玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條，屬于食品安全檢測技術(shù)領域。本發(fā)明所述試紙條的檢測墊設置在PVC板上，檢測墊的一端交疊連接吸水墊，另一端交疊連接金標墊，金標墊的遠離檢測墊的一端交疊連接樣品墊，檢測墊以硝酸纖維素膜為基墊，檢測墊依次設有第一檢測線、第二檢測線和控制線，第一檢測線靠近金標墊一側(cè)，第一檢測線包被有抗ZEA單克隆抗體?牛血清白蛋白偶聯(lián)物，第二檢測線包被有抗DON單克隆抗體?牛血清白蛋白偶聯(lián)物，控制線包被有二抗羊抗鼠IgG。本發(fā)明同時快速檢測兩種毒素的免疫層析試紙條，操作簡單方便，一個樣品可以同時獲得兩個檢測結(jié)果，節(jié)省藥品，節(jié)省判斷時間，特別適用于特別現(xiàn)場的快速檢測。
【專利說明】
玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條
技術(shù)領域
[0001] 本發(fā)明屬于食品安全檢測技術(shù)領域;具體涉及一種玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀 菌烯醇雙檢試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002] 隨著科技進步和人民生活水平的提高，人民對食品質(zhì)量安全提出了更高的要求。 尤其是近年來，中國人對乳制品的需求增長，所以對于乳制品的質(zhì)量應予以格外的關(guān)注。隨 著我國農(nóng)獸藥殘留、食品添加劑和生物毒素等問題日益突出，因此加快食品安全檢測技術(shù) 的研究，構(gòu)建食品質(zhì)量和安全保障體系具有重要的現(xiàn)實意義。
[0003] 真菌毒素廣泛存在于糧食作物及其制品中，對動物會造成嚴重危害，且動物食入 真菌毒素污染的谷物，真菌毒素可以殘留在動物體內(nèi)，從而污染肉、蛋、奶等動物性食品，對 人體危害較大，具有致癌，致畸和致突變等作用，由于現(xiàn)在還未有一個較好的脫毒處理辦 法，所以除了加強糧食生產(chǎn)、加工等環(huán)節(jié)的規(guī)范操作，儲存時注意防霉外，目前唯一有效的 辦法是加強糧食的檢測監(jiān)控，及時發(fā)現(xiàn)并剔除受污染糧食，確保食品安全。隨著真菌毒素所 引發(fā)的食品安全事件的頻發(fā)，目前國內(nèi)外真菌毒素的研究不斷加強，限量標準也在不斷降 低，這對食品快速檢測技術(shù)也提出了新的要求:高靈敏度，高特異性、低成本、易商業(yè)化。
[0004] 脫氧雪腐鐮刀菌稀醇（Deoxynivalenol，D0N)和玉米赤霉稀酮（Zearalenone，ZEA) 都是霉菌污染谷物所產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物。DON有一定的毒性作用，人類和動物誤食了被 DON污染的食品后，會發(fā)生嘔吐癥狀;ZEA有很強的類雌激素作用，會危害人和動物的生殖系 統(tǒng)。這兩種毒素廣泛存在于自然中，奶牛的飼料小麥、玉米、大麥等經(jīng)常受到污染，再經(jīng)過消 化進入牛奶中，對人類的健康和安全造成嚴重威脅。因此，研制能夠快速、方便、準確、同時 的檢測牛奶中DON和ZEA免疫層析試紙條具有重要意義。
[0005] 目前，關(guān)于同時檢測DON和ZEA免疫層析試紙條相關(guān)報道極少。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是要提供玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條，其能夠 快速、方便、準確的同時檢測牛奶中DON和ZEA。
