一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因Rps1b毒性的分子方法
【專利摘要】一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因Rps1b毒性的分子方法，包括以下步驟：將待檢測(cè)大豆疫霉菌接種于大豆葉片上，12小時(shí)后提取待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA；以提取的總RNA為模版進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA反應(yīng)液；采用毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R，以所得cDNA反應(yīng)液為模版進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，如果在實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增過程中能夠檢測(cè)到無毒基因Avr1b?1的轉(zhuǎn)錄，則對(duì)應(yīng)的待檢測(cè)大豆疫霉菌為無毒菌株，否則為毒性菌株。本發(fā)明能夠快速準(zhǔn)確的測(cè)定出待檢測(cè)大豆疫霉菌對(duì)抗病基因Rps1b的毒性，并為大量、快速和準(zhǔn)確鑒定大豆疫霉菌的生理小種或致病型提供有力支持。
【專利說明】
_種測(cè)定大S·疫霉菌對(duì)抗病基因 Rps1 b毒性的分子方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001 ] 本發(fā)明涉及一種分子測(cè)定方法，尤其涉及一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因 Rpslb 毒性的分子方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大豆疫霉菌是一種大豆上的重要病原菌，屬于茸鞭生物界卵菌門卵菌綱霜霉目腐 霉科疫霉屬，該菌能夠侵染大豆引起大豆苗期的猝倒和成株期的根腐，稱為大豆疫霉根腐 病。利用抗病品種、藥劑拌種和土壤排水3種方法是控制大豆疫霉根腐病病害的發(fā)生的有效 措施，其中利用抗病品種防治該病害是最重要也是最基本的一種方法，而監(jiān)測(cè)大豆疫霉菌 的毒力結(jié)構(gòu)或小種組成是有效利用抗病品種進(jìn)行防治的關(guān)鍵。大豆疫霉菌生理小種的測(cè)定 通常采用國際通用的鑒別寄主通過下胚軸創(chuàng)傷接種法來進(jìn)行。目前，已鑒定并命名55個(gè)生 理小種，但更多的未被命名的新生理小種不斷出現(xiàn)，使監(jiān)測(cè)大豆疫霉菌群體的生理小種組 成變化顯得尤為重要。
[0003] 目前大豆疫霉菌對(duì)抗病基因的毒性主要采用下胚軸創(chuàng)傷接種法來進(jìn)行測(cè)定。這種 生物測(cè)定方法簡(jiǎn)單易行，但也存在著一些缺點(diǎn)，首先是這種方法需要使用大量的鑒別寄主 大豆種子，因此鑒別寄主大豆每年都必須進(jìn)行大量的擴(kuò)繁;其次是需要一個(gè)能夠嚴(yán)格控制 溫度、濕度和光照的溫室，如果實(shí)驗(yàn)條件控制不嚴(yán)將會(huì)導(dǎo)致鑒別寄主大豆抗感反應(yīng)不清楚 而出現(xiàn)大量的中間類型，甚至出現(xiàn)錯(cuò)誤的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；另外，生物測(cè)定方法的實(shí)驗(yàn)周期較長， 從種植鑒別寄主、接種大豆疫霉菌到出現(xiàn)清晰的抗感反應(yīng)，一個(gè)實(shí)驗(yàn)流程完成需要約2周時(shí) 間，如果大量出現(xiàn)中間類型，還需要不斷的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，則需要更長的時(shí)間。
[0004] 2006年大豆疫霉菌的全基因組測(cè)序工作圓滿完成，這大大促進(jìn)了大豆疫霉菌無毒 基因的定位和克隆。目前已有Avrlb-1、Avrla、Avr3a、Avr3c、Avr4/6、Avr3b、Avrlk^PAv;rld 等8個(gè)無毒基因被克隆出來，這些無毒基因的克隆為采用分子生物學(xué)的方法來鑒定大豆疫 霉菌的生理小種提供了可能。研究發(fā)現(xiàn)，病原菌的無毒基因在抗病基因的選擇壓力下可以 通過不轉(zhuǎn)錄無毒基因的方式來逃避抗病基因的識(shí)別，從而成功侵染宿主植物。Avrlb-Ι是大 豆疫霉菌中克隆出來的第一個(gè)無毒基因，該基因在中國群體中的序列多態(tài)性和轉(zhuǎn)錄情況已 被詳細(xì)研究，序列多態(tài)性研究共發(fā)現(xiàn)4種不同類型的序列和1種片段替換的情況，轉(zhuǎn)錄分析 顯示:在侵染過程中不轉(zhuǎn)錄無毒基因 Avrlb-Ι的菌株均為毒性菌株;在侵染過程中轉(zhuǎn)錄無毒 基因 Avrlb-Ι的菌株中，僅有無毒基因 Avrlb-Ι堿基序列為第Π 種類型的菌株為毒性菌株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因 Rpslb毒性的分子方法， 該方法能夠快速準(zhǔn)確的測(cè)定出待檢測(cè)大豆疫霉菌對(duì)抗病基因 Rps lb的毒性，并為大量、快速 和準(zhǔn)確鑒定大豆疫霉菌的生理小種或致病型提供有力支持。
