技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及涉及用于檢測意大利蜜蜂mrjp2基因表達(dá)的特異性引物，一種熒光定量pcr技術(shù)檢測意大利蜜蜂王漿主蛋白mrjp2基因表達(dá)的方法。

背景技術(shù)：
：

蜂王漿是由蜂群中青年工蜂頭部的咽下腺和上顎腺分泌而來，呈現(xiàn)為一種黏稠的乳漿狀物質(zhì)，蜂王漿富含多種對機體有益的物質(zhì)，其中蛋白質(zhì)約占干質(zhì)量的50％，包括水溶性蛋白質(zhì)和水不溶性蛋白質(zhì)。水溶性蛋白質(zhì)占蜂王漿中總蛋白質(zhì)含量的46％～89％，為蜂王漿蛋白質(zhì)的主要部分，稱為蜂王漿主蛋白(majorroyaljellyproteins，mrjps)。

王漿主蛋白成分為一個蛋白質(zhì)家族，迄今為止，研究人員已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10個成員(mrjp1～mrjp9和mrjpψ)，分子量在49-87kda，其中5種蛋白質(zhì)，即mrjp1–mrjp5，占蜂王漿總蛋白的82％-90％。

mrjps作為蜂王漿中的主要活性成分，不僅具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑菌、抗氧化、抗疲勞等功效，還具有多種生物學(xué)功能，如參與決定蜂群中雌性蜂的級型分化，為幼蟲的發(fā)育提供必要的可利用氮元素，以及可能在蜜蜂行為調(diào)控中起作用等。但是mrjps中各個成員之間的功能不同，所以針對mrjps中單一組分的研究很有必要。

mrjps家族中，mrjp1和mrjp2是被研究比較全面的成員，二者含量約占蜂王漿總蛋白的47％。mrjp2是蛋白質(zhì)家族的第2個成員，其在蜂王漿主蛋白中含量中等，為16％左右。mrjp2的分子量為49-52.7kda，等電點為6.2～7.9，屬于一種弱堿性糖蛋白。simúth等研究發(fā)現(xiàn)mrjp2可以刺激小鼠巨噬細(xì)胞釋放腫瘤壞死因子(tnf-α)，提出其抗癌應(yīng)用的潛在生理價值。bíliková等研究發(fā)現(xiàn)mrjp2能夠抑制芽孢桿菌屬(paenibacialuslarvea)的生長，提示蜂王漿中功能蛋白組分mrjp2在藥物研究方面的應(yīng)用前景。

我國是養(yǎng)蜂大國，蜂群數(shù)量和蜂產(chǎn)品產(chǎn)量、出口量均居世界第一，目前，中國蜂蜜年產(chǎn)量40多萬噸，占世界蜂蜜總產(chǎn)量1/4以上。近年來其質(zhì)量安全問題多次曝光，已經(jīng)受到政府部門和社會各界的高度重視和普遍關(guān)注。蜂產(chǎn)品質(zhì)量安全隱患主要包括抗生素殘留、重金屬污染以及濫用添加劑等方面。其中，蜂產(chǎn)品中抗生素殘留問題較為嚴(yán)重。蜂產(chǎn)品抗生素殘留主要是蜂病防治過程中用藥不科學(xué)造成的，在意大利蜜蜂養(yǎng)殖過程中，蜜蜂常受白堊病的困擾，蜜蜂白堊病是由于蜂球菌危害引起的，給養(yǎng)蜂業(yè)造成很大威脅。蜂農(nóng)常用苯菌靈藥物來防治蜜蜂白堊病。

苯菌靈別名為1-正丁胺基甲酰-苯并咪唑-2-氨基甲酸甲酯，是一種高效、低毒的廣譜殺菌物質(zhì)，多應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中病蟲害的防治工作，在使用和分析處理過程中，容易轉(zhuǎn)化為多菌靈，多菌靈屬于新型苯胺類苯并咪衍生物，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，降解半衰期較長，能持久地殘留在使用部位，易致累積效應(yīng)對生態(tài)環(huán)境和人類健康造成威脅，若使用不當(dāng)，可對生育能力、危害胎兒、損害遺傳基因，三項人體健康造成影響。

