采用正電荷aie熒光團特異性檢測和量化心磷脂和分離線粒體及該aie熒光團的制造方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及通過在包含樣本的溶液中引入AIE發(fā)光團以及測量所述溶液的熒光強度，從而采用正電荷AIE發(fā)光團檢測和量化樣本中的心磷脂的一步法；以及通過采用AIE發(fā)光團染色含分離線粒體的樣本以及測量熒光強度，從而采用正電荷AIE發(fā)光團量化分離線粒體的方法；以及通過向包含分離線粒體的樣本中引入AIE發(fā)光團，并在顯微鏡下識別染色的分離線粒體，從而采用正電荷AIE發(fā)光團量化分離線粒體的方法，其中所述AIE發(fā)光團染色所述分離線粒體。與其它主要的線粒體膜脂質(zhì)相比，具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光特性的發(fā)光團TTAPE?Me對心磷脂具有更高的靈敏性和杰出的選擇性，因此可以用作心磷脂檢測和量化、以及分離線粒體量化的頗有價值的熒光傳感器。
【專利說明】采用正電荷AIE熒光團特異性檢測和量化心磷脂和分離線粒 體及該AIE熒光團的制造方法
[0001] 相關(guān)申請的交叉引用
[0002] 本專利申請要求2013年12月3日遞交的美國臨時專利申請No.61/963,393的優(yōu)先 權(quán)，該美國臨時專利申請的
【申請人】為本專利申請的發(fā)明人，并且其全部內(nèi)容以引用方式并 入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明主題特別涉及可量化心磷脂（cardiol ipin，CL)且可量化和識別分離線粒 體(特別是來自酵母菌的釀酒酵母(S. cerevisiae)菌株YPH 500)的化合物或鹽。
【背景技術(shù)】
[0004] 真核細胞使用其約5%的基因合成脂質(zhì)。由于脂質(zhì)在細胞中不可或缺的功能，很大 一部分脂質(zhì)得到利用。由于其獨特的結(jié)構(gòu)，脂質(zhì)形成雙層結(jié)構(gòu)以將內(nèi)部成分與細胞外環(huán)境 分離以及將單個細胞器官分區(qū)。除了其屏障功能外，脂質(zhì)也可用于脂滴中的能量儲存和在 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和分子識別過程中作為信使。
[0005] 心磷脂是僅存于線粒體內(nèi)膜的雙磷脂酰甘油脂。心磷脂調(diào)節(jié)參與電子傳遞和氧化 磷酸化的酶的活性。該獨特的脂質(zhì)由四個不飽和的?；満途哂须p負電荷的極性頭組成， 其結(jié)構(gòu)如下：
[0007] 心磷脂與蛋白細胞色素 c(cyt c)之間的相互作用激活蛋白的過氧化物酶的活性 和誘發(fā)線粒體介導(dǎo)的凋亡。在凋亡過程中，心磷脂分布變化，從而影響線粒體中的ATP合成。 同時，心磷脂水平在凋亡過程中以時間依賴地方式降低，且與細胞色素 c到胞液(細胞中的 可見的胞內(nèi)液或細胞質(zhì)基質(zhì)）的釋放和活性氧的生成有關(guān)。
[0008] 除了在細胞凋亡途徑中具有重要作用外，線粒體的心磷脂水平也具有臨床意義。 心磷脂損耗是衰老、Barth綜合征、以及與線粒體呼吸功能相關(guān)疾?。òㄐ呐K缺血、再灌 注、腦膠質(zhì)瘤相關(guān)疾病、心肌肥厚、心臟衰竭)的關(guān)鍵指標。丹吉爾病是心磷脂異常增生導(dǎo)致 的疾病。已有報道指出帕金森病、HIV-1和各種癌癥與心磷脂異常相關(guān)。因此，開發(fā)出檢測和 量化心磷脂的有效方法是非常重要的。
[0009] 現(xiàn)有技術(shù)的各種定量心磷脂的方法包括William Kenneth Lang(US 2004/ 0096903Al)、Wonhwa Cho(US 2012/0225447Al)、Ruey-min Lee(US 2006/0172958A1)、 Fatih M.Uckun(US 2001/0044442A1)和Robert E.Davis(US 2001/0021526A1)披露的各種 方法。然而，這些現(xiàn)有技術(shù)示例一般都面臨著諸如缺乏標準的實驗方案、涉及額外的基質(zhì)并 且方法復(fù)雜的問題。
[0010]特別地，在眾多磷脂中，心磷脂的特異性檢測非常重要。近來已經(jīng)開發(fā)出高分辨率 的液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)的脂質(zhì)組學(xué)分析用于心磷脂量化分析。該有效方法需要復(fù)雜 的設(shè)備和經(jīng)驗豐富的操作人員，因此限制了其應(yīng)用范圍。
[0011]熒光光學(xué)檢測一方面相對簡單可用，另一方面可以提供卓越的靈敏度。早在上世 紀80年代初，即已經(jīng)有采用熒光染料10-正壬基丫啶橙(ΝΑ0)檢測心磷脂和線粒體染色的介 紹了，ΝΑ0的結(jié)構(gòu)如下：