[0006] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病 基因 Rpslb毒性的分子方法，包括以下步驟:將待檢測(cè)大豆疫霉菌接種于大豆葉片，12小時(shí) 后提取待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA;以提取的總RNA為模版進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到cDNA反應(yīng)液;采 用毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/AVR1BR2R，以所得cDNA反應(yīng)液為模版進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，如 果在實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增過程中能夠檢測(cè)到無毒基因 Avrlb-Ι的轉(zhuǎn)錄，則對(duì)應(yīng)的待檢測(cè)大 豆疫霉菌為無毒菌株，否則為毒性菌株;所述毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/AVR1BR2R的核苷酸序 列如下： AVR1BR2F: 5z-GAGCTCATGAAGAGGACGAT-3z (如序列表中的序列 1); AVR1BR2R: 5 z-TCTTATCCAGGCTGTACCCC-3 z (如序列表中的序列2)。
[0007] 進(jìn)一步地，所述提取待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA的步驟為:將待檢測(cè)大豆疫霉菌在 10%V8液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天；用滅菌雙層紗布過濾收集培養(yǎng)5天的大豆疫霉菌絲體，用蒸 餾水沖洗3次后緊貼在大豆葉片的正反面，保濕培養(yǎng)12h，然后用濾紙吸干水份放入研缽中 加液氮研碎，采用總RNA提取試劑盒提取待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA;所述的10 % V8液體培 養(yǎng)基通過以下方式制得:在每100mL用紗布過濾后的V8蔬菜汁中加入0.2g碳酸鈣，加蒸餾水 補(bǔ)足至lOOOmL，分裝在三角瓶中，121°C滅菌20min。
[0008] 進(jìn)一步地，所述逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系及操作程序?yàn)?在PCR管中加入提取的總RNA2y 1，逆轉(zhuǎn)錄引物01ig〇dT( 18) ΙμL，濃度為10mmol/L的dNTP ΙμL，重蒸水8μ1，通過離心使總 RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物01igodT(18)、dNTP和重蒸水充分混勻，65°C加熱5min后冰置5min;繼續(xù)向 PCR管中加入5XFirst Strand Buffer 4yl，0.1mol/L的二硫蘇糖醇2yl，RNA酶抑制劑ΙμL， 混勻后37°C反應(yīng)2min，迅速加入ΙμL逆轉(zhuǎn)錄酶在50°C條件下反應(yīng)50min;最后在70°C加熱 5min終止反應(yīng);冷卻后得到cDNA反應(yīng)液，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0009] 進(jìn)一步地，以大豆疫霉菌的ActinA為內(nèi)標(biāo)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，內(nèi)標(biāo)基因特 異性引物ACTAF/ACTAR的核苷酸序列分別為： ACTAF: 5 z -ACTGCACCTTCCAGACCATC-3 z (如序列表中的序列 3) ACTAR: 5 z-CCACCACCTTGATCTTCATG-3 z (如序列表中的序列4)。