[0007] 本發(fā)明中玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條包括樣品墊、金標墊、 檢測墊、吸水墊和PVC板，檢測墊設置在PVC板上，檢測墊的一端交疊連接吸水墊，另一端交 疊連接金標墊，金標墊的遠離檢測墊的一端交疊連接樣品墊，檢測墊以硝酸纖維素膜(NC 膜)為基墊，檢測墊依次設有第一檢測線、第二檢測線和控制線，第一檢測線靠近金標墊一 偵I第一檢測線包被有抗ZEA單克隆抗體(抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體)-牛血清白蛋白偶聯(lián) 物，第二檢測線包被有抗DON單克隆抗體(抗脫氧雪腐鐮刀菌單克隆抗體)-牛血清白蛋白偶 聯(lián)物，控制線包被有二抗羊抗鼠 IgG。
[0008] 所述樣品墊長為16mm~18mm;金標墊長為6mm~7mm;所述吸水墊長為19mm~20mm， 所述試紙條寬為3~4mm。
[0009] 第一檢測線和第二檢測線之間的間距為5mm，第二檢測線和控制線之間的間距為 5mm 〇
[0010] 所述檢測墊與吸水墊交疊2mm~3mm;檢測墊和金標墊交疊2mm~3mm;金標墊和樣 品墊交疊2mm~3mm。
[0011]抗ZEA單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的包被濃度3mg/ml，包被量ΙμL/cm。
[0012]抗DON單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的包被濃度為2mg/ml，包被量ΙμL/cm。
[0013] 二抗羊抗鼠 IgG的包被濃度為lmg/ml，包被量0 · 8μ1/αη。
[0014] 包被液為?!1值為7.5、濃度為1〇111111111〇1/1?85緩沖液，含有3%甲醇。
[0015] 樣品墊是將玻璃纖維浸于50mmol/l硼酸緩沖液中，均勻浸濕后于42°C干燥lh;所 述硼酸緩沖液包含1 % BSA、1.0 % Tween 20和3 %海藻糖，pH值為7.5。
[0016] 所述金標墊的制備方法如下:一、抗體-膠體金標記物溶液的制備:取lmL膠體金溶 液，加入2μ10. lmol/L K2C03，再加入24μ1抗ZEA單克隆抗體和18μ1抗DON單克隆抗體，振蕩混 勻，靜置15min，加入100μΙ濃度為10% (w/v)BSA溶液，振蕩混勻，靜置15min;在4°C、10000r/ min條件下離心15min，將棄去上清液后，沉淀物重懸于100yL20mmol/L復溶液中，獲得抗體-膠體金標記物溶液(粒徑為25nm左右的膠體金），于4°C保存?zhèn)溆?；二、將硝酸纖維素膜(NC 膜)剪裁后浸泡于含〇. 5%Tween 20且pH為8.0的PBS溶液中，均勻浸濕后45°C烘干2h;三、將 步驟一獲得抗體-膠體金標記物溶液與復溶液按1:4體積比混合得到抗體-膠體金標記物溶 液的稀釋液，然后將經(jīng)步驟二預處理無紡布浸于l〇〇yL抗體-膠體金標記物溶液的稀釋液 中，置于60°C烘干lh，用噴條機將抗ZEA單克隆抗體、抗DON單克隆抗體和二抗羊抗鼠 IgG分 別劃線固定在相應位置，60°C干燥lh，得到金標墊，置于干燥環(huán)境備用。
[0017] 本發(fā)明所述試紙條的制備方法:本發(fā)明將樣品墊、金標墊、檢測墊、吸水墊和PVC板 按順序依次粘在PVC板上，其中吸水墊與檢測墊之間、檢測墊和金標墊之間、金標墊和樣品 墊之間都有交疊，用切條機將大卡切成一定寬度的試紙條，和干燥劑一起密封保存。