[0013] ΝΑ0的綠色熒光隨著心磷脂的出現(xiàn)減少。然而，采用ΝΑ0量化心磷脂是不可靠的， 因為發(fā)光和激發(fā)最大值均取決于染料濃度，僅在ΝΑ0/心磷脂的摩爾比等于2時才能建立線 性關(guān)系。為了采用ΝΑ0量化線粒體，需要采用非常復(fù)雜的步驟，包括線粒體的固定、長時間培 養(yǎng)、離心。此外，ΝΑ0的斯托克斯位移小、水溶性差，使得其不易在生物系統(tǒng)中使用。ΝΑ0的工 作機制尚不清楚，且性能難以改善，即使采用各種處理方法也是如此。雖然ΝΑ0有許多的缺 點，甚至沒有標準的實驗方案，但是多年來還是一直在使用它，因為目前還沒有別的選擇。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]在替換方案的尋找過程中，具有聚集誘導(dǎo)發(fā)光(ΑΙΕ)特性的發(fā)光團（luminogens) 獲得了廣泛關(guān)注。相對于傳統(tǒng)的染料，當(dāng)以分子狀態(tài)溶解時，AIE發(fā)光團是非發(fā)光的，而當(dāng)其 處于聚集狀態(tài)時，是高熒光性的，這是由于分子內(nèi)運動限制造成的。
[0015] 在一個示例性實施例中，本發(fā)明描述了采用正電荷AIE發(fā)光團檢測和量化樣本中 的心磷脂的一步法，包括:在包含樣本的溶液中引入所述AIE發(fā)光團，以及測量所述溶液的 熒光強度。
[0016] 在另一示例性實施例中，本發(fā)明描述了采用正電荷AIE發(fā)光團量化分離線粒體的 一步法，包括:采用AIE發(fā)光團染色含分離線粒體的樣本，并測量熒光強度。
[0017] 在第三示例性實施例中，本發(fā)明描述了采用正電荷AIE發(fā)光團量化分離線粒體的 一步法，包括:在包含分離線粒體的樣本中引入所述AIE發(fā)光團，其中所述AIE發(fā)光團染色所 述分離線粒體;以及在顯微鏡下識別染色的所述分離線粒體。
【附圖說明】
[0018] 圖1示出了有無囊泡和心磷脂時TTAPE-Me的發(fā)光光譜。含心磷脂的囊泡由pH 7.4 的含T0CL/D0PC( 1:1摩爾比）的25mM HEPES緩沖液組成，無心磷脂的囊泡由pH 7.4的含純 D0PC的25mM HEPES緩沖液組成，[染料]= 10μΜ;[脂質(zhì)]總=22μΜ;λ0Χ = 35Οηπι。
[0019]圖2A是含心磷脂的囊泡的粒度分析。含心磷脂的囊泡由pH 7.4的含T0CL/D0PC(1: 1摩爾比）的25mM HEPES緩沖液組成?？傊|(zhì)濃度:22μΜ。
[0020] 圖2Β是無心磷脂的囊泡的粒度分析。無心磷脂的囊泡由pH 7.4的含純D0PC的25mM HEPES緩沖液組成?？傊|(zhì)濃度:22μΜ。
[0021] 圖3Α是含心磷脂的囊泡和無心磷脂的囊泡在480nm的TTAPE-Me熒光增強α/Ιο-1) 圖譜。
[0022] 圖3Β是I /1 ο-1值的線性區(qū)域和心磷脂濃度，[染料]=1 ΟμΜ; λΜ = 350nm。
[0023] 圖4A是心磷脂含量不同時(2-50%T0CL)，存在LUV時的TTAPE-Me發(fā)光光譜；
[0024]圖4B是在480nm的熒光增強和心磷脂含量的圖譜；[染料]= 10μΜ;[脂質(zhì)]總=22μΜ; Aex = 350nm〇
[0025] 圖5示出了含心磷脂的囊泡隨NaCl濃度變化的發(fā)光光譜(A)，其中[染料]=1 ΟμΜ; [脂質(zhì)]總=22μΜ; λ0Χ = 350nm;確定TTAPE-Me與含心磷脂的囊泡的結(jié)合化學(xué)計量的工作曲線 (B)，其中TTAPE-Me和CL的總濃度保持在20μΜ;在25°C連續(xù)注入TTAPE-Me滴定含心磷脂的囊 泡的量熱曲線(C);以及隨[TTAPE-Me]/[脂質(zhì)]總摩爾比變化的結(jié)合等溫線(D)。其中含C1的 囊泡由T0CL和D0PC( 1:1摩爾比）組成。
[0026] 圖6示出了BSP0TPE的發(fā)光光譜，以及添加含心磷脂囊泡和無心磷脂囊泡的 BSP0TPE的發(fā)光光譜。含心磷脂囊泡和無心磷脂囊泡分別由pH 7.4的含T0CL/D0PC( 1:1摩爾 比）或含純D0PC的25mM HEPES緩沖液組成，其中[染料]= 10μΜ;[脂質(zhì)]總=22μΜ;λ0Χ = 35Οηπι。
[0027] 圖7示出了（A)TTATO-Me和（Β)具有不同脂質(zhì)含量的囊泡的ΝΑΟ(從左到右：20% T0CL，100 % D0PC，40 %DPPE，2 % 大豆PI，1 % D0PS，和2 % SM;各類囊泡的剩余組分為D0PC)的 熒光強度的變化；（C)TTAPE-Me和(D)具有含心磷脂的全組分囊泡和無 CL的全組分囊泡的 ΝΑ0的發(fā)光光譜；以及插圖C和D中示出的熒光強度變化的條形圖(E)(紅色表示含心磷脂的 囊泡，而藍色表示無 C的囊泡）。其中[染料]=ΙΟμΜ;[脂質(zhì)]總=22μΜ;對于TTAPE-Me，λ0Χ = 350nm 且 Xem=480nm;對于 NA0:Xex=499nm 且 Xem=530nm〇
[0028] 圖8示出了DNA含量不同時(pUC 18DNA，2686bp)TTAPE-Me的發(fā)光光譜。示出具有含 心磷脂的LUV的TTAPE-Me作為對照。其中[染料]=1 ΟμΜ; Aex = 350nm。
[0029] 圖9A示出了pH 7.4的25mM HEPES緩沖液中，含T0CL的全組分LUV(17%T0CL, 39 · 5 %D0PC, 38 · 8 %DPPE, 1 · 7 % 大豆PI, 1 %D0PS和2 % SM)的粒度分析。
[0030] 圖9B示出了pH 7.4的25mM HEPES緩沖液中，無 T0CL的全組分LUV(56.5%D0PC, 38 · 8 %DPPE, 1 · 7 % 大豆PI, 1 %D0PS和2 % SM)的粒度分析。
[0031] 圖10A示出了SEM緩沖液（250mM蔗糖，lmMEDTA，10mMM0PS-K0H，pH7·2)中具有不 同含量的酵母線粒體的TTAPE-Me在480nm的發(fā)光強度。
[0032]圖10B示出了日光下拍攝的TTAPE-ME染色的酵母線粒體的圖像，其中[染料]= 10μ M;Aex = 350nm。
