一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物，其核苷酸序列如下：上游引物序列：5′?AAGCCCGTGCCTAAAGTG?3′，下游引物序列：5′?CTGCCATAGTTGGTGTTGT?3′。本特異性引物可對嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測，在檢測基因mRNA表達(dá)水平方面具有靈敏度高、特異性好等優(yōu)點(diǎn)。通過實(shí)時監(jiān)測硫氧化代謝過程中sor基因mRNA表達(dá)水平，用于解釋嗜酸氧化硫硫桿菌的硫氧化機(jī)理。
【專利說明】一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物。
【背景技術(shù)】
[0002]作為一種無機(jī)化能自養(yǎng)型、革蘭氏陰性、桿狀的極端微生物，嗜酸氧化硫硫桿菌與硫化礦系(煤礦、黃銅礦、黃鐵礦、輝銅礦等)的生物浸出密切相關(guān)，其在工業(yè)應(yīng)用領(lǐng)域具有廣泛的前景。嗜酸氧化硫硫桿菌能以元素硫及還原型無機(jī)硫化合物(Reduced InorganicSulfur Compounds，簡稱RISCs)作為能源物質(zhì)。關(guān)于嗜酸氧化硫硫桿菌的研究至今從未間斷，但對于其生物化學(xué)過程則有待進(jìn)一步的補(bǔ)充和完善。在嗜酸氧化硫硫桿菌中硫氧化酶系的作用下，元素硫或還原型無機(jī)硫化合物經(jīng)過一系列的酶反應(yīng)或非酶反應(yīng)最終產(chǎn)生硫酸鹽而釋放到機(jī)體外，硫酸鹽對于維持體系中的PH至關(guān)重要。
[0003]作為需氧的硫氧化過程中的初始酶，硫氧化還原酶(SOR)存在于某些嗜熱古菌和嗜酸菌中，其在嗜酸嗜熱古菌如騰沖嗜酸兩性菌(d c i c/ia/3 us ie/設(shè)cA o/3ge/3 si s)和布氏嗜酸兩性菌ambivalens)以及喜溫硫桿菌{Acidith1baciIIuscaldus)均有敬道。SOR依賴氧分子催化單質(zhì)硫發(fā)生歧化反應(yīng)，能夠同時產(chǎn)生硫化物、亞硫酸鹽和硫代硫酸鹽。該酶催化的反應(yīng)具備以下特點(diǎn):①反應(yīng)相關(guān)的酶是可溶性的且位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)；②反應(yīng)的最適 pH 和最適溫度分別為 7.0 ± 0.5 ( Sulfolobusbrierleyi)和 65_85°C{Acidianustengchongensis及Acidianusambivalens);③該反應(yīng)不需借助外源輔助因子及電子供體。硫氧化還原酶具有催化元素硫發(fā)生歧化反應(yīng)的能力，其產(chǎn)物硫化物、硫代硫酸鹽以及亞硫酸鹽均在硫氧化途徑中充當(dāng)重要的中間代謝產(chǎn)物，因此該酶在元素硫和還原型無機(jī)硫化合物的氧化過程至關(guān)重要。
[0004]熒光定量PCR技術(shù)是在普通PCR(Polymerase Chain React1n, PCR)的基礎(chǔ)上，結(jié)合實(shí)時熒光檢測技術(shù)和計(jì)算機(jī)分析技術(shù)。它是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測樣品模板的初始濃度。它的出現(xiàn)，極大地簡化了定量檢測的過程，而且真正實(shí)現(xiàn)了絕對定量。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明提供了一種檢測嗜酸氧化硫硫桿菌硫氧化還原酶基因mRNA表達(dá)水平的特異性引物，并采用熒光定量PCR技術(shù)，通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)和優(yōu)化，我們得到一組能夠有效檢測嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達(dá)量的引物，并總結(jié)出一套最佳的PCR反應(yīng)使用的參數(shù)。
[0006]本發(fā)明提供一種嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測的特異性引物，所述引物的核苷酸序列為:上游引物:57 -AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37，
下游引物:5' -CTGCCATAGTTGGTGTTGT-37。
[0007 ]對應(yīng)地，本發(fā)明提供一種嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟:
(1)嗜酸氧化硫硫桿菌總RNA的提取和純化；
