溶于吡啶 中，加入的吡啶與三氯生的體積摩爾比為2:1，于80°C水浴攪拌48小時(shí)；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去 吡啶，加入與吡啶同體積的雙蒸水，用吡啶5倍體積的乙酸乙酯萃取3次，再用吡啶5倍體 積水洗乙酸乙酯相3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，得到合成三氯生半抗原即化合物I， 化合物I通過(guò)碳二酰亞胺（EDC)活化后，與大分子蛋白偶聯(lián)，獲得三氯生人工抗原，即化合 物II，合成路線如反應(yīng)式（1)所示：
反應(yīng)式（I) 合成方法為： (1)三氯生半抗原的制備 三氯生和丁二酸酐按1:1. 2的摩爾比溶于吡啶中，吡啶與三氯生的體積摩爾比為2:1， 于80°C水浴攪拌48小時(shí)；用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去吡啶，加入與吡啶同體積的雙蒸水，用吡啶5 倍體積的乙酸乙酯萃取3次，再用吡啶5倍體積水洗乙酸乙酯相3次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙 酸乙酯，得到合成三氯生半抗原即化合物I。
[0016] (2)三氯生人工抗原的制備 取化合物I溶于DMF，每100 y L的DMF中溶解IOmg化合物I，加入與化合物I同質(zhì)量 的H)C，室溫?cái)嚢?0分鐘，蛋白溶解于0. 0IM pH7. 4的PBS緩沖液中，每2mLPBS溶解IOOmg 蛋白；將蛋白溶液加入到化合物與EDC混合溶液中，蛋白與化合物I的質(zhì)量比為5:1 ;室溫 攪拌過(guò)夜，取出裝入透析袋，用0.0 lM pH7. 4PBS緩沖液透析三天三夜，其中換液6-8次；PBS 透析后得到化合物II。
[0017] 所述大分子蛋白為：牛血清白蛋白BSA、卵清白蛋白0VA、人血清白蛋白HSA、牛甲 狀腺球蛋白BTG、血匙藍(lán)蛋白KLH中的一種。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種利用上述三氯生人工抗原制備特異性抗體的方法。
[0019]選用I. 5Kg的新西蘭大白兔為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，首次免疫采用免疫原與等體積的弗氏完 全佐劑乳化，免疫劑量為每只動(dòng)物lmg，頸部皮內(nèi)多點(diǎn)注射，二免以后使用與免疫原等體積 的弗氏不完全佐劑乳化，免疫劑量為每只動(dòng)物〇. 5mg，頸背部皮下多點(diǎn)注射；首免四周后二 免，之后每隔兩周免疫一次，三免后每次免疫7天后耳緣靜脈采血，收集血液，分離血清進(jìn) 行檢測(cè)；待血清效價(jià)合格后，頸動(dòng)脈采血，飽和硫酸銨法沉淀分離抗血清。
[0020] 本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明通過(guò)簡(jiǎn)單的合成方法獲得一種三氯生半抗原，最大程 度的保留了三氯生的特異性結(jié)構(gòu)；并制備了相應(yīng)的人工抗原；通過(guò)免疫動(dòng)物獲得的多克隆 抗體效價(jià)高，特異性強(qiáng)，對(duì)三氯生IC50可達(dá)3. 6ng/mL。
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1為三氯生的人工抗原紫外光譜圖。
[0022] 圖2為三氯生的抑制曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下的實(shí)施例便于更好的理解本發(fā)明，但不限定本發(fā)明；下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方 法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法；下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī) 生化試劑。
[0024] 實(shí)施例1、三氯生半抗原的制備 稱取三氯生289mg和丁二酸酐120mg，溶于2mL吡啶中，于80°C水浴攪拌48小時(shí)，用旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去吡啶，加入2mL水，用IOmL乙酸乙酯萃取3次，再用IOmL水洗乙酸乙酯相3 次，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙酸乙酯，得到三氯生半抗原即化合物I。