[0010] 進(jìn)一步地，所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系和條件為： 反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)混合液1 OyL，1 Ομπιο 1 /L毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/AVR1BR2R各0.4yL， cDNA反應(yīng)液2yL，雙蒸餾水7 · 2yL; 反應(yīng)條件:95 °C預(yù)熱2min;然后95 °C變性15s，60 °C退火30s，40個(gè)循環(huán)。
[0011]檢測(cè)原理及有益效果： 在侵染過程中不能正常轉(zhuǎn)錄無毒基因 Avrlb-Ι的菌株，經(jīng)提取侵染過程中的待檢測(cè)大 豆疫霉菌的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，得到的cDNA反應(yīng)液中必然不含無毒基因 Avrlb-Ι，因此在后續(xù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR過程中也檢測(cè)不到無毒基因 Avrlb-Ι的轉(zhuǎn)錄;在侵染過程中能正常轉(zhuǎn)錄無 毒基因 Avrlb-Ι的菌株，經(jīng)提取侵染過程中的待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA并逆轉(zhuǎn)錄，得到的 cDNA反應(yīng)液中必然含有無毒基因 Avrlb-Ι，采用毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/AVR1BR2R進(jìn)行實(shí)時(shí) 熒光定量PCR，毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/AVR1BR2R能夠與第I種和第IV種類型的無毒基因 Avrlb-Ι相結(jié)合而不能與第Π 種類型的無毒基因 Avrlb-Ι相結(jié)合，從而使攜帶第Π 種類型無 毒基因 Avrlb-Ι的菌株在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)不到無毒基因 Avrlb-Ι的轉(zhuǎn)錄;本發(fā)明通過 提取侵染過程中的待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等步驟，并根據(jù)實(shí) 時(shí)熒光定量PCR過程中能否檢測(cè)到無毒基因 Avrlb-Ι的轉(zhuǎn)錄來間接判斷大豆疫霉菌對(duì)抗病 基因 Rpslb的毒性，因此，本發(fā)明提供的分子方法僅需要少量的感病大豆，檢測(cè)時(shí)間較短(一 般5天左右即可完成），測(cè)定過程中不出現(xiàn)中間類型，從而避免進(jìn)行不斷的重復(fù)實(shí)驗(yàn)來消除 中間類型，而且具有很高的準(zhǔn)確性，適合大量、快速、準(zhǔn)確的大豆疫霉菌毒性測(cè)定。
【附圖說明】
[0012] 圖1是本發(fā)明涉及的四種類型無毒基因 Rpslb的核苷酸序列及特異性引物結(jié)合位 點(diǎn)示意圖；圖中四種類型無毒基因 Rpslb的核苷酸序列按I、n、m、IV依次對(duì)應(yīng)序列表中的 序列5、序列6、序列7、序列8;圖中的點(diǎn)表示與第I種序列對(duì)應(yīng)的核苷酸相同； 圖2是本發(fā)明具體實(shí)施例18株大豆疫霉菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果示意圖；橫坐標(biāo)表 示不同的菌株，縱坐標(biāo)表示相對(duì)表達(dá)量，其中將菌株P(guān)S0301對(duì)應(yīng)的表達(dá)量標(biāo)定為1; 圖3是本發(fā)明試驗(yàn)二6株大豆疫霉菌使用毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/AVR1BR2R進(jìn)行試驗(yàn)得 到的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果示意圖；橫坐標(biāo)表示不同菌株，縱坐標(biāo)表示相對(duì)表達(dá)量，其 中將菌株P(guān)S0702的表達(dá)量標(biāo)定為1;圖中A表示對(duì)應(yīng)的菌株為無毒菌株，V表示對(duì)應(yīng)的菌株為 毒性菌株； 圖4是是本發(fā)明試驗(yàn)二6株大豆疫霉菌使用通用轉(zhuǎn)錄分析引物AVR1BR1F/AVR1BR1R進(jìn)行 試驗(yàn)得到的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析結(jié)果示意圖；橫坐標(biāo)表示不同菌株，縱坐標(biāo)表示相對(duì)表達(dá) 量，其中將菌株P(guān)S0702的表達(dá)量標(biāo)定為1;圖中A表示對(duì)應(yīng)的菌株為無毒菌株，V表示對(duì)應(yīng)的 菌株為毒性菌株。
【具體實(shí)施方式】
