本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于志賀氏菌檢測(cè)的引物組、試劑盒和志賀氏菌的ic-lamp檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

志賀氏菌為革蘭陰性桿菌，是人類(lèi)細(xì)菌性痢疾最為常見(jiàn)的病原菌。志賀菌可穿入低位腸段的粘膜，引起粘液分泌、充血、白細(xì)胞浸潤(rùn)、水腫，并常有表淺粘膜潰瘍。急性典型菌痢癥狀，有腹痛腹瀉、膿血粘便、里急后重、發(fā)熱等呈現(xiàn)嚴(yán)重的全身中毒癥狀。

志賀菌屬是主要的腸道病原菌之一，也是引起人類(lèi)細(xì)菌性痢疾的病原體。本屬細(xì)菌分布于全世界，是炎癥性痢疾的典型病原菌，很多地區(qū)5%~10%的腹瀉性疾病是由該菌屬所致。弗氏志賀菌和宋內(nèi)志賀菌比鮑氏志賀菌和毒力特別強(qiáng)的痢疾志賀菌分布更廣。志賀菌廣泛存在于食品中，大量食入，會(huì)引起嚴(yán)重后果。因此，快速準(zhǔn)確地檢測(cè)出志賀氏菌就顯得尤為重要。

目前臨床應(yīng)用的志賀氏菌的檢測(cè)方法包括細(xì)菌分離鑒定、免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)檢測(cè)方法等，但這些方法都存在一些缺陷。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法主要采用細(xì)菌前增菌培養(yǎng)、分離培養(yǎng)、菌落形態(tài)觀(guān)察和一系列的生化鑒定以及血清型鑒定等步驟，一般需4至7天，此方法培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)、工作量大、實(shí)驗(yàn)步驟繁瑣，在很多突發(fā)事件中不能及時(shí)反映準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)。免疫學(xué)方法易污染，且交叉反應(yīng)比較嚴(yán)重、假陽(yáng)性多、靈敏度偏低。常規(guī)pcr方法檢測(cè)其靈敏度低，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，需要昂貴的pcr儀器以及電泳儀、凝膠成像儀等配套儀器并且在檢測(cè)前還需要進(jìn)行菌體的富集，dna的提取。免疫磁分離技術(shù)是將特異性抗體與一定大小的磁珠偶聯(lián)，利用特異性抗體能與細(xì)胞表面抗原相結(jié)合的原理，將磁球與細(xì)胞結(jié)合，在外磁場(chǎng)的作用下，將磁球-細(xì)胞復(fù)合物從環(huán)境中分離出來(lái)，達(dá)到獲取目標(biāo)細(xì)胞的一項(xiàng)技術(shù)，但是單獨(dú)使用該技術(shù)時(shí)只能實(shí)現(xiàn)分離，還需結(jié)合其他手段進(jìn)行檢測(cè)，而目前使用免疫磁分離技術(shù)進(jìn)行分離的檢測(cè)方法的靈敏度仍有待提高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于提供了一種用于檢測(cè)志賀氏菌的ic-lamp特異性引物組，它包括正向內(nèi)引物fip、反向內(nèi)引物bip、正向外引物f3、反向外引物b3，各引物序列如下：

fip:5'-ctgtcgaagctccgcagaggttttggattccgtgaacaggtcg-3'；（如seoidno：1所示）

bip:5'-ctttcgctgttgctgctgatgcttttccggagattgttccatgtga-3'；（如seoidno：2所示）

f3:5'-ataccgtctctgcacgca-3'；（如seoidno：3所示）

b3:5'-gccttctgatgcctgatgg-3'；（如seoidno：4所示）。

本發(fā)明另一目的是提供一種志賀氏菌的ic-lamp檢測(cè)試劑盒，其包括權(quán)利要求1所述的志賀氏菌的ic-lamp檢測(cè)引物組和結(jié)合有志賀氏菌特異抗體的proteina/g偶聯(lián)磁珠。

其中結(jié)合有志賀氏菌特異抗體的proteina/g親和磁珠是采用proteina/g可以特異性的與抗體fc段結(jié)合的原理制備的，具體參考proteina/g免疫沉淀磁珠（美國(guó)biotool，貨號(hào)：b23202）產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)所述方法制得。