[0025] 實(shí)施例2、三氯生人工抗原的制備 取20mg化合物I，溶于200微升DMF中，加入EDC20mg，室溫?cái)嚢?0分鐘，IOOmg牛血清 白蛋白BSA溶解于2mL的0. 0IM pH7. 4的PBS緩沖液中，將蛋白溶液加入到化合物I于EDC 混合溶液中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，取出裝入透析袋，用0.0 lM pH7. 4PBS緩沖液透析三天三夜，其 中換液6-8次；PBS透析后得到三氯生抗原。
[0026] 實(shí)施例3、三氯生人工抗原的制備 取20mg化合物I，溶于200微升DMF中，加入EDC20mg，室溫?cái)嚢?0分鐘，IOOmg卵清 白蛋白OVA溶解于2mL的0. 0IM pH7. 4的PBS緩沖液中，將蛋白溶液加入到化合物I于EDC 混合溶液中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，取出裝入透析袋，用0.0 lM pH7. 4PBS緩沖液透析三天三夜，其 中換液6-8次；PBS透析后得到三氯生抗原。
[0027] 實(shí)施例4、三氯生人工抗原的制備 取20mg化合物I，溶于200微升DMF中，加入EDC20mg，室溫?cái)嚢?0分鐘，IOOmg人血清 白蛋白HSA溶解于2mL的0. 0IM pH7. 4的PBS緩沖液中，將蛋白溶液加入到化合物I于EDC 混合溶液中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，取出裝入透析袋，用0.0 lM pH7. 4PBS緩沖液透析三天三夜，其 中換液6-8次；PBS透析后得到三氯生抗原。
[0028] 實(shí)施例5、三氯生人工抗原的制備 取20mg化合物I，溶于200微升DMF中，加入EDC20mg，室溫?cái)嚢?0分鐘，IOOmg牛甲 狀腺球蛋白BTG溶解于2mL的0.0 lM pH7. 4的PBS緩沖液中，將蛋白溶液加入到化合物I 于EDC混合溶液中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，取出裝入透析袋，用0.0 lM pH7. 4PBS緩沖液透析三天三 夜，其中換液6-8次；PBS透析后得到三氯生抗原。
[0029] 實(shí)施例6、三氯生人工抗原的制備 取20mg化合物I，溶于200微升DMF中，加入EDC20mg，室溫?cái)嚢?0分鐘，IOOmg血匙 藍(lán)蛋白KLH溶解于2mL的0. 0IM pH7. 4的PBS緩沖液中，將蛋白溶液加入到化合物I于EDC 混合溶液中，室溫?cái)嚢柽^(guò)夜，取出裝入透析袋，用0.0 lM pH7. 4PBS緩沖液透析三天三夜，其 中換液6-8次；PBS透析后得到三氯生抗原。
[0030] 三氯生抗原合成的鑒定如圖1所示。
[0031] 實(shí)施例7、三氯生抗血清的制備 一、動(dòng)物免疫 選用健康成年新西蘭大白兔(雄性，體重I. 5Kg左右)為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)施例2合成的人工 抗原作為免疫原，免疫5只動(dòng)物。
[0032] 免疫方法：首次免疫采用免疫原與等體積的弗氏完全佐劑乳化，頸背部皮內(nèi)多 點(diǎn)注射，免疫劑量為每只動(dòng)物lmg，約注射20個(gè)點(diǎn)左右；二免以后使用弗氏不完全佐劑乳 化，頸背部皮下多點(diǎn)注射，免疫劑量為每只動(dòng)物〇. 5mg，約注射15個(gè)點(diǎn)左右；首免四周后二 免，之后每隔兩周免疫一次，三免后每次免疫7天后耳源靜脈采血，收集血液4000rmp離心 lOmin，分離血清進(jìn)行檢測(cè)。
[0033] 二、動(dòng)物采血 采用頸動(dòng)脈放血法。
[0034] 將家兔仰面固定于兔臺(tái)上，頭部放低，暴露頸部，沿中線用2%普魯卡因局部麻醉， 15min后暴露頸中部皮膚IOcm長(zhǎng)；沿氣管鈍性分離皮下組織，暴露氣管前的胸鎖乳突肌。 輕輕分開胸鎖乳突肌，暴露頸動(dòng)脈，將雙側(cè)頸動(dòng)脈仔細(xì)分離；先將一側(cè)動(dòng)脈遠(yuǎn)心端絲線結(jié)扎 緊，然后在向心端用止血鉗夾住，用眼科剪在兩側(cè)絲線中間的動(dòng)脈壁上剪開一個(gè)小口，插入 塑料放血管，再以絲線固定，松開止血鉗，收集血液；收集的血液置于4°C過(guò)夜，然后于4°C 下2500g離心30min，取上清液。
[0035] 三、抗血清純化 取兔血清加等體積生理鹽水，于攪拌下逐滴加入