(2)對步驟(I)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用權(quán)利要求1所述的特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR;
(3)根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果計(jì)算出mRNA表達(dá)水平。
[0008]其中步驟(3)中的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?95°C變性30 sec;在退火溫度56° C下復(fù)性15s; 72° C延伸25 s，40個循環(huán)。
[0009]優(yōu)選地，其中采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為轉(zhuǎn)錄內(nèi)參基因；使用△ACt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。
[0010]本發(fā)明還提供一種用于上述的熒光定量PCR檢測方法的檢測試劑盒，該試劑盒包括如上所述的特異性引物。
[0011 ]具體地，所述方法更具體步驟如下:
(1)采用離心的方法回收菌體，然后使用Trizol試劑來提取RNA，接著使用MicroElute RNA Clean-Up Kit (OMEGA)，提取的總RNA按照說明進(jìn)行純化，然后使用RNase-free DNase I (OMEGA)去除提取物中含有的基因組DNA;
(2)使用NanoDropND-1000 分光光度計(jì)(NanoDrop Technologies)檢測RNA 的濃度和純度，參數(shù)設(shè)置為0D260 和0D280，使用OMEGA MicroElute RNA Clean-Up Kit (50)純化 RNA;
(3)利用FirstStrand cDNA Synthesis Kit (TOYOBO)對2 Hg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄;
(4)以I μ I 逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物 cDNA 作為模板，使用 QuantiFast? SYBR? Green PCR Kit(QIAGEN)配置25 μ? 的體系，然后使用MyIQ Single Color Real-Time PCR Detect1nSystem (B10-RAD)進(jìn)行實(shí)時定量PCR。
[0012]本發(fā)明采用上述的技術(shù)方案，通過監(jiān)測不同時期嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達(dá)水平和用于解釋硫氧化機(jī)理，進(jìn)而可以作為該菌對硫元素或還原型無機(jī)硫化合物氧化速率的依據(jù)。
[0013]本發(fā)明以嗜酸氧化硫硫桿菌中的sor基因?yàn)槟０?，設(shè)計(jì)出一系列引物，并通過優(yōu)化條件和反復(fù)實(shí)驗(yàn)，挑選出一對高特異性的引物。該引物在mRNA水平監(jiān)測sor基因不同時期的表達(dá)差異更具有針對性，能夠有效地反映硫氧化過程中基因的表達(dá)情況，從而能夠作為考查硫氧化速率的一項(xiàng)重要的參照指標(biāo)。
【附圖說明】
[0014]圖1為實(shí)施例2中的樣品擴(kuò)增曲線；
圖2為實(shí)施例2中的標(biāo)準(zhǔn)曲線；
圖3為實(shí)施例2中的樣品溶解曲線。
[0015]
【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)施例1、特異性引物對的篩選與獲得
硫氧化還原酶由sor基因編碼，該酶具有催化元素硫發(fā)生歧化反應(yīng)的能力，在元素硫和還原型無機(jī)硫化合物的氧化過程至關(guān)重要。硫氧化還原酶存在于某些嗜熱古菌和嗜酸菌中，其在嗜酸嗜熱古菌如騰沖嗜酸兩性菌和布氏嗜酸兩性菌以及嗜酸細(xì)菌如喜溫硫桿菌均有報道。
[0017]通過全基因組測序，我們獲得th10xidans AOl的全基因組序列信息，并首次在該種中報道了硫氧化還原酶編碼基因的存在。根據(jù)兒th10xidansAOl的sor基因(NCBI登錄號為KJ483962)，通過Primer 5設(shè)計(jì)多組引物，盡量滿足引物設(shè)計(jì)的規(guī)則，尤其是盡可能避免引物二聚體、錯配和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。5對引物分別為:
引物 I上游序列:5' -ACCAACTATGGCAGTCAGG-37引物 I 下游序列:5' -ATCATGGGTCCAAAGAGC-37引物2上游序列:57 -AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37引物2下游序列:57 -CTGCCATAGTTGGTGTTGTAC-37引物3上游序列:5' - AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37引物3下游序列:57 - CTGCCATAGTTGGTGTTGT-37引物4上游序列:57 -CAACACCAACTATGGCAGTC-37引物4下游序列:57 -ATCATGGGTCCAAAGAGC-37引物5上游序列:5' -ACCAACTATGGCAGTCAGG-37引物5下游序列:57 -CATGGGTCCAAAGAGCAT-37
通過設(shè)置溫度梯度(50°C?60°C;以2為步長遞增)，引物4和5出現(xiàn)多處明暗不等的雜帶，可判斷該引物對的特異性差;而引物I和2的電泳圖顯示，靠近目的條帶的地方出現(xiàn)較暗的雜帶，初步分析可能為引物二聚體。而引物3具有較好的特異性，且根據(jù)不同溫度下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定引物最佳的退火溫度(56° C)。
[0018]實(shí)施例2、嗜酸氧化硫硫桿菌在不同能源下硫氧化還原酶基因mRNA表達(dá)水平一、培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件
菌株Acidith1baciIliis th10xidans AOl分別選用9K培養(yǎng)基和德國生物材料資源中心培養(yǎng)基71 (DSMZ medium 71)進(jìn)行液體培養(yǎng)。其中，含10.0 g/L元素硫的9K培養(yǎng)基用5 mol/L的H2S04調(diào)節(jié)培養(yǎng)液初始pH至2.0，而含5.0 g/L硫代硫酸鈉的DSMZ medium 71培養(yǎng)基調(diào)pH至4.4。細(xì)菌在裝有100 mL培養(yǎng)液的錐形瓶(規(guī)格為250 mL)培養(yǎng)，其細(xì)菌初始濃度為2.5X 16個/毫升，培養(yǎng)溫度為30°C，搖床振蕩頻率為170 rpm。
[0019]二、RNA 的提取
在對數(shù)中期(54 h)(三個重復(fù)實(shí)驗(yàn)求平均值)采用離心的方法回收菌體并用以提取RNA，然后使用RNase-free (MH2O清洗樣品兩次。具體步驟如下:
(I)細(xì)胞裂解。12000 rpm離心20 min收集菌體，加入I ml的Trizol試劑，并反復(fù)吹打移液槍，使細(xì)胞充分裂解。
[0020](2)為使核酸蛋白復(fù)合物完全分離，將勻漿樣品在15-30°C溫育5 min。
[0021](3) 4。C下，10000 rpm 離心2 min，收集上清液。
[0022](4)按每I ml Trizol加0.2 ml的比例添加氯仿，蓋好離心管，吸打15 S，室溫溫育3 min。
[0023](5) 4。C下，10000 rpm離心10-15 min后，樣品分成三層:底層為黃色的有機(jī)相，中間層及上層無色的水相，而RNA主要在水相中，使用移液槍小心把水相(約600 μ?)轉(zhuǎn)移到新離心管中。
[0024](6)在加有水相溶液的新離心管中加入等體積(600 μ?)的異丙醇，經(jīng)充分混勻后，室溫放置20-30 min。
[0025](7) 4。C，10000 rpm 離心 10 min，棄上清。
[0026]三、RNA的純化
(I) RNA樣品加DEPC-Water至總體積為100 μ?。
[0027](2)加350 μ I QVL Lysis buffer (每 Iml 加20 μ I β_ 巰基乙醇)，另加入 2 μ ILinear Acrylam1le，禍方定混勾。
[0028](3)加250 μ?無水乙醇到樣品混合液中，混合均勻。
[0029](4)轉(zhuǎn)移700 μ?混合液到套著2 ml收集管的RNeasy純化柱子中，12，000 rpm離心I min，棄收集液。
[0030](5)加300 μ I RffB Buffer (已稀釋)到柱子中，10，000 rpm、離心 I min，棄收集液。
[0031](6)取另一新的離心管，加入 73.5 μ I DNase I Digest1n Buffer和I.5 μ IRNase-free DNase I，充分混勾。
[0032](7)將配成的75 μ? DNase I消化混合液轉(zhuǎn)移到RNeasy純化柱硅膠膜正中間，室溫(25-30°C)放置15 min。
[0033](8)加400μ1 RffB Wash buffer (已稀釋)到RNeasy純化柱中，室溫放置5 min, 10,000 rpm離心I min，棄收集液。
[0034](9)加500 μ I RffB Buffer (已稀釋)到RNeasy 純化柱中，10,000 rpm 離心 I min,
棄收集液。
[0035](10)重復(fù)步驟9。
[0036](11)空柱13,000 rpm離心2 min空用干燥柱子基質(zhì)。
[0037](12)將柱子轉(zhuǎn)移到新的1.5ml離心管，加入30 μ I DEPC-treated Water到RNeasy純化柱基質(zhì)中，靜置2 min，10 ,OOOrpm離心I min。
