鑒定結球葉用萵苣品種的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種鑒定結球葉用萵苣品種的方法，采用SSR分子標記法對結球葉用萵苣進行品種鑒定，SSR分子標記法在結球葉用萵苣多態(tài)性研究中，其專用引物如下：SML026；SML022；SML021；SML015；SML013；SML002；SML001；SH86；SH66；SH49；SH43；SH42；KSL271；KSL173；KSL123；KSL115；KSL97；KSL92；KSL87；KSL51；KSL32；KSL26。用上述專用引物獲取結球葉用萵苣SSR指紋圖譜和待鑒定品種的指紋，將待測品種的指紋與所述的SSR指紋圖譜進行對比，獲得鑒定結果。能方便、準確的鑒定結球葉用萵苣品種。
【專利說明】
鑒定結球葉用萵苣品種的方法
技術領域
[0001] 本發(fā)明涉及一種鑒定結球葉用萵苣品種技術，尤其涉及一種鑒定結球葉用萵苣品 種的方法。
【背景技術】
[0002] 目前，我國國家蔬菜種質(zhì)資源庫收集和保存結球葉用萵苣種質(zhì)資源200余份，但目 前生產(chǎn)上使用的栽培品種多數(shù)引自國外。結球葉用萵苣是一種低投入、高收益、營養(yǎng)價值豐 富的速生蔬菜，近年來栽培面積迅速擴大，逐漸成為人們食用的首選綠葉蔬菜之一。但是， 我國結球葉用萵苣的栽培品種主要靠引進國外已有品種，具有自主知識產(chǎn)權的品種和類型 很有限，并且在品種資源搜集、鑒定上幾乎是空白。因此，需要多角度、多方法開展種質(zhì)資源 的創(chuàng)新工作，開發(fā)出品質(zhì)優(yōu)良的結球葉用萵苣新品種，來滿足當前生產(chǎn)的需要。種質(zhì)資源是 蔬菜遺傳育種和品種改良的基本材料，種質(zhì)資源的鑒定和篩選是培育和改良優(yōu)異品種的一 項基礎工作。由于不同地區(qū)之間頻繁引種，使得品種名稱十分混亂，同物異名和同名異物的 現(xiàn)象非常普遍。所以，利用SSR指紋圖譜技術鑒定結球葉用萵苣品種很有必要。
[0003] 現(xiàn)階段，對于蔬菜的種質(zhì)資源鑒定，大多用的基于PCR技術的DNA標記技術，可綜合 為三大類：一是以分子雜交為基礎的標記技術，主要是RFLP( Restrict ion Fragment Length Polymorphism)及VNTR(Variable number tandem repeat);二是以PCR為基礎的標 記技術，如RAroWandom Amplified Polymorphic DNA)、SCAR(Sequence Characterized Amplified Regions)、STS(Sequence Tagged Site)、SSR(Simple Sequence Repeat)、ISSR (Inter-Simple Sequence Repeat)nDAF(DNA Amplified Fingerprinting)^.ERPAR(Ex-tended Random Primer Amplified Regions)等；三是酶切和PCR相結合的標記技術，主要 有AFLP(Amplified ragment Length Polymorphism)和CAPS(Cleaved Amplified Polymorphic Sequence)。此外，還有一類新近發(fā)展起來的基于單個核苷酸多態(tài)性的DNA標 記，即SNP(Simple Nucleotide Polymorphism)。隨著逆轉(zhuǎn)座子研究，一項基于反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座 子的植物分子標記技術一RTN技術得到了很大的發(fā)展，主要有SSAP( Sequence-1 Variation Polymorphism)、RIAP(Inverse Retrotransposon Amplified Polymorphism)、RBIP (Retrotransposon based Insertion Polymorphism)等5種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種使用方便、結果準確的鑒定結球葉用萵苣品種的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術方案實現(xiàn)的：
