專利名稱：用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法及其試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
檢測生物(包括人類)組織樣本中特定蛋白質(zhì)因子的含量，對于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域的應(yīng)用和基礎(chǔ)研究具有非常重要的意義。例如，檢測病原微生物的特異性蛋白質(zhì)組分是目前診斷傳染病的重要手段；同樣，測定癌癥的早期生物標(biāo)記性蛋白質(zhì)因子含量的變化對于疾病的早發(fā)現(xiàn)早治療和療效觀察極為重要。根據(jù)不同的應(yīng)用目標(biāo)，待測分析物可以是一種或幾種蛋白質(zhì)，也可以是數(shù)目不等的一組蛋白質(zhì)，而近年來基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究和應(yīng)用的飛速發(fā)展，更要求能夠同時(shí)多重性檢測生物組織樣本中幾百幾千種蛋白質(zhì)乃至整個(gè)蛋白質(zhì)組。
為滿足這些要求，近年來各種檢測方法應(yīng)運(yùn)而生，例如免疫檢測技術(shù)、雙向凝膠電泳、質(zhì)譜分析和肽圖譜分析等等。其中最方便、應(yīng)用范圍最廣也是目前使用最多的是免疫技術(shù)中的酶聯(lián)免疫吸附檢測(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay，簡稱ELISA)。經(jīng)典的酶聯(lián)免疫檢測采用能夠和同一種抗原的不同抗原決定簇結(jié)合的兩種不同但是互相配合的抗體來完成，一種抗體和抗原的結(jié)合不干擾另一種抗體和同一抗原分子的結(jié)合。這種方法稱為夾心酶聯(lián)免疫吸附檢測(Sandwich ELISA)，其技術(shù)要點(diǎn)是(1)將捕獲抗體(capture antibody)包被在某一固相表面上(通常是微量板的微孔內(nèi)部表平面)；(2)加入生物樣本或其它待測樣本，使其中含有的分析物(抗原)與捕獲抗體特異性結(jié)合，然后洗除未結(jié)合的非特異性物質(zhì)；(3)加入標(biāo)有報(bào)道分子(酶、生物素、熒光素等熒光基團(tuán)或其他類型分子)的探測抗體(detection antibody)，使之與被捕獲的分析物特異性結(jié)合，然后洗除未結(jié)合的探測抗體；(4)加入使報(bào)道分子產(chǎn)生信號(hào)的相關(guān)試劑(例如親和素、酶的底物)，然后測定信號(hào)強(qiáng)度，或者直接測定報(bào)道分子(例如熒光強(qiáng)度等)。根據(jù)信號(hào)的強(qiáng)度，參照分析物的已知濃度標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線，從而確定樣本中分析物的濃度。雖然Sandwich ELISA特異性比較高，靈敏度也比較高，通?？蛇_(dá)0.5-2ng/ml。但是該方法的應(yīng)用有三個(gè)重要局限性。第一，如果要建立檢測一種分析物的Sandwich ELISA檢測方法，首先必須擁有針對該分析物的兩種不同抗體(捕獲抗體和探測抗體)，而且要求這兩種抗體對該抗原都擁有高度親合力，同時(shí)它們之間必須互相配合，即捕獲抗體和抗原蛋白質(zhì)的結(jié)合不影響探測抗體對同一抗原分子的結(jié)合。這些要求在很大程度上限制了Sandwich ELISA的應(yīng)用，這是因?yàn)?，一種蛋白質(zhì)被鑒定提純后，在實(shí)際工作中往往要經(jīng)過很多努力、很長時(shí)間才能獲得上述能夠互相配合的一對抗體。