[0018] 使用方法:待檢樣品中按等體積比加入甲醇和PBS溶液(體積比1:4)中，在5000r/ min下離心5min，吸取上清液獲得樣品提取液；用移液槍取100μ1待測樣品吸附到樣品墊上， 10min后觀察結(jié)果。當?shù)谝粰z測線和第二檢測線同時出現(xiàn)紅色條帶，結(jié)果為陰性(ZEA〈30ng/ ml且D0N〈25ng/ml);當?shù)谝粰z測線出現(xiàn)紅色條帶，第二檢測線不顯色，結(jié)果為陽性（ZEA〈 30ng/ml，D0N彡25ng/ml);當?shù)诙z測線出現(xiàn)紅色條帶，第一檢測線不顯色，結(jié)果為陽性 (ZEA彡30ng/ml，D0N〈25ng/ml) ;當?shù)谝粰z測線和第二檢測線均不顯色，結(jié)果為陽性(ZEA彡 30ng/ml且DON彡25ng/ml)。當控制線不顯色，表明試紙條失效。
[0019] 保存方法:和干燥劑一起密封保存。
[0020] 本發(fā)明同時快速檢測兩種毒素的免疫層析試紙條，操作簡單方便，一個樣品可以 同時獲得兩個檢測結(jié)果，節(jié)省藥品，節(jié)省判斷時間，特別適用于特別現(xiàn)場的快速檢測。
[0021] 本發(fā)明的試紙條室內(nèi)密封可保存三個月以上。
【附圖說明】
[0022] 圖1是本發(fā)明試紙條結(jié)構(gòu)示意圖；圖1中1一一樣品墊，2-一金標墊，3-一檢測墊， 4--吸水墊，5--PVC板，31--第一檢測線，32--第二檢測線，33--控制線；
[0023]圖2是膠體金溶液的電鏡掃描圖；
[0024] 圖3是不同pH值的檢測線結(jié)果；
[0025] 圖4是不同抗原包被濃度的檢測線結(jié)果；
[0026] 圖5是不同膜處理條件的的檢測線結(jié)果；
[0027] 圖6是金標ZEA抗體稀釋倍數(shù)的檢測線結(jié)果；
[0028]圖7是金標DON抗體稀釋倍數(shù)的檢測線結(jié)果；
[0029] 圖8是試紙條的特異性測定；
[0030] 圖9是ZEA快速檢測試紙條的靈敏度；
[0031] 圖10是DON快速檢測試紙條的靈敏度。
【具體實施方式】
[0032]
【具體實施方式】一:結(jié)合圖1進行說明，本實施方式中將樣品墊1、金標墊2、檢測墊3、 吸水墊4和PVC板按順序依次粘在PVC板上，其中吸水墊4與檢測墊3之間、檢測墊3和金標墊2 之間、金標墊2和樣品墊1之間都有交疊，切成3_寬的試紙條，和干燥劑一起密封保存。 [0033]本發(fā)明中玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條包括樣品墊1、金標墊 2、檢測墊3、吸水墊4和PVC板5,檢測墊3設置在PVC板5上，檢測墊3的一端交疊連接吸水墊4， 另一端交疊連接金標墊2,金標墊2的遠離檢測墊3的一端交疊連接樣品墊2,檢測墊3以硝酸 纖維素膜(NC膜)為基墊，檢測墊3依次設有第一檢測線31、第二檢測線32和控制線33,第一 檢測線31靠近金標墊2-側(cè)，第一檢測線31包被有抗ZEA單克隆抗體(抗玉米赤霉烯酮單克 隆抗體)-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，第二檢測線32包被有抗DON單克隆抗體(抗脫氧雪腐鐮刀菌 單克隆抗體)_牛血清白蛋白偶聯(lián)物，控制線33包被有二抗羊抗鼠 IgG。
[0034] 所述樣品墊1長為16mm;金標墊2長為6mm;所述吸水墊4長為20mm，所述試紙條寬為 3mm 〇
[0035] 第一檢測線31、第二檢測線32之間的間距為5mm，第二檢測線32和控制線33之間的 間距為5mm。