[0006] 本發(fā)明的鑒定結球葉用萵苣品種的方法，采用SSR分子標記法對結球葉用萵苣進 行品種鑒定，所述的SSR分子標記法在結球葉用萵苣多態(tài)性研究中，其專用引物如下：
[0007] (1)SML026
[0008] (2)SML022
[0009] (3)SML021
[0010] (4)SML015
[0011] (5)SML013
[0012] (6)SML002
[0013] (7)SML001
[0014] (8)SH86
[0015] (9)SH66
[0016] (l〇)SH49
[0017] (11)SH43
[0018] (12)SH42
[0019] (13)KSL271
[0020] (14)KSL173
[0021] (15)KSL123
[0022] (16)KSL115
[0023] (17)KSL97
[0024] (18)KSL92
[0025] (19)KSL87
[0026] (20)KSL51
[0027] (21)KSL32
[0028] (22)KSL26
[0029] 用所述專用引物獲取結球葉用萵苣SSR指紋圖譜，并用所述專用引物獲取待鑒定 品種的指紋，將待測品種的指紋與所述的SSR指紋圖譜進行對比，獲得鑒定結果。
[0030] 由上述本發(fā)明提供的技術方案可以看出，本發(fā)明實施例提供的鑒定結球葉用萵苣 品種的方法，能方便、準確的鑒定結球葉用萵苣品種。
【具體實施方式】
[0031 ]下面將對本發(fā)明實施例作進一步地詳細描述。
[0032] 本發(fā)明的鑒定結球葉用萵苣品種的方法，其較佳的【具體實施方式】是：
[0033] 采用SSR分子標記法對結球葉用萵苣進行品種鑒定，所述的SSR分子標記法在結球 葉用萵苣多態(tài)性研究中，其專用引物如下：
[0034] (1)SML026
[0035] (2)SML022
[0036] (3)SML021
[0037] (4)SML015
[0038] (5)SML013
[0039] (6)SML002
[0040] (7)SML001
[0041] (8)SH86
[0042] (9)SH66
[0043] (l〇)SH49
[0044] (11)SH43
[0045] (12)SH42
[0046] (13)KSL271
[0047] (14)KSL173
[0048] (15)KSL123
[0049] (16)KSL115
[0050] (17)KSL97
[0051 ] (18)KSL92
[0052] (19)KSL87
[0053] (20)KSL51
[0054] (21)KSL32
[0055] (22)KSL26
[0056] 用所述專用引物獲取結球葉用萵苣SSR指紋圖譜，并用所述專用引物獲取待鑒定 品種的指紋，將待測品種的指紋與所述的SSR指紋圖譜進行對比，獲得鑒定結果。
[0057]通過以下方法獲取結球葉用萵苣SSR指紋圖譜，包括以下步驟：
[0058] A、以葉用萵苣的基因組DNA為模板，用所述專用引物進行PCR擴增；
[0059] B、將步驟A中得到的擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳，分別記錄品種中SSR片段的長度；
[0060] C、按照電泳的峰值圖讀數(shù)，有峰記為1，無峰記為0,根據(jù)(0，1)數(shù)據(jù)矩陣，構建SSR 指紋圖譜。
[0061] 應用于品種鑒定時，將待鑒定品種的DNA用所述專用引物經(jīng)PCR產(chǎn)物擴增，將產(chǎn)物 對應的條帶填寫入相應的（〇，1)標記表中得出待測品種的指紋，而后將待測品種的指紋與 上述的SSR指紋圖譜進行對比，直接獲得鑒定結果。
[0062] 具體實施例：
[0063]實例1、用SSR分子標記法建立結球葉用萵苣指紋圖譜。
[0064]操作流程為：制備模板DNA-DNA擴增4毛細管電泳4統(tǒng)計分析結果。具體方法和 過程如下：
[0065] 1、使用改良的CTAB法提取的葉用萵苣基因組DNA:
[0066]提取的基因組DNA經(jīng)Eppendorf Biophotometer測定OD26Q/OD28Q值在 1 ·7-1 ·9范圍 內(nèi)。將DNA提取液稀釋成lOOng/μΙ，取3μ1 DNA樣品加入ΙμL loading buffer稀釋液，在1% 的瓊脂糖凝膠上檢測，穩(wěn)壓4V/cm，電泳45min。電泳結果顯示，DNA主帶清晰，無降解現(xiàn)象， RNA去除干凈，可以作為模板。