而對于那些分子量較小或者只有1-2個(gè)抗原決定簇的蛋白質(zhì)(或蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域)，在實(shí)驗(yàn)中就更難獲得兩個(gè)互相配合的抗體。第二，Sandwich ELISA方法通常要求在每種探測抗體上都用人工方法標(biāo)記酶或其他信號(hào)分子。如果同時(shí)定量檢測成百上千甚至上萬種蛋白質(zhì)，就要把每一種蛋白質(zhì)的探測抗體都進(jìn)行標(biāo)記，這一工作量十分巨大，而且會(huì)因?yàn)槿斯?biāo)記條件和效率的不同而造成不同批量探測抗體之間的差異。此外，標(biāo)記過程的化學(xué)修飾可能影響到探測抗體對抗原的結(jié)合。第三，在多重性檢測多種蛋白質(zhì)時(shí)，必須把所有蛋白質(zhì)相對應(yīng)的探測抗體都混合到一起，由此造成每個(gè)單一抗體的稀釋和非特異性結(jié)合的增加，降低特異性信號(hào)和靈敏度，擴(kuò)大檢測噪音。這些局限性使Sandwich ELISA方法的應(yīng)用受到很大限制，尤其是很難成為蛋白質(zhì)組學(xué)(蛋白質(zhì)芯片技術(shù))研究應(yīng)用的主要技術(shù)平臺(tái)。
為了克服Sandwich ELISA的上述局限，人們提出并實(shí)驗(yàn)了若干種改進(jìn)方法，例如，將生物樣本中的所有抗原預(yù)先用熒光化合物等報(bào)道分子進(jìn)行直接標(biāo)記(Miller等，2003.Proteomics.3∶56-63)。然后與固定在固相載體上的檢測抗體結(jié)合，洗除非特異性物質(zhì)后，直接檢測結(jié)合在固相抗體上的被標(biāo)記的抗原。這個(gè)方法雖然簡單易行，只需要一種抗體(捕獲抗體)就能夠進(jìn)行檢測。但缺點(diǎn)是，第一，生物樣本中含有成千上萬種大小分子，其中很多會(huì)干擾標(biāo)記效率，含量低的蛋白質(zhì)往往難以有效地被標(biāo)記。第二，標(biāo)記過程本身可能修飾改變蛋白質(zhì)分子上的抗原決定簇特征，降低甚至抑制與抗體的結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果已經(jīng)證明，抗原預(yù)先標(biāo)記檢測方法通常本底噪音大，靈敏度低。為了提高檢測靈敏度，最近還提出了在Sandwich ELISA方法中以DNA寡聚核苷酸來標(biāo)記探測抗體，然后用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)或滾環(huán)復(fù)制(rolling circle replication)方法擴(kuò)增信號(hào)，這些方法雖然可以較大程度上提高檢測靈敏度，但是檢測手段過于繁瑣、成本太高，而且上述Sandwich ELISA方法的幾個(gè)局限性依然存在。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有免疫檢測方法的不足，本發(fā)明公開了一種新的檢測方法，只需采用一種捕獲劑就能靈敏地、簡便地定量檢測分析物。這一方法稱為“特異性分析物標(biāo)記及再捕獲法”，英文名稱是“Specific AnalyteLabeling and Recapture Assay”，簡稱SALRA。其原理是將被捕獲劑捕獲的分析物用報(bào)道分子標(biāo)記；再將經(jīng)過標(biāo)記的分析物從復(fù)合物上洗脫下來，與新的固相捕獲劑再結(jié)合，通過檢測報(bào)道分子的標(biāo)記信號(hào)來確定分析物含量。SALRA方法適用于各類基于固相方法的檢測平臺(tái)，例如微孔板、濾膜、蛋白質(zhì)(抗體)芯片、微珠(beads)，等等。