本發(fā)明試劑盒還包括常規(guī)lamp檢測(cè)中所需的常規(guī)試劑，例如2×isothermalmastermix、無(wú)核酸酶水。

本發(fā)明將環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（lamp)與免疫磁珠相結(jié)合，針對(duì)志賀氏菌重要的毒性基因ipah基因設(shè)計(jì)一套引物，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立志賀氏菌ic-lamp檢測(cè)技術(shù)。

本發(fā)明另一目的是提供了一種志賀氏菌檢測(cè)的新方法，利用proteina/g免疫沉淀磁珠與志賀氏菌的多克隆抗體偶聯(lián)形成免疫磁珠去捕捉樣品中的志賀氏菌，然后通過(guò)直接裂解法獲得基因組，通過(guò)環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，確認(rèn)是否存在有志賀氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物。

所述的待測(cè)樣品可以是被志賀氏菌污染的水、食品及人和動(dòng)物的糞便及咽拭子/肛拭子等。

檢測(cè)方法具體步驟如下：

（1）待測(cè)樣品的制備，將待測(cè)樣品用已經(jīng)滅菌的lb液體培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋?zhuān)?/p>

（2）在待測(cè)樣品中添加結(jié)合有志賀氏菌特異抗體的proteina/g偶聯(lián)磁珠，混勻后進(jìn)行磁性分離，棄上清液，然后加入pbs-t溶液重懸后再進(jìn)行磁性分離，重復(fù)2-3次；

（3）采用直接裂解法裂解步驟（2）中捕獲菌體的基因組dna，即在步驟（2）獲得的磁珠-抗體-抗原的復(fù)合物中加入裂解液進(jìn)行裂解，然后加入終止液終止反應(yīng)；

（4）采用針對(duì)志賀氏菌的ic-lamp檢測(cè)引物組對(duì)獲得基因組dna進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增，反應(yīng)體系：15μl2×isothermalmastermix、2μl的10mm正向內(nèi)引物fip、2μl的10mm反向內(nèi)引物bip、0.25μl的10mm反向外引物b3、0.25μl的10mm正向外引物f3、步驟（3）裂解液模板1-6μl，加無(wú)核酸酶水補(bǔ)至終體積25μl；反應(yīng)條件：65℃擴(kuò)增30min，80℃-98℃變性10min，終止反應(yīng)；

（5）擴(kuò)增產(chǎn)物利用紫外檢測(cè)系統(tǒng)、色素法或熒光法檢測(cè)（根據(jù)不同的顯色法加入不同的顯色劑），判斷是否存在志賀氏菌；檢測(cè)方法均為常規(guī)檢測(cè)法。

例如擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，直接在紫外燈下觀(guān)察結(jié)果（擴(kuò)增前顯色劑即加入擴(kuò)增的pcr管中）；結(jié)果判定：pcr管中樣品在紫外照射下出現(xiàn)綠色熒光，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，則說(shuō)明樣品中含有志賀氏菌；pcr管中樣品在紫外照射下不出現(xiàn)綠色熒光，檢測(cè)結(jié)果為陰性，則說(shuō)明樣品中不含有志賀氏菌。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：采用本發(fā)明所公開(kāi)的志賀氏菌的ic-lamp特異性引物組制備的試劑盒在檢測(cè)志賀氏菌方面ic-lamp具有良好的積極效果。

本發(fā)明公開(kāi)的用于檢測(cè)志賀氏菌的試劑盒與現(xiàn)有技術(shù)相比所具有的積極效果在于：

（1）本發(fā)明采用的lamp技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、快速、敏感等特點(diǎn)，其敏感性比常規(guī)pcr高數(shù)倍以上；而且檢測(cè)過(guò)程只需恒溫水浴鍋和便攜式磁力架即可完成，不需要pcr儀等昂貴的設(shè)備（恒溫水浴鍋即可），更適合于基層推廣應(yīng)用。此外，本發(fā)明將lamp技術(shù)與免疫磁珠技術(shù)相結(jié)合，可以通過(guò)肉眼直接觀(guān)察和判定結(jié)果，僅需30min，比傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)法節(jié)省3天，比提取基因組進(jìn)行pcr方法（瓊脂糖凝膠電泳）縮短3h，且不需要對(duì)菌體進(jìn)行富集，提取其基因組等，使檢測(cè)更為便捷、高效；