苯菌靈是防治蜂群白堊病的常用藥物，施藥期間對于蜂群所產(chǎn)蜂王漿的品質(zhì)是否有影響，是關(guān)系蜂產(chǎn)品安全生產(chǎn)的大問題。通過觀測蜜蜂體內(nèi)mrjps的表達(dá)水平，可以從一定的程度上反應(yīng)蜂群所產(chǎn)蜂王漿的質(zhì)量。本專利檢測的mrjp2在蜂王漿mrjps占有較大的比例，熒光定量pcr檢測飼喂苯菌靈前后蜂群體內(nèi)mrjp2的相對表達(dá)水平，對于苯菌靈的藥物使用量，蜂產(chǎn)品的安全生產(chǎn)都具有重要的意義。

實時熒光rt-pcr技術(shù)是在常規(guī)pcr技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的核酸定量技術(shù)。實時熒光rt-pcr不僅實現(xiàn)了常規(guī)pcr從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)pcr相比，實時熒光pcr技術(shù)由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進(jìn)一步提高靈敏度；實時熒光rt-pcr技術(shù)全封閉反應(yīng)，無須pcr后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。目前，已廣泛應(yīng)用于分子生物學(xué)和醫(yī)學(xué)研究等領(lǐng)域。隨著實時熒光rt-pcr試劑盒的進(jìn)一步開發(fā)，近年來，實時熒光rt-pcr技術(shù)在動物生態(tài)防治中也得到了廣泛的應(yīng)用。

技術(shù)實現(xiàn)要素：
：

本發(fā)明中意大利蜜蜂mrjp2實時熒光rt-pcr檢測方法的建立，為快速檢測蜂王漿品質(zhì)建立了一個參考指標(biāo)。研究飼喂抗生素對意大利蜜蜂體內(nèi)mrjp2基因表達(dá)量的影響，研究結(jié)果不僅為探究意大利蜜蜂疾病的治療策略提供理論基礎(chǔ)，也為研究抗生素苯菌靈對蜂王漿的品質(zhì)影響提供一定的參考，這對于意大利蜜蜂的疾病防治和蜂產(chǎn)品的安全都具有重要意義。

本發(fā)明的目的是公開一種熒光rt-pcr技術(shù)檢測意大利蜜蜂王漿主蛋白mrjp2基因表達(dá)的方法：

設(shè)計一種采用熒光定量pcr技術(shù)檢測意大利蜜蜂mrjp2基因表達(dá)的特異性引物，其特征在于包括符合熒光pcr反應(yīng)特點的特異上下游引物：

mrjp2-f：5'-tcgcttctcacggtttgtatt-3'

mrjp2-r：5'-agtgattgatgctcgttccag-3'

本發(fā)明所述特異性引物快速檢測意大利蜜蜂mrjp2基因表達(dá)的方法，其特征在于按如下步驟進(jìn)行：

(1)使用下述引物進(jìn)行該基因的檢測：

符合熒光pcr反應(yīng)特點的該序列特異上下游引物：

mrjp2-f：5'-tcgcttctcacggtttgtatt-3'

mrjp2-r：5'-agtgattgatgctcgttccag-3'

(2)總rna的提?。翰捎酶鞣N通用的rna提取方法，從意大利蜜蜂成體中提取總rna；

(3)cdna合成：以意大利蜜蜂總rna為模板合成cdna，反應(yīng)體系為20μl；

(4)實時熒光pcr：以上述合成的cdna為模板，上述(1)中mrjp2-f和mrjp2-r、β-actin-f和β-actin-r為特異性引物，進(jìn)行實時熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)，每個樣品設(shè)3個平行管，擴(kuò)增后所得3個平行管的ct值取平均數(shù)。

(5)苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2的相對表達(dá)量計算：

實時熒光pcr后，當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近時，采用2^－δδct法計算苯菌靈處理前后mrjp2基因的相對表達(dá)量差異。

