本發(fā)明屬于生物組織學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種茄子根莖部組織的石蠟切片的制備方法。

背景技術(shù)：

石蠟組織切片技術(shù)是組織學(xué)常規(guī)制片技術(shù)中最為廣泛應(yīng)用的一種方法。不僅用于觀察正常細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)，也是病理學(xué)和法醫(yī)學(xué)等學(xué)科用以研究、觀察及判斷細(xì)胞組織的形態(tài)變化的主要方法，已廣泛應(yīng)用于眾多學(xué)科領(lǐng)域的研究中。但由于植物的組織結(jié)構(gòu)特異性，不同材料的具體操作方法也不盡相同。

目前，在茄子上開展的石蠟切片技術(shù)研究較少，且效果并不理想（切片破碎不完整且清晰度差）。因此如何克服現(xiàn)有技術(shù)的不足是目前生物組織學(xué)技術(shù)領(lǐng)域亟需解決的問題。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了有效觀察茄子根莖部的組織結(jié)構(gòu)，對(duì)茄子的生理和病理進(jìn)行研究，并解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種茄子根莖部組織的石蠟切片的制備方法。本發(fā)明方法是在傳統(tǒng)石蠟切片的基礎(chǔ)上，對(duì)茄子根莖部組織開展石蠟切片技術(shù)研究，通過技術(shù)改良與創(chuàng)新，最終摸索出的一套簡單高效、可操作性強(qiáng)、可重復(fù)率高、結(jié)果清晰且穩(wěn)定可靠的實(shí)驗(yàn)技術(shù)方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下：

一種茄子根莖部組織的石蠟切片的制備方法，包括如下步驟：

步驟（1）固定與軟化：

選取新鮮茄子植株，截取地上1～3cm處的莖部組織和地下1～3cm處的主根組織作為石蠟切片的試驗(yàn)材料；

將所選的試驗(yàn)材料去雜，截成長為0.48～0.52cm的小段，放入faa固定液中，于3～5℃下固定3～5d；

之后，在固定液中再加入體積是固定液體積5%的甘油對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行初次軟化，5～7d后，將試驗(yàn)材料取出，放置于體積比為1：1的甘油與體積濃度為70%的乙醇混合液中，于35～38℃的暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行二次軟化處理15d以上；

步驟（2）脫水：將經(jīng)步驟（1）處理后的試驗(yàn)材料用體積濃度為30%的乙醇沖洗1～2次，之后將試驗(yàn)材料放置于體積濃度為50%乙醇中30min，取出后再依次放置在體積濃度為70%、85%、95%的乙醇中各處理2h，最后放置在純乙醇中處理2次，每次30min，兩次處理不需要間隔時(shí)間；

步驟（3）透明：將經(jīng)步驟（2）脫水后的試驗(yàn)材料置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中1～2h，之后再置于二甲苯中兩次，每次1.5～2h，兩次處理不需要間隔時(shí)間；

步驟（4）浸蠟：將經(jīng)步驟（3）處理的試驗(yàn)材料浸泡于二甲苯中，放入38℃的烘箱中，并不斷提高烘箱溫度，白天每6h升高1℃，晚上每12h升高1℃，同時(shí)每2h向二甲苯中添加1～2g石蠟粉末；

當(dāng)烘箱溫度升至56～57℃且溶液體積達(dá)到二甲苯體積的2倍以上時(shí)，將試驗(yàn)材料置于石蠟液中處理3次，每次處理24h，且每更換一次石蠟液后烘箱需升溫1℃，最終烘箱溫度為58℃；

步驟（5）包埋：首先對(duì)包埋盒及經(jīng)步驟（4）處理的試驗(yàn)材料進(jìn)行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為65～71℃，之后，先在包埋盒中加入石蠟液至形成底座，石蠟液的加入量為剛剛覆蓋包埋盒底部即可；3～5s后再向包埋盒中倒入能沒過試驗(yàn)材料的石蠟液，待底座變白后將試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)入包埋盒中進(jìn)行包埋，待石蠟液全部凝結(jié)后，將石蠟塊取出，備用；

步驟（6），修蠟與切片：對(duì)步驟（5）得到的石蠟塊進(jìn)行修理，要求將試驗(yàn)材料周圍多余的蠟塊去除，得到切面平整、截面為矩形或梯形的試驗(yàn)材料蠟塊；將試驗(yàn)材料蠟塊切片，切片厚度為8～10μm；