（2）基于ic-lamp方法的敏感、特異，成本低廉，便于操作等諸多優(yōu)勢(shì)，本發(fā)明在一定程度上提高了我國(guó)志賀氏菌菌株的檢測(cè)能力，為志賀氏菌疾病的臨床實(shí)時(shí)快速診斷、動(dòng)物和食品的出入境檢驗(yàn)檢疫中該菌的快速準(zhǔn)確檢測(cè)提供了新技術(shù)來(lái)源，對(duì)提高我國(guó)檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)志賀氏菌的疫情監(jiān)控和快速檢測(cè)水平，以及普及先進(jìn)技術(shù)在基層檢驗(yàn)檢疫機(jī)構(gòu)的推廣應(yīng)用均具有重要意義。特別對(duì)于糞便等特殊樣品的檢測(cè)，此方法解決了從糞便等特殊樣品中菌體的獲取、富集的難題，其靈敏度比利用普通檢測(cè)方法如pcr、多重?zé)晒舛縫cr等方法高。

附圖說(shuō)明

圖1(a)為利用正向外引物f3、反向外引物b3進(jìn)行pcr鑒定體系的特異性檢測(cè)結(jié)果，泳道2的反應(yīng)模板為志賀氏菌的基因組；泳道3至泳道7依次為大腸桿菌、金黃色葡萄菌、沙門(mén)氏菌、李斯特桿菌、銅綠假單胞桿菌基因組；泳道8為去核酸酶水作為模板的陰性對(duì)照；（b）利用正向外引物f3、反向外引物b3進(jìn)行pcr鑒定體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其反應(yīng)模板為質(zhì)粒，泳道2-10其質(zhì)粒濃度依次為10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、100copies/ml，泳道11為去核酸酶水作為模板的陰性對(duì)照；

圖2(a)為利用正向外引物f3、反向外引物b3、正向內(nèi)引物fip、正向反向內(nèi)引物bip進(jìn)行l(wèi)amp鑒定體系的特異性檢測(cè)結(jié)果，泳道2的反應(yīng)模板為志賀氏菌的基因組，泳道3至泳道7依次為大腸桿菌、金黃色葡萄菌、沙門(mén)氏菌、李斯特桿菌、銅綠假單胞桿菌基因組，泳道8為去核酸酶水作為模板的陰性對(duì)照；（b）為本發(fā)明lamp鑒定體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其反應(yīng)模板為質(zhì)粒，泳道2-11其濃度依次為10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹copies/ml，泳道12為去核酸酶水作為模板的陰性對(duì)照；

圖3為本發(fā)明ic-lamp鑒定體系的特異性檢測(cè)結(jié)果，曲線(xiàn)1-4的反應(yīng)模板為利用免疫磁珠捕獲含有志賀氏菌的混合菌（分別混合大腸桿菌、金黃色葡萄菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞桿菌）的裂解液，曲線(xiàn)5-8為利用免疫磁珠捕獲混合菌種大腸桿菌、金黃色葡萄菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞桿菌的裂解液；

圖4為本發(fā)明ic-lamp鑒定體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其反應(yīng)模板為污染樣品的裂解液，曲線(xiàn)1是未用免疫磁珠捕獲污染樣品的裂解液，菌濃度為8.7×10⁰cfu/ml，曲線(xiàn)2-7是用免疫磁珠捕獲污染樣品的裂解液，菌濃度分是8.7×10⁵，8.7×10⁴，8.7×10³，8.7×10²，8.7×10¹，8.7×10⁰cfu/ml，曲線(xiàn)8為去核酸酶水作為模板的陰性對(duì)照。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明，但本發(fā)明保護(hù)范圍不局限于所述內(nèi)容，實(shí)施例中使用的試劑和方法，如無(wú)特殊說(shuō)明，均采用常規(guī)試劑和使用常規(guī)方法。

實(shí)施例1：特異性靶基因的引物設(shè)計(jì)

1、本地blast分析

從ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/)中下載的志賀氏菌ipah基因，對(duì)本地的核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行本地blast檢索，獲取得到菌種各序列片段與數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果。