本發(fā)明所述的檢測方法，其中每條引物分別配制成濃度為100μm的貯存液，工作濃度為2μm。

本發(fā)明進(jìn)一步公開了采用熒光rt-pcr技術(shù)檢測抗生素苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相對表達(dá)量，旨在制備檢測抗菌肽mrjp2在意大利蜜蜂免疫系統(tǒng)調(diào)控中的作用。實驗結(jié)果表明：圖5為抗生素苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相對表達(dá)量。從圖中看出，在苯菌靈脅迫的情況下，意大利蜜蜂體內(nèi)的mrjp2的相對表達(dá)量呈下降的趨勢，這說明藥物苯菌靈對于蜂王漿內(nèi)的mrjp2表達(dá)確實有影響。

本發(fā)明提供的特異性引物快速檢測意大利蜜蜂mrjp2基因表達(dá)的方法，與現(xiàn)有技術(shù)相比的有益效果是：

(1)本發(fā)明采用的實時熒光rt-pcr技術(shù)與常規(guī)pcr相比，實時熒光pcr技術(shù)由自動化儀器收集熒光信號，避免了肉眼判斷的主觀性，可進(jìn)一步提高靈敏度；實時熒光pcr技術(shù)全封閉反應(yīng)，無須pcr后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠性和重復(fù)性。實時熒光rt-pcr技術(shù)也免除了常規(guī)pcr中的電泳、定量掃描等后續(xù)繁瑣步驟，大大縮短了實驗時間。

(2)在通過qrt-pcr的方法研究抗生素苯菌靈處理前后mrjp2基因表達(dá)的變化，結(jié)果顯示苯菌靈脅迫下意大利蜜蜂體內(nèi)的mrjp2基因的表達(dá)水平下調(diào)，說明苯菌靈確實對蜜蜂體內(nèi)mrjp2基因表達(dá)有影響。

(3)因此本發(fā)明研究結(jié)果可為探究意大利蜜蜂白堊病的治療策略提供理論基礎(chǔ)，這對于意大利蜜蜂的疾病防治具有重要意義。

說明書附圖：

圖1為內(nèi)參基因β-actin擴(kuò)增曲線；

圖2為內(nèi)參基因β-actin溶解曲線；

圖3為mrjp2的擴(kuò)增曲線；

圖4為mrjp2的溶解曲線；

圖5為抗生素苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相對表達(dá)量。

具體實施方式：

為了使本發(fā)明實現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

這里所述實施例的方案，不限制本發(fā)明，本領(lǐng)域的專業(yè)人員參照本發(fā)明的精神，可以對其進(jìn)行改進(jìn)和變化，所述的這些改進(jìn)和變化都應(yīng)視為在本發(fā)明的范圍內(nèi)，本發(fā)明的范圍和實質(zhì)由權(quán)利要求來限定；其中所用試劑均有市售。本發(fā)明中所述的意大利蜜蜂總rna的提取、cdna的合成、實時熒光rt-pcr等方法都是本領(lǐng)域成熟的技術(shù)，試劑盒等實驗藥品和試劑都可以從生產(chǎn)商家購買。

實施例1：

獲得意大利蜜蜂mrjp2基因序列

打開beebase(http://hymenopteragenome.org/beebase/)數(shù)據(jù)庫，在搜索欄輸入關(guān)鍵詞mrjp2，搜索到mrjp2一個結(jié)果。點擊mrjp2得到其beebase數(shù)據(jù)庫基因號為gb55212。點擊進(jìn)入基因描述頁面，選中ncbi(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫的鏈接，進(jìn)入ncbi，得到其基因編號為loc406091，ref-seq的mrna編號為nm_001011580.1，protein編號為np_001011580.1，即得到mrjp2的cds以及氨基酸序列。

實施例2：

意大利蜜蜂總rna的提取

選取2組(每組3個平行樣)健康的意大利蜜蜂進(jìn)行抗生素對mrjp2表達(dá)量影響的探究實驗。實驗組三個蜂群依照苯菌靈藥物使用說明，飼喂一周。實驗組三個蜂群飼喂同量的糖水，飼喂一周。處理后選取適量的意蜂工蜂，并保存于-20℃冷凍。

(1)取10頭意蜂工蜂置于無菌研缽內(nèi)，倒入液氮并迅速用研磨棒充分研磨，研磨后將粉末轉(zhuǎn)入1.5ml中，再加1000μlrnaisoplus溶液入離心管，靜置5min。