步驟（7），展片與烤片：將蒸餾水與刷過粘片劑的載玻片進(jìn)行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為40～42℃；然后在載玻片上滴上1ml的蒸餾水，之后將步驟（6）得到切片正面朝上放置在載玻片上展片，再用濾紙將多余的蒸餾水吸除；接著將載玻片放置在40～45℃的烘箱中進(jìn)行烤片3～7d，待肉眼可見蠟帶已基本融化即完成烤片；

步驟（8），脫蠟：將步驟（7）烤片后的載玻片從烘箱中拿出后立即放入二甲苯浸泡40min，再換成新的二甲苯浸泡至肉眼觀察試驗(yàn)材料周圍的蠟完全脫去；

步驟（9），復(fù)水：將經(jīng)步驟（8）脫蠟后的載玻片依次放入體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑、純乙醇、體積濃度為95%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為15%乙醇、蒸餾水中，各浸泡2～3min；

步驟（10），染色：將經(jīng)步驟（9）復(fù)水后的載玻片放入質(zhì)量濃度為1%的番紅花紅t水溶液中，于29～31℃的培養(yǎng)箱中放置4～6h，然后依次放置于用蒸餾水、體積濃度為15%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為95%乙醇中，各10s；接著放置于質(zhì)量濃度為1%的固綠溶液中5s，再放置于純乙醇中2次，每次2min；之后放置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中2min，最后放置于二甲苯中2次，每次3～6min；

步驟（11），封片：將步驟（10）染色的載玻片在二甲苯中沾濕后，用擦鏡紙擦去載玻片底部和周圍多余的二甲苯，在載玻片中央滴入加拿大中性樹膠，輕微晃動(dòng)玻片讓中性樹膠與二甲苯充分混合，從載玻片一端輕放上蓋玻片，放入35～40℃的烘箱中烤干，得到茄子根莖部組織的永久切片，即可觀察。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟（1）中，去雜時(shí)，采用流水沖洗去雜。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟（1）中，每100mlfaa固定液中含福爾馬林5ml、冰醋酸5ml、體積濃度為70%的乙醇90ml。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟（1）中，固定所采用的faa固定液體積為試驗(yàn)材料體積的20倍以上。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟（4）、步驟（5）中，石蠟液為石蠟經(jīng)過以上多次加熱沸騰并紗布過濾所得，石蠟的熔點(diǎn)為56～58℃。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟（5）中，預(yù)熱的具體方法是在烘片機(jī)上，對(duì)包埋盒及裝有試驗(yàn)材料的廣口瓶進(jìn)行預(yù)熱；將試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)入包埋盒中是采用經(jīng)酒精燈預(yù)熱過的鑷子來轉(zhuǎn)入。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟（7）中所述的粘片劑的配制方法為1g明膠溶解于100ml蒸餾水中，加入2g苯酚和15ml甘油，充分混勻后于121℃下高溫滅菌，即得。

進(jìn)一步，優(yōu)選的是，步驟（8）中，再換成新的二甲苯浸泡時(shí)間為20min。

本發(fā)明得到的切片可放在光學(xué)顯微鏡下觀察，用測微尺進(jìn)行測量，用顯微成像系統(tǒng)或顯微鏡攝像頭進(jìn)行拍照。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果為：

1、軟化：本方法在軟化過程中，通過在固定液中添加甘油進(jìn)行初次軟化，并使用35～38℃的暗培養(yǎng)箱加溫軟化，從而加速軟化過程、縮短軟化時(shí)間、提高軟化效果，更好的保證了材料的完整性。

2、浸蠟：本方法以38℃為浸蠟起點(diǎn)（軟化處理的溫度），58℃（所用石蠟的最高熔點(diǎn)）為浸蠟終點(diǎn)，并通過每天逐步升高烘箱處理溫度3℃和每2h添加一次石蠟粉末，使得浸蠟過程持續(xù)、完整，浸蠟效果均勻、細(xì)膩；為后期蠟帶和材料的完整、清晰、透明奠定了良好的基礎(chǔ)。

3、預(yù)熱：本方法在包埋、展片和脫蠟時(shí)，均采用了保溫預(yù)熱的方法，使試驗(yàn)材料和蠟在處理過程中避免溫差過大所造成的氣泡、脫離和變形，從而保證了試驗(yàn)材料和蠟帶的良好融合和完整性。