2、引物設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)以基因名ipah，genbank登陸號(hào)為m32063.1（251..1849）的序列設(shè)計(jì)特異引物。針對(duì)ipah基因的3'端的f3c、f2c和flc區(qū)以及5'端的bl、b2和b3區(qū)6個(gè)不同的位點(diǎn)設(shè)計(jì)4種引物，包括一對(duì)內(nèi)引物（fip、bip）和一對(duì)外引物(f3、b3)，該引物用于lamp技術(shù)檢測(cè)，其中外引物還用作pcr反應(yīng)的上、下游引物，用于志賀氏菌的鑒定。

實(shí)施例2：lamp檢測(cè)方法的建立

1、dna的提取

（1）用北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司的細(xì)菌基因組dna小量提取試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：

1）取志賀氏菌培養(yǎng)液5ml，12000rpm離心1分鐘，盡量吸凈上清；

2）向留有菌體沉淀的離心管中加入500μl細(xì)胞懸浮液，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌細(xì)胞沉淀，37℃溫浴30分鐘；每隔10分鐘顛倒混勻數(shù)次；12000rpm離心2分鐘，盡量吸凈上清；

3）向菌體沉淀中加入225μl緩沖液a，振蕩至菌體徹底懸?。?/p>

4）向管中加入6μlrnasea溶液，振蕩15秒，室溫放置5分鐘；

5）向管中加入10μl蛋白酶k溶液，顛倒混勻；

6）加入25μl裂解緩沖液s，顛倒混勻；

7）加入250μl緩沖液b，振蕩10秒，70℃放置10分鐘。12,000rpm離心1分鐘，取上清放入一新管中，棄去沉淀；

8）加入250μl無(wú)水乙醇，充分振蕩混勻15秒，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀，瞬時(shí)離心以去除管蓋內(nèi)壁的水珠；

9）將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱中(吸附柱放入收集管中)，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；

10）向吸附柱中加入500μl緩沖液c，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；

11）向吸附柱中加入700μl漂洗液w2，12000rpm離心30秒，倒掉廢液，將吸附柱放入收集管中；

12）向吸附柱中加入500μl漂洗液w2，12000rpm離30秒，倒掉廢液，將吸附柱放回收集管中；然后12000rpm離心2分鐘，將吸附柱置于一個(gè)新的1.5ml離心管中，室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

13）將吸附柱轉(zhuǎn)入一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加100μl洗脫緩沖液te，室溫放置2分鐘，12000rpm離心2分鐘，將溶液收集到離心管中。

（2）使用直接裂解液，其配方為：

溶液a：125mmnaoh、1mmedta、0.1％tween20；

溶液b：125mmhcl、10mmtrishcl；

取志賀菌樣加入10μl溶液a65℃孵育10min，加入10μl溶液b，混勻即可。

2、陽(yáng)性質(zhì)粒載體構(gòu)建及獲得

（1）靶序列pcr擴(kuò)增

以志賀氏菌的基因組dna為模板，對(duì)特異基因進(jìn)行pcr擴(kuò)增，將其擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

（2）目的產(chǎn)物的回收

從脂糖凝膠中切下目的片段，用北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司的小量瓊脂糖凝膠dna回收試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：

1）將單一的目的dna條帶從瓊脂糖凝膠中切下(盡量切除多余部分)放入干凈的離心管中，稱(chēng)取重量；

2）向膠塊中加入2倍體積溶膠液，55℃水浴10分鐘，其間不斷溫和地上下翻轉(zhuǎn)離心管，以確保膠塊充分溶解；

3）將上一步所得溶液加入一個(gè)吸附柱中，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

4）向吸附柱中加入700μl漂洗液w2，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

5）向吸附柱中加入50μl漂洗液w2，12,000rpm離心1分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

6）將吸附柱放入收集管中，12,000rpm離心2分鐘，盡量除去漂洗液；

7）將室溫吸附柱置于室溫放置數(shù)分鐘，徹底晾干。將吸附柱放入到一個(gè)干凈離心管，向吸附柱中間懸空滴加30μl的洗脫緩沖液te，室溫放置2分鐘。12,000rpm離心2分鐘，收集dna溶液。

（3）連接、轉(zhuǎn)化及篩選

1）大腸桿菌dh5α感受態(tài)細(xì)胞的制備

①挑取單個(gè)dh5α菌落，接種于3ml不含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)過(guò)夜，次日取上述菌液按比例1:100再接種于50mllb培養(yǎng)基中，37℃振蕩2小時(shí)。當(dāng)od600值達(dá)到0.35時(shí)，收獲細(xì)菌培養(yǎng)物；

