用于砧用南瓜“黃誠(chéng)根2號(hào)”雜交種子純度鑒定的ssr引物及方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了用于砧用南瓜“黃誠(chéng)根2號(hào)”雜交種子純度鑒定的SSR引物及方法。所用SSR引物為：正向引物：5’?GGCATTTCTGAGAACAGCTT?3’和反向引物：5’?ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC?3’。鑒定方法如下：1)砧用南瓜幼苗基因組DNA的提取；2)以砧用南瓜基因組DNA為模板，使用SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增；3)對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；4)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析，同時(shí)具有父本、母本特異性條帶的單株為真雜交種，只有母本特征帶而無(wú)父本特征帶的后代為假雜種或自交種。本發(fā)明的引物和方法可對(duì)“黃誠(chéng)根2號(hào)”雜交種子和其母本、父本種子進(jìn)行有效、快速區(qū)分，準(zhǔn)確檢測(cè)出雜交種子純度。本方法具有快速、準(zhǔn)確、低成本、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。
【專(zhuān)利說(shuō)明】
用于砧用南瓜"黃誠(chéng)根2號(hào)"雜交種子純度鑒定的SSR引物及 方法
技術(shù)領(lǐng)域：
[0001] 本發(fā)明屬于分子檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種用于砧用南瓜雜交種"黃誠(chéng)根2號(hào)"種子 純度鑒定的引物及方法。
【背景技術(shù)】：
[0002] 種子質(zhì)量的高低關(guān)系到農(nóng)業(yè)生產(chǎn)安全，而衡量種子質(zhì)量的重要指標(biāo)之一就是純 度，因此對(duì)種子進(jìn)行純度檢測(cè)在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及質(zhì)量監(jiān)管過(guò)程中尤為重要。以形態(tài)學(xué)標(biāo)記鑒定 品種的純度和真?zhèn)?，耗時(shí)長(zhǎng)、受季節(jié)限制、多態(tài)性差。隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的廣泛應(yīng)用，使 得從基因組水平上鑒定純度已成為種子純度鑒定的重要方向。目前常用的分子標(biāo)記技術(shù)包 括AFLP(Amplified fragment length polymorphism)、RAPD(Random amplified polymorphic DNA)、SCAR(Sequence Characterized Amplified Region)、ISSR(Inter simple sequence repeat)、DAF(DNA amplified fingerprint)、SSR(Simple sequence repeat)等。SSR分子標(biāo)記技術(shù)以其標(biāo)記數(shù)量豐富、多態(tài)性高、呈共顯性遺傳、重復(fù)性好、易于 操作、結(jié)果可靠等諸多優(yōu)點(diǎn)成為快速、穩(wěn)定、準(zhǔn)確的純度鑒定方法，可以將呈父母本互補(bǔ)帶 型的雜交種與其雙親、甚至也可以將一些異源花粉造成的雜交種區(qū)分開(kāi)?；谏鲜鎏攸c(diǎn)， SSR標(biāo)記逐步成為蔬菜作物品種鑒定的理想分子標(biāo)記之一。
[0003] 南瓜是萌蘆科南瓜屬蔬菜作物，屬于雌雄同株異花植物。在制種過(guò)程中的串粉及 收獲后的機(jī)械混雜導(dǎo)致優(yōu)良品種混雜，此外母本去雄不徹底形成的自交種，是導(dǎo)致種子遺 傳純度下降的主要原因。同時(shí)，隨著南瓜選育品種數(shù)目的增多及育種材料遺傳基礎(chǔ)的日益 狹窄，使得品種間的遺傳差異越來(lái)越小，導(dǎo)致品種真實(shí)性和純度鑒定的難度不斷加大，因此 建立一套準(zhǔn)確、快速、穩(wěn)定、不受環(huán)境因素影響的雜交種純度鑒定技術(shù)體系是保障良種及時(shí) 銷(xiāo)售和安全使用、規(guī)范種子市場(chǎng)和促進(jìn)我國(guó)種子產(chǎn)業(yè)參與國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)的迫切需要。
