本發(fā)明涉及基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，以及它們作為治療腫瘤的藥物的用途，所述MSC包含一種或多種外源核酸分子，其中所述外源核酸分子包括可操作地連接于啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合的、編碼一種或多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子或免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的區(qū)域。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包含至少一種外源核酸分子的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，所述外源核酸分子包括編碼例如誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和/或分化的免疫刺激分子的區(qū)域。

本發(fā)明涵蓋MSC作為治療腫瘤和/或腫瘤疾病的藥物的用途，例如通過(guò)調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境以吸引免疫效應(yīng)細(xì)胞和促進(jìn)所述免疫效應(yīng)細(xì)胞的激活和/或記憶表型的過(guò)繼。本發(fā)明的一個(gè)方面涉及所述MSC在抗腫瘤治療中的用途，所述抗腫瘤治療包括聯(lián)合施用所述間充質(zhì)干細(xì)胞與免疫治療，所述免疫治療例如檢查點(diǎn)抑制劑(包括例如抗CTLA-4、PD-1、PD-L1和其他免疫共刺激分子的抗體)，免疫細(xì)胞例如T細(xì)胞(如具有人工T細(xì)胞受體的T細(xì)胞，例如嵌合抗原受體(CAR-T)或外源T細(xì)胞受體(TCR)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞)，NK細(xì)胞或巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞，或活性免疫治療藥物，例如腫瘤抗原、來(lái)源于患者的腫瘤物質(zhì)和旨在激活和/或指導(dǎo)免疫應(yīng)答對(duì)抗腫瘤或腫瘤特征的其他治療藥物。

背景技術(shù)：

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)是存在于骨髓和其他組織中的非造血起源的細(xì)胞。MSC一般被認(rèn)為是多能成體祖細(xì)胞，其具有分化為有限數(shù)目的細(xì)胞譜系如成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞的能力。基于直接分化為這些末期表型的能力，已經(jīng)對(duì)MSC作為治療實(shí)體的用途進(jìn)行了研究，包括MSC促進(jìn)或提高骨修復(fù)和用于修復(fù)軟骨缺損的用途(Vilquin和Rosset,再生醫(yī)學(xué)(Regenerative Medicine)2006:1,4,p 589以及Veronesi等人,干細(xì)胞和發(fā)育(Stem Cells and Development)2013；22,p 181)。已經(jīng)描述了用于許多治療性適應(yīng)癥的MSC的分離和培養(yǎng)，并且這代表了針對(duì)治療炎癥相關(guān)障礙的有前途的方法(例如WO 2010/119039)。

已知MSC展示了施用于患者后的免疫逃逸特性。已經(jīng)顯示MSC展示了在移植同種異體供體材料情況下有利的免疫調(diào)節(jié)作用(Le Blanc等人,Lancet2004:363,p 1439)，從而減少了潛在致病的同種異體反應(yīng)性和排斥。MSC治療還可以在創(chuàng)傷愈合中起治療作用?？梢越?jīng)由全身注射進(jìn)行MSC的治療遞送，然后MSC歸巢并移入于損傷的部位(Kidd等人,干細(xì)胞(Stem Cells)2009:27,p 2614)。還已知MSC展示了關(guān)于在體內(nèi)向腫瘤歸巢的遷移特性。

使用基因修飾MSC的基于MSC的細(xì)胞治療能夠使治療性基因產(chǎn)品遞送至患者體內(nèi)感興趣的特定區(qū)域。例如，已經(jīng)顯示MSC遷移至炎癥區(qū)域如腫瘤，從而在局部發(fā)揮治療影響。MSC典型地具有免疫調(diào)節(jié)作用，引起在感興趣的區(qū)域中的免疫抑制，從而調(diào)節(jié)或減少炎癥以促進(jìn)恢復(fù)。然而，本發(fā)明利用MSC作為細(xì)胞載體，用于遞送用于刺激免疫應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)物，從而利用MSC靶向于炎癥區(qū)域，尤其是腫瘤的獨(dú)特的歸巢能力，從而基于適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的激活，發(fā)揮局部治療作用。

通過(guò)針對(duì)腫瘤組織的免疫應(yīng)答的適當(dāng)激活或加強(qiáng)，可以阻止腫瘤生長(zhǎng)。然而，在癌癥治療領(lǐng)域需要用于局部增強(qiáng)這樣的免疫應(yīng)答，而不啟動(dòng)不想要的全身性副作用的手段。存在許多用于治療癌癥的藥物在不引起顯著不想要的副作用(例如發(fā)燒、肝酶水平升高或全身炎癥，如細(xì)胞因子風(fēng)暴，可能會(huì)導(dǎo)致死亡)的情況下不能被全身施用。用于避免這樣的副作用的一種選擇是施用顯著減少劑量的這樣的藥物，這雖然在減少副作用中是有效的，但是通常在靶位點(diǎn)產(chǎn)生不足的藥物水平并且產(chǎn)生不足的治療益處。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

