檢測綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物保護領(lǐng)域，具體涉及檢測綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物。所述特異性引物的序列為：引物F1：5'?GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC；R1：5'?GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT。檢測的靈敏度達到1:2500。
【專利說明】
檢測綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及植物保護領(lǐng)域，具體涉及檢測綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引 物。
【背景技術(shù)】
[0002] 昆蟲病原真菌能夠侵染寄生昆蟲，使昆蟲罹病死亡，其殺蟲功能已被用于農(nóng)、林、 草等植物害蟲的防控治理中。近年研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲病原真菌除了能夠侵染害蟲減少植物蟲 害以外，還能夠進入植物宿存，促進植物的發(fā)育生長。至今證明至少有8屬種殺蟲真菌可在 植物體內(nèi)定植，包括綠僵菌（Metarhizium anisopliae，M.robertsii)、白僵菌 (Beauveriabassiana)、擬青霉（Paecilomyces sp ·)、錯蟻輪枝抱 (Lecanicilliumlecanii)、蟲草棒束抱（Isariafarinosa)、支頂抱(Acremoniumsp ·)、枝抱 菌（Cladosporiumsp ·)、食線蟲真菌（Plectosphaerellacucumerina)，還有抑制植物土傳病 害的粉紅粘帚霉(Clonostachysrosea)等。研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)生的殺蟲真菌與植物形成一定的互 惠共生關(guān)系，例如綠僵菌提高番茄的株高、根長和生物量，（Garcia et al.2011)，促進柳枝 稷和扁豆根生長發(fā)育（Sasan&Bidochka2012)，提高大豆的抗鹽特性Khan et al. (2012);白 僵菌在小麥植株中定植，促進了小麥植株的生長(Sanchez et al. 2012)。這些控制植物蟲 害或病害的生防真菌自身種群的大量繁殖并不在植物內(nèi)，而是在相應(yīng)的寄主蟲體中。它們 在植物中宿存的生物學(xué)意義深受關(guān)注，已成為近年研究熱點。
[0003] 不像植物病害菌侵入植物后會大量繁殖，殺蟲真菌在植物中通常只有少量存在， 發(fā)現(xiàn)和檢測植物內(nèi)生的殺蟲真菌需要一定的技術(shù)方法。目前檢測植物內(nèi)生菌主要采用選擇 分離培養(yǎng)法，即用選擇性培養(yǎng)基分離到植物內(nèi)生菌群，在單菌落培養(yǎng)，通過鑒別菌落形態(tài)和 產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)的顯微形態(tài)來鑒定類別（Wyrebeket et al.，2011;Garciaet al.，2011;Dober& Tribe，1980)。這種方法需要有選擇性好的培養(yǎng)基，適用于可在培養(yǎng)基上正常生長的、在植 物中存活數(shù)量較大的類群，其檢測的靈敏度較低，像殺蟲真菌這些存活量較少的種類極易 在分離中被遺漏掉。為了確證殺蟲真菌的內(nèi)生性，研究者將供試殺蟲菌株加上易于檢測的 人工標記，如同位素或熒光蛋白等，然后通過人工接種植物共培養(yǎng)后，檢測植物中是否存在 殺蟲真菌的人工標記。應(yīng)用同位素標記證明了綠僵菌的植物內(nèi)生性，并且發(fā)現(xiàn)它通過侵染 地下害蟲轉(zhuǎn)而進入植株體內(nèi)，將蟲體有機氮源傳遞到植株根內(nèi)，是氮營養(yǎng)素在昆蟲與植株 之間的橋梁(Behieet al. 2012)。通過基因工程技術(shù)將綠色熒光蛋白基因 gfp轉(zhuǎn)入殺蟲真菌 綠僵菌中表達GFP蛋白，然后用帶gfp標記的菌株接種柳枝稷和扁豆，共培養(yǎng)后在熒光顯微 鏡下觀察到兩種植物根中內(nèi)生定植的綠僵菌菌絲，證明綠僵菌是一種內(nèi)生菌并能促進植物 生的生長(Sasan&Bidochka2012)。然而，同位素或焚光蛋白標記方法需要特殊的檢測儀器 和環(huán)境，檢測過程也較為繁瑣。先標記后檢測的方法，顯然不適用于對自然狀況下植株的檢 測，因為預(yù)期的內(nèi)生殺蟲真菌并沒有可見的人工標記。對于目標菌株的檢測，預(yù)先人工加入 DNA分子標記，在進行改菌株的各類生物學(xué)研究時，再通過PCR檢測可確定目標菌株的存在。
[0004] 因此，建立綠僵菌特異性標記及其在植物內(nèi)生性的檢測方法，對推動綠僵菌功能 多樣性研究和建立植保生物防治綜合評價有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了檢測確定綠僵菌(Metarhizium anisopliae)的植物內(nèi)生性，本發(fā)明的目的是 提供檢測綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物。