[0004] 砧用南瓜"黃誠(chéng)根2號(hào)"是以S4236為母本，XR為父本育成的砧用南瓜一代雜交種。 "黃誠(chéng)根2號(hào)"具有與黃瓜親和力強(qiáng)，高抗枯萎病，嫁接黃瓜增加瓜條亮度的特點(diǎn)，已經(jīng)在設(shè) 施黃瓜生產(chǎn)中大面積應(yīng)用。為了保證優(yōu)良雜交品種的推廣和產(chǎn)生最大的經(jīng)濟(jì)效益，篩選出 對(duì)砧用南瓜"黃誠(chéng)根2號(hào)"雜交種子純度進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的SSR引物及方法，以解決"黃誠(chéng)根2 號(hào)"在制種過(guò)程中導(dǎo)致制種純度不高的問(wèn)題，為種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)提供了一個(gè)準(zhǔn)確、穩(wěn)定、 快速、實(shí)用的"黃誠(chéng)根2號(hào)"雜交種子純度鑒定的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0005] 本發(fā)明的目的在于提供用于砧用南瓜一代雜種"黃誠(chéng)根2號(hào)"種子純度鑒定的SSR 弓丨物NG32和一種快速、準(zhǔn)確鑒定"黃誠(chéng)根2號(hào)"種子純度的方法。
[0006] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下：
[0007] -種用于砧用南瓜雜交種"黃誠(chéng)根2號(hào)"種子純度鑒定的SSR引物NG32,序列如下所 示：
[0008] NG32-正向引物：5'-GGCATTTCTGAGAACAGCTT-3'（SEQ ID N0:1),
[0009] NG32-反向引物：5'-ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC-3'（SEQ ID N0:2)。
[0010] -種用于砧用南瓜"黃誠(chéng)根2號(hào)"雜交種子純度鑒定的方法，具體步驟如下：
[0011] 1)分別提取"黃誠(chéng)根2號(hào)"及其父本、母本幼苗基因組DNA;
[0012 ] 2)以上述提取的基因組DNA為模板，使用SSR引物對(duì)NG32進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0013] 3)對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳；
[0014] 4)對(duì)凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時(shí)具有父本、母本特異性條帶的單株為真正 的雜交種，只有母本特征條帶而無(wú)父本特征條帶的后代為假雜種或自交種，計(jì)算種子純度。
[0015] PCR 擴(kuò)增的 25μ1 反應(yīng)體系為：基因組 DNA 1.0yl，25mmol.L-WgCh 2·5μ1， 2.0mmol · L-ΜΝΤΡ 2μ1，NG32 引物 lOymol · L-1 各為 0 · 5μ1，Taq 酶0 · 2U 0 · ΙμL，10 X PCR buffer 2 ·5μ1，(ΜΗ2〇補(bǔ)足至25μ1。
[0016] PCR擴(kuò)增的程序?yàn)?94°C預(yù)變性5min后，94°C變性30s，57°C退火30s，72°C延伸30s， 35個(gè)循環(huán)后，72°C保持lOmin，然后置于4°C保存。
[0017] 所述凝膠電泳為8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染檢測(cè)。
[0018] 本發(fā)明的方法可將"黃誠(chéng)根2號(hào)"雜交種子與其母本、父本種子區(qū)分開(kāi)來(lái)，快速檢測(cè) 出雜交種子的純度。本方法具有快速、準(zhǔn)確、低成本，操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，能夠替代傳統(tǒng)雜交種 子純度鑒定的方法，具有較高的商業(yè)應(yīng)用價(jià)值。
【附圖說(shuō)明】