鑒于現(xiàn)有技術(shù)，基于本發(fā)明的技術(shù)問(wèn)題是提供用于癌癥免疫治療的新策略。具體地，基于本發(fā)明的問(wèn)題是提供用于局部刺激針對(duì)受試者的腫瘤組織的免疫應(yīng)答的合適手段?；诒景l(fā)明的進(jìn)一步問(wèn)題是提供用于施用有效劑量的治療劑如免疫調(diào)節(jié)劑或免疫刺激劑的手段，其在靶組織提供有效的局部作用和減少水平的不想要的副作用。

通過(guò)獨(dú)立權(quán)利要求的特征解決這個(gè)問(wèn)題。通過(guò)從屬權(quán)利要求提供了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式。

因此，本發(fā)明涉及在腫瘤治療中用作藥物的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述MSC包含一種或多種外源核酸分子，其中所述外源核酸分子包括編碼一種或多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域，所述編碼一種或多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域可操作地連接于啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合，其中所述治療包括聯(lián)合施用所述間充質(zhì)干細(xì)胞與抗腫瘤免疫治療。

聯(lián)合施用可涉及在所述免疫治療之前、期間和/或之后，同時(shí)和/或有順序地施用所述間充質(zhì)干細(xì)胞。聯(lián)合施用還應(yīng)包括聯(lián)合治療方案，該聯(lián)合治療方案包括治療的任一種治療性組分的多次施用。本文提供了聯(lián)合施用的進(jìn)一步實(shí)施方式。

因此，除了用于治療具有腫瘤的受試者的方法或治療腫瘤和/或腫瘤疾病的方法之外，本發(fā)明涵蓋本文描述的MSC的醫(yī)學(xué)用途，尤其是用于治療癌癥。

本發(fā)明還涵蓋本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其本身不依賴于它們的特定醫(yī)學(xué)用途。

本發(fā)明使得能夠刺激參與抗腫瘤免疫應(yīng)答的細(xì)胞，從而局部激活、支持和/或加強(qiáng)抗腫瘤免疫應(yīng)答。如本文描述的MSC由于它們的天然的或工程化的在體內(nèi)歸巢至炎癥區(qū)域的能力而遷移至腫瘤組織。歸巢和/或移入腫瘤組織(腫瘤基質(zhì))導(dǎo)致免疫刺激細(xì)胞因子的局部表達(dá)，從而使得局部腫瘤環(huán)境中免疫細(xì)胞的量和/或活性提高，從而使患者的免疫系統(tǒng)能夠攻擊腫瘤細(xì)胞，并且還提供對(duì)聯(lián)合免疫治療的支持。

本發(fā)明使得能夠施用經(jīng)由移植的MSC表達(dá)的有效和治療相關(guān)劑量的一種或多種免疫刺激細(xì)胞因子，同時(shí)避免顯著的副作用，所述副作用在沒(méi)有適當(dāng)靶向劑的情況下是全身施用細(xì)胞因子中固有的。因此，本發(fā)明涉及利用作為靶向劑的MSC和/或載體，所述載體用于在炎癥區(qū)域，優(yōu)選在腫瘤組織內(nèi)和接近于腫瘤組織處，局部遞送免疫調(diào)節(jié)信號(hào)，優(yōu)選免疫刺激信號(hào)。

免疫治療的成功開發(fā)和臨床使用中的關(guān)鍵限制是通過(guò)建立免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，腫瘤逃逸和抑制對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的天然免疫應(yīng)答的能力。該現(xiàn)象被稱為腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制，并且該現(xiàn)象在很大程度上是通過(guò)由存在于腫瘤中的顯示調(diào)節(jié)性表型的免疫細(xì)胞(例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(TReg)和單核細(xì)胞衍生抑制細(xì)胞(MDSC))分泌抗炎性細(xì)胞因子所介導(dǎo)的。因此，本發(fā)明提供了改變腫瘤微環(huán)境的手段，使腫瘤微環(huán)境成為促炎的，促進(jìn)存在于腫瘤中的免疫細(xì)胞的激活和外部免疫細(xì)胞的募集和激活，從而促進(jìn)免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤的廣泛激活；和/或提高抗腫瘤免疫治療性治療的有效性的手段。

在一種實(shí)施方式中，在免疫治療性治療之前，可以施用如本文描述的MSC以修改腫瘤微環(huán)境和使得腫瘤微環(huán)境有利于和有助于免疫治療。

本發(fā)明利用MSC作為用于遞送用于模擬免疫應(yīng)答的免疫調(diào)節(jié)效應(yīng)物的細(xì)胞載體，從而利用MSC靶向炎癥區(qū)域(尤其是腫瘤)的獨(dú)特歸巢能力，從而基于適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答的激活發(fā)揮局部治療作用(其中所述免疫應(yīng)答優(yōu)選涉及宿主(受試者)的天然免疫應(yīng)答)，從而提高免疫治療劑的有效性和治療作用，所述免疫治療劑如雙特異性抗體、過(guò)繼免疫治療劑、抗腫瘤疫苗和/或檢查點(diǎn)抑制劑。