②將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到一個(gè)50ml預(yù)冷的無(wú)菌聚丙烯管中，冰上放置10分鐘，使培養(yǎng)物冷卻；

③于4℃下4100rpm離心10分鐘，吸出培養(yǎng)液，并將管倒置l分鐘以使殘留的培養(yǎng)基流盡；

④每50ml初始培養(yǎng)液用30ml預(yù)冷的0.1mol/lcacl2-mgcl2溶(80mmol/lmgcl2，20mmol/lcacl2)重懸細(xì)胞沉淀；

⑤于4℃下4100rpm離心10分鐘，吸出上清液，并將管倒置l分鐘以使殘留的液體流盡；

⑥每50ml初始培養(yǎng)物用2ml預(yù)冷的0.1mol/lcacl2溶液重懸細(xì)胞沉淀，分裝后備用。

2）連接到pmd19-tsimple

①在微量離心管中加入1μltakarapmd19-tsimple載體、4μl目的基因基因pcr產(chǎn)物及5μl的連接酶緩沖混合物；

②16℃反應(yīng)過(guò)夜。

3）轉(zhuǎn)化dh5α

①全量(10μl)加入至100μldh5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30分鐘；

②42℃加熱90秒后，再在冰中放置1分鐘；

③加入37℃溫浴過(guò)的lb培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60分鐘；

④取200μl涂布于含有氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)16h以形成單菌落；

（4）陽(yáng)性克隆的篩選

挑取上述單菌落于含氨芐青霉素的lb培養(yǎng)基中，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)4h，以m13f（tgtaaaacgacggccagt）和m13r（caggaaacagctatgacc）為引物進(jìn)行菌落pcr擴(kuò)增。對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳后紫外觀(guān)察，將經(jīng)pcr驗(yàn)證正確的陽(yáng)性克隆送昆明碩擎生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

（5）陽(yáng)性質(zhì)粒提取

挑取上述單菌落于lb培養(yǎng)基中，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)4h，進(jìn)行pcr擴(kuò)增；擴(kuò)增引物f3（ataccgtctctgcacgca）、b3（gccttctgatgcctgatgg），擴(kuò)增條件：95℃，5min；95℃，30s；46℃，30s；72℃，30s；72℃，7min；16℃，∞；將經(jīng)pcr確證的陽(yáng)性克隆，接種于lb液體培養(yǎng)基，37℃，160rpm培養(yǎng)過(guò)夜。取每個(gè)菌株過(guò)夜培養(yǎng)液5ml，用北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司小量質(zhì)粒提取試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒抽提，具體操作步驟如下：

1）取5ml過(guò)夜培養(yǎng)的菌液，加入離心管中，12,000rpm離心1分鐘，盡量吸除上清；

2）向留有菌體沉淀的離心管中加入250μl溶液1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀；

3）向離心管中加入250μl溶液2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次使菌體充分裂解；

4）向離心管中加入350μl溶液3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，即出現(xiàn)白色絮狀沉淀。12,000rpm離心10分鐘，此時(shí)在離心管底部形成沉淀。將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱中，12,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

5）向吸附柱中加入700μl漂洗液w2，12,000rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

6）向吸附柱中加入500μl漂洗液w2，12,000rpm離心60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱放入收集管中；

7）將吸附柱放入收集管中，12,000rpm離心2分鐘，置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；

8）將吸附柱置于一個(gè)干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加60μl洗脫緩沖液te，室溫放置2分鐘，12,000rpm離心1分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。

（6）陽(yáng)性質(zhì)粒濃度測(cè)定

打開(kāi)thermoscientificbiomate3s紫外分光光度計(jì)，預(yù)熱15分鐘；選定mode方式為dsdna，將比色杯用超純水反復(fù)洗幾次后加入100μlte緩沖液調(diào)零；將te緩沖液完全吸出，然后加入待測(cè)樣品(1μl樣品加入99μlte緩沖液)，選定稀釋倍數(shù)為100倍進(jìn)行測(cè)定，讀取質(zhì)粒dna濃度。