4、染色：由于石蠟切片在染色過程中往往是番紅染色難、固綠染色容易而出現(xiàn)片子發(fā)綠，看不到材料的木質(zhì)部（本應(yīng)被番紅染成紅色）；本方法通過將染缸放入培養(yǎng)箱中處理，并縮短固綠染色時(shí)間，從而有效縮短染色過程、增加染色效果，使染出的片子紅綠分明、組織結(jié)構(gòu)清晰。

5、適用范圍：本方法可重復(fù)性高，適用范圍廣，可用于制作不同茄子材料（栽培茄、野茄）、不同生長時(shí)期（幼苗、成株）的根莖部組織的石蠟切片。

綜上所述，為了對(duì)茄子的病理和生理組織結(jié)構(gòu)變化開展研究，申請(qǐng)人經(jīng)過多次實(shí)驗(yàn)探索出一種快捷、安全、實(shí)用的茄子根莖部組織石蠟切片方法，該方法得到的結(jié)果可操作性強(qiáng)、可重復(fù)率高、穩(wěn)定可靠，鏡下觀察切片質(zhì)量高、效果好、組織結(jié)構(gòu)清晰。本方法不僅可用于研究、觀察及判斷茄子根莖部細(xì)胞組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，從而對(duì)茄子的生理、病理和形態(tài)學(xué)進(jìn)行研究，還可廣泛應(yīng)用于茄果類乃至其它植物的組織切片實(shí)驗(yàn)中，具有較好的科研應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為現(xiàn)有技術(shù)1的顯微鏡圖；圖中1~6均為根部橫切面顯微鏡圖；

圖2為現(xiàn)有技術(shù)2的顯微鏡圖；圖中a圖為野顛茄根橫切面顯微鏡圖；b圖為喀西茄根橫切面顯微鏡圖；

圖3為本發(fā)明切片10倍目鏡×10倍物鏡下的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖4為本發(fā)明切片10倍目鏡×40倍物鏡下的結(jié)構(gòu)示意圖；

圖5為本發(fā)明切片10倍目鏡×100倍物鏡下的結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者，按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

本發(fā)明除非另有說明，否則百分號(hào)代表質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。

本實(shí)施例所采用的烘片機(jī)的型號(hào)為db-b2，廠家為北京亞歐德鵬科技有限公司；

包埋盒中凹槽尺寸為24mm×24mm×9mm，優(yōu)選放入2～4個(gè)試驗(yàn)材料；

本發(fā)明實(shí)施例所采用的石蠟切片機(jī)為徠卡rm2016輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)。

本發(fā)明實(shí)施例用鑷子和接種針將切片正面朝上放置在載玻片上展片。

實(shí)施例1

一種茄子根莖部組織的石蠟切片的制備方法，包括如下步驟：

步驟（1）固定與軟化：

選取新鮮茄子植株，截取地上1～3cm處的莖部組織和地下1～3cm處的主根組織作為石蠟切片的試驗(yàn)材料；

將所選的試驗(yàn)材料采用流水沖洗去雜，截成長為0.48～0.52cm的小段，放入faa固定液中，于3℃下固定3d；每100mlfaa固定液中含福爾馬林5ml、冰醋酸5ml、體積濃度為70%的乙醇90ml；固定所采用的faa固定液體積為試驗(yàn)材料體積的20倍以上。

之后，在固定液中再加入體積是固定液體積5%的甘油對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行初次軟化，5d后，將試驗(yàn)材料取出，放置于體積比為1：1的甘油與體積濃度為70%的乙醇混合液中，于35℃的暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行二次軟化處理15d以上；處理時(shí)間越長軟化效果越好；

步驟（2）脫水：將經(jīng)步驟（1）處理后的試驗(yàn)材料用體積濃度為30%的乙醇沖洗1次，之后將試驗(yàn)材料放置于體積濃度為50%乙醇中30min，取出后再依次放置在體積濃度為70%、85%、95%的乙醇中各處理2h，最后放置在純乙醇中處理2次，每次30min，兩次處理不需要間隔時(shí)間；

步驟（3）透明：將經(jīng)步驟（2）脫水后的試驗(yàn)材料置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中1h，之后再置于二甲苯中兩次，每次1.5h，兩次處理不需要間隔時(shí)間；