SALRA方法既可以用來檢測一種或幾種抗原，也可以用于多重性同時(shí)檢測幾十種幾百種乃至成千上萬種不同蛋白質(zhì)；既可以檢測抗體與抗原蛋白質(zhì)的結(jié)合，也可以檢測非免疫性的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合或者蛋白質(zhì)與其他類型分子的結(jié)合。同時(shí)，SALRA方法還能被用來快速分離鑒定產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤株系。本發(fā)明還提供了一種用于用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法的試劑盒。
本發(fā)明用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法，其特征在于(1)捕獲分析物將捕獲劑包被到固相表面，成為捕獲裝置；加入待測生物樣本，使捕獲裝置上的捕獲劑與樣本中的特異性分析物結(jié)合，形成捕獲劑-分析物復(fù)合物；(2)標(biāo)記復(fù)合物用報(bào)道分子標(biāo)記捕獲劑-分析物復(fù)合物；(3)洗脫分析物將經(jīng)過標(biāo)記的分析物從復(fù)合物上洗脫下來；(4)再捕獲將洗脫下的分析物中和及稀釋后與檢測裝置上的捕獲劑再結(jié)合，所說的檢測裝置是指包被了捕獲劑的固相表面；(5)檢測洗去檢測裝置上未結(jié)合的非特異性物質(zhì)后，通過檢測報(bào)道分子的標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度來確定分析物含量。
本發(fā)明方法中所說的捕獲劑可以是抗體、抗體片段、非抗體類蛋白質(zhì)、肽、寡聚核苷酸或小分子化合物，當(dāng)捕獲劑是抗體時(shí)，所說的抗體最好是單克隆抗體；本發(fā)明中所說的分析物是能與所說的捕獲劑特異性結(jié)合的抗原蛋白質(zhì)、抗體、其他蛋白質(zhì)、肽、寡聚核苷酸適體、其他生物大分子及其復(fù)合物、小分子化合物、亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，等等。
本發(fā)明方法中所說的報(bào)道分子，包括但不限于生物素、熒光素或其他熒光物質(zhì)、酶、肽、寡聚核苷酸。
以下以抗體-抗原為例，來進(jìn)一步說明用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法(1)將捕獲抗體(單克隆抗體)包被到固相表面，例如微量板、微孔表面、尼龍(或其它介質(zhì))濾膜表面、微珠表面，等等；該固相表面將用來捕獲生物樣本中的特異性抗原，稱為“捕獲裝置”；根據(jù)檢測系統(tǒng)、檢測目標(biāo)和樣本特點(diǎn)的不同，捕獲裝置上包被的抗體或者是一種，或者是多種混合在一起(用于同時(shí)檢測多種抗原)；包被完成后，洗去未結(jié)合的抗體分子，用過量的非特異性蛋白質(zhì)(例如脫脂奶粉或牛血清蛋白)封阻固相表面上未結(jié)合的平面空間，然后再洗去非特異性蛋白質(zhì)。
加入待測生物樣本，使捕獲裝置上的抗體結(jié)合并“捕獲”樣本中的特異性抗原，形成緊密結(jié)合的抗體-抗原復(fù)合物；然后洗去未與抗體結(jié)合的非特異性蛋白質(zhì)和其他組成成分。
(2)用報(bào)道分子標(biāo)記捕獲劑-分析物復(fù)合物。例如加入能夠共價(jià)標(biāo)記修飾蛋白質(zhì)側(cè)鏈基團(tuán)的小分子，這些小分子攜帶某種報(bào)道分子(生物素、熒光基團(tuán)等)，從而將報(bào)道分子連接到被結(jié)合到捕獲裝置抗體上的抗原蛋白質(zhì)分子表面。例如，基于N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，簡稱NHS)的化合物，包括NHS-生物素、NHS-熒光素、NHS-肽或NHS-寡聚核苷酸，能夠?qū)y帶的報(bào)道分子(生物素、熒光素、肽、寡聚核苷酸等)共價(jià)結(jié)合在蛋白質(zhì)的賴氨酸自由氨基上。