[0033] 圖10C示出了紫外光下拍攝的TTAPE-ME染色的酵母線粒體的圖像，其中[染料]= 10yM；Aex = 350nm〇
[0034] 圖11示出了具有不同磷脂的LUV出現(xiàn)時，化合物1的發(fā)光光譜。
[0035] 圖12示出了具有含心磷脂和無心磷脂的全組分囊泡的化合物2的發(fā)光光譜。
[0036] 圖13示出了具有含心磷脂和無心磷脂的全組分囊泡的化合物3的發(fā)光光譜。
[0037]圖14示出了具有不同磷脂的LUV出現(xiàn)時，化合物3的發(fā)光光譜。
[0038]圖15示出了具有不同磷脂的LUV出現(xiàn)時，化合物4的發(fā)光光譜。
【具體實施方式】
[0039] 發(fā)明人發(fā)現(xiàn)某些AIE發(fā)光團可以用于量化心磷脂和分離線粒體。更具體地說，這些 AIE發(fā)光團可以施加到樣本、細胞或囊泡，從而使細胞成像。從而可量化心磷脂或分離線粒 體。
[0040] AIE發(fā)光團可以是熒光團TTAPE-ME。該TTAPE-ME可以結(jié)合脂結(jié)合蛋白，該脂結(jié)合蛋 白可以是任何蛋白的脂結(jié)合片段。
[0041] 心磷脂可以位于胞漿或膜中。該膜可以是細胞膜或是脂質(zhì)囊泡的形式。脂質(zhì)囊泡 可能是大單層囊泡（LUV)，即囊泡的直徑為約60nm至800nm、70至800nm、80nm至800nm、90nm 至800nm、100nm至700nm、200nm至600nm、300nm至500nm、400nm至800nm、500nm至800nm、 600]11]1至80011111、或700111]1至800 〇
[0042] 細胞膜可能是真核生物細胞膜。該真核細胞膜可能是哺乳動物細胞膜，其中該哺 乳動物細胞膜可能是上皮細胞、成纖維細胞、角質(zhì)形成細胞、巨噬細胞、單核細胞、肌肉細胞 或神經(jīng)細胞的結(jié)構(gòu)成分。
[0043] 在此提供了量化心磷脂或分離線粒體的方法。AIE發(fā)光團可以施加或引入生物樣 本、細胞或脂質(zhì)囊泡中，其中AIE發(fā)光團結(jié)合到心磷脂或分離線粒體。接著可以基于細胞或 脂質(zhì)囊泡的成像分析量化該AIE發(fā)光團結(jié)合的心磷脂或分離線粒體絡(luò)合物。
[0044]
[0045] ^有規(guī)定外，在此使用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有和本發(fā)明所屬的領(lǐng)域中技 術(shù)人員通常所理解的含義。為了更好地理解本發(fā)明的主題和構(gòu)造附加的權(quán)利要求，提供以 下定義。
[0046] 在此使用的術(shù)語"聚集誘導(dǎo)發(fā)光(aggregation induced emission)"或"ΑΙΕ"是指 化合物基于在非晶或結(jié)晶（固體)狀態(tài)的聚集表現(xiàn)出增強的發(fā)光，而在稀溶液中表現(xiàn)出很弱 的發(fā)光甚至幾乎沒有發(fā)光的現(xiàn)象。
[0047] 在此使用的術(shù)語"發(fā)光強度"是指通常由熒光光譜儀或熒光顯微鏡測量獲得的熒 光/磷光亮度。
[0048]在此使用的術(shù)語"發(fā)光團（luminogen)"是指表現(xiàn)發(fā)光性質(zhì)的化合物。
[0049]在此使用的術(shù)語"焚光團(fluorogen)"是指表現(xiàn)發(fā)光性質(zhì)的化合物。
[0050]在此使用的術(shù)語"片段"是指參考肽、多肽或核酸序列的一部分。
[0051 ]在此使用的術(shù)語"分離"或"分離的"是指從含線粒體的材料分離線粒體的過程，在 該材料中包括與線粒體關(guān)聯(lián)的至少一種不希望的成分或污染物。術(shù)語"分離"包括"分開"、 "凈化"和/或"澄清"。而不需要特定水平的線粒體分離。
[0052] 術(shù)語"芳基"是指具有單環(huán)(例如苯環(huán)）、多環(huán)(例如聯(lián)苯)或其中至少一個環(huán)是芳香 烴環(huán)的縮合環(huán)(例如萘基、1，2,3,4_四氫化萘、蒽基、或菲基）的芳香羧酸基團，其可不被取 代或者可被一個或多個其他上述取代基取代。
[0053] 在此使用的術(shù)語"雜芳基"是指其中至少一個環(huán)是芳香烴環(huán)的雜環(huán)。雜環(huán)化合物可 以是飽和的、不飽和的，或是具有單環(huán)、多環(huán)或多個縮合環(huán)的芳香羧酸基團，并且在其至少 一個環(huán)中具有至少一個雜原子如氮、氧或硫。
[0054] 在此使用的術(shù)語"烷基"是指有支鏈或無支鏈的烴鏈，其包含指定數(shù)量的碳原子。 例如，&-C6直鏈或支鏈烷基鏈包含1到6個碳原子，且包括但不限于例如甲基、乙基、丙基、異 丙基、丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、正己基等的取代基。在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，"烷基"也 可以指其烴鏈中的任何的碳原子可以任選地被〇、NH、S或S0 2替換的烷基。例如，正戊基的第 2位碳原子可以被0替代而形成丙氧基甲基。