步驟（4）浸蠟：將經(jīng)步驟（3）處理的試驗(yàn)材料浸泡于二甲苯中，放入38℃的烘箱中，并不斷提高烘箱溫度，白天每6h升高1℃，晚上每12h升高1℃，同時(shí)每2h向二甲苯中添加1g石蠟粉末；

當(dāng)烘箱溫度升至56～57℃且溶液體積達(dá)到二甲苯體積的2倍以上時(shí)，將試驗(yàn)材料置于石蠟液中處理3次，每次處理24h，且每更換一次石蠟液后烘箱需升溫1℃，最終烘箱溫度為58℃；

步驟（5）包埋：首先對(duì)包埋盒及經(jīng)步驟（4）處理的試驗(yàn)材料進(jìn)行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為65℃，之后，先在包埋盒中加入石蠟液至形成底座；石蠟液的加入量為剛剛覆蓋包埋盒底部即可；3s后再向包埋盒中倒入能沒過試驗(yàn)材料的石蠟液，待底座變白后將試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)入包埋盒中進(jìn)行包埋，待石蠟液全部凝結(jié)后，將石蠟塊取出，備用；

步驟（6），修蠟與切片：對(duì)步驟（5）得到的石蠟塊進(jìn)行修理，要求將試驗(yàn)材料周圍多余的蠟塊去除，得到切面平整、截面為矩形或梯形的試驗(yàn)材料蠟塊；將試驗(yàn)材料蠟塊切片，切片厚度為8～10μm；

步驟（7），展片與烤片：將蒸餾水與刷過粘片劑的載玻片進(jìn)行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為40℃；然后在載玻片上滴上1ml的蒸餾水，之后將步驟（6）得到切片正面朝上放置在載玻片上展片，再用濾紙將多余的蒸餾水吸除；接著將載玻片放置在40℃的烘箱中進(jìn)行烤片3～7d，待肉眼可見蠟帶已基本融化即完成烤片；

步驟（8），脫蠟：將步驟（7）烤片后的載玻片從烘箱中拿出后立即放入二甲苯浸泡40min，再換成新的二甲苯浸泡至肉眼觀察試驗(yàn)材料周圍的蠟完全脫去；從烘箱拿出載玻片時(shí)，采用夾子夾好，中間隔開避免粘片；

步驟（9），復(fù)水：將經(jīng)步驟（8）脫蠟后的載玻片依次放入體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑、純乙醇、體積濃度為95%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為15%乙醇、蒸餾水中，各浸泡2min；

步驟（10），染色：將經(jīng)步驟（9）復(fù)水后的載玻片放入質(zhì)量濃度為1%的番紅花紅t水溶液中，于29℃的培養(yǎng)箱中放置4h，然后依次放置于用蒸餾水、體積濃度為15%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為95%乙醇中，各10s；接著放置于質(zhì)量濃度為1%的固綠溶液中5s，再放置于純乙醇中2次，每次2min；之后放置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中2min，最后放置于二甲苯中2次，每次3min；

步驟（11），封片：將步驟（10）染色的載玻片在二甲苯中沾濕后，用擦鏡紙擦去載玻片底部和周圍多余的二甲苯，在載玻片中央滴入加拿大中性樹膠，輕微晃動(dòng)玻片讓中性樹膠與二甲苯充分混合，從載玻片一端輕放上蓋玻片，放入35℃的烘箱中烤干，得到茄子根莖部組織的永久切片，即可觀察。

其中，步驟（4）、步驟（5）中，石蠟液為石蠟經(jīng)過以上多次加熱沸騰并紗布過濾所得，石蠟的熔點(diǎn)為56～58℃。

步驟（5）中，預(yù)熱的具體方法是在烘片機(jī)上，對(duì)包埋盒及裝有試驗(yàn)材料的廣口瓶進(jìn)行預(yù)熱；將試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)入包埋盒中是采用經(jīng)酒精燈預(yù)熱過的鑷子來轉(zhuǎn)入。