以NHS-生物素為例，由于賴氨酸幾乎普遍存在于所有的蛋白質(zhì)中，因此NHS-生物素能夠標(biāo)記幾乎的所有蛋白質(zhì)。這里要著重指出的是，抗原和抗體的緊密結(jié)合使抗原分子上的特異性抗原決定簇受到保護(hù)而不被NHS-生物素修飾，仍然保持對特異性抗體的結(jié)合能力。因此，在后續(xù)步驟中抗體-抗原復(fù)合物解離分開后，該抗原分子能夠重新和同樣的抗體結(jié)合形成新的復(fù)合物。除了生物素，根據(jù)檢測系統(tǒng)和目標(biāo)的不同也可以選用其他報(bào)道分子(信號(hào)基團(tuán))，比如寡聚核苷酸或熒光基團(tuán)(例如NHS-熒光素)，以熒光基團(tuán)作為報(bào)道分子尤其適用于蛋白質(zhì)芯片檢測系統(tǒng)。除了NHS，也可以用能夠共價(jià)修飾蛋白質(zhì)其它基團(tuán)(如巰基、羧基或羥基)的活性小分子進(jìn)行標(biāo)記。
(3)用含有過量自由氨基的溶液(例如Tris-HCl緩沖液)淬滅并除去未與蛋白質(zhì)共價(jià)結(jié)合的游離NHS-生物素。然后加入少量抗原洗脫液，讓標(biāo)記過的抗原蛋白質(zhì)從抗體-抗原復(fù)合物上離解出來。可以采用0.1M的檸檬酸(pH2.8)作為抗原洗脫液，或者使用目前市場上存在的抗原洗脫液(例如美國PIERCE公司的ImmunoPure洗脫液)。然后將含有抗原蛋白質(zhì)的洗脫液移出，加入3-10倍體積的緩沖液(含有非特異性蛋白質(zhì)如脫脂奶粉等)中和并稀釋抗原洗脫液，以提高pH值，降低抗原洗脫液的濃度，使之不再影響抗原蛋白質(zhì)和同一抗體的再結(jié)合。
(4)將中和的標(biāo)記有報(bào)道分子的抗原加入到“檢測裝置”進(jìn)行檢測。根據(jù)檢測系統(tǒng)和檢測目標(biāo)的不同，檢測裝置可以由微孔板、尼龍濾膜、微珠、玻璃或塑料薄片(蛋白質(zhì)芯片)等固體表面承載。檢測裝置固相表面結(jié)合著和捕獲裝置上同樣類型的抗體，并且已經(jīng)經(jīng)過非特異性蛋白質(zhì)的封阻。然而，和捕獲裝置不同的是，檢測裝置上的抗體均單獨(dú)存在，不混合在一起。如果捕獲裝置包被著的是混合在一起的多種抗體，這些抗體在檢測裝置上將被獨(dú)立分開，互不混淆。如果檢測裝置的固相載體是微孔板，那么每個(gè)微孔只結(jié)合有一種抗體；如果檢測裝置的固相載體是蛋白質(zhì)芯片，那么芯片上抗體成陣列分布，每種抗體在陣列中均占有獨(dú)特的地理位置。檢測裝置上抗體的結(jié)合和封阻應(yīng)該提前進(jìn)行，當(dāng)上述第“3”步驟完成，即捕獲裝置上被標(biāo)記的抗原從抗體上洗脫下來并中和稀釋后，能夠立即轉(zhuǎn)移至檢測裝置。
(5)在檢測裝置上，已被標(biāo)記的抗原與相應(yīng)的特異性抗體重新結(jié)合(再捕獲)，洗去未結(jié)合的非特異蛋白質(zhì)后，即可進(jìn)行信號(hào)測定。比如，如果報(bào)道分子是生物素，可以加入標(biāo)記有某種酶(通常為辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶)的親和素蛋白，親和素蛋白和生物素具有極強(qiáng)的親和力，從而把所攜帶的酶固定在被再捕獲的抗原分子表面。洗掉未結(jié)合的親和素蛋白后，加入該酶的底物，使之產(chǎn)生顏色、熒光或發(fā)光，即可鑒定酶的活性。如果報(bào)道分子是熒光基團(tuán)，則可以直接測讀或掃描熒光強(qiáng)度。通過這些信號(hào)，能夠計(jì)算出生物樣本中該特異性抗原蛋白質(zhì)的含量。