[0036] 所述檢測墊3與吸水墊4交疊3mm;檢測墊3和金標墊2交疊3mm;金標墊2和樣品墊1 交疊3mm。
[0037]抗ZEA單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的包被濃度3mg/ml，包被量ΙμL/cm。
[0038]抗DON單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯(lián)物的包被濃度為2mg/ml，包被量ΙμL/cm。 [0039] 二抗羊抗鼠 IgG的包被濃度為lmg/ml，包被量0.8μ1/αη。
[0040] 包被液為?!1值為7.5、濃度為1〇111111111〇1/1?85緩沖液，含有3%甲醇。
[0041] 樣品墊1是將玻璃纖維浸于50mmol/l硼酸緩沖液中，均勻浸濕后于42°C干燥lh;所 述硼酸緩沖液包含1 % BSA、1.0 % Tween 20和3 %海藻糖，pH值為7.5 (采用此種硼酸緩沖液 檢測線顯色最亮）。
[0042]所述金標墊2的制備方法如下：
[0043] 一、抗體-膠體金標記物溶液的制備:取lmL膠體金溶液，加入2μ10. lmol/L K2C03， 再加入24μ1抗ZEA單克隆抗體和18μ1抗DON單克隆抗體，振蕩混勻，靜置15min，加入100μΙ濃 度為10%(w/v)BSA溶液，振蕩混勻，靜置15min;在4°C、10000r/min條件下離心15min，將棄 去上清液后，沉淀物重懸于100yL20mmol/L復溶液中，獲得抗體-膠體金標記物溶液，于4°C 保存?zhèn)溆茫?br>[0044] 步驟一制備的膠體金顆粒大小基本均一，沒有三角形、水滴形等特殊形狀，沒有聚 集現(xiàn)象，見圖2。隨機選取100個顆粒，對直徑做平均數(shù)計算得到膠體金顆粒約為25.17nm。
[0045] 二、將硝酸纖維素膜(NC膜)剪裁后浸泡于含0.5%TWeen 20且pH為8.0的PBS溶液 中，均勻浸濕后45°C烘干2h;
[0046] 三、將步驟一獲得抗體-膠體金標記物溶液與復溶液按1:4體積比混合得到抗體-膠體金標記物溶液的稀釋液，然后將經(jīng)步驟二預處理無紡布浸于i〇〇yL抗體-膠體金標記物 溶液的稀釋液中，置于60°C烘干lh，得到金標墊2,置于干燥環(huán)境備用。
[0047] 本實施方式所述試紙條的制備方法:本發(fā)明將樣品墊1、金標墊2、檢測墊3、吸水墊 4和PVC板按順序依次粘在PVC板上，其中吸水墊4與檢測墊3之間、檢測墊3和金標墊2之間、 金標墊2和樣品墊1之間都有交疊，用切條機將大卡切成一定寬度的試紙條，和干燥劑一起 密封保存。
[0048] 膠體金粒徑逐漸增大，顏色由橙色到紫灰，越來越深(表1)。直徑小的顆?？臻g位 阻大，不易標記;直徑大的顆粒雖然顯色深，但是標記量小，且穩(wěn)定性差。因此，選擇25nm的 膠體金用于制備金標抗，即檸檬酸三鈉添加量為lml制得的膠體金溶液。
[0049] 表1膠體金溶液的性質(zhì)
[00511采用下述試驗驗證發(fā)明效果 [0052]實驗所用的主要試劑如表2所示。
[0053]表2實驗主要試劑

[0056]試驗使用的儲備液如表3所示 [0057]表3實驗使用的儲備液

[0060] 實驗中使用的主要儀器如表4所示。
[0061] 表4主要儀器設備
[0064]實驗中使用的試紙條如表5所示。
[0065]表5試紙條所用材料
[0067] 一、檢測線上抗原包被條件試驗 [0068] (1)包被液pH的確定