[0019] 圖為南瓜"黃誠(chéng)根2號(hào)"種子純度鑒定PCR產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜（M: pBR322DNA/MspI分子量標(biāo)準(zhǔn)；1，2,3,4,5,6:雜交種"黃誠(chéng)根2號(hào)"；，7，8:父本"XR" ；9，10:母 本"S4236" ；
【具體實(shí)施方式】
[0020] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說(shuō)明，但并不局限于此。
[0021] 實(shí)施例1
[0022] 砧用南瓜"黃誠(chéng)根2號(hào)"雜交種子純度檢測(cè)方法的建立。
[0023] 1、篩選純度鑒定的SSR引物。
[0024]從所公布的南瓜SSR引物在親本(母本"S4236"，父本"XR"）間、進(jìn)行篩選，選出共顯 性差異標(biāo)記條帶的引物NG32，序列如下所示：
[0025] NG32-正向引物：5'-GGCATTTCTGAGAACAGCTT-3'（SEQ ID N0:1)
[0026] NG32-反向引物：5'-ACGTTAGTTATGCTATTTTGTAGGC-3'（SEQ ID N0:2)
[0027] 該標(biāo)記帶型清晰、重復(fù)性好。引物NG32能產(chǎn)生123bp的父本特異性標(biāo)記NG32 123和 89bp的母本特異性標(biāo)記NG32 89。
[0028] 2、利用SSR引物NG32對(duì)"黃誠(chéng)根2號(hào)"雜交種子進(jìn)行純度鑒定。
[0029] (1)南瓜基因組DNA的提取
[0030]實(shí)驗(yàn)材料為砧用南瓜"黃誠(chéng)根2號(hào)"及其父本(XR)、母本(S4236)子葉DNA。
[0031 ] 步驟如下：
[0032]①液氮在2ml的離心管內(nèi)用研杵研磨，在液氮快蒸發(fā)干時(shí)迅速加入2%CTAB提取緩 沖液700μ1，混勾后置于65°C水浴中溫浴60min(每隔5min搖動(dòng)一次）。
[0033] ②靜置至室溫后在4°C下12000rpm離心10min，將上清轉(zhuǎn)移到新的2ml離心管。
[0034]③加入等體積的酚：氯仿：異戊醇（25 : 24:1 )，顛倒混勻，靜置3-5分鐘，在4°C下 12000rpm離心10min，將上清液轉(zhuǎn)入新的1.5ml離心管中。
[0035]④加2/3體積預(yù)冷的異丙醇，緩慢混勻，置于一 20 °C下放置30min。
[0036] ⑤在4°C下12000rpm離心10min，棄上清，加入200~300μ1預(yù)冷的70 %乙醇洗滌DNA 沉淀(兩次），微干。
[0037] ⑥加入30μ1無(wú)菌水溶解。
[0038] (2)PCR擴(kuò)增:采用25μ1的PCR擴(kuò)增體系 基因組DNA模板 1. 0 μ 1 10XPCH buffer (含 25 2. 5 μ 1
[0039] 飄0:[ · Ρ 鳴) 2, 0 nunol · L：1 dNTP 2. 0 μ： 1 NG32 正向引物 10 :μ mol · L--1 0. 5 μ 1 NG32 反向引物 10: μ 興1 · L-1 0. 5 μ 1 Taq 酶:Q. 2? 0. 1 μ 1
[0040] ddH20 18,. 4 μ 1
[0041 ] PCR擴(kuò)增程序如下：
[0042] 94Γ 預(yù)變性 5min;
[0043] 94 °C 變性 30s，57 °C 退火 30s，72 °C 延伸 40s，35 個(gè)循環(huán)；
[0044] 72°C 延伸 7min;
[0045] 4°C 保存。
[0046] (3)凝膠電泳
[0047] 取5μ1 PCR產(chǎn)物加入ΙμL 6x loading buffer混勻，取ΙμL上樣于8%的非變性聚丙 烯酰胺凝膠電泳，150V穩(wěn)壓2.5h，電泳結(jié)束后進(jìn)行0.1%AgN03銀染20min;銀染后用2% NaOH、0.4%甲醛、0.04%Na2C03顯色，顯色后在燈箱上拍照分析。
[0048] (4)擴(kuò)增結(jié)果
[0049]砧用南瓜"黃誠(chéng)根2號(hào)"雜交種擴(kuò)增出123bp和89bp兩條帶;父本擴(kuò)增出123bp的條 帶;母本擴(kuò)增出89bp的條帶(見(jiàn)圖）。