[0067] 2、SSR引物的設計和篩選：
[0068] 在SSR分子標記實驗中，不同引物組合對某一特定基因組的擴增效率是不同的。弓丨 物擴增效率的高低由它產(chǎn)生的多態(tài)性條帶數(shù)決定。本實例對109對引物組合進行分別進行 擴增，從中篩選出了22對譜帶分布均勻，條帶豐富，多態(tài)性較高且譜帶質(zhì)量較好的引物組 合，可用于提供樣品種質(zhì)資源遺傳多樣性研究。這十一對引物如下：
[0069] 引物對 1: SML026 ;GGGTTCTCATTGGCTGACAT/TGTCTTCCAACCAAAACATACA(GAA)ii
[0070] 引物對 2: SML022 ;GGGCCTCAAATCCTCTCTG/TGTTCTTCCCCTCTTTGGAA(ATC)i3 [0071 ]引物對 3: SML021; TTGGGAGAATTTTCATTTCCA/AGTCATCTTTTTCACCCCACA(TA)8
[0072] 引物對 4: SML015; TTGAGGAGGGCATTTACGTC/GAGGCGTATCTCCAAGGTGT(TGTTA)i6
[0073] 引物對5: SMLO13; TCCCATGATGGAGAGACTCA/CCCAAAAGGGAATAGCAACC(GAA) i4 (CTG) 5
[0074] 引物對 6: SML002 ;GTGATTGCATGCCAAATGAA/TTAGTAGCCCGCATGCTTTT(TTC)i7
[0075] 引物對 7: SML001; ccatggatcctgtgtgaaga/caccatgttccacttccactt(catgat)6
[0076] 引物對 8: SH86 ;GTCTGTGTGGITTTGGT/TGTGGTGGAGTGTGATTT(CT)2〇
[0077] 引物對 9: SH66 ;GGTAGGGCAGTCAAGCAAGA/AATGATGAITTTGCCCTTGG(TC)28
[0078] 引物對10: SH49 ;GGAGATTGAGAGGAAAA/GAGTGGAAGGGAAATAG(AG)25
[0079] 引物對11: SH43; CTCTCGTTCCTTTTGTTGGTTT/TGGTAGTGGCTTCCTTGCTATT(AC)i〇
[0080] 引物對12: SH42 ;GCAAGCTAAAGGGCTTTTTGT/CAGCCTGGGAATATTTACTCTGA(ATT)27 [0081 ]引物對13 :KSL271; ACAAAGGCAAGATTGGGTCA/GCGGATATGCAGCCATAACA(ATG)i2
[0082] 引物對 14:KSL173; ATAGTCACGACTCACGCCCA/CCATTTTCCTCTTTCTGCGA (CT) i4
[0083] 引物對 15: KSL123; ATTGTAACTTCTGCGGGCCT/GCCTCACATGTTCTTCCCCT (ATC) i3
[0084] 引物對 16: KSL115; CATTGCACTCCGTCATCTCC/GGGTTGATTCCGAAAGTTCC (CT) 11
[0085] 引物對 17 :KSL97; CGCAGAAAAGGGATCAGACA/TCAGAGACACTGCAAAAGGGA(CT)ii
[0086] 引物對 18: KSL92; GGTCTCTTTCCTCTGCCCTG/TCGCGTTCTGAAGTAGCCAT (CT) 2〇
[0087] 引物對 19: KSL87; GCGGGATCGATACTTACCCT/ATCATCGACGGGCTTTTCTT (CT) π
[0088] 引物對 20 :KSL51; CCCCTACCACCACCAAAGTC/TACCAAATGACATGCACCCC(ATG)i〇
[0089] 引物對21 :KSL32; CGGGGAGCATTTAGTGTGTG/AATTTGGGGTCCGATTTGAG(CT)i4
[0090] 引物對22: KSL26; GGGCTTTCTCTCCTTTCCTTT/AATTTGGATCCTGTCGAGGG (TC) 16
[0091] 3、DNA的擴增，如下表1:
[0092]