MSC響應(yīng)于促炎信號(hào)(例如，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-b)，吲哚胺2,3-雙加氧酶)能夠表達(dá)不同的抗炎因子。對(duì)于TGF-b，已經(jīng)顯示了它能提高激活的T細(xì)胞的存活率，因?yàn)樗Ｗo(hù)細(xì)胞免受所謂的“激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡”。驚人地，MSC中促炎細(xì)胞因子的表達(dá)允許旁觀T細(xì)胞(bystander T cells)的靶向激活和持續(xù)激活，而不誘導(dǎo)T細(xì)胞中的激活誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡(AICD)。本文描述的細(xì)胞的這種特性是由于抗炎因子(例如TGF-b)的存在，所述抗炎因子也由MSC表達(dá)，并且防止AICD。表達(dá)抗炎因子的MSC與促炎轉(zhuǎn)基因細(xì)胞因子的組合產(chǎn)生預(yù)料不到的技術(shù)效果，這在刺激抗腫瘤的免疫應(yīng)答中是有利的。

驚人地，用一種或多種如本文描述的免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子修飾的MSC顯示所述細(xì)胞因子在體外和體內(nèi)的預(yù)料不到的良好表達(dá)和分泌?；诠逃袘?yīng)答或和免疫治療，技術(shù)人員不會(huì)預(yù)料到這些特定的細(xì)胞因子可以以足夠的量表達(dá)，并且以足夠的量從細(xì)胞中輸出以誘導(dǎo)或提高希望的局部免疫應(yīng)答。

本發(fā)明還涵蓋經(jīng)由本文描述的基于MSC的方法，在腫瘤中表達(dá)免疫激活細(xì)胞因子和/或趨化因子的組合，目的是吸引免疫效應(yīng)細(xì)胞和輔助細(xì)胞、誘導(dǎo)免疫激活、促進(jìn)記憶免疫細(xì)胞的成熟和/或抑制抑制性免疫細(xì)胞和/或調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞的出現(xiàn)和存留。

在一種實(shí)施方式中，使用了細(xì)胞因子的組合，以促進(jìn)免疫應(yīng)答的不同分支的激活，包括固有免疫應(yīng)答和適應(yīng)性免疫應(yīng)答、效應(yīng)細(xì)胞、輔助細(xì)胞和/或抗原提呈細(xì)胞。

預(yù)期細(xì)胞因子如TNF-α?xí)せ蠲庖呦到y(tǒng)的多個(gè)方面，然而該作用可能缺少對(duì)腫瘤應(yīng)答必要的特異性。

另一方面，IL-2、IL-7、IL-15和IL-21特異性地激活使對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的特異性應(yīng)答增強(qiáng)的細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞如T細(xì)胞和NK細(xì)胞。同樣地，IL-12會(huì)激活細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞，還有單核細(xì)胞和輔助細(xì)胞。

IL-12與例如IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21的組合會(huì)具有如下作用：(i)激活腫瘤定向的細(xì)胞毒性細(xì)胞，(ii)激活輔助細(xì)胞，所述輔助細(xì)胞增強(qiáng)細(xì)胞毒性細(xì)胞的激活，和/或(iii)激活單核細(xì)胞，所述單核細(xì)胞可以發(fā)展對(duì)抗腫瘤的附加免疫應(yīng)答。因此，細(xì)胞因子的組合產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，正如在天然免疫應(yīng)答中所見(jiàn)，以及在本發(fā)明中，該細(xì)胞因子的組合大大提高了治療效果。驚人的結(jié)果是，在使用基于MSC的轉(zhuǎn)基因方法中，天然免疫應(yīng)答可以以增強(qiáng)的方式實(shí)際上交叉(mirrored)或類似地應(yīng)用。

因此，本發(fā)明基于如下的驚人發(fā)現(xiàn)：通過(guò)提供在一種或多種MSC中編碼免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因的組合，可以獲得更有效的局部和安全的抗腫瘤應(yīng)答。MSC載體中多種細(xì)胞因子的組合引起導(dǎo)致局部抗腫瘤應(yīng)答(包括免疫應(yīng)答的多個(gè)分支)的獨(dú)特的免疫刺激因子的局部表達(dá)和分泌，而不誘導(dǎo)如對(duì)腫瘤患者全身施用細(xì)胞因子時(shí)所觀察到的全身毒性。

此外，MSC的獨(dú)特特性，即歸巢和移入腫瘤組織，引起治療性細(xì)胞因子的持續(xù)表達(dá)，以保持免疫應(yīng)答用于治療作用。在一種實(shí)施方式中，誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的使用使得局部和腫瘤特異性細(xì)胞因子表達(dá)成為可能，所述誘導(dǎo)型因子優(yōu)選接近于腫瘤組織處表達(dá)或在腫瘤組織內(nèi)表達(dá)或在發(fā)炎組織中表達(dá)，在該區(qū)域中的腫瘤(因此優(yōu)選是炎性)隨后減少后，所述局部和腫瘤特異性細(xì)胞因子表達(dá)隨后減少。

本發(fā)明還涉及基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)，其中所述MSC包含一種或多種外源核酸分子，其中所述外源核酸分子包括編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域，所述編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，外源核酸包括編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域，所述編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合，其中細(xì)胞因子選自由IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL21、IFNγ和IFNβ組成的組。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子至少包括IL-12，以及IL-2、IL-7、IL-15和/或IL-21中的一種或多種。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子至少包括IL-7和IL-21。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子包括至少一種趨化因子和至少一種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子，所述免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子選自由IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL21、IFNγ和IFNβ組成的組。