實(shí)施例2

一種茄子根莖部組織的石蠟切片的制備方法，包括如下步驟：

步驟（1）固定與軟化：

選取新鮮茄子植株，截取地上1～3cm處的莖部組織和地下1～3cm處的主根組織作為石蠟切片的試驗(yàn)材料；

將所選的試驗(yàn)材料采用流水沖洗去雜，截成長為0.48～0.52cm的小段，放入faa固定液中，于5℃下固定5d；每100mlfaa固定液中含福爾馬林5ml、冰醋酸5ml、體積濃度為70%的乙醇90ml；固定所采用的faa固定液體積為試驗(yàn)材料體積的20倍以上。

之后，在固定液中再加入體積是固定液體積5%的甘油對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行初次軟化，7d后，將試驗(yàn)材料取出，放置于體積比為1：1的甘油與體積濃度為70%的乙醇混合液中，于38℃的暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行二次軟化處理15d以上；處理時(shí)間越長軟化效果越好；

步驟（2）脫水：將經(jīng)步驟（1）處理后的試驗(yàn)材料用體積濃度為30%的乙醇沖洗2次，之后將試驗(yàn)材料放置于體積濃度為50%乙醇中30min，取出后再依次放置在體積濃度為70%、85%、95%的乙醇中各處理2h，最后放置在純乙醇中處理2次，每次30min，兩次處理不需要間隔時(shí)間；

步驟（3）透明：將經(jīng)步驟（2）脫水后的試驗(yàn)材料置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中2h，之后再置于二甲苯中兩次，每次2h，兩次處理不需要間隔時(shí)間；

步驟（4）浸蠟：將經(jīng)步驟（3）處理的試驗(yàn)材料浸泡于二甲苯中，放入38℃的烘箱中，并不斷提高烘箱溫度，白天每6h升高1℃，晚上每12h升高1℃，同時(shí)每2h向二甲苯中添加2g石蠟粉末；

當(dāng)烘箱溫度升至56～57℃且溶液體積達(dá)到二甲苯體積的2倍以上時(shí)，將試驗(yàn)材料置于石蠟液中處理3次，每次處理24h，且每更換一次石蠟液后烘箱需升溫1℃，最終烘箱溫度為58℃；

步驟（5）包埋：首先對(duì)包埋盒及經(jīng)步驟（4）處理的試驗(yàn)材料進(jìn)行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為71℃，之后，先在包埋盒中加入石蠟液至形成底座；石蠟液的加入量為剛剛覆蓋包埋盒底部即可；5s后再向包埋盒中倒入能沒過試驗(yàn)材料的石蠟液，待底座變白后將試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)入包埋盒中進(jìn)行包埋，待石蠟液全部凝結(jié)后，將石蠟塊取出，備用；

步驟（6），修蠟與切片：對(duì)步驟（5）得到的石蠟塊進(jìn)行修理，要求將試驗(yàn)材料周圍多余的蠟塊去除，得到切面平整、截面為矩形或梯形的試驗(yàn)材料蠟塊；將試驗(yàn)材料蠟塊切片，切片厚度為8～10μm；

步驟（7），展片與烤片：將蒸餾水與刷過粘片劑的載玻片進(jìn)行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為42℃；然后在載玻片上滴上1ml的蒸餾水，之后將步驟（6）得到切片正面朝上放置在載玻片上展片，再用濾紙將多余的蒸餾水吸除；接著將載玻片放置在45℃的烘箱中進(jìn)行烤片3～7d，待肉眼可見蠟帶已基本融化即完成烤片；

步驟（8），脫蠟：將步驟（7）烤片后的載玻片從烘箱中拿出后立即放入二甲苯浸泡40min，再換成新的二甲苯浸泡至肉眼觀察試驗(yàn)材料周圍的蠟完全脫去；從烘箱拿出載玻片時(shí)，采用夾子夾好，中間隔開避免粘片；

步驟（9），復(fù)水：將經(jīng)步驟（8）脫蠟后的載玻片依次放入體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑、純乙醇、體積濃度為95%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為15%乙醇、蒸餾水中，各浸泡3min；

步驟（10），染色：將經(jīng)步驟（9）復(fù)水后的載玻片放入質(zhì)量濃度為1%的番紅花紅t水溶液中，于31℃的培養(yǎng)箱中放置6h，然后依次放置于用蒸餾水、體積濃度為15%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為95%乙醇中，各10s；接著放置于質(zhì)量濃度為1%的固綠溶液中5s，再放置于純乙醇中2次，每次2min；之后放置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中2min，最后放置于二甲苯中2次，每次6min；