[0013] 下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明。
[0014] 實(shí)施例 待檢測(cè)大豆疫霉菌:18株菌株(其菌株分離年份及堿基序列的類型如表1);這些菌株均 為采用大豆葉碟誘捕法從中國大豆田土壤中分離，然后經(jīng)過單孢分離進(jìn)行純化，轉(zhuǎn)接于 10 % V8斜面培養(yǎng)基上12 °C下保存的菌株;所述的10 % V8斜面培養(yǎng)基通過以下方式制得，在 每100mL用紗布過濾后的V8蔬菜汁中，加入0.2g碳酸鈣和15g瓊脂粉，加蒸餾水補(bǔ)足至 1000mL，加熱使瓊脂完全融化，然后分裝在三角瓶中，121°C滅菌20min; 一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因 Rpslb毒性的分子方法，分別對(duì)18株待檢測(cè)大豆疫霉 菌菌株進(jìn)行測(cè)定，具體測(cè)定方法包括以下步驟： 步驟一、提取待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA 將待檢測(cè)大豆疫霉菌在10%V8液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天;用滅菌雙層紗布過濾收集培養(yǎng)5 天的大豆疫霉菌絲體，用蒸餾水沖洗3次后緊貼在大豆葉片（大豆品種為Williams)的正反 面，保濕培養(yǎng)12h，然用濾紙吸干水份放入研缽中加液氮研碎，采用TRNzol總RNA提取試劑盒 提取待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA;所述的10%V8液體培養(yǎng)基通過以下方式制得:在每100mL 用紗布過濾后的V8蔬菜汁中加入0.2g碳酸鈣，加蒸餾水補(bǔ)足至1000mL，分裝在三角瓶中， 121°C 滅菌 20min; 步驟二、逆轉(zhuǎn)錄 在PCR管中加入提取的總RNA2yl，逆轉(zhuǎn)錄引物01igodT(18)lyl (逆轉(zhuǎn)錄引物OligodT (18)為逆轉(zhuǎn)錄PCR常用的市場(chǎng)常見的引物溶液），濃度為1 Ommo 1 /L的dNTP 1 μ 1，重蒸水8μ 1， 通過離心使總RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物01igodT(18)、dNTP和重蒸水充分混勻，65°C加熱5min后迅速 冰置5min;繼續(xù)向PCR管中加入5XFirst Strand Buffer 4yl，0.1mol/L的二硫蘇糖醇 (DTT)2yl，RNA酶抑制劑(RNasin)lyl，混勻后37°C反應(yīng)2min，迅速加入ΙμL逆轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV) 在50 °C條件下反應(yīng)50min;最后在70 °C加熱5min終止反應(yīng);冷卻后得到cDNA反應(yīng)液，置于-20 °C保存?zhèn)溆?；OligodT 18、5XFirst Strand Buffer和二硫蘇糖醇均購自上海索萊寶生物 科技有限公司，dNTP和RNA酶抑制劑購自寶生物工程(大連)有限公司； 步驟三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 以大豆疫霉菌的ActinA為內(nèi)標(biāo)基因，內(nèi)標(biāo)基因引物ACTAF/ACTAR的核苷酸序列分別為： ACTAF: 5 z-ACTGCACCTTCCAGACCATC-3 z (如序列表的序列3)， ACTAR: 5z-CCACCACCTTGATCTTCATG-3z (如序列表的序列4); 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系:PCR反應(yīng)混合液(SYBR Green PCR Master Mix，寶生物 工程有限公司）10yL，ΙΟμ mol/L毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/AVR1BR2R各0.4yL，cDNA反應(yīng)液2yL， 雙蒸餾水7.2yL; 實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)條件:95°C預(yù)熱2min;然后95°C變性15s，60°C退火30s，40個(gè)循 環(huán);所用試劑為SYBR Premix Ex Taq(寶生物工程（大連)有限公司）；所述毒性檢測(cè)引物 AVR1BR2F和AVR1BR2R的堿基序列分別如序列表的序列1和序列2所示； 實(shí)時(shí)焚光定量PCR完成后使用ABI 7300Sequence Detection System軟件進(jìn)行分析，分 析結(jié)果如圖2所示； 從圖2中可以看出：菌株？80301、？80701、？80702、？80705、？80708和？