[0006] 根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案，分別提取了綠僵菌DNA和其他種類真菌DNA，包括白僵菌 (Beauveria bas si ana )、構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans) lSi(Fusarium oxysporum)、青霉（Penicillium sp·)、毛霉（Mucor sp ·)、單頂抱(Monacrosporium sp.)及 幾種未鑒定的土壤分離真菌，引物FI ( 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC)，R1 ( 5 ' -GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT)能夠獨特地從綠僵菌DNA中擴增出清晰的目的片段，而其它 種類真菌DNA均沒有擴增片段，因而確定引物F1/R1可作為鑒別綠僵菌、區(qū)分其他種類真菌 的特異性PCR擴增引物，擴增得到綠僵菌的特異性片段，（序列如SEQ ID No.1所示）。
[0007] GGAGGGATCATTACCGAGTTATCCAACTCCCAACCCCTGTGAATTATACCTTTAATTGTTGCTTCGGCG GGACTTCGCGCCCGCCGGGGACCCAAACCTTCTGAATTTTTTAATAAGTATCTTCTGAGTGGTTAAAAAAAAATGAA TCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATT GCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGTCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGC GTCATTACGCCCCTCAAGTCCCCTGCGGACTTGGTGTTGGGGATCGGCGAGGCTGGTTTTCCAGCACAGCCGTCCCT TAAATTAATTGGCGGTCTCGCCGTGGCCCTCCTCTGCGCAGTAGTAAAGCACTCGCAACGGGAGCCCGGCGCGGTCC ACTGCCGTAAAACCCCCAACTTTTTATAGTTGACCTCGAATCAGGTAGGACT
[0008] 引物F1/R1進行PCR檢測的靈敏度，當綠僵菌在植物中內(nèi)生宿存，通過PCR檢測其 DNA是混合的，而且是小量綠僵菌DNA混合于大量植物DNA中。試驗分別提取了綠僵菌DNA和 花生根DNA，將綠僵菌DNA與花生DNA按 1:500、1:1000、1:1500、1: 2000、1: 2500、1: 3000、1: 3500比例混合，以上述1中的引物F1/R1進行PCR擴增，擴增重復(fù)3次，結(jié)果顯示在1:500-2500 比例下能夠擴做到目的片段，即檢測的靈敏度達到1:2500。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的【具體實施方式】，以引物F1/R1PCR檢測綠僵菌的植物內(nèi)生性。在花生 播種后的7d時，將綠僵菌孢子懸浮液澆淋在幼苗根莖周圍，同時設(shè)澆淋清水為對照。分別在 花生生長15(1、30(1、45(1、60(1、75(1、90(1時取樣。提取各個時間段的花生根樣本0嫩，分別以上 述1中的引物F1/R1進行PCR擴增，重復(fù)樣本3次，結(jié)果顯示在60d、75d、90d的根樣中檢測到目 的片段，而之前的15d、30d、45d樣本和對照樣本均沒有擴增出相應(yīng)片段，從而證明了綠僵菌 在花生根的宿存內(nèi)生，而且在60d后達到可監(jiān)測的量級。
【附圖說明】
[0010]圖1用引物F1/R1進行PCR檢測區(qū)分綠僵菌與其他真菌的電泳圖譜，泳道順序：1綠 僵菌防地下害蟲菌株MBJQH2-2;2-12不同地理或寄主來源的綠僵菌菌株；13-15購買引進的 綠僵菌菌株；16空白對照；17-21的非綠僵菌其他種類真菌菌株;22-24:田間土壤分離后鑒 定的綠僵菌菌株;25-31田間土壤分離后鑒定的非綠僵菌其他種類真菌菌株;32空白對照;Μ marker；
[0011]圖2用F1/R1引物PCR檢測花生根中綠僵菌的內(nèi)生性的電泳圖譜，泳道順序：1和2為 MBJQH2-2處理75d和90d根樣；3和4位Ma9處理75d和90d根樣；5位對照根樣;Μ為marker;
[0012] 圖3用F1/R1引物PCR檢測玉米根中綠僵菌的內(nèi)生性的電泳圖譜，左圖F1/R1PCR泳 道順序：1為marker; 2為無模板清水對照;3為對照根樣;4為MBJQH2-2處理根樣;5為gpd-ben 標記的M2-2-44044菌株處理根樣。
【具體實施方式】
[0013] 實施例1用特異性引物F1/R1的PCR檢測區(qū)分綠僵菌與其他真菌