本發(fā)明的貢獻(xiàn)在于，提供了一種只需要單一捕獲劑就能定量檢測特異性分析物的新流程如圖1所示，而在本方法各步驟中涉及到的具體操作技術(shù)，如包被捕獲劑的技術(shù)、捕獲劑和分析物結(jié)合的技術(shù)、顯示并測定報(bào)道分子信號(hào)強(qiáng)度的技術(shù)等，是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的。
一種用于本發(fā)明方法的試劑盒，其特征在于，包括捕獲裝置、檢測裝置，以及用于標(biāo)記的報(bào)道分子和分析物洗脫液。
很顯然，本發(fā)明公開的用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法，能應(yīng)用在臨床診斷、生物標(biāo)記鑒定分析、蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析、新藥靶位鑒定分析、臨床藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)分析等領(lǐng)域。
和現(xiàn)有的酶聯(lián)免疫檢測相比，本發(fā)明所提出的SALRA檢測方法有如下優(yōu)點(diǎn)(1)SALRA方法只需使用一種捕獲劑就能定量檢測分析物，也就是說只要一種抗體就能檢測一種抗原蛋白質(zhì)，顯而易見，獲得一個(gè)單克隆抗體比獲得兩個(gè)互相配對的單克隆抗體要容易的多。因此，對于那些目前沒有Sandwich ELISA檢測方法的蛋白質(zhì)，SALRA能夠迅速建立起檢測方法。而且，SALRA方法能夠檢測只擁有一個(gè)或幾個(gè)相鄰很近抗原決定簇的蛋白質(zhì)分子或分子結(jié)構(gòu)域，比如蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)、蛋白質(zhì)的重要功能域及其活化狀態(tài)、小肽、特異性寡聚核苷酸序列、有機(jī)化合物小分子，等等。因此，SALRA的適用范圍非常廣泛，將有力促進(jìn)蛋白質(zhì)組學(xué)研究應(yīng)用、疾病診斷、新藥研制、食品及農(nóng)產(chǎn)品衛(wèi)生檢查和化合物殘留檢測、環(huán)境保護(hù)等等各個(gè)領(lǐng)域的工作。
(2)SALRA方法不需要標(biāo)記抗體。無論同時(shí)檢測多少種蛋白質(zhì)，只需要一種標(biāo)記小分子即可。
(3)檢測特異性高、噪音低。SALRA方法有兩個(gè)步驟確保檢測的特異性和降低檢測噪音第一，捕獲裝置只捕獲樣本中的特異性分析物。進(jìn)行標(biāo)記時(shí)，絕大多數(shù)非特異性物質(zhì)已經(jīng)被洗去，因此只有結(jié)合在捕獲劑上的分析物才能得到標(biāo)記，而不是標(biāo)記樣本中所有的物質(zhì)。第二，在檢測裝置上抗體重新捕獲被標(biāo)記分析物的過程中，將進(jìn)一步洗去非特異物質(zhì)，使之無立足之地。
(4)靈敏度高。SALRA方法標(biāo)記分析物的過程本身就是重要的信號(hào)放大步驟。例如用NHS-生物素標(biāo)記抗原時(shí)，由于大多數(shù)抗原蛋白質(zhì)都含有幾個(gè)、十幾個(gè)甚至幾十個(gè)賴氨酸，因此可以被標(biāo)記上幾個(gè)、十幾個(gè)或幾十個(gè)生物素分子，使總體檢測信號(hào)和檢測靈敏度相應(yīng)提高。同時(shí)，上述確保檢測特異性的兩個(gè)步驟也為提高檢測靈敏度開辟了空間由于檢測噪音低，研究人員可以選用比較溫和的清洗條件來增強(qiáng)抗體對特異性抗原的捕獲能力，這對于親和力比較低的抗體-抗原體系非常重要。此外，由于捕獲裝置和檢測裝置是分開的，可以把來自捕獲裝置的抗原適當(dāng)濃縮后加入到檢測裝置，從而提高檢測靈敏度。例如，可以采用面積比較大的或者表面粗糙的微孔作為捕獲裝置的載體，增加捕獲固相的表面積，同時(shí)縮小檢測裝置的平面面積，以提高特異性抗原的濃度。