80704對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí) 熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果中，能夠檢測(cè)到無毒基因 Avrlb-Ι的轉(zhuǎn)錄，因此這些菌株為無毒菌株 (即菌株能夠引起抗病基因 Rpslb的抗病反應(yīng)，對(duì)攜帶抗病基因 Rpslb的寄主植物L(fēng)77-1863 表現(xiàn)為不致病）；菌株P(guān)s0403、Ps0303、Ps0716、Ps0710、Ps0302、Ps0404、Ps0405、Ps0719、 Ps0709、Ps0712、Ps0714和Ps0720對(duì)應(yīng)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果中，不能夠檢測(cè)到無毒 基因 Avrlb-Ι的轉(zhuǎn)錄，因此這些菌株為毒性菌株（即菌株不能夠引起抗病基因 Rpslb的抗病 反應(yīng)，對(duì)攜帶抗病基因 Rpslb的寄主植物L(fēng)77-1863表現(xiàn)為致?。?。
[0015]試驗(yàn)一 采用下胚軸創(chuàng)傷接種法測(cè)定實(shí)施例中18株大豆疫霉菌株對(duì)鑒別寄主L77-1863(僅帶有 抗病基因 Rpslb)的致病性(即對(duì)抗病基因 Rpslb的毒性），其實(shí)驗(yàn)步驟包括:將在V8培養(yǎng)基平 板上培養(yǎng)7天的大豆疫霉菌株切成2mmX 3mm的小塊作為接種體;用解剖刀在種植7天的大豆 幼苗子葉下lcm處向下劃約0.5cm長的傷口，然后將接種體菌絲面朝內(nèi)貼在傷口處。接種后 保濕12h，然后放入24-28°C、14h光照/10h黑暗的溫室中，5天后調(diào)查結(jié)果；以Williams(不帶 任何抗病基因）為感病對(duì)照，每個(gè)鑒別寄主接種10株，以植株死亡率作為抗感的分類標(biāo)準(zhǔn)， 植株死亡率<30 %，記為抗病；植株死亡率多70 %，記為感?。恢仓晁劳雎试?0 %-70 %之 間，記為中間類型，試驗(yàn)重復(fù)2次，各菌株的抗病反應(yīng)見表1; 表1本試驗(yàn)所用18株大豆疫霉菌菌株
比較本試驗(yàn)與實(shí)施例中兩種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因 Rpslb毒性的方法測(cè)定的結(jié) 果，結(jié)果表明上述兩種測(cè)定方法測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因 Rpslb毒性的結(jié)果完全相同，說 明本發(fā)明提供的分子測(cè)定方法是準(zhǔn)確可靠的。
[0016]試驗(yàn)二 分別對(duì) 6 株大豆疫霉菌（菌株？80702、？80708、？80709、？80403、？80405、？80404，分離年 份及堿基序列類型見表1，分離方法與實(shí)施例中的分離方法相同）進(jìn)行如實(shí)施例中的步驟： 提取浸染過程中的待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA、逆轉(zhuǎn)錄、實(shí)時(shí)熒光定量PCR;實(shí)驗(yàn)組的步驟與 實(shí)施例中的步驟完全相同，在逆轉(zhuǎn)錄PCR中使用毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/AVR1BR2R，其實(shí)時(shí) 熒光定量PCR結(jié)果如圖3所示;對(duì)照組的步驟與實(shí)施例中的步驟區(qū)別僅在于，在逆轉(zhuǎn)錄PCR中 使用通用轉(zhuǎn)錄分析引物AVR1BR1F(如序列表的序列9)/AVRlBRlR(如序列表的序列10)，其實(shí) 時(shí)熒光定量PCR結(jié)果如圖4所示;本試驗(yàn)中使用的引物如表2; 表2實(shí)時(shí)熒光定量PCR所用引物
結(jié)合表1和表2,比較圖3和圖4,可以看出采用通用轉(zhuǎn)錄分析引物AVR1BR1F/AVR1BR1R進(jìn) 行實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR時(shí)，毒性菌株P(guān)s0405正常轉(zhuǎn)錄無毒基因 Avrlb-Ι;而采用毒性檢測(cè)引 物AVR1BR2F/AVR1BR2R時(shí)，毒性菌株P(guān)s0405表現(xiàn)為不轉(zhuǎn)錄無毒基因 Avrlb-Ι，從而使2種類型 的無毒菌株P(guān)s0702(I)和Ps0708〇V)表現(xiàn)為正常轉(zhuǎn)錄無毒基因 Avrlb-Ι，而4種類型的毒性 菌株P(guān)s0709(I)、Ps0403(IV)、Ps0405( Π )和Ps0404(III)均表現(xiàn)為不轉(zhuǎn)錄無毒基因 Avrlb-1， 進(jìn)而成功將毒性菌株與無毒菌株區(qū)分開。