[0014]實驗菌株共30個，分別為不同地理、寄主來源的綠僵菌菌株12個、購買引進的綠僵 菌菌株3個、已知的其他種類真菌菌株5個、從花生試驗地土壤分離純化后鑒定為綠僵菌的 菌株3個和鑒定為其他種類真菌菌株7個(表1)。分別接種培養(yǎng)各菌株，收集菌絲體，按照 Fungi DNA Extraction Kit說明書操作提取DNA。以引物F1/R1進行PCR擴增，PCR條件為:反 應(yīng)體系總體積50yL，含lOXEx Taq Buffer 5yL、5U/yL Ex Taq 0.25yL、2.5mmol/L dNTP Mixture 4yL、10ymol/L的FI和R1 各lyL、DNA模板lyL，超純水37.75yL。反應(yīng)程序為：94°C 3min-94°C15sec，59°C10sec，72°C10sec，45 個循環(huán)-72°C 延伸 lOmin。反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊 脂糖電泳，得到電泳圖譜（圖1)。結(jié)果顯示，所有18個綠僵菌中均能夠擴增到特異性片段，而 12個非綠僵菌的其他種類真菌菌株均沒有該擴增片段。因此證明，本發(fā)明的F1/R1引物及 PCR條件具有區(qū)分綠僵菌與其他真菌的優(yōu)良特異性。
[0015] 表1試驗菌株名錄
[0016]
[0017]
[0018] 實施例2用F1/R1引物PCR檢測花生根中綠僵菌的內(nèi)生性
[0019]設(shè)置2個綠僵菌菌株接種花生的實驗。在PDA培養(yǎng)基上，分別接種綠僵菌菌株 MBJQH2-2和Ma9菌株，25°C培養(yǎng)15d，獲得的分生孢子粉。配制孢子懸浮液，調(diào)整濃度為1 X 107孢子/ml。播種花生時，在種穴內(nèi)澆淋100ml孢子液。以澆淋清水為不接種對照。按一致條 件下常規(guī)管理種植，于播種后第75d和90d收取花生根檢測。方法步驟如下：
[0020] 1)清洗花生根，吸干表面水分，保存于-20°C備用。2) DNA提取。3) PCR檢測。①合成 引物F1 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC和引物R1 5 ' -GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT;②配 制 PCR 反應(yīng)體系；③運行程序 941€3111丨114941€2〇86(3,571€2〇86(3,72 1€2586(3,40個循環(huán)472 °C 1 Omin。④電泳分離鑒定:將PCR反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖電泳，得到電泳圖譜。
[0021] 結(jié)果見圖2,可見接種了綠僵菌M2-2或Ma9菌株的花生根DNA可擴增出預(yù)期的綠僵 菌特征條帶，而對照花生根沒有擴增到相應(yīng)的條帶，證明了引物F1/R1-PCR是檢測綠僵菌在 花生內(nèi)生的有效方法。
[0022]實施例3用F1/R1引物PCR檢測玉米根中綠僵菌的內(nèi)生性
[0023] 設(shè)置gpd-ben標記的綠僵菌菌株M2-2-44044和原始菌株菌株MBJQH2-2接種玉米的 實驗。在Η)Α培養(yǎng)基上，分別接種綠僵菌菌株M2-2-44044和MBJQH2-2，25°C培養(yǎng)15d，獲得的 分生孢子粉。配制孢子懸浮液，調(diào)整濃度為IX 1〇7孢子/ml。在玉米播種后第4d，將100ml孢 子液澆淋到幼苗基部周圍。以澆淋清水為不接種對照。按一致條件下常規(guī)管理種植，于施菌 后第28d收取玉米根檢測。
[0024]方法步驟如下：1)清洗玉米根，吸干表面水分，保存于-20°C備用。2)DNA提取。3) pcr 檢測，合成弓丨物 fus'-ggggtagtcagtattctggcgggckrus'-ggggttccacggcgagaccgccaat) ; 配制 PCR 反應(yīng)體系 。運行 PCR 程序 ，將 PCR 反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1. 2 % 瓊 脂糖電泳，得到電泳圖譜。
[0025] 結(jié)果見圖3,可見接種了帶gpd-ben標記的綠僵菌M2-2-44044菌株的玉米根DNA用 F1/R1和F2/R2引物均能擴增出預(yù)期的綠僵菌特征條帶，而接種原始菌株MBJQH2-2的根樣只 能用F1/R1引物，而對照根樣用F1/R1引物均沒有擴增到相應(yīng)的條帶，證明了 F1/R1引物能有 效檢測綠僵菌物種在玉米種的內(nèi)生性，而F2/R2引物能夠針對特定gpd-ben標記的菌株檢測 其植物內(nèi)生性。
【主權(quán)項】
1. 檢測綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的特異性引物，其特征在于，所述特異性引物的序列 為： 引物Fl: 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC; Rl：5'-GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT 〇2. 特異性檢測綠僵菌在植物根中內(nèi)生性的方法，其特征在于，所述方法包括使用以下 引物進行檢測的步驟， 引物Fl: 5 ' -GGGGTAGTCAGTATTCTGGCGGGC; Rl：5'-GGGGTTCCACGGCGAGACCGCCAAT 〇
【文檔編號】C12R1/645GK105907872SQ201610395664
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年6月6日
【發(fā)明人】農(nóng)向群, 劉少芳, 王廣君, 李興佳, 曹廣春, 張澤華
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護研究所