本發(fā)明在某些實(shí)施方式中涵蓋了如本文描述的細(xì)胞中的細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因的組合，尤其是本文公開的單獨(dú)的細(xì)胞因子或趨化因子的任何給定的特定組合，優(yōu)選是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL21、IFNγ、IFNβ、CD28、趨化因子(C-C基序)配體1、2、4、17、19、22、23(CCL1、CCL2、CCL4、CCL17、CCL19、CCL22、CCL23)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1)中的兩種或更多種的任何給定的特定組合。

通過(guò)在由固有免疫系統(tǒng)或由聯(lián)合免疫治療產(chǎn)生的抗腫瘤免疫應(yīng)答中局部免疫系統(tǒng)刺激的驚人和有利的構(gòu)思，，將由兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子限定的MSC和包括施用由一種或多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子限定的MSC與其他抗腫瘤免疫治療的組合的腫瘤治療方法聯(lián)系起來(lái)。出人意料的是，在刺激抗腫瘤應(yīng)答中編碼轉(zhuǎn)基因免疫刺激細(xì)胞因子的MSC可以用作有效的抗腫瘤佐劑。相關(guān)的現(xiàn)有技術(shù)僅教導(dǎo)了使用MSC載體用于局部施用(轉(zhuǎn)基因)細(xì)胞毒性劑，具有直接效果。然而，使用編碼(可能是多種)轉(zhuǎn)基因免疫刺激細(xì)胞因子的MSC，或這樣的MSC與抗腫瘤免疫治療的組合來(lái)加強(qiáng)局部抗腫瘤免疫應(yīng)答，代表本發(fā)明的特別的技術(shù)特征。

驚人地，用如本文描述的多種細(xì)胞因子修飾的MSC顯示出所述細(xì)胞因子在體外和體內(nèi)的不可預(yù)料的良好表達(dá)和分泌?；诠逃袘?yīng)答或和免疫治療，技術(shù)人員不會(huì)預(yù)料到這些特定細(xì)胞因子可以以足夠的量表達(dá)，并且以足夠的量從細(xì)胞中輸出以誘導(dǎo)或提高希望的局部免疫應(yīng)答。

因此本發(fā)明涉及用作腫瘤治療中的藥物的本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，所述間充質(zhì)干細(xì)胞包含一種或多種外源核酸分子，其中所述外源核酸分子包括編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域。本文公開的任何特征還應(yīng)用于包括用于至少兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)基因物質(zhì)的MSC，所述特征為關(guān)于治療或醫(yī)學(xué)施用或施加MSC的方法，或它們與本文描述的抗腫瘤免疫治療劑的聯(lián)合施用的特征。

本發(fā)明提供了在受試者中局部刺激對(duì)抗腫瘤組織的免疫應(yīng)答的適當(dāng)手段。這包括患者的天然免疫應(yīng)答和旨在使免疫應(yīng)答針對(duì)腫瘤的免疫治療性治療(例如檢查點(diǎn)抑制劑、抗腫瘤抗原的CART和其他腫瘤免疫治療)。免疫應(yīng)答的這樣的支持或誘導(dǎo)在不同的臨床環(huán)境下可以是有利的，以便啟動(dòng)和保持免疫應(yīng)答，以及逃避腫瘤介導(dǎo)的常常阻止這種激活的免疫抑制。

本發(fā)明的細(xì)胞可以用于提高活性和/或增加已經(jīng)存在于受試者中的內(nèi)源免疫細(xì)胞的量?？晒┻x擇地或另外地，可以與本發(fā)明的MSC聯(lián)合施用(例如同時(shí)地或順序地)額外的免疫細(xì)胞(自體的或同種異體的)以便提高希望的治療性免疫應(yīng)答。

可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的技術(shù)進(jìn)行本文描述的基因修飾MSC的構(gòu)建。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，外源核酸包括病毒載體序列，例如病毒表達(dá)構(gòu)建體形式的病毒載體序列。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，外源核酸是非病毒表達(dá)構(gòu)建體。

如本文所使用的，“核酸”是指任何核酸分子，包括但不限于DNA、RNA和其雜交體或修飾的變體?！巴庠春怂帷焙汀巴庠椿蛟鄙婕耙爰?xì)胞的任何核酸，其不是細(xì)胞“原始”或“天然”基因組的組件。外源核酸可以整合于或不整合于靶標(biāo)間充質(zhì)干細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中，或涉及穩(wěn)定轉(zhuǎn)導(dǎo)的核酸。

本發(fā)明涵蓋了任何給定的基因遞送方法，并且所述基因遞送方法優(yōu)選涉及病毒或非病毒載體，以及轉(zhuǎn)染的生物或化學(xué)方法，或其組合。該方法可以在使用的系統(tǒng)中產(chǎn)生穩(wěn)定或瞬時(shí)基因表達(dá)。