[0069] 由于抗原抗體反應形成的復合物是不牢固的，不合適的pH值會破壞抗原抗體間的 非共價鍵結(jié)合，使復合物發(fā)生解離。用不同pH的10mMPBS緩沖液(含3%甲醇)稀釋ZEA-BSA/ D0N-BSA至最適標記濃度，羊抗鼠 IgG分別吸附于NC膜上作為檢測線和質(zhì)控線，制備試紙條 并用于檢測陰性樣品，根據(jù)檢測線的顯色情況判定。
[0070] 蛋白與NC膜的結(jié)合主要分為結(jié)合和長時間結(jié)合兩個階段，這兩個階段都主要都是 靠疏水作用力和靜電作用保證結(jié)合。同時，由于蛋白質(zhì)具有兩性電離的性質(zhì)，抗原抗體的反 應必須在合適的pH環(huán)境中進行，一般抗原抗體的反應pH都在6~9的范圍內(nèi)。本實驗對 口!16.5、7.0、7.5、8.0、8.5的1011^?83緩沖液(含3%甲醇)進行優(yōu)化。結(jié)果如圖3所示，？!17.5 組的檢測線最亮。因此選擇PH7.5的1 OmM PBS緩沖液(含3 %甲醇）作為檢測線抗原的包被 液。
[0071] (2)檢測線抗原包被濃度的確定
[0072] T線抗原的包被濃度直接影響著檢測靈敏度。用含3% (w/w)甲醇的PBS緩沖液 (1 OmM pH7 · 5)將ZEN-BSA/DON-BSA和羊抗鼠 IgG稀釋至6/8、3/4、2/2、1 /1、0 · 5/0 · 5 mg/ml 和 lmg/ml，用移液槍按照ΙμL/cm分別滴于試紙條上的檢測線和質(zhì)控線的位置，每兩條線的間 距均為5mm，6(TC烘干lh。制備試紙條，檢測陰性樣品，根據(jù)結(jié)果確定檢測線抗原的最適包被 濃度。
[0073] 若檢測線包被的抗原濃度過高，會造成試劑的浪費。若檢測線包被的抗原濃度過 低，則會影響檢測的靈敏度。對檢測線檢測抗原包被量的優(yōu)化結(jié)果如圖4所示，隨著檢測抗 原包被濃度的降低，捕獲的金標抗含量降低，檢測線顯色減弱。當ZEA/D0N抗原濃度低于3/ 2mg/ml時，檢測線顯色較淺，尤其是0.5mg/ml時，顯色微弱；當ZEA/D0N抗原濃度高于3/2mg/ ml時，檢測線顯色較深，尤其是6/8mg/ml時，顯色極深。能滿足肉眼觀察的最低濃度即為檢 測抗原包被的最優(yōu)濃度。因此，檢測線包被ZEA-BSA的最優(yōu)濃度為3mg/ml，檢測線包被D0N-BSA的最優(yōu)濃度為2mg/ml。
[0074] (3)NC膜處理條件的確定
[0075] 將劃膜處理的NC膜分別置于室溫（25Γ )、lh，37 Γ、lh，60 Γ、lh，室溫（25Γ )、Id， 37°C、Id，60°C、2h，60°C、3h，60°C、4h烘干處理，其他條件不變，組裝成試紙條檢測陰性樣 品，通過顯色情況進行判定。
[0076] 為了提高抗原在NC膜上的包被效率，使抗體經(jīng)過抗原的時候有更高的結(jié)合率，所 以要對NC膜進行處理。對干燥溫度和干燥時間兩種處理條件的優(yōu)化結(jié)果如圖5。同樣處理 lh，檢測線的顯色隨著溫度升高加深。當溫度高達60°C，檢測線的顯色隨著時間延長減弱， 說明此溫度下過長時間的處理使抗原變的不穩(wěn)定。說明升高溫度和延長干燥時間都有利于 抗原的包被。在包被效果較號好的60 °C、lh和37 °C、1 d兩組中，為提高實驗效率、縮短處理的 時間，60°C干燥lh是NC膜處理的最佳條件。
[0077]二、膠體金標記抗體稀釋倍數(shù)試驗
[0078] 將經(jīng)過離心處理的金標抗體用復溶液按照1:1、1:5、1:10、1:20、1:50、1:80進行稀 釋，其他條件不變，吸附于處理過的金標墊上并置于電熱干燥箱中干燥，與固定濃度的檢測 抗原組裝成試紙條，根據(jù)顯色情況進行判定。