[0055] 在此使用的術(shù)語"不飽和烷基"是指有支鏈或無支鏈的不飽和烴鏈，其包含指定數(shù) 量的碳原子。例如，C2-C 6直鏈或支鏈烯基鏈包含具有至少一個雙鍵的2到6個碳原子，且包括 但不限于例如乙烯基、丙烯基、異丙烯基、丁烯基、異丁烯基、叔丁烯基、正-戊烯基、正己烯 基等的取代基。在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)，"不飽和烷基"也可以指其不飽和烴鏈中的任何的 碳原子可以任選地被〇、NH、S或S0 2替換的不飽和烷基。例如，4-戊烯的第2位碳原子可以被0 替換而形成(2-丙烯)氧基甲基。
[0056] 在此使用的術(shù)語"環(huán)烷基"是指包含指定數(shù)量的碳原子的有機環(huán)取代基。例如，C3_ C8環(huán)烷基包含3到8個碳原子以形成三、四、五、六、七或八元環(huán)，包括例如環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán) 戊基、環(huán)己基、環(huán)庚基、環(huán)辛基等。
[0057] 除另有說明外，在此使用的術(shù)語"一"或"一個"包括單數(shù)和復(fù)數(shù)。因此，術(shù)語"一"、 "一個"或"至少一個"可以在該本申請中互換使用。
[0058]在本申請中，各個實施例的描述使用"包括"的描述。然而，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理 解，在某些特定的情況下，一個實施例可以替代使用"基本上由…組成"或"由…組成"進行 描述。
[0059] 為了更好地理解本發(fā)明的教導(dǎo)，而非限制本發(fā)明的范圍，除另有說明外，所有的表 示數(shù)量、百分比或比例的數(shù)值，或其他在本發(fā)明說明書或權(quán)利要求書中使用的其他數(shù)值，在 所有情況中都應(yīng)該理解為是大約的數(shù)值。因此，除另有說明外，在下述說明書和后附的權(quán)利 要求書中出現(xiàn)的數(shù)值參數(shù)是估計的，并且取決于試圖獲得的性質(zhì)。至少，每個數(shù)值參數(shù)至少 應(yīng)被解釋為根據(jù)記載的有效數(shù)字通過應(yīng)用普通的四舍五入獲得。
[0060] 使用的縮寫列表 [00611 AIE聚集誘導(dǎo)發(fā)光
[0062] bp堿基對
[0063] BSP0TPE水溶性AIE發(fā)光團
[0064] CL心磷脂
[0065] cyt c細胞色素 c
[0066] D0PC 1，2_二油錫-甘油-4-磷酸膽堿
[0067] D0PS 1，2_二油錫-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸(鈉鹽）
[0068] DPPE (1，2二棕櫚錫-甘油-3-磷脂酰乙醇胺）
[0069] HEPES 4-(2-輕乙基）-1-哌嗪乙磺酸
[0070] I/Io熒光增強
[0071] ITC等溫滴定量熱法
[0072] LC-MS液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用 [0073] 最大發(fā)射
[0074] λΜ激發(fā)波長
[0075] LUV大單層囊泡
[0076] Μ 摩爾
[0077] MHz 兆赫
[0078] mL 毫升
[0079] 禮毫摩爾
[0080] mmol 毫摩爾 [0081 ] mtDNA 線粒體DNA
[0082] ΝΑΟ 10-正壬基丫啶橙
[0083] nm 納米 [0084] NMR核磁共振 [0085] ppm百萬分之一 [0086] pUC質(zhì)?？寺≥d體
[0087] S.cerevisiae 釀酒酵母
[0088] SEM掃描電鏡
[0089] SM N-己?；?D-鞘磷脂
[0090] soy PI L-α-磷脂酰肌醇（Soy)(鈉鹽）
[0091 ] T0CL 1，Γ，2，2 ' -四油酰雙磷脂酰甘油脂
[0092] TPE四苯基乙烯
[0093] TTAPE-Me 1，1，2,2_四[4-(2-三甲基氨根乙氧基)苯基]四溴化乙烯
[0094] UV紫外光
[0095] μπι 微米
[0096] 麵
[0097] ΑΙΕ發(fā)光團可以施加或引入生物樣本、細胞或脂質(zhì)囊泡中。ΑΙΕ發(fā)光團可以注入樣 本、細胞或囊泡中。ΑΙΕ發(fā)光團也可以通過蛋白轉(zhuǎn)染劑轉(zhuǎn)染至樣本、細胞或囊泡。轉(zhuǎn)染劑可以 是Influx?吞噬細胞加載劑或脂質(zhì)制劑，如BIOPORTER?轉(zhuǎn)染劑。
[0098] 樣本可包括一個或多個細胞和/或一個或多個脂質(zhì)囊泡。所述細胞或脂質(zhì)囊泡可 能來自受實驗者的任何細胞類型、組織或體液，且包括用于組織學(xué)目的的組織切片例如活 檢和尸檢樣本、冰凍切片，血液，頭發(fā)，粘液，血漿，唾液，血清，皮膚，痰，大便，和眼淚。細胞 類型和組織還包括腹水，腦脊液，婦科液，肺組織或細胞，淋巴液，腹腔液，尿液，陰道清洗 收集液，或陰道沖洗收集液。組織或細胞類型可以通過從受實驗者取出細胞樣本提供，但也 可以通過使用以前分離的細胞，例如在其他時間、其他人和/或出于其他目地分離的細胞。 檔案組織，例如有治療或結(jié)果史的檔案組織也可以使用。
[0099]鍾
[0100] 含AIE發(fā)光團的細胞或脂質(zhì)囊泡可用于成像分析。成像分析可能涉及成像顯微鏡 系統(tǒng)，特別是熒光顯微鏡、共聚焦顯微鏡和/或雙光子顯微鏡的使用。
[0101] 量化