（7）質(zhì)粒數(shù)目換算及梯度稀釋

陽(yáng)性質(zhì)粒測(cè)完濃度后，分別根據(jù)其所測(cè)濃度換算成質(zhì)粒數(shù)目。質(zhì)粒數(shù)目換算公式為(注：x為質(zhì)粒濃度ng/μl；y為目的產(chǎn)物堿基對(duì)數(shù)；na為阿伏伽德羅常數(shù)；2692為載體堿基對(duì)數(shù)；660為堿基平均分子量)。取已知濃度的質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋到底。

3、菌落計(jì)數(shù)

（1）菌液的培養(yǎng)

配制lb固體培養(yǎng)基，用高壓蒸汽滅菌鍋滅菌121℃，20min。將在-80℃冰箱中保藏的志賀氏菌種接種于新鮮的lb液體培養(yǎng)基，37℃震蕩培養(yǎng)12小時(shí)。

（2）稀釋平板計(jì)數(shù)法計(jì)數(shù)及其步驟

1）熔化培養(yǎng)基；

2）倒平皿；

3）梯度稀釋法稀釋原菌樣品；

4）涂平皿：

選取1/10⁶，1/10⁷，1/10⁸三個(gè)稀釋度計(jì)數(shù)，每皿取菌液0.1ml，用玻璃刮鏟涂布均勻，每個(gè)稀釋度做一個(gè)重復(fù)；

5）37℃倒置培養(yǎng)1天；

6）計(jì)數(shù)：

每1ml原菌樣品中微生物的活細(xì)胞數(shù)（菌落形成數(shù)，cfu=（同一稀釋度平板上菌落平均數(shù)×稀釋倍數(shù)）/原菌樣品體積（ml）；

結(jié)果：圖1(a)為利用正向外引物f3、反向外引物b3進(jìn)行pcr鑒定體系的特異性檢測(cè)結(jié)果，泳道2的反應(yīng)模板為志賀氏菌的基因組；泳道3至泳道7依次為大腸桿菌、金黃色葡萄菌、沙門(mén)氏菌、李斯特桿菌、銅綠假單胞桿菌基因組；泳道8為去核酸酶水作為模板的陰性對(duì)照；（b）利用正向外引物f3、反向外引物b3進(jìn)行pcr鑒定體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其反應(yīng)模板為質(zhì)粒，泳道2-10其質(zhì)粒濃度依次為10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、100copies/ml，泳道11為去核酸酶水作為模板的陰性對(duì)照；

圖2(a)為利用正向外引物f3、反向外引物b3、正向內(nèi)引物fip、正向反向內(nèi)引物bip進(jìn)行l(wèi)amp鑒定體系的特異性檢測(cè)結(jié)果，泳道2的反應(yīng)模板為志賀氏菌的基因組，泳道3至泳道7依次為大腸桿菌、金黃色葡萄菌、沙門(mén)氏菌、李斯特桿菌、銅綠假單胞桿菌基因組，泳道8為去核酸酶水作為模板的陰性對(duì)照；（b）為本發(fā)明lamp鑒定體系的靈敏度檢測(cè)結(jié)果，其反應(yīng)模板為質(zhì)粒，泳道2-11其濃度依次為10⁰、10¹、10²、10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹copies/ml，泳道12為去核酸酶水作為模板的陰性對(duì)照。

4、建立ic-lamp鑒定體系

（1）志賀氏菌的培養(yǎng)

取出凍存的菌液進(jìn)行l(wèi)b平板劃線(xiàn)，于37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)過(guò)夜。第二天挑取單克隆于lb液體培養(yǎng)基中37℃，180轉(zhuǎn)/小時(shí)培養(yǎng)4-5小時(shí)。

（2）志賀氏菌多克隆抗體的制備

將培養(yǎng)好的菌液稀釋到10⁸cfu/ml，并進(jìn)行滅活，取100μl與等體積的弗氏完全佐劑混合均勻免疫bab/c小鼠；第一次免疫后14天進(jìn)行第二次免疫，取100μl與等體積的弗氏不完全佐劑混合均勻免疫bab/c小鼠；第三，四次免疫與第二次免疫相同；第四次免疫4天后摘眼球取血分離多抗血清。

（3）利用免疫磁珠捕獲抗原

（a）抗原的準(zhǔn)備：分別用巴氏滅菌的脫脂奶粉稀釋菌液至終濃度8.7×10⁵、8.7×10⁴、8.7×10³、8.7×10²、8.7×10¹和8.7×10⁰cfu/ml。