[0079]對膠體金標記抗體稀釋倍數(shù)的優(yōu)化結(jié)果如圖6和7。當ZEA金標抗體/DON金標抗體 的稀釋比例小于1:50/1:20時，檢測線顯色非常微弱，肉眼不能清除分辨，造成錯誤的判定 為陽性結(jié)果。1:50/1:20作為ZEA金標抗體/DON金標抗體，肉眼可清晰觀察到的結(jié)果。
[0080] 四、特異性實驗
[0081 ] 取4?11^?81^?82小81、(^\.的標準溶液10(^1用移液槍滴到樣品墊，1〇1^11后觀 察結(jié)果確定試紙條的特異性。
[0082]用含甲醇的PBS緩沖液(pH7.5)將AFM1、AFB1、AFB2、FB1、OTA、ZEA、DON的標準溶液 稀釋至100ng/ml，分別利用ZEA和DON試紙條進行檢測判定其特異性。特異性驗證結(jié)果如圖 8，AFM1、AFB1、AFB2、FB1、0TA.的檢測線顯色，結(jié)果為陰性，ZEA/D0N的檢測不顯色，結(jié)果為陽 性，表明抗ZEA單克隆抗體、抗DON單克隆抗體和其他毒素無交叉反應，試紙條特異性良好。 [0083]五、靈敏度實驗
[0084] 將ZEA/D0N標準品配置為1. Omg/ml的濃儲液，再用含甲醇的roS緩沖液(pH7.5)配 制成0/0、10/10、30/25、50/50、100/100、200/200ng/ml的標準溶液。用試紙條進行檢測，每 個濃度設兩個重復試驗，l〇min觀察結(jié)果，T線顯色為陰性(_)，T線不顯色為陽性(+ )。
[0085] ΖΕΑ和DON試紙條的靈敏度檢測結(jié)果分別如圖9和圖10,隨著濃度減小，檢測線顏色 逐漸變淺。當ZEA濃度低于30ng/ml時，檢測線顯色，結(jié)果為陰性；同樣當DON濃度低于25ng/ ml時，檢測線顯色，結(jié)果為陰性。因此確定檢測ZEA試紙條的靈敏度為30ng/ml，檢測DON試紙 條的靈敏度為25ng/ml。
[0086] 隨著濃度減小，檢測線顏色逐漸變淺，見圖9和10。當ZEA濃度低于30ng/ml時，檢測 線顯色，結(jié)果為陰性；同樣當DON濃度低于25ng/ml時，檢測線顯色，結(jié)果為陰性。檢測ZEA試 紙條的靈敏度為30ng/ml，檢測DON試紙條的靈敏度為25ng/ml效果最佳。
[0087] 六、穩(wěn)定性實驗
[0088] 將【具體實施方式】一所述的試紙條密封保存于4°C、25°C和37°C。保存于37°C的試紙 條每天取出，分別檢測0/0、50/25、100/50ng/mlZEA/D0N標準品溶液 ;保存于25°C的試紙條 每3d取出，分別檢測0/0、50/25、100/50ng/mlZEA/D0N標準品溶液;保存于4°C的試紙條每 周取出，分別檢測檢測0/0、50/25、100/50ng/mlZEA/D0N標準品溶液，通過結(jié)果判定試紙條 的穩(wěn)定性。
[0089] 試紙條在4°C和25°C下可以密封保存3個月，保持靈敏度不變;37°C密封保存的試 紙條15d內(nèi)靈敏度保持不變，表明本試紙條穩(wěn)定性較好。
【主權(quán)項】
1. 玉米赤霉烯酮和脫氧雪腐鐮刀菌烯醇雙檢試紙條，包括樣品墊（1)、金標墊(2)、檢測 墊(3)、吸水墊(4)和PVC板(5)，其特征在于檢測墊(3)設置在PVC板(5)上，檢測墊(3)的一端 交疊連接吸水墊(4 )，另一端交疊連接金標墊(2 )，金標墊(2)的遠離檢測墊(3)的一端交疊 連接樣品墊(2)，檢測墊(3)以硝酸纖維素膜為基墊，檢測墊(3)依次設有第一檢測線(31)、 第二檢測線(32)和控制線(33)，第一檢測線(31)靠近金標墊(2)-側(cè)，第一檢測線(31)包被 有抗ZEA單克隆抗體-牛血清白蛋白偶聯(lián)物，第二檢測線(32)包被有抗DON單克隆抗體-牛血 清白蛋白偶聯(lián)物，控制線(33)包被有二抗羊抗鼠 IgG。