[0102] 可以通過基于sFCS (熒光相關(guān)光譜掃描）的比率分析或計算量化細胞或脂質(zhì)囊泡 中的心磷脂。對于比率分析，可提供校準曲線。該曲線可以基于FB/FG和目標脂質(zhì)，其中F值 是通過對應(yīng)不同的帶通濾波器通道，對含F(xiàn)LBP(熒光脂質(zhì)結(jié)合蛋白）且具有已知濃度的目標 脂質(zhì)(且可任選含有一種或多種其它脂質(zhì)）的成像脂質(zhì)囊泡或細胞進行光子計數(shù)而確定的。 校準曲線接著可以用于確定目標脂質(zhì)的濃度。
[0103] 對于細胞和/或細胞膜測量，F(xiàn)b的最小值可取自胞液，F(xiàn)b的最大值可在施加過量目 標脂質(zhì)到細胞之后評定。接著可使用上述的校準曲線從觀察的F B/FC值確定細胞心磷脂濃 度。
[0104] 趄
[0105] 可以使用量化心磷脂和分離線粒體的方法來診斷紊亂和/或癌癥。量化的心磷脂 或分離線粒體與參考標準的比較值可以指示是否脂質(zhì)代謝酶正常工作。該參考標準可以是 來自具有或不具有紊亂的單獨個體的可比樣本中出現(xiàn)的量值。
[0106] 該紊亂可包括心磷脂損耗，和與線粒體呼吸功能相關(guān)、與心磷脂異常增生和與心 磷脂異常相關(guān)的疾病。特別地，該紊亂可包括衰老、Barth綜合征、心臟缺血、再灌注、腦膠質(zhì) 瘤、心肌肥厚、心臟衰竭、丹吉爾癥、帕金森病、HIV-1和各種癌癥。
[0107] 試劑盒/檢驗
[0108] 本發(fā)明提供了一種檢驗方法，包括在當(dāng)AIE發(fā)光團曝露于測試樣本中的蛋白時， 檢測和/或測量AIE發(fā)光團結(jié)合的步驟。該檢驗可包括識別和/或分離結(jié)合到所述AIE發(fā)光團 的所述蛋白的步驟。所述AIE發(fā)光團可用于從包含多種蛋白的測試樣本中檢測/測量/識別 和/或分離多于一種心磷脂結(jié)合蛋白。多于一種AIE發(fā)光團可用于檢測/測量/識別和/或分 離多于一種心磷脂結(jié)合蛋白，所述測試樣本可以是組織或組織培養(yǎng)提取物，優(yōu)選裂解提取 物。該測試樣本可通過在包含至少一種非離子表面活性劑（例如1RIT0N(RTM)X-100或NP-40)的緩沖液中的裂解細胞獲得。所述AIE發(fā)光團可在存在或不存在可溶性心磷脂的情況下 曝露于所述測試樣本?？杀容^多于一個測試樣本間的蛋白質(zhì)探針結(jié)合以確定所述樣本之間 的心磷脂結(jié)合蛋白變化。
[0109] 本發(fā)明的檢驗中可使用清潔劑以減少AIE發(fā)光團的非特異性結(jié)合。在此，AIE發(fā)光 團包括共價連接到微珠或其它微粒的心磷脂衍生物，可使用清潔劑增加所述微珠/微粒的 可溶性。
[0110] 此外，結(jié)合到閃爍劑的AIE發(fā)光團可用于識別與心磷脂反應(yīng)的心磷脂結(jié)合蛋白的 拮抗劑和興奮劑。該用途特別適合候選的拮抗劑/興奮劑的高通量篩選，特別是單步高通量 篩選。測試已知與心磷脂結(jié)合的放射標記蛋白（例如氚標記的亮氨酸或35S-蛋氨酸)與本發(fā) 明的探針的結(jié)合，本發(fā)明的探針在一個或多個候選拮抗劑和/或興奮劑存在或缺失的情況 下與閃爍劑結(jié)合。使用結(jié)合到閃爍劑的AIE發(fā)光團的優(yōu)點在于，心磷脂結(jié)合蛋白與AIE發(fā)光 團的正常結(jié)合（即，在沒有任何候選拮抗劑或興奮劑的對照樣本中）、降低結(jié)合或增強結(jié)合 (即，在具有興奮劑或拮抗劑的樣本中）之間的差異比沒有閃爍劑時要大得多。因此，采用興 奮劑和拮抗劑更易識別。
[0111] 從組織提取物中識別心磷脂結(jié)合蛋白的常用方法如下。使用標準方法均質(zhì)組織， 產(chǎn)生兩種成分，胞液和細胞膜。該胞液成分按照1:1比例混合緩沖液A(50mM Tris-HCl pH 8.0，150mM NaCl，10mM EDTA，1 %NP-40，蛋白抑制劑），接著采用本發(fā)明的探針在緩沖液B中 (50mM Tris-HCl pH 7.5,150mM NaCl，5mM EDTA，0.1%Tween-20,0.02%疊氮化鈉）均衡培 育30分鐘。該細胞膜成分按照1: 3比例與含2%NP-40的緩沖液A在冰上混合30分鐘。接著以 100,000 Xg旋轉(zhuǎn)1小時以產(chǎn)生可溶性膜提取物。該提取物與如上所述均衡和處理的心磷脂 微珠（即本發(fā)明的探針，其在固相是微珠)混合。該樣本在4C放入旋轉(zhuǎn)器2小時，然后冷卻后 采用緩沖液B洗滌三次。這些清洗是非常重要的，因為它們將移除非特異結(jié)合蛋白。接下來 的修飾提供了格外的特異性水平:在引入微珠之前，在多個樣本中的一個樣本中加入過量 的可溶性心磷脂(該可溶性心磷脂溶液是通過干燥氯仿中溶解的C: 12或C:8心磷脂，然后在 緩沖液A中懸浮，且超聲處理5分鐘從而獲得250mM原液制成的）。假設(shè)過量的可溶性心磷脂 將與心磷脂在微珠上競爭，這樣將導(dǎo)致回轉(zhuǎn)結(jié)合到微珠的蛋白量減少。從凝膠中切取感興 趣的帶，用胰蛋白酶處理。通過質(zhì)譜分析從各個帶產(chǎn)生的胰蛋白酶消化物。
[0112] 本發(fā)明的AIE發(fā)光團可用作來自不同組織和體液的心磷脂結(jié)合蛋白的通用分析工 具?？蓪θ魏渭毎愋偷陌汉图毎こ煞植捎帽景l(fā)明的AIE發(fā)光團篩選心磷脂結(jié)合蛋白。 在所有情況下，胞漿或膜成分可以進行如上所述檢驗。
[0113] 本發(fā)明的主旨包括多個方面，下列非限制性實施例中對這多個方面進行了描述。
[0114] 在一個實施例中，本發(fā)明描述了使用正電荷AIE發(fā)光團在樣本中檢測和量化心磷 脂的一步法，包括將AIE發(fā)光團引入含所述樣本的溶液中，以及測量所述溶液的熒光強度。