[0038]四、反轉(zhuǎn)錄cDNA的合成
(I)配置反應(yīng)體系:11 μ? RNA樣品和I μ?隨機(jī)引物。
[0039](2)輕輕混勻反應(yīng)體系后，進(jìn)行如下處理:65°C加熱5 min，置于冰上2_3 min，充分冷卻后，短暫低速離心。
[0040](3)再在反應(yīng)體系中依次添加12 μ?變性RNA，4 μ? 5 X RT buffer，2 μ? dNTPMixture，I μI RNase Inhibitor和I μ? ReverTra Ace。
[0041 ] (4)輕輕上下吸打均勻。
[0042](5)樣品依次在如下條件下進(jìn)行處理:30°C，10 min;42°C，20 min;99°C，5 min；4°C，5 min0
[0043](6)使用NanoDrop微量分光光度計(jì)檢測cDNA質(zhì)量，然后將樣品稀釋成200 ng/μI，再使用Real-time PCR進(jìn)行檢測以備待用。
[0044]五、實(shí)時定量RT-PCR
PCR的參數(shù)設(shè)置為:95°C，30 s;56。C，15s;72。C，25 s，循環(huán)數(shù)為40。此外，甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為轉(zhuǎn)錄內(nèi)參基因，并使用△ ACt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量，其倍數(shù)變化采用2—AAet表示。
[0045]實(shí)驗(yàn)結(jié)果請參見圖1至圖3，圖1顯示樣品擴(kuò)增曲線，圖2顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線，圖3顯示樣品溶解曲線。其中，樣品擴(kuò)增曲線(圖1)顯示，樣品擴(kuò)增的Ct值為26，且擴(kuò)增在38個循環(huán)后達(dá)到平臺期。Real-time PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖2)表明，擴(kuò)增的動力學(xué)方程相關(guān)系數(shù)為0.999，PCR擴(kuò)增效率為82.1%。一般地，擴(kuò)增效率的范圍在80%?120%，所以該標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)方程是理想的。該樣品溶解曲線(圖3)為單一吸收峰，無非特異性產(chǎn)物和引物二聚體等生成，從而表明該引物的特異性良好，能夠用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，且Real-time PCR結(jié)果能夠準(zhǔn)確反映樣品初始濃度。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測的特異性引物，所述引物的核苷酸序列為: 上游引物:57 -AAGCCCGTGCCTAAAGTG-37， 下游引物:5' -CTGCCATAGTTGGTGTTGT-37。2.—種嗜酸氧化硫硫桿菌sor基因mRNA表達(dá)水平的熒光定量PCR檢測方法，包括以下步驟: 嗜酸氧化硫硫桿菌總RNA的提取和純化； 對步驟(I)提取的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA，利用權(quán)利要求1所述的特異性引物進(jìn)行熒光定量PCR; 根據(jù)熒光定量PCR的結(jié)果計(jì)算出mRNA表達(dá)水平。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的熒光定量PCR檢測方法，其中步驟(3)中的PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)?95°C變性30 sec;在退火溫度56°(:下復(fù)性158;72°(:延伸25 s，40個循環(huán)。4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的熒光定量PCR檢測方法，其中采用甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因作為轉(zhuǎn)錄內(nèi)參基因；使用A ACt方法計(jì)算基因的相對表達(dá)量。5.—種用于如權(quán)利要求2至4任一項(xiàng)所述的熒光定量PCR檢測方法的檢測試劑盒，其特征在于包括如權(quán)利要求1所述的特異性引物。
【文檔編號】C12Q1/04GK105925667SQ201610199719
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年4月1日
【發(fā)明人】尹華群
【申請人】中南大學(xué)