(2)將200μl氯仿加入離心管，劇烈振蕩5-10min，靜置5min。

(3)4℃下12000rpm離心10min，將上層無色水相轉(zhuǎn)入新無菌離心管中，加入500μl異丙醇，輕柔顛倒混勻，放置10min，12000rpm離心10min。

(4)小心倒掉管中液體，保留沉淀，加入1000μl75％乙醇洗滌沉淀。4℃下7500rpm離心5min，再重復(fù)一次乙醇洗滌沉淀操作。

(5)小心棄去上清液，室溫干燥2min。將rna沉淀溶于50μldepc水中。

(6)所得沉淀即為意蜂總rna，產(chǎn)物立即使用或冷凍保存于-80℃。

實施例3：

cdna的合成

以實施例2所述意大利蜜蜂總rna作為模板。取一消毒的0.2ml離心管，加入以下反應(yīng)體系(20μl體系)：

(1)在冰浴的nuclease-freepcr管中加入以下試劑：rna按照800ng反轉(zhuǎn)。

(2)輕輕混勻后離心3～5s，反應(yīng)混合物在65℃溫浴5min后，冰浴2min，然后離心3～5s。

(3)將試管冰浴，再加入下列試劑：

5×rtbuffer4.0ul

thermoscientificribolockrnaseinhibitor(20u)0.5ul

revertaidpremiumreversetranscriptase(200u)31.0ul

(4)輕輕混勻后離心3～5s

(5)在pcr儀上按照下列條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

①25℃孵育10min

②cdna合成50℃30min

③終止反應(yīng)85℃5min，處理后，置于冰上放置。

(6)將上述溶液-20℃保存。

實施例4：

熒光定量pcr反應(yīng)體系和條件

(1)引物設(shè)計：

根據(jù)所述意大利蜜蜂mrjp2-1基因的全長序列，使用primer5軟件設(shè)計適用于實時熒光rt-pcr檢測的特異性引物，引物序列如下：

mrjp2-f：5'-tcgcttctcacggtttgtatt-3'

mrjp2-r：5'-agtgattgatgctcgttccag-3'

pcr產(chǎn)物預(yù)計長度為199bp

同時，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫里提供的意大利蜜蜂β-actin基因的cds序列設(shè)計用于實時熒光rt-pcr內(nèi)對照的引物，引物序列如下：

β-actin-f：atgccaacactgtcctttctgg

β-actin-r：gacccaccaatccatacgga

pcr產(chǎn)物預(yù)計長度為135bp。

(2)實時熒光pcr：運用sybrgreen嵌合熒光法進(jìn)行rt-pcr分析。使用cf96xpcr儀(bio-rad)進(jìn)行pcr反應(yīng)。以上述實施例3中合成的cdna為模板，使用mrjp2-f和mrjp2-r、β-actin-f和β-actin-r為特異性引物，進(jìn)行實時熒光pcr擴(kuò)增反應(yīng)，每個樣品設(shè)3個平行管，擴(kuò)增后所得3個平行管的ct值(即每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的反應(yīng)循環(huán)數(shù))取平均數(shù)。

實時熒光pcr擴(kuò)增體系設(shè)置如下：

實驗樣本：將cdna樣品稀釋8倍作為模板上機檢測。

實時熒光pcr擴(kuò)增參數(shù)設(shè)置如下：

儀器的操作

完成上述步驟后，把加好樣品的96孔板放在abisteponeplus型熒光定量pcr儀中進(jìn)行反應(yīng)。

抗生素苯菌靈處理前后意大利蜜蜂mrjp2基因的相對表達(dá)量的計算：當(dāng)目的基因與內(nèi)參基因的擴(kuò)增效率相近時，采用2^－δδct法計算苯菌靈處理前后mrjp2基因的表達(dá)差異。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理和主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。

序列表

<110>安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所

<120>一種熒光定量pcr技術(shù)檢測意大利蜜蜂王漿主蛋白mrjp2基因表達(dá)的方法

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1359

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<213>意大利蜜蜂

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<213>意大利蜜蜂

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