（b）磁珠預(yù)處理：將免疫沉淀磁珠（proteina/g偶聯(lián)磁珠）漩渦振蕩1min，使磁珠充分振蕩重懸；取25~50μl（相當(dāng)于25~50μg）磁珠懸液置于1.5mlep管中；加入200μl磷酸鹽緩沖液（pbs：nacl137mmol/l、kcl2.7mmol/l、na2hpo410mmol/l、kh2po42mmol/l、ph7.4）洗滌，進(jìn)行磁性分離（將ep管放置于磁力架上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；該操作描述以下省略），棄上清液，從磁性分離器上取下ep管，重復(fù)洗滌一次，最后加入200μl結(jié)合緩沖液重懸磁珠以備用。

（c）抗體結(jié)合反應(yīng)：將步驟（b）預(yù)處理的磁珠懸液進(jìn)行磁性分離加入300μl的志賀氏菌抗體(1:1000)，于37℃100轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)2小時(shí)。然后進(jìn)行磁性分離，加入1ml的pbs-t重懸后磁性分離（此步驟重復(fù)3次）。

（d）抗原沉淀反應(yīng)：將步驟（a）抗原加入步驟（c）的結(jié)合有志賀氏菌特異抗體的proteina/g偶聯(lián)磁珠溶液中，于37℃100轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)0.5小時(shí)；然后進(jìn)行磁性分離，加入1ml的pbs-t重懸后磁性分離（此步驟重復(fù)3次）。

（e）抗原的裂解：將步驟（d）中的磁珠-抗體-抗原的復(fù)合物中加入10μl的a液（125mmnaoh、1mmedta、0.1％tween20)于65℃反應(yīng)10分鐘，最后加入10μl溶液b終止反應(yīng)。

（4）特異性檢測(cè)

分別用免疫磁珠（結(jié)合有志賀氏菌特異抗體的proteina/g偶聯(lián)磁珠）捕獲含有志賀氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄菌、沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞桿菌混合菌液及不含有志賀氏菌的混合菌液，捕獲完成后進(jìn)行直接裂解；各取6μl作為模板進(jìn)行ic-lamp反應(yīng)。在儀器genieii中的反應(yīng)體系為：15μl2×isothermalmastermix、2μl的10mm正向內(nèi)引物fip、2μl的10mm反向內(nèi)引物bip、0.25μl的10mm反向外引物b3、0.25μl的10mm正向外引物f3，模板（裂解液）6μl，加去核酸酶水補(bǔ)足25μl。反應(yīng)條件：65℃擴(kuò)增30min，98℃-80℃變性10min；

結(jié)果：混合菌中（含有志賀氏菌）均能被ic-lamp檢測(cè)出來(lái)，pcr管在紫外照射下出現(xiàn)綠色熒光，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖3中曲線(xiàn)1、2、3、4所示；而混合菌中（不含有志賀氏菌）均不能被ic-lamp檢測(cè)出來(lái)，pcr管在紫外照射下不出現(xiàn)綠色熒光，檢測(cè)結(jié)果為陰性，其擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖3中的曲線(xiàn)5、6、7、8所示。

（5）靈敏度檢測(cè)

取1-6μl步驟（3）中裂解液進(jìn)行l(wèi)amp反應(yīng)。在儀器genieii中的反應(yīng)體系為：15μl2×isothermalmastermix，內(nèi)游引物fip和bip各20μm，外游引物b3和f3各2.5μm，模板（裂解液）6μl，加去核酸酶水補(bǔ)足25μl。反應(yīng)條件：65℃擴(kuò)增30min，98℃-80℃變性10min；結(jié)果：利用ic-lamp檢測(cè)方法，可將污染樣本中志賀氏菌快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出來(lái)，且檢測(cè)下限達(dá)到8.7×10⁰cfu/ml，pcr管在紫外照射下出現(xiàn)綠色熒光，檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其擴(kuò)增曲線(xiàn)如圖4。其中曲線(xiàn)2、3、4、5、6、7分別表示利用ic-lamp檢測(cè)含有志賀氏菌的樣本（樣本菌濃度依次為8.7×10⁵，8.7×10⁴，8.7×10³，8.7×10²，8.7×10¹，8.7×10⁰cfu/ml），曲線(xiàn)1為普通lamp檢測(cè)污染志賀氏菌樣本（樣本菌濃度為8.7×10⁰cfu/ml）。從圖4中擴(kuò)增曲線(xiàn)出峰的時(shí)間可以看出同樣檢測(cè)同一污染樣品，利用ic-lamp檢測(cè)方法其擴(kuò)增曲線(xiàn)7比普通lamp檢測(cè)方法的擴(kuò)增曲線(xiàn)1出峰時(shí)間早，說(shuō)明利用免疫磁珠捕獲抗原能更有效地富集抗原，在實(shí)際檢測(cè)中更能準(zhǔn)確、靈敏的檢測(cè)出志賀氏菌。