[0115] 在另一個實施例中，本發(fā)明描述了采用正電荷AIE發(fā)光團量化分離線粒體的方法， 包括:采用AIE發(fā)光團染色含分離線粒體的樣本，以及測量熒光強度。
[0116] 在另一個實施例中，本發(fā)明描述了采用正電荷AIE發(fā)光團量化分離線粒體的方法， 包括:在包含分離線粒體的樣本中引入所述AIE發(fā)光團，其中所述AIE發(fā)光團染色所述分離 線粒體；以及在顯微鏡下識別染色的所述分離線粒體。特別地，優(yōu)選在光學(xué)顯微鏡下，更優(yōu) 選在熒光顯微鏡下，識別染色的所述分離線粒體。
[0117] 在一個實施例中，可以在任何上述方法中使用的所述AIE發(fā)光團具有選自下列組 的化學(xué)式的主鏈結(jié)構(gòu)：

[0120] 其中每個R、R'、R"和R'"可分別選自：
[0122] 化合物1-4
[0123] 因為AIE發(fā)光團對心磷脂的特異性探測基于探針和目標被分析物之間的靜電反 應(yīng)，因此建議使用正電荷AIE發(fā)光團。研究的用于心磷脂檢測的AIE發(fā)光團包括如下化合物 1-4：
[0125] 圖11-15示出了化合物1-4的發(fā)光光譜。
[0126] TTAPE-Me
[0127] I心磷脂量化
[0128] 在實施例，受到cyt c和心磷脂的特異性反應(yīng)啟發(fā)，設(shè)計和合成正電荷ΑΙΕ熒光團 用于心磷脂檢測。該正電荷AIE熒光團設(shè)計成1，1，2,2_四[4-(2-三甲基氨根乙氧基)苯基] 四溴化乙烯(TTAPE-Me )，且具有以下結(jié)構(gòu)：
[0130] AIE熒光團TTAPE-Me按照如下方式合成：
[0132]基于AIE機制，TTAPE-Me染料需要在結(jié)合到含心磷脂的膜時才能激發(fā)熒光，這可以 實現(xiàn)心磷脂的檢測和量化。在其季銨基團的幫助下，TTAPE-Me是完全可溶的，因此按照AIE 熒光團的一般性質(zhì)，水溶液中沒有熒光。如圖1所示，TTAPE-Me在出現(xiàn)含心磷脂的囊泡時發(fā) 射熒光。
[0133] TTAPE-Me的熒光隨著含心磷脂的囊泡的總脂質(zhì)濃度的增加而顯著增加，而對于無 心磷脂囊泡，TTAPE-Me的熒光發(fā)射非常弱（圖SAhTTAPE-Me在480nm的熒光增強（I/Io-l)在 心磷脂濃度為0-1 ΟμΜ時成線性關(guān)系，該濃度范圍位于線粒體膜的心磷脂的生理范圍內(nèi)。心 磷脂的線性檢測也可以采用T0CL(2-50%T0CL)在囊泡中的含量變化獲得（圖4Α-4Β)。該研 究結(jié)果表明，在CL的檢測和量化中，允許靈活的TTAPE-Me和心磷脂的比例。相反地，傳統(tǒng)的 ΝΑΟ在量化測量中，要求ΝΑΟ/心磷脂嚴格遵守2:1的比例。此外，心磷脂的檢測可以在將囊泡 與探針混合之后就非常迅速地完成而不需要任何其它處理。
[0134] TTAPE-Me是具有四苯基乙烯(ΤΡΕ)疏水核心和四季銨親水基團的雙性分子。如圖 5A所示，離子化強度影響TTAPE-Me的熒光強度。隨著氯化鈉濃度的增加，染料的熒光減弱， 這證實了 TTAPE-Me通過靜電引力結(jié)合心磷脂。Na+離子與染料結(jié)合分子競爭。一旦染料在溶 液中釋放，分子內(nèi)的運動不再受到限制，因此將停止發(fā)射熒光。
[0135] 1，2_二油錫-甘油-4-磷酸膽堿(D0PC)是真核細胞膜中最豐富的磷脂，并具有以下 結(jié)構(gòu)：
[0137] 然而，疏水性相互作用是不太可能涉及到的。雖然心磷脂均具有長烷基鏈，但是 TTAPE-Me僅結(jié)合到心磷脂。
[0138] BSP0TPE是具有兩個負電荷的水溶性AIE發(fā)光團，其具有如下結(jié)構(gòu)：
[0140] BSP0TPE用作對照，因為其并沒有對含CL囊泡顯示出顯著的熒光增強（圖6)。
[0141] 根據(jù)AIE原則，TTAPE-Me僅在結(jié)合時發(fā)射熒光，因此，該熒光可以報告TTAPE-Me與 含心磷脂囊泡的結(jié)合。接著可記錄TTAPE-Me與含心磷脂的LUV的發(fā)光強度變化率且與工作 曲線關(guān)聯(lián)（圖5B)。該曲線在~0.67具有峰值，對應(yīng)T0CL與TTAPE-Me的2:1的結(jié)合率。該結(jié)合 率非常精確地匹配電荷比，從而為TTAPE-Me與心磷脂的結(jié)合主要受到靜電作用提供了非常 好的支持?？刹捎玫葴氐味繜岱ǎ↖TC)來確定親和力，這將指明TTAPE-Me與心磷脂的相互 作用是放熱過程（圖5C)。該結(jié)合曲線通過對每個進樣峰的面積進行積分并隨后減去染料分 子的稀釋熱而生成（圖f5D)。曲線擬合得到2.08 X 10-6Μ的解離常數(shù)。
[0142] 為了進一步評價TTAPE-Me對心磷脂的特異性，同樣檢驗了TTAPE-Me對線粒體膜上 出現(xiàn)的其他主要脂質(zhì)的響應(yīng)。評價的其他主要脂質(zhì)是1，2二棕櫚錫-甘油-3-磷脂酰乙醇胺 (DPPE)：
[0144] L-α-磷脂酰肌醇（soy PI):
[0146] 1，2_二油錫-甘油-3-磷酸-L-絲氨酸(DOPS):
[0148] 和
[0149] N-己酰基-D-鞘磷脂（SM):
[0151] 制造六種不同的LUV，這六種不同的LUV包含超過線粒體膜含量的上述脂質(zhì)和 T0CL、D0PC，余量為D0PC填充的各種類型的LUV。
[0152] 如圖7A所示，對于T0CL囊泡，TTAPE-Me選擇性發(fā)射熒光。而對于具有生理濃度的脂 質(zhì)組分的其他囊泡，TTAPE-Me不會產(chǎn)生任何的熒光變化。雖然D0PS和PI帶負電荷，其每個分 子可攜帶一個電荷，且分別僅共享1%到2%的總線粒體膜脂質(zhì)(對于心磷脂~20%)。因此， 少量的D0PS和大豆PI不會影響TTAPE-Me用于心磷脂檢測的選擇性和靈敏性。