(5)SALRA方法尤其適合同時(shí)多重性檢測多種蛋白質(zhì)。多重檢測時(shí)，只需在捕獲裝置上包被多種捕獲劑的混合液，而在檢測裝置上則將這些捕獲劑一一單獨(dú)分開，就能同時(shí)定量檢測多種分析物。采用SALRA方法只需要少量生物樣本就能檢測多種蛋白質(zhì)，尤其適合小量樣本(例如組織活體檢查樣本)的多重性檢測和蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。
(6)SALRA的原理和方法也適用于檢測非抗體-抗原關(guān)系的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)之間或者蛋白質(zhì)和其它分子之間的互作和結(jié)合。這些互作和結(jié)合對于研究生命運(yùn)動(dòng)、診斷疾病進(jìn)程，研制新藥都非常重要。例如，為了鑒定生物樣本中某個(gè)蛋白質(zhì)因子的含量，可以將能夠和該蛋白質(zhì)結(jié)合的另一種蛋白質(zhì)作為捕獲劑包被在捕獲裝置的固相表面，采用SALRA的原理，加入待測樣本，然后用小分子標(biāo)記待測蛋白質(zhì)因子，洗脫后加入到檢測裝置上和同一種作為捕獲劑的蛋白質(zhì)重新結(jié)合，即可對其定量檢測。除了蛋白質(zhì)，還可以用其他物質(zhì)作為捕獲劑，比如肽、核酸、多糖、脂類、甚至小分子等等，來檢測與其特異性結(jié)合的各類分析物，例如蛋白質(zhì)、肽、核酸適體、小分子，等等。


圖1是本發(fā)明方法的流程示意2是實(shí)施例1的檢測結(jié)果3是實(shí)施例2的檢測結(jié)果圖具體實(shí)施方式
以下結(jié)合圖1的步驟來進(jìn)一步闡述本發(fā)明方法。
實(shí)施例1單一性檢測(檢測一種蛋白質(zhì))在本實(shí)施例子中，捕獲裝置和檢測裝置都是96-孔微量板。捕獲裝置的每個(gè)微孔包被一種抗體，用來檢測一種抗原蛋白質(zhì)。待測抗原蛋白質(zhì)為四種細(xì)胞因子(cytokines)，分別為IL-1-beta、IL-4、IL-8和GM-CSF。其相應(yīng)的抗體均為單克隆抗體。
(1)捕獲抗原蛋白質(zhì)a.包被捕獲抗體取兩個(gè)96-孔微量板(平底，對蛋白質(zhì)高度結(jié)合)，一個(gè)用于捕獲樣本中的抗原(捕獲裝置)，另一個(gè)用于檢測標(biāo)記的抗原(檢測裝置)。微孔內(nèi)分別加入100μl濃度為0.5μg/ml(稀釋于PBS緩沖液)的抗IL-1-beta、IL-4、IL-8或GM-CSF的單克隆抗體。每個(gè)微孔只加有一種抗體，每個(gè)微量板上每種抗體加入8個(gè)微孔。將微量板置于4度過夜。
b.封阻非特異性結(jié)合位點(diǎn)移去捕獲裝置和檢測裝置微孔中的抗體溶液，用PBS+0.1％Tween 20(PBST)清洗1次。移去PBST，加入400μl的2％脫脂奶粉(溶于PBS)，在室溫下進(jìn)行封阻。捕獲裝置的封阻時(shí)間為一小時(shí)；檢測裝置的封阻一直持續(xù)到使用前(約4小時(shí))。
c.捕獲抗原蛋白質(zhì)移去封阻溶液，根據(jù)抗體的分布，分別在微孔中加入100μl不同濃度的四種細(xì)胞因子(稀釋于PBS+1％脫脂奶粉)。室溫下1.5小時(shí)。
(2)標(biāo)記抗原蛋白質(zhì)移去未與固相抗體結(jié)合的細(xì)胞因子和非特異性物質(zhì)，PBST清洗2次，PBS清洗1次。每一微孔加入100μl 0.02％NHS-生物素(溶于PBS)，室溫保持30分鐘。移去NHS-生物素，用10mM的Tris-HCl緩沖液(pH8.0)淬滅并清洗殘余的NHS-生物素(室溫下保持5分鐘)，然后移去Tris-HCl緩沖液。
(3)洗脫抗原加入20μl抗原洗脫液(使用美國PIERCE公司的ImmunoPure)，室溫下15分鐘。與此同時(shí)，移去檢測裝置微孔中的封阻溶液，加入180μlPBS+1％脫脂奶粉。