實(shí)施例3：ic-lamp臨床樣本的檢測(cè)

（1）磁珠預(yù)處理

將免疫沉淀磁珠（proteina/g偶聯(lián)磁珠）漩渦振蕩1min，使磁珠充分振蕩重懸。取25~50μl（相當(dāng)于25~50μg）磁珠懸液置于1.5mlep管中。加入200μl結(jié)合緩沖液洗滌，進(jìn)行磁性分離（將ep管放置于磁力架上，使磁珠被吸附在管壁至溶液澄清；該操作描述以下省略），棄上清液，從磁性分離器上取下ep管，重復(fù)洗滌一次，最后加入200μl結(jié)合緩沖液重懸磁珠以備用。

（2）抗體結(jié)合反應(yīng)

將步驟（1）預(yù)處理的磁珠懸液進(jìn)行磁性分離加入300μl的抗體(1:1000)，于37℃100轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)2小時(shí)；然后進(jìn)行磁性分離，加入1ml的pbs-t重懸后磁性分離（此步驟重復(fù)3次）。

（3）抗原捕獲反應(yīng)

在含有志賀氏菌的猴子糞便檢測(cè)樣品中，加入1ml的lb液體培養(yǎng)基漩渦振蕩10s，加入步驟（2）中預(yù)處理好的磁珠抗體的混合物中，輕輕混勻后于37℃100轉(zhuǎn)/分鐘反應(yīng)0.5小時(shí)。然后進(jìn)行磁性分離，加入1ml的pbs-t重懸后磁性分離（此步驟重復(fù)3次）。

（4）抗原的裂解

將步驟（3）中的磁珠-抗體-抗原的復(fù)合物中加入10μl的a液（125mmnaoh、1mmedta、0.1％tween20)于65℃反應(yīng)10分鐘，最后加入10μl溶液b（125mmhcl、10mmtris-hcl）終止反應(yīng)。

（5）ic-lamp反應(yīng)

取1-6μl步驟（4）中的裂解液進(jìn)行ic-lamp反應(yīng)。反應(yīng)體系為：2μl的10mm正向內(nèi)引物fip、2μl的10mm反向內(nèi)引物bip、0.25μl的10mm反向外引物b3、0.25μl的10mm正向外引物f3，模板（裂解液）6μl，2.5μl10×lampbuffer，150mmmg²⁺，40μmdntpsmixtures，1μlbstdnapolymerase加去核酸酶水補(bǔ)足25μl。反應(yīng)條件：63.5℃擴(kuò)增50min，80℃變性2min。

（6）ic-lamp結(jié)果分析

46個(gè)猴子糞便樣本經(jīng)過(guò)傳統(tǒng)的生化鑒定以及血清凝集法檢測(cè)，共檢測(cè)出12個(gè)陽(yáng)性樣本，34個(gè)陰性樣本與ic-lamp檢測(cè)結(jié)果一致。利用兩個(gè)不同的檢測(cè)方法驗(yàn)證了ic-lamp能快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出志賀氏菌，并具有快速、靈敏、高特異性等特點(diǎn)，適合于臨床樣本的檢測(cè)。

本發(fā)明和傳統(tǒng)經(jīng)典方法的在臨床樣本檢測(cè)結(jié)果的符合情況

。

序列表

<110>昆明理工大學(xué)

<120>志賀氏菌的ic-lamp檢測(cè)引物組及其應(yīng)用

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>43

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ctgtcgaagctccgcagaggttttggattccgtgaacaggtcg43

<210>2

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

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<210>3

<211>18

<212>dna

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<212>dna

<213>人工序列

<400>6

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