[0153] 另一方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可能認為負電荷線粒體DNA (mtDNA)干擾TTAPE-Me的心 磷脂檢測。然而，在對照實驗中，在質(zhì)粒出現(xiàn)時，沒有觀察到TTAPE-Me的熒光增強。圖8顯示 了質(zhì)粒，環(huán)狀雙鏈mtDNA模型，在很寬的濃度范圍內(nèi)，這意味著mtDNA的出現(xiàn)不會使CL量化變 得復(fù)雜。
[0154] 同時，為了模擬線粒體膜，制備含心磷脂或無心磷脂的全組分LUV。該含心磷脂或 無心磷脂的全組分LUV由上述脂質(zhì)按照其生理學(xué)比例混合的混合物組成（圖9A-9B)。對于無 心磷脂的全組分LUV，TTAPE-Me的發(fā)光光譜與緩沖液中的自由染料的光譜相同（圖7C)。對于 含心磷脂的全組分LUV，藍綠熒光增強3倍以上（圖7C&E)。采用ΝΑ0作為探針進行平行實驗。 ΝΑ0是關(guān)閉式傳感器，其熒光在心磷脂存在時減少（圖7D)。然而，心磷脂不是誘導(dǎo)ΝΑ0信號降 低的唯一脂質(zhì)，其他脂質(zhì)，例如DPPE，PI或D0PS都可以誘導(dǎo)ΝΑ0信號降低較大程度（圖7Β)。除 了選擇性差以外，ΝΑΟ的靈敏度遠低于TTAPE-Me (圖7E)。
[0155] II線粒體量化
[0156] 除了心磷脂檢測外，還驗證了TTAPE-Me在線粒體量化中的使用。采用雙縮脲法從 釀酒酵母菌株YPH 500中分離和校準單個線粒體。如圖10A所示，隨著線粒體數(shù)量的增加， TTAPE-Me的熒光發(fā)射逐漸增加。在TTAPE-Me的熒光強度和線粒體濃度之間建立線性關(guān)系。 采用TTAPE-Me染色的分離線粒體在熒光顯微鏡下可清楚可見（圖10B-10C)，其結(jié)果表明，采 用TTAPE-Me可以簡單輕松地以高靈敏度和低背景噪聲的方式完成線粒體的量化。相比之 下，使用ΝΑ0量化分離線粒體費時且程序復(fù)雜。分離線粒體需要用甲醛固定，然后經(jīng)過多次 漂洗、離心分離和再懸浮的步驟。此外，利用ΝΑ0的信噪比要小得多，這可能是因為ΝΑ0在溶 液中具備很強的背景噪聲。
[0157] 總之，已經(jīng)研發(fā)出水溶性的ΑΙΕ熒光團TTAPE-Me用于心磷脂(位于線粒體內(nèi)膜的獨 特的磷脂)的檢測和量化。TTAPE-Me熒光通過含心磷脂的囊泡選擇性開啟，且其強度與心磷 脂的濃度或片段成比例。作為熒光開啟傳感器，TTAPE-Me可以用于分離線粒體的定量分析 和可視化。與作為目前唯一市售的心磷脂檢測染料的ΝΑ0相比，TTAPE-Me提供更高的靈敏度 和選擇性，以及定義良好的工作機制，而不會涉及任何困難或者不清楚的實驗步驟。由于 具有這些優(yōu)點，在臨床診斷和線粒體相關(guān)研究的一系列應(yīng)用中，TTAPE-Me是用于心磷脂的 特異性檢測和量化的ΝΑ0的良好的替代品。
[0158] 示例
[0159] TTAPE-Me的心磷脂檢測確定
[0160] 為了確定TTAPE-Me能夠特異性地檢測心磷脂，制備直徑為100-200nm的兩種類型 的大單層囊泡(LUV)(圖2A和2B)。采用在真核細胞膜上含量最豐富的純1，2_二油錫-甘油-4-磷酸膽堿(D0PC)制備無心磷脂的囊泡。采用1，1'，2,2'_四油酰雙磷脂酰甘油脂(T0CL)和 D0PC的混合物制備含心磷脂的囊泡，其中兩性離子的D0PC用于固定囊泡。如圖1中所示，在 含心磷脂的囊泡出現(xiàn)時，TTAPE-Me的熒光發(fā)射開啟。
[0161] TTAPE-Me 的一般合成
[0162] 4,4'-二(8-溴乙氧基）二苯甲酮(8)的合成。將1，8-二溴乙烷(3.88，14.0謹 〇1)添 加到4，4 ' -二羥基二苯甲酮（1.0g，4.7mmol)和碳酸鉀（1.3g，9.3mmol)的丙酮(50ml)混合物 中。將混合物回流攪拌12h。在過濾和溶劑蒸發(fā)后，將粗產(chǎn)物采用氯仿作為洗脫劑在硅膠柱 洗脫純化。獲得白色粉末產(chǎn)物B，產(chǎn)率為66%(3.1(^)。1^ = 0.5(氯仿）。1!1麗1?(40010^， CDC13)，δ(ρρπι): 7.78(d，4H)，6.94((1,4H) ,4.05(t，4H) ,3.42(t，4H) ,1.89-1 ·80(ι?，8H)， 1.48-1.39(111，16!1)。13(：匪R(100MHz，CDCl 3)，S(ppm):193.9，161.8，131.6，129.9，113.3， 67·5，33·3，32·1，28·5，28·4，28·0，27·4，25·3。
[0163] 1，1，2,2-四[4-(8-溴乙氧基）苯基]乙烯(C)的合成。在B(1.0g，1.7mmol)的50ml THF懸浮液中加入TiC14(0.19mL，1.7mmol)和鋅粉(0.22g，3.4mmol)?；亓?0小時，反應(yīng)混合 物冷卻至室溫，過濾。在真空中蒸發(fā)溶劑，然后將粗產(chǎn)品用氯仿/正己烷（l :lv/V)作為洗脫 劑在硅膠柱洗脫純化。獲得黃色粘稠液體產(chǎn)物C，產(chǎn)率為62% (0.6克）。心=0.5(氯仿/正己 烷= 1:1),Η NMR(400MHz，CDCl3)j(ppm):6.99-6.90(m，8H)，6.63-6.60(m，8H) ,3.87-3.80 (m,8H) ,3.41-3.39(m,8H),1.86-1.70(m,16H),1.34-1.26(m,32H)〇13C NMR (100MHz, CDC13)，δ(ρρπι):157.9,137.5,133.2,129.9,114.2,68.3,55.6,34.7,33.4,29.9,29.3, 28.7,26.6〇