(4)抗原再捕獲將從捕獲裝置微孔中洗脫的抗原(約20μl)轉(zhuǎn)移至檢測裝置上含有對應(yīng)抗體的微孔中。室溫下1小時(shí)。由于檢測裝置微孔已經(jīng)含有180μlPBS+1％脫脂奶粉，抗原洗脫液被中和并稀釋10倍，不再影響到抗原和檢測裝置上特異性抗體的再結(jié)合(再捕獲)。
(5)檢測a.顯示信號(hào)移去未結(jié)合的物質(zhì)，用PBST清洗2次，PBS清洗1次。加入100μl辣根過氧化物酶-親和素(用PBS+1％脫脂奶粉稀釋至1μg/ml)，室溫下30分鐘。然后用PBST清洗3次，PBS清洗1次。加入100μl過氧化物酶底物溶液(0.3mg/ml ABTS，0.02％過氧化氫)，37度30分鐘。讀測405nm波長光吸收。
b.檢測結(jié)果圖2顯示實(shí)施例1的檢測結(jié)果。供試的所有四個(gè)細(xì)胞因子的信號(hào)強(qiáng)度和濃度之間從100ng/ml到0.4ng/ml都展現(xiàn)按一定比例的線性關(guān)系，證明SALRA方法能夠在這一濃度范圍檢測這些蛋白質(zhì)，靈敏度都至少可達(dá)0.4ng/ml。
實(shí)施例2多重性檢測(同時(shí)檢測三種蛋白質(zhì))在本實(shí)施例子中，捕獲裝置和檢測裝置都是96-孔微量板。捕獲裝置的每個(gè)微孔表面包被三種混合在一起的抗體，用來同時(shí)檢測三種抗原蛋白質(zhì)。待測抗原蛋白質(zhì)為三種細(xì)胞因子，分別為IL-1-beta、TNF-α和IL-10。其相應(yīng)的抗體均為單克隆抗體。
(1)捕獲抗原蛋白質(zhì)a.包被捕獲抗體取兩個(gè)96-孔微量板(平底，對蛋白質(zhì)高度結(jié)合)，一個(gè)用于捕獲(捕獲裝置)，另一個(gè)用于檢測(檢測裝置)。捕獲裝置微孔內(nèi)加入100μl抗IL-1-beta、TNF-α和IL-10的三種抗體混合液，每種抗體的濃度均為0.5μg/ml(稀釋于PBS緩沖液)，共加入8個(gè)微孔。而檢測裝置每個(gè)微孔只加有一種抗體，濃度為0.5μg/ml(稀釋于PBS緩沖液)，每種抗體加入8個(gè)微孔。將微量板置于攝氏4度過夜。
b.封阻非特異性結(jié)合位點(diǎn)同實(shí)施例1。
c.捕獲抗原蛋白質(zhì)移去捕獲裝置微孔中的封阻溶液，分別在微孔中加入100μl上述三種細(xì)胞因子不同濃度的混合液(稀釋于PBS+1％脫脂奶粉)。室溫下1.5小時(shí)?？乖旌弦褐腥N細(xì)胞因子的濃度如表1所示表1.三種細(xì)胞因子的濃度(ng/ml) (2)標(biāo)記抗原蛋白質(zhì)同實(shí)施例1。
(3)洗脫抗原加入20μl抗原洗脫液(同實(shí)施例1)，室溫下15分鐘。與此同時(shí)，移去檢測裝置微孔中的封阻溶液，加入60μl PBS+1％脫脂奶粉。
(4)抗原再捕獲將捕獲裝置微孔中洗脫的抗原分別加入至檢測裝置上的三個(gè)包被不同抗體的微孔，每孔6μl。室溫下1小時(shí)。由于檢測裝置微孔已經(jīng)含有60μl PBS+1％脫脂奶粉，抗原洗脫液被中和并稀釋，不再影響到被標(biāo)記的抗原和檢測裝置上特異性抗體的再結(jié)合(再捕獲)。
(5)檢測a.顯示信號(hào)同實(shí)施例1。
b.檢測結(jié)果圖3顯示實(shí)施例2的檢測結(jié)果。供試的三個(gè)細(xì)胞因子的信號(hào)強(qiáng)度和濃度之間從100ng/ml到0.4ng/ml都展現(xiàn)按一定比例的線性關(guān)系，證明SALRA方法能夠多重性地同時(shí)檢測多種蛋白質(zhì)，本例中靈敏度都至少可達(dá)0.4ng/ml。
權(quán)利要求