步驟（11），封片：將步驟（10）染色的載玻片在二甲苯中沾濕后，用擦鏡紙擦去載玻片底部和周圍多余的二甲苯，在載玻片中央滴入加拿大中性樹膠，輕微晃動(dòng)玻片讓中性樹膠與二甲苯充分混合，從載玻片一端輕放上蓋玻片，放入40℃的烘箱中烤干，得到茄子根莖部組織的永久切片，即可觀察。

其中，步驟（4）、步驟（5）中，石蠟液為石蠟經(jīng)過以上多次加熱沸騰并紗布過濾所得，石蠟的熔點(diǎn)為56～58℃。

步驟（5）中，預(yù)熱的具體方法是在烘片機(jī)上，對(duì)包埋盒及裝有試驗(yàn)材料的廣口瓶進(jìn)行預(yù)熱；將試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)入包埋盒中是采用經(jīng)酒精燈預(yù)熱過的鑷子來轉(zhuǎn)入。

步驟（7）中所述的粘片劑的配制方法為1g明膠溶解于100ml蒸餾水中，加入2g苯酚和15ml甘油，充分混勻后于121℃下高溫滅菌，即得。

步驟（8）中，再換成新的二甲苯浸泡時(shí)間為20min。

實(shí)施例3

一種茄子根莖部組織的石蠟切片的制備方法，包括如下步驟：

步驟（1）固定與軟化：

選取新鮮茄子植株，截取地上1～3cm處的莖部組織和地下1～3cm處的主根組織作為石蠟切片的試驗(yàn)材料；

將所選的試驗(yàn)材料采用流水沖洗去雜，截成長為0.48～0.52cm的小段，放入faa固定液中，于4℃下固定4d；每100mlfaa固定液中含福爾馬林5ml、冰醋酸5ml、體積濃度為70%的乙醇90ml；固定所采用的faa固定液體積為試驗(yàn)材料體積的20倍以上。

之后，在固定液中再加入體積是固定液體積5%的甘油對(duì)試驗(yàn)材料進(jìn)行初次軟化，6d后，將試驗(yàn)材料取出，放置于體積比為1：1的甘油與體積濃度為70%的乙醇混合液中，于37℃的暗培養(yǎng)箱中進(jìn)行二次軟化處理15d以上；處理時(shí)間越長軟化效果越好；

步驟（2）脫水：將經(jīng)步驟（1）處理后的試驗(yàn)材料用體積濃度為30%的乙醇沖洗2次，之后將試驗(yàn)材料放置于體積濃度為50%乙醇中30min，取出后再依次放置在體積濃度為70%、85%、95%的乙醇中各處理2h，最后放置在純乙醇中處理2次，每次30min，兩次處理不需要間隔時(shí)間；

步驟（3）透明：將經(jīng)步驟（2）脫水后的試驗(yàn)材料置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中1.5h，之后再置于二甲苯中兩次，每次1.8h，兩次處理不需要間隔時(shí)間；

步驟（4）浸蠟：將經(jīng)步驟（3）處理的試驗(yàn)材料浸泡于二甲苯中，放入38℃的烘箱中，并不斷提高烘箱溫度，白天每6h升高1℃，晚上每12h升高1℃，同時(shí)每2h向二甲苯中添加1.7g石蠟粉末；

當(dāng)烘箱溫度升至56～57℃且溶液體積達(dá)到二甲苯體積的2倍以上時(shí)，將試驗(yàn)材料置于石蠟液中處理3次，每次處理24h，且每更換一次石蠟液后烘箱需升溫1℃，最終烘箱溫度為58℃；

步驟（5）包埋：首先對(duì)包埋盒及經(jīng)步驟（4）處理的試驗(yàn)材料進(jìn)行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為68℃，之后，先在包埋盒中加入石蠟液至形成底座；石蠟液的加入量為剛剛覆蓋包埋盒底部即可；4s后再向包埋盒中倒入能沒過試驗(yàn)材料的石蠟液，待底座變白后將試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)入包埋盒中進(jìn)行包埋，待石蠟液全部凝結(jié)后，將石蠟塊取出，備用；

步驟（6），修蠟與切片：對(duì)步驟（5）得到的石蠟塊進(jìn)行修理，要求將試驗(yàn)材料周圍多余的蠟塊去除，得到切面平整、截面為矩形或梯形的試驗(yàn)材料蠟塊；將試驗(yàn)材料蠟塊切片，切片厚度為8～10μm；