基因修飾的病毒已經(jīng)廣泛應(yīng)用于將基因遞送至干細(xì)胞?？梢允褂孟俨《?，或RNA病毒如慢病毒，或其他反轉(zhuǎn)錄病毒。腺病毒在基因治療和細(xì)胞工程領(lǐng)域中已經(jīng)被用于產(chǎn)生一系列用于基因轉(zhuǎn)移的載體。通過(guò)刪除E1基因(病毒復(fù)制所需)產(chǎn)生具有4kb克隆能力的載體，來(lái)生產(chǎn)初代腺病毒載體。另外刪除E3(負(fù)責(zé)宿主免疫應(yīng)答)允許8kb克隆能力。通過(guò)E2和/或E4刪除產(chǎn)生進(jìn)一步的代次。本發(fā)明涵蓋任何給定的腺病毒載體的使用，例如根據(jù)上文描述的腺病毒載體。

慢病毒是病毒的反轉(zhuǎn)錄病毒家族的成員(M.Scherr等人,使用慢病毒載體將基因轉(zhuǎn)移至造血干細(xì)胞(Gene transfer into hematopoietic stem cells using lentiviral vectors).Curr Gene Ther.2002Feb；2(1):45-55)。通過(guò)刪除除了LTR和順式作用包裝信號(hào)以外的整個(gè)病毒序列產(chǎn)生慢病毒載體。獲得的載體具有約8kb的克隆能力。這些載體與反轉(zhuǎn)錄病毒載體的一個(gè)區(qū)別特征是它們轉(zhuǎn)導(dǎo)分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞以及終末分化細(xì)胞的能力。

還可以采用非病毒方法，如以下供選擇的策略，其包括：通過(guò)使用基于核酸酶的基因編輯的靶向基因整合法人常規(guī)質(zhì)粒轉(zhuǎn)移和應(yīng)用，整合酶或轉(zhuǎn)座酶技術(shù)。這些表示用于載體轉(zhuǎn)化的方法，所述方法具有有效并且通常在它們的整合中是位點(diǎn)特異性的優(yōu)勢(shì)。將載體導(dǎo)入細(xì)胞的物理方法是技術(shù)人員已知的。一個(gè)例子涉及電穿孔，其依賴于使用通過(guò)克服它的電容在膜上產(chǎn)生瞬時(shí)孔的短時(shí)高電壓的電脈沖。該方法的一個(gè)優(yōu)勢(shì)是可以將它用于在大多數(shù)細(xì)胞類型中穩(wěn)定和瞬時(shí)基因表達(dá)?？晒┻x擇的方法涉及使用脂質(zhì)體或蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域。適當(dāng)?shù)姆椒▽?duì)技術(shù)人員是已知的，并且不意欲作為本發(fā)明的限制性實(shí)施方式。

本發(fā)明涵蓋使用多于一種病毒或病毒和其他基因編輯事件或基因修飾，包括使用mRNA、siRNA、miRNA或其他基因修飾，以便控制基因表達(dá)任何給定的相關(guān)因素。在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子涉及多種細(xì)胞因子和/或趨化因子或其組合。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合產(chǎn)生外源核酸的組成性表達(dá)。因?yàn)樵谌硎┯煤蠡蚓植渴┯煤蟮氖茉囌唧w內(nèi)，MSC的對(duì)腫瘤有利的歸巢特性，使用用于表達(dá)一種或多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的組成型啟動(dòng)子是優(yōu)選的。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是EF1α啟動(dòng)子，例如EF1αS啟動(dòng)子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是PGK啟動(dòng)子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是CMV或SV40病毒啟動(dòng)子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是GAG啟動(dòng)子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是UBC啟動(dòng)子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，當(dāng)基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞與腫瘤組織或腫瘤基質(zhì)組織接近時(shí)，表達(dá)免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子。

考慮到間充質(zhì)干細(xì)胞可以顯示選擇性遷移至正常以及病態(tài)情況下的不同的組織微環(huán)境，本發(fā)明涵蓋組織特異性啟動(dòng)子、或與特定疾病微環(huán)境關(guān)聯(lián)的其他啟動(dòng)子、或在募集的干細(xì)胞中由啟動(dòng)的分化途徑誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的使用，并且所述使用可以用于驅(qū)動(dòng)治療性基因的選擇性表達(dá)，如本文描述的細(xì)胞因子，具體地在限定的生物背景下。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，所述細(xì)胞在施用后分化時(shí)誘導(dǎo)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合。施用后分化的一個(gè)例子是內(nèi)皮分化，其中MSC可以移入并且隨后分化為在腫瘤組織中或接近于腫瘤組織處的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮樣細(xì)胞，從而使刺激性細(xì)胞因子能夠以局部方式表達(dá)。

募集到其他組織環(huán)境(niches)而沒(méi)有經(jīng)歷疾病區(qū)域(腫瘤環(huán)境)的干細(xì)胞不應(yīng)表達(dá)治療性基因。該方法允許對(duì)治療性基因在限定的微環(huán)境中的選擇性表達(dá)進(jìn)行顯著程度的潛在控制，從而減少與全身施用促炎細(xì)胞因子相關(guān)的已知毒性發(fā)生的可能性，并且該方法已經(jīng)被成功地應(yīng)用于在新血管生成(neovascularization)期間調(diào)節(jié)治療性基因表達(dá)。WO 2008/150368和WO 2010/119039公開了這樣的基因修飾的可能方法，據(jù)此將這些專利公開全文并入。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是Tie2啟動(dòng)子。