[0050]回收特異條帶，送上海生工公司測(cè)序。雜交種子中123bp條帶的序列如SEQ ID N0: 3所示，89bp條帶的序列如SEQ ID N0:4所示，與父本、母本擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相符。 <uo>青島利技大學(xué)，青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 <120>用于砧用南瓜"黃誠(chéng)根2 ^雜交種/·純度鑒定的SSR引物及方法 <130> <160> 4 <170> Patent in version 3.3 <210 1 <2li> 20 <2I2> ?)ΝΛ <2Π> 人工序列 <400> 1 (i(iCArTTCTGA<3AAC：AGCTT 20 Ol 2 25 ·2\2> ΟΝ Λ <2LV> 尺工序列' <400> 2
[0051 ] ΛΓ0-? ΙΛ?Π lAKiC'IAm !CilA(j(ir 25 <2\\> 123 <212> DNA <213> Ciwurhita moschata <4.〇0> 3' GGC'ATTTCTG AGAACAGCTT CCTAGTACTT TATTACCATT TCTTGAGAGA GAGAGAGAGA 60 CiAGAGAGAGA CiAGAGA(.iAGA C；ACiAOAOAC.iA UACiATTCTCiC* C'TAC ΛΛΛΛΤΛ GC ATAAC ΤΛΛ 120 CCiT 123 4 <211> 89 <212> DNA 13> Cucurbita mosekata <400> 4 G(.irATTTCn:w\(.iAACAGCTT CTT\GTACTT ΤΛΤΤΛα'ΛΤΤ TCTTGAGAG 60 TTCTGCCTAC AAAATAGCAT AACTAACGT 8：9
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 用于鑒定砧用南瓜"黃誠(chéng)根2號(hào)"雜交種子純度的一對(duì)SSR引物NG32，其特征在于包括 正向引物：5 ' -GGCAITTCTGAGAACAGCTT-3 '，反向引物：5 ' -ACGTTAGTTATGCTAITTTGTAGGC-3 '。2. -種用于砧用南瓜雜交種"黃誠(chéng)根2號(hào)"種子純度鑒定的方法，包括如下步驟： 1) 提取南瓜幼苗基因組DNA; 2) 以南瓜基因組DNA為模板，使用權(quán)利要求1的SSR引物NG32進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 3) 對(duì)擴(kuò)增的產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳； 4) 對(duì)凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行分析，只有同時(shí)具有父本、母本特異性條帶的單株為真正的雜 交種，只有母本特征帶而無(wú)父本特征帶的后代為假雜種或自交種，計(jì)算種子純度。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于SSR標(biāo)記的砧用南瓜雜交后代純度鑒定方法，其特征在 于：所述的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)總體積為25yL:基因組DNA 1.0yl，25mmol · IZ1MgCl2 2.5μ1， 2.0mmol · L-ΜΝΤΡ 2μ1，NG32 引物 IOymol · L-1 各為 O · 5μ1，Taq 酶O · 2U O · ΙμL，10 X PCR buff er 2 · 5μ1，ddH20補(bǔ)足至25μ1; PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，57 °C退 火 30s，72°C 延伸 3〇8,30個(gè)循環(huán)；72°(：延伸1〇1^11，4°(：保存。4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的基于SSR標(biāo)記的砧用南瓜雜交種子的純度鑒定方法，其特征在 于：SSR引物在父本產(chǎn)生123bp的父本特異標(biāo)記NG32 123，在母本產(chǎn)生89bp的母本特異標(biāo)記 NG32 89〇
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK105907869SQ201610381694
【公開(kāi)日】2016年8月31日
【申請(qǐng)日】2016年6月1日
【發(fā)明人】李鳳梅, 崔健, 祝倩倩, 劉素芹, 宋云云, 江志訓(xùn)
【申請(qǐng)人】青島科技大學(xué), 青島市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院