[0093] 94°C 預變性 5min;94°C 變性 30sec，58°C 退火 30sec，72°C 延伸 45sec，循環(huán) 38次；最 后72 °C延伸1 Omin。4 °C保溫待用。
[0094] 表2.SSR擴增統(tǒng)計結果：
[0095]
[0096] 4.獲取結球葉用萵苣的指紋圖譜：
[0097] 根據(jù)擴增帶的強弱，以及清晰度確定遺傳變異的帶，淘汰假象帶。在電泳圖譜中進 行比較，確定單態(tài)帶和多態(tài)帶。選取電泳平板上清晰可辨的電泳條帶，以"Γ和"0"分別記錄 條帶的有無，在同一迀移距離上有帶賦值"Γ，無帶賦值"0"。
[0098] 實例2、結球葉用萵苣的SSR指紋圖譜分析與應用：
[0099] 根據(jù)22對引物的擴增結果，用(0，1)法繪制得出結球葉用萵苣的指紋圖譜，如表3:
[0100] 表3:結球葉用萵苣的指紋圖譜(部分）
[0101]
[0102] 應用于品種鑒定時，將待鑒定品種的DNA，用22對引物經(jīng)PCR產(chǎn)物擴增，將產(chǎn)物對應 的條帶填寫入相應的（〇，1)標記表中得出待測品種的指紋，而后將待測品種的指紋與上述 的指紋圖譜(表3)進行對比，可直接獲得鑒定結果。
[0103] 如某一品種經(jīng)上述流程得出指紋為：
[0104] 010001000010010000100010000000100010000000001000000000000000100101000 0001000001010000010000100000000100001000001000000000100001000000100000
[0105] 將此指紋與表3提供的指紋對比，則可知此品種為GJ-31。
[0106] 以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實施方式】，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此， 任何熟悉本技術領域的技術人員在本發(fā)明披露的技術范圍內(nèi)，可輕易想到的變化或替換， 都應涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。因此，本發(fā)明的保護范圍應該以權利要求書的保護范 圍為準。
【主權項】
1. 一種鑒定結球葉用萵苣品種的方法，其特征在于，采用SSR分子標記法對結球葉用萵 苣進行品種鑒定，所述的SSR分子標記法在結球葉用萵苣多態(tài)性研究中，其專用引物如下： (DSML026 (2) SML022 (3) SML021 ⑷SML015 (5) SML013 (6) SML002 (7) SMLOOl (8) SH86 (9) SH66 (10) SH49 (11) SH43 (12) SH42 (13) KSL271 (14) KSL173 (15) KSL123 (16) KSL115 (17) KSL97 (18) KSL92 (19) KSL87 (20) KSL51 (21) KSL32 (22) KSL26 用所述專用引物獲取結球葉用萵苣SSR指紋圖譜，并用所述專用引物獲取待鑒定品種 的指紋，將待測品種的指紋與所述的SSR指紋圖譜進行對比，獲得鑒定結果。2. 根據(jù)權利要求1所述的鑒定結球葉用萵苣品種的方法，其特征在于，通過以下方法獲 取結球葉用萵苣SSR指紋圖譜，包括以下步驟： A、 以葉用萵苣的基因組DNA為模板，用所述專用引物進行PCR擴增； B、 將步驟A中得到的擴增產(chǎn)物進行毛細管電泳，分別記錄品種中SSR片段的長度； C、 按照電泳的峰值圖讀數(shù)，有峰記為1，無峰記為0,根據(jù)(0，1)數(shù)據(jù)矩陣，構建SSR指紋 圖譜。3. 根據(jù)權利要求2所述的鑒定結球葉用萵苣品種的方法，其特征在于，應用于品種鑒定 時，將待鑒定品種的DNA用所述專用引物經(jīng)PCR產(chǎn)物擴增，將產(chǎn)物對應的條帶填寫入相應的 (〇，1)標記表中得出待測品種的指紋，而后將待測品種的指紋與上述的SSR指紋圖譜進行對 比，直接獲得鑒定結果。
【文檔編號】C12Q1/68GK105907866SQ201610348755
【公開日】2016年8月31日
【申請日】2016年5月24日
【發(fā)明人】范雙喜, 張鵬航, 韓瑩琰, 羅江, 高琦, 劉超杰, 谷建田
【申請人】北京農(nóng)學院