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于所述樣品墊（1)長為16mm~18mm;金 標墊(2)長為6mm~7mm;所述吸水墊(4)長為19mm~20mm，所述試紙條寬為3~4mm。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于第一檢測線（31)和第二檢測線（32) 之間的間距為5mm，第二檢測線(32)和控制線(33)之間的間距為5mm。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于所述檢測墊(3)與吸水墊(4)交疊2mm ~3mm;檢測墊(3)和金標墊(2)交疊2mm~3mm;金標墊(2)和樣品墊（1)交疊2mm~3mm。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于抗ZEA單克隆抗體-牛血清白蛋白偶 聯(lián)物的包被濃度3mg/ml，包被量ΙμΙ/cm。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于抗DON單克隆抗體-牛血清白蛋白偶 聯(lián)物的包被濃度為2mg/ml，包被量ΙμΙ/cm。7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于二抗羊抗鼠 IgG的包被濃度為lmg/ ml，包被量 0.8yl/cm〇8. 根據(jù)權(quán)利要求5、6或7所述的雙檢試紙條，其特征在于包被液為pH值為7.5、濃度為 10mmmol/l PBS緩沖液，含有3%甲醇。9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于樣品墊（1)是將玻璃纖維浸于 5 0 mm ο 1 /1硼酸緩沖液中，均勻浸濕后于4 2 °C干燥1 h;所述硼酸緩沖液包含1 % B S A、1.0 % Tween 20和3%海藻糖，pH值為7.5〇10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙檢試紙條，其特征在于所述金標墊(2)的制備方法如下： 一、 抗體-膠體金標記物溶液的制備:取lmL膠體金溶液，加入2μ10. lmol/L K2C03，再加 入24μ1抗ZEA單克隆抗體和18μ1抗DON單克隆抗體，振蕩混勻，靜置15min，加入100μΙ濃度 為10% (w/v)BSA溶液，振蕩混勾，靜置15min;在4°C、10000r/min條件下離心15min，將棄去 上清液后，沉淀物重懸于100yL20mmol/L復溶液中，獲得抗體-膠體金標記物溶液，于4°C保 存?zhèn)溆茫? 二、 將硝酸纖維素膜剪裁后浸泡于含〇.5%Tween 20且pH為8.0的PBS溶液中，均勻浸濕 后45°C烘干2h; 三、 將步驟一獲得抗體-膠體金標記物溶液與復溶液按1:4體積比混合得到抗體-膠體 金標記物溶液的稀釋液，然后將經(jīng)步驟二預處理無紡布浸于l〇〇yL抗體-膠體金標記物溶液 的稀釋液中，置于60°C烘干lh，用噴條機將抗ZEA單克隆抗體、抗DON單克隆抗體和二抗羊抗 鼠 IgG分別劃線固定在相應位置，60°C干燥lh，得到金標墊(2)，置于干燥環(huán)境備用。
【文檔編號】G01N33/577GK106093406SQ201610374027
【公開日】2016年11月9日
【申請日】2016年5月31日
【發(fā)明人】滿朝新, 姜毓君, 丁木, 周文琦, 姜霞
【申請人】東北農(nóng)業(yè)大學