步驟（7），展片與烤片：將蒸餾水與刷過粘片劑的載玻片進(jìn)行預(yù)熱，預(yù)熱溫度為41℃；然后在載玻片上滴上1ml的蒸餾水，之后將步驟（6）得到切片正面朝上放置在載玻片上展片，再用濾紙將多余的蒸餾水吸除；接著將載玻片放置在43℃的烘箱中進(jìn)行烤片5d，待肉眼可見蠟帶已基本融化即完成烤片；

步驟（8），脫蠟：將步驟（7）烤片后的載玻片從烘箱中拿出后立即放入二甲苯浸泡40min，再換成新的二甲苯浸泡至肉眼觀察試驗(yàn)材料周圍的蠟完全脫去；從烘箱拿出載玻片時(shí)，采用夾子夾好，中間隔開避免粘片；

步驟（9），復(fù)水：將經(jīng)步驟（8）脫蠟后的載玻片依次放入體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑、純乙醇、體積濃度為95%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為15%乙醇、蒸餾水中，各浸泡2.5min；

步驟（10），染色：將經(jīng)步驟（9）復(fù)水后的載玻片放入質(zhì)量濃度為1%的番紅花紅t水溶液中，于30℃的培養(yǎng)箱中放置5h，然后依次放置于用蒸餾水、體積濃度為15%乙醇、體積濃度為30%乙醇、體積濃度為50%乙醇、體積濃度為70%乙醇、體積濃度為85%乙醇、體積濃度為95%乙醇中，各10s；接著放置于質(zhì)量濃度為1%的固綠溶液中5s，再放置于純乙醇中2次，每次2min；之后放置于體積比為1：1的乙醇與二甲苯的混合溶劑中2min，最后放置于二甲苯中2次，每次5min；

步驟（11），封片：將步驟（10）染色的載玻片在二甲苯中沾濕后，用擦鏡紙擦去載玻片底部和周圍多余的二甲苯，在載玻片中央滴入加拿大中性樹膠，輕微晃動(dòng)玻片讓中性樹膠與二甲苯充分混合，從載玻片一端輕放上蓋玻片，放入38℃的烘箱中烤干，得到茄子根莖部組織的永久切片，即可觀察。

其中，步驟（4）、步驟（5）中，石蠟液為石蠟經(jīng)過以上多次加熱沸騰并紗布過濾所得，石蠟的熔點(diǎn)為56～58℃。

步驟（5）中，預(yù)熱的具體方法是在烘片機(jī)上，對(duì)包埋盒及裝有試驗(yàn)材料的廣口瓶進(jìn)行預(yù)熱；將試驗(yàn)材料轉(zhuǎn)入包埋盒中是采用經(jīng)酒精燈預(yù)熱過的鑷子來轉(zhuǎn)入。

步驟（7）中所述的粘片劑的配制方法為1g明膠溶解于100ml蒸餾水中，加入2g苯酚和15ml甘油，充分混勻后于121℃下高溫滅菌，即得。

步驟（8）中，再換成新的二甲苯浸泡時(shí)間為20min。

本發(fā)明得到的切片可放在光學(xué)顯微鏡下觀察，用測微尺進(jìn)行測量，用顯微成像系統(tǒng)或顯微鏡攝像頭進(jìn)行拍照。

如圖1~5，本方法與傳統(tǒng)方法（已報(bào)道文獻(xiàn)）比較可見，本方法鏡下觀察切片質(zhì)量高、效果好、組織結(jié)構(gòu)完整且清晰。

圖1為現(xiàn)有技術(shù)1（王桂芹,王秀艷,段亞軍.茄子砧木與栽培種根的解剖結(jié)構(gòu)比較.2002.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).33(4):255-257.）的根部橫切圖；

圖2為現(xiàn)有技術(shù)2（馬莉,房志堅(jiān).野顛茄及其混淆品喀西茄的性狀與顯微鑒別.中藥材2012,35（2）:216-220.）的橫切顯微鏡圖；

圖1和圖2均來自于以上參考文獻(xiàn)。

本方法與常規(guī)方法比較，結(jié)果如表1所示。

表1

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是說明本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等效物界定。