在炎癥或新血管生成的情況下，選擇性地調(diào)節(jié)可以引入的啟動(dòng)子。就這一點(diǎn)而言，已經(jīng)針對(duì)內(nèi)皮特異性表達(dá)研究了Tie2啟動(dòng)子、Flkl啟動(dòng)子和內(nèi)含子增強(qiáng)子、內(nèi)皮素-1啟動(dòng)子和內(nèi)皮素原-1(pre-proendothelin-1)啟動(dòng)子(Huss,R,von Luttichau,I,Lechner,S,Notohamiprodjo,M,Seliger,C,Nelson,P(2004)[在創(chuàng)傷愈合和組織再生中趨化因子指導(dǎo)移植成體干細(xì)胞的歸巢(Chemokine directed homing of transplanted adult stem cells in wound healing and tissue regeneration)].Verh Dtsch Ges Pathol 88:170-173)。

本發(fā)明的另一種實(shí)施方式提供了包含啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合的間充質(zhì)干細(xì)胞，所述啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合可由炎性介質(zhì)誘導(dǎo)以及控制刺激性細(xì)胞因子(免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子)的轉(zhuǎn)錄。這些炎性介質(zhì)可以由腫瘤基質(zhì)組織釋放，使得當(dāng)干細(xì)胞與腫瘤基質(zhì)組織接近時(shí)，誘導(dǎo)細(xì)胞毒性蛋白在間充質(zhì)干細(xì)胞中的表達(dá)。炎性介質(zhì)可以是例如細(xì)胞因子、如TNFα或IFNγ。特別地，啟動(dòng)子可以是RANTES啟動(dòng)子，其尤其可以由TNFOC或IFNγ誘導(dǎo)(Nelson PJ,Kim HT,Manning WC等人.RANTES趨化因子基因的基因組結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)(Genomic organization and transcriptional regulation of the RANTES chemokine gene).J Immunol 1993；151(5):2601-12；von Luettichau I,Nelson PJ,Pattison JM等人.病態(tài)的和正常的人體組織中RANTES趨化因子的表達(dá)(RANTES chemokine expression in diseased and normal human tissues).Cytokine 1996；8(l):89-98；Nelson PJ,Pattison JM,Krensky AM.RANTES的基因表達(dá)(Gene expression of RANTES).Methods Enzymol 1997；287:148-62；Duell EJ,Casella DP,Burk RD等人.促炎基因TNF-A、RANTES和CCR5中的炎癥、基因多態(tài)性和胰腺癌的風(fēng)險(xiǎn)(Inflammation,genetic polymorphisms in proinflammatory genes TNF-A,RANTES,and CCR5,and risk of pancreatic adenocarcinoma).Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 2006；15(4):726-31；Marfaing-Koka,A.,等人,由內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)RANTES趨化因子的產(chǎn)生(Regulation of the production of the RANTES chemokine by endothelial cells).IFNγ與TNFα的協(xié)同誘導(dǎo)和IL-4和IL-13的抑制(Synergistic induction by IFN-gamma plus TNF-alpha and inhibition by IL-4and IL-13).Journal of Immunology,1995.154(4):p.1870-8)。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，啟動(dòng)子是RANTES啟動(dòng)子?！癛ANTES”啟動(dòng)子在本領(lǐng)域也被稱為“CCL5”啟動(dòng)子。

由促炎介質(zhì)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的另外的例子是NF-kB應(yīng)答元件，以及一般地為可以由TNF誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

此外，抗炎性介質(zhì)(例如TGF-β)激活的啟動(dòng)子可以用于實(shí)現(xiàn)細(xì)胞毒性蛋白在間充質(zhì)干細(xì)胞中的靶向表達(dá)。例子是含有Smad-結(jié)合元件的啟動(dòng)子。使用由炎性介質(zhì)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子使得能夠選擇性治療尚未經(jīng)歷血管生成的腫瘤。

此外，癌組織中激活的或由癌細(xì)胞釋放的信號(hào)激活的啟動(dòng)子可以用于本發(fā)明以實(shí)現(xiàn)編碼的細(xì)胞因子在患者的有關(guān)部位中選擇性表達(dá)，以避免不想要的全身作用。在癌癥中上調(diào)的啟動(dòng)子的一個(gè)例子是HSP70啟動(dòng)子。HSP70蛋白是主要的應(yīng)激誘導(dǎo)型熱休克蛋白，它是在人腫瘤和腫瘤細(xì)胞系中豐富和優(yōu)先表達(dá)的伴侶蛋白。由于HSP70保護(hù)細(xì)胞免受大范圍的凋亡和壞死刺激的能力，已經(jīng)假設(shè)HSP70可以為腫瘤細(xì)胞提供存活優(yōu)勢(shì)(Rohde等人,Genes Dev.Mar 1,2005；19(5):570–582；Nylandsted等人.,Ann N Y Acad Sci.2000；926:122-5；Ramp等人,Histol Histopathol.2007Oct；22(10):1099-107；Ricaniadis等人,Eur J Surg Oncol.2001Feb；27(1):88-93)。因此，HSP70啟動(dòng)子是選擇性表達(dá)本發(fā)明涵蓋的治療性細(xì)胞因子的一種選擇。HSP70啟動(dòng)子的更多信息可以獲得自Wu等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,Vol.83,pp.629-633,1986。