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因沿Λ5Μ毒性的分子方法，其特征在于：包括以下步 驟:將待檢測(cè)大?疫霉囷接種于大?葉片上，12小時(shí)后提取待檢測(cè)大?疫霉囷的總RNA;以 提取的總R N A為模版進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，得到c D N A反應(yīng)液；采用毒性檢測(cè)引物A V RIB R 2 F / AVR1BR2R，以所得cDNA反應(yīng)液為模版進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR，如果在實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增 過程中能夠檢測(cè)到無毒基因的轉(zhuǎn)錄，則對(duì)應(yīng)的待檢測(cè)大豆疫霉菌為無毒菌株，否則 為毒性菌株;所述毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R的核苷酸序列如下： AVR1BR2F:5 z-GAGCTCATGAAGAGGACGAT-3 ζ; AVR1BR2R:5Z-TCTTATCCAGGCTGTACCCC-3Z。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因你 W/;毒性的分子方法，其特 征在于:所述提取待檢測(cè)大豆疫霉菌的總RNA的步驟為： 將待檢測(cè)大豆疫霉菌在10%V8液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)5天；用滅菌雙層紗布過濾收集培養(yǎng)5 天的大豆疫霉菌絲體，用蒸餾水沖洗3次后緊貼在大豆葉片的正反面，保濕培養(yǎng)12小時(shí)，然 后用濾紙吸干水份放入研缽中加液氮研碎，采用總RNA提取試劑盒提取待檢測(cè)大豆疫霉菌 的總RNA;所述的10%V8液體培養(yǎng)基通過以下方式制得:在每IOOmL用紗布過濾后的V8蔬菜汁 中加入〇.2g碳酸f丐，加蒸餾水補(bǔ)足至1000 mU分裝在三角瓶中，121°C滅菌20 min。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因你毒性的分子方法，其特 征在于:所述逆轉(zhuǎn)錄的反應(yīng)體系及操作程序?yàn)椋?在PCR管中加入提取的總RNA 2μ1，逆轉(zhuǎn)錄引物OligodT(IS)IlIl，濃度為lOmmol/L的 dNTP ΙμL，重蒸水8μ1，通過離心使總RNA、逆轉(zhuǎn)錄引物01igodT(18)、dNTP和重蒸水充分混 勾，65°C 加熱 5 min 后冰置 5 min;繼續(xù)向 PCR 管中加入 5XFirst Strand Buffer 4 μL， 0. lmol/L的二硫蘇糖醇2μ1，RNA酶抑制劑ΙμL，混勾后37°C反應(yīng)2 min，迅速加入ΙμL逆轉(zhuǎn)錄 酶在50°C條件下反應(yīng)50 min;最后在70°C加熱5 min終止反應(yīng);冷卻后得到cDNA反應(yīng)液，置 于-20 °C保存?zhèn)溆谩?. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因你 W/;毒性的分子方法，其特 征在于：以大?疫霉菌的ActinA為內(nèi)標(biāo)基因進(jìn)彳丁實(shí)時(shí)焚光定量PCR，內(nèi)標(biāo)基因特異性引物 ACTAF/ ACTAR的核苷酸序列分別為： ACTAF:5 ζ-ACTGCACCTTCCAGACCATC-3 ζ; ACTAR:5 ζ-CCACCACCTTGATCTTCATG-3 ζ。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種測(cè)定大豆疫霉菌對(duì)抗病基因你毒性的分子方法，其特 征在于:所述實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)體系和條件為： 反應(yīng)體系：PCR反應(yīng)混合液IOyL，ΙΟμ mol/L毒性檢測(cè)引物AVR1BR2F/ AVR1BR2R各0.4yL， cDNA反應(yīng)液2yL,雙蒸餾水7.2yL; 反應(yīng)條件:95 °C預(yù)熱2min;然后95 °C變性15s，60 °C退火30s，40個(gè)循環(huán)。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105907863SQ201610297980
【公開日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年5月6日
【發(fā)明人】王源超, 崔林開, 王曉莉, 董莎萌, 鄭小波
【申請(qǐng)人】南京農(nóng)業(yè)大學(xué)