1.一種用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法，其特征在于(1)捕獲分析物將捕獲劑包被到固相表面，成為捕獲裝置；加入待測生物樣本，使捕獲裝置上的捕獲劑與樣本中的特異性分析物結(jié)合，形成捕獲劑-分析物復(fù)合物；(2)標(biāo)記復(fù)合物用報(bào)道分子標(biāo)記捕獲劑-分析物復(fù)合物；(3)洗脫分析物將經(jīng)過標(biāo)記的分析物從復(fù)合物上洗脫下來；(4)再捕獲將洗脫的分析物中和及稀釋后與檢測裝置上的捕獲劑再結(jié)合，所說的檢測裝置是指包被了捕獲劑的固相表面；(5)檢測通過檢測報(bào)道分子的標(biāo)記信號(hào)強(qiáng)度來確定分析物含量。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于其中所說的捕獲劑是抗體、抗體片段、非抗體類蛋白質(zhì)、肽、寡聚核苷酸或小分子化合物。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的定量檢測方法，其特征在于其中所說的抗體是單克隆抗體。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所說的分析物是能與所說的捕獲劑特異性結(jié)合的抗原蛋白質(zhì)、抗體、肽、寡聚核苷酸適體、其他生物大分子及其復(fù)合物、小分子以及亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1、2、3或4所述的定量檢測方法，其特征在于，所說的報(bào)道分子是生物素、熒光素或其他熒光基團(tuán)、酶、肽或寡聚核苷酸。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的定量檢測方法，其特征在于，其中所說的捕獲裝置的固相表面是試管、微量板、濾膜、測試紙或微珠；所說的檢測裝置的固相表面為微量板、濾膜、測試紙、微珠、玻璃或塑料薄片載體。
7.權(quán)利要求1所述的定量檢測方法，在臨床診斷、生物標(biāo)記鑒定分析、蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析、新藥靶位鑒定分析、臨床藥物動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)分析中的應(yīng)用。
8.一種用于權(quán)利要求1所說的用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法的試劑盒，其特征在于，包括捕獲裝置、檢測裝置，以及用于標(biāo)記的報(bào)道分子和分析物洗脫液。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法及其試劑盒。用單一捕獲劑定量檢測特異性分析物的方法是先使待測分析物與固相捕獲劑結(jié)合，再將被捕獲劑捕獲的分析物用報(bào)道分子標(biāo)記；之后將經(jīng)過標(biāo)記的分析物從復(fù)合物上洗脫下來，與新的固相捕獲劑再結(jié)合，通過檢測報(bào)道分子的標(biāo)記信號(hào)來確定分析物含量。用于本發(fā)明方法的試劑盒，包括捕獲裝置、檢測裝置，以及用于標(biāo)記的報(bào)道分子和分析物洗脫液。本發(fā)明的有益效果是只需一種捕獲劑，能夠檢測許多目前無法檢測的分析物，應(yīng)用范圍廣、靈敏度高、檢測噪音低，在疾病診斷、醫(yī)學(xué)鑒定、新藥研制、蛋白質(zhì)微陣和芯片應(yīng)用和基礎(chǔ)研究等領(lǐng)域有很好的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)G01N33/543GK1700009SQ20051004029
公開日2005年11月23日 申請日期2005年5月30日 優(yōu)先權(quán)日2005年5月30日
發(fā)明者孫東旭 申請人:孫東旭