[0164] 1，1，2,2-四[4-(2-三甲基氨根乙氧基)苯基]四溴化乙烯(TTAPE-Me)的合成。采用 過量的三甲胺季銨化C生成TTAPE-Me。獲得淺黃色粉末產(chǎn)物，產(chǎn)率為85 %。4 NMR(400MHz， D20)，δ(ρρπ〇 :7.09(d，8H)，6.83(d，8H)，4.46(t，8H)，3.80(t，8H)，3.25(8,36!1)。13(：匪1? (100MHz，D2〇)J(pp m):155.4,139.2,137.4,132.3,113.7,64.8,61.6,53.7.MS(T0F)，m/e 855 · 6561 ([M-2Br-3CH3]+，計算值855 · 6725)。
[0165] 基于在此包含的信息，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不偏離下述權(quán)利要求的精神 和范圍的情況下，對本發(fā)明的精確描述做出各種改變是顯而易見的。本發(fā)明的主題不限于 在此定義的步驟、性質(zhì)或組分，因為這些優(yōu)選的實施例以及其他描述是用于示例本發(fā)明的 各個特定方面。實際上，對于化學(xué)、生物化學(xué)或相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可以對本發(fā)明所 描述的示例做出各種修改，這些修改都落入本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種采用正電荷AIE發(fā)光團檢測和量化樣本中的心磷脂的一步法，包括： 在包含所述樣本的溶液中引入所述AIE發(fā)光團，以及 測量所述溶液的熒光強度。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述AIE發(fā)光團具有選自下列組的化學(xué)式的主鏈 結(jié)構(gòu)：ν Q3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述ΑΙΕ發(fā)光團包括具有下列通式的主鏈結(jié)構(gòu)： ''> 〇4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述ΑΙΕ發(fā)光團包括具有下列通式的主鏈結(jié)構(gòu)：5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述ΑΙΕ發(fā)光團通過靜電作用僅結(jié)合負電荷心磷 脂。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述量化的心磷脂是包含在大單層囊泡中的心磷 脂的形式。7. -種采用正電荷AIE發(fā)光團量化分離線粒體的方法，包括： 采用AIE發(fā)光團染色含分離線粒體的樣本；以及 測量熒光強度。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述AIE發(fā)光團具有選自下列組的化學(xué)式的主鏈 結(jié)構(gòu)：其中每個R、R'、礦和R…分別選目7| H wp.9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其中，所述AIE發(fā)光團包括具有下列通式的主鏈結(jié)構(gòu)：10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述AIE發(fā)光團包括具有下列通式的主鏈結(jié)構(gòu)：〇.11. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中，所述量化的分離線粒體來自釀酒酵母菌株YPH 500 〇12. -種采用正電荷AIE發(fā)光團量化分離線粒體的方法，包括： 在包含分離線粒體的樣本中引入所述AIE發(fā)光團，其中所述AIE發(fā)光團染色所述分離線 粒體；以及 在顯微鏡下識別染色的所述分離線粒體。13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述AIE發(fā)光團具有選自下列組的化學(xué)式的主 鏈結(jié)構(gòu)：IX.其中每個R、R'、R"和R'"分別選自〇14. 根據(jù)權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述AIE發(fā)光團包括具有下列通式的主鏈結(jié)構(gòu)：r\ 015. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述AIE發(fā)光團包括具有下列通式的主鏈結(jié)構(gòu)：16. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述量化的分離線粒體來自釀酒酵母菌株YPH 500 〇
【文檔編號】C09K11/06GK105874319SQ201480062369
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2014年12月3日
【發(fā)明人】唐本忠, 洪煜檸, 梁瑋彤
【申請人】香港科技大學(xué)