“腫瘤特異性”啟動(dòng)子的使用，或在炎性或“癌癥樣”條件下優(yōu)先表達(dá)或誘導(dǎo)的啟動(dòng)子的使用可以顯示與關(guān)于減少不想要的全身作用的MSC歸巢特性組合的協(xié)同作用。本發(fā)明的MSC向炎性組織遷移，尤其是向腫瘤組織遷移，從而提供了避免編碼的細(xì)胞因子在患者體內(nèi)全身表達(dá)的有效手段。使用用于表達(dá)優(yōu)先在炎癥條件下表達(dá)或在腫瘤組織中存在的條件下表達(dá)的細(xì)胞因子的啟動(dòng)子進(jìn)一步以協(xié)同方式增強(qiáng)了全身表達(dá)的減少，從而以基于MSC的方式施用本文描述的細(xì)胞因子提供了驚人的益處。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子保持或提高了腫瘤組織內(nèi)的或接近腫瘤組織的免疫細(xì)胞的活性、存活率和/或數(shù)目。

如本領(lǐng)域已知的，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子要被理解為直接或間接引起或產(chǎn)生免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)、激活和/或增強(qiáng)的任何細(xì)胞因子，所述免疫應(yīng)答優(yōu)選地針對(duì)抗原，例如腫瘤抗原。特別地，本發(fā)明的免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子優(yōu)選被認(rèn)為是引起對(duì)治療腫瘤疾病有利的免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)、激活和/或增強(qiáng)的細(xì)胞因子。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)免疫應(yīng)答調(diào)控細(xì)胞因子或免疫應(yīng)答相關(guān)的細(xì)胞因子可以相互交換地使用，并且涉及參與、調(diào)控、控制和/或調(diào)節(jié)由于免疫細(xì)胞分化、成熟和激活引起的包括抗腫瘤活性的免疫應(yīng)答和/或炎性反應(yīng)。

細(xì)胞因子是起細(xì)胞之間介質(zhì)的作用的不同組的非抗體蛋白質(zhì)。目前，細(xì)胞因子在臨床上被用作用于治療各種疾病的生物應(yīng)答調(diào)節(jié)劑。術(shù)語(yǔ)細(xì)胞因子是用于描述一大組蛋白質(zhì)的通用術(shù)語(yǔ)。特定類型的細(xì)胞因子可以包括：?jiǎn)魏艘蜃?，也就是由單核吞噬?xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子；淋巴因子，也就是由激活的淋巴細(xì)胞，特別是Th細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子；白細(xì)胞介素，也就是在白細(xì)胞之間起介質(zhì)作用的細(xì)胞因子；以及趨化因子，也就是主要負(fù)責(zé)白細(xì)胞遷移的小的細(xì)胞因子。細(xì)胞因子信號(hào)傳導(dǎo)是靈活的，并且可以誘導(dǎo)保護(hù)應(yīng)答和損傷應(yīng)答。它們可以產(chǎn)生級(jí)聯(lián)反應(yīng)，或提高或抑制其他細(xì)胞因子的產(chǎn)生。盡管細(xì)胞因子具有各種角色，技術(shù)人員知道可以將哪種細(xì)胞因子看作刺激免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子，并且因此將其應(yīng)用于如本文描述的腫瘤疾病的治療中。

細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答的能力，并且通常被腫瘤利用以允許腫瘤生長(zhǎng)和操縱免疫應(yīng)答。這些免疫調(diào)節(jié)作用允許細(xì)胞因子被用作藥物以驅(qū)使對(duì)抗腫瘤的免疫應(yīng)答。

可以將以下細(xì)胞因子稱為免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子或免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)細(xì)胞因子。

在抗腫瘤治療中常用的兩組細(xì)胞因子是干擾素和白細(xì)胞介素。

干擾素是由通常參與抗病毒應(yīng)答的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的細(xì)胞因子，而且還顯示了在治療癌癥中的有效性。存在三組干擾素(IFN)：I型(IFNα和IFNβ)、II型(IFNγ)和相對(duì)新發(fā)現(xiàn)的III型(IFNλ)。IFNα被應(yīng)用于毛細(xì)胞白血病、AIDS相關(guān)的卡波濟(jì)氏肉瘤、濾泡性淋巴瘤、慢性粒細(xì)胞白血病和黑色素瘤的治療。I型和II型IFN已經(jīng)被廣泛研究，并且雖然兩種類型促進(jìn)免疫系統(tǒng)的抗腫瘤作用，但是到目前為止僅I型IFN顯示了在癌癥治療中在臨床上是有效的。已經(jīng)檢測(cè)了IFNλ在動(dòng)物模型中的抗腫瘤作用，并且顯示了希望。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是IFNα。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是IFNγ。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是IFNβ。

根據(jù)本發(fā)明的某些實(shí)施方式，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子或免疫應(yīng)答調(diào)節(jié)細(xì)胞因子優(yōu)選是參與T細(xì)胞調(diào)節(jié)或具有對(duì)T細(xì)胞的效應(yīng)功能的細(xì)胞因子(T細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞因子)。這些細(xì)胞因子展示了關(guān)于誘導(dǎo)促炎微環(huán)境的希望的特性，從而促進(jìn)對(duì)抗腫瘤的免疫系統(tǒng)的激活和/或提高抗腫瘤免疫治療性治療的效果。這樣的細(xì)胞因子可能能夠吸引免疫效應(yīng)細(xì)胞如T細(xì)胞，以及促進(jìn)記憶免疫細(xì)胞的成熟。這些細(xì)胞因子的例子是IFNγ、IL-2、IL-12、IL-23、IL-15和IL-21(參考凱利的風(fēng)濕病學(xué)教科書(Kelley's Textbook of Rheumatology)；Firestein等人,8th ed.(ISBN 978-1-4160-3285-4),p367“細(xì)胞因子(Cytokines)”)。

本文提到的特定分子優(yōu)選涉及哺乳動(dòng)物分子，優(yōu)選是人類分子，原因是對(duì)人受試者施用的適用性。例如，本文提到的細(xì)胞因子和/或趨化因子優(yōu)選涉及人類序列，如技術(shù)人員可以不過(guò)分費(fèi)力地獲得的，例如從序列數(shù)據(jù)庫(kù)如由美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)維護(hù)的序列數(shù)據(jù)庫(kù)獲得。

蛋白序列或編碼蛋白的核酸序列與通常已知的序列對(duì)比可以是修飾的，例如通過(guò)進(jìn)行例如蛋白序列中的保守氨基酸置換或通過(guò)利用遺傳密碼的簡(jiǎn)并性以改變編碼序列而不改變編碼的蛋白序列。正如技術(shù)人員所認(rèn)識(shí)到的，生物分子的序列可以經(jīng)由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)改變(突變)，從而與已知的原始序列對(duì)比改善或保持它們的特性。因此，本發(fā)明的范圍涵蓋了保持已知序列的基本特性或功能上類似于已知序列的任何修飾的細(xì)胞因子序列。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是IL-2。

白細(xì)胞介素-2是可以提高免疫系統(tǒng)的抗腫瘤活性的細(xì)胞因子的例子，并且因此可以被用作癌癥的治療劑。白細(xì)胞介素-2被用于治療惡性黑色素瘤(商品名，)和腎細(xì)胞癌。在正常生理?xiàng)l件下，白細(xì)胞介素-2促進(jìn)效應(yīng)T細(xì)胞(產(chǎn)生免疫應(yīng)答的細(xì)胞)和T調(diào)節(jié)細(xì)胞(抑制免疫應(yīng)答的細(xì)胞)，但是它在治療癌癥中的確切機(jī)制是未知的。最近的研究表明IL-2表達(dá)在癌癥治療中的有利作用。IL-2已經(jīng)與過(guò)繼免疫治療如CART治療聯(lián)合使用，以促進(jìn)T細(xì)胞的激活。然而，IL-2的全身施用帶來(lái)了廣泛免疫激活的風(fēng)險(xiǎn)，所述的廣泛免疫激活帶來(lái)了與CART治療相關(guān)的毒性。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是IL-7。

白細(xì)胞介素-7(IL-7)是由骨髓和胸腺中的基質(zhì)細(xì)胞分泌的造血生長(zhǎng)因子。IL-7刺激多能造血干細(xì)胞分化為淋巴樣祖細(xì)胞。在臨床前的動(dòng)物研究和最近的用于各種惡性腫瘤和HIV感染期間的人類臨床試驗(yàn)中檢測(cè)了作為免疫治療劑的IL-7(Fry TJ,Mackall CL(2002年6月).“白細(xì)胞介素-7：從實(shí)驗(yàn)臺(tái)到臨床(Interleukin-7:from bench to clinic)”.Blood 99(11):3892–904)。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是IL-15。

白細(xì)胞介素15(IL-15)是與IL-2具有結(jié)構(gòu)相似性的細(xì)胞因子。與IL-2一樣，IL-15結(jié)合于由IL-2/IL-15受體β鏈(CD122)和共同的γ鏈(γ-C，CD132)組成的復(fù)合物，并且通過(guò)所述復(fù)合物發(fā)信號(hào)。IL-15誘導(dǎo)天然殺傷細(xì)胞的細(xì)胞增殖；該天然殺傷細(xì)胞為固有免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，其首要作用是殺傷病毒感染細(xì)胞或癌細(xì)胞。IL-15在臨床前模型中已經(jīng)顯示提高CD8+T細(xì)胞的抗腫瘤免疫性(Klebanoff CA等人.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.101(7):1969–74)。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是IL-21。

白細(xì)胞介素21(IL-21)是對(duì)免疫系統(tǒng)細(xì)胞具有有效調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，所述免疫系統(tǒng)細(xì)胞包括可以破壞病毒感染細(xì)胞或癌細(xì)胞的天然殺傷(NK)細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。IL-21已被批準(zhǔn)用于轉(zhuǎn)移性黑色素瘤(MM)和腎細(xì)胞癌(RCC)患者的I期和II期臨床試驗(yàn)(H,Skak K,Tissue Antigens74(6):467–79)。IL-21已經(jīng)顯示對(duì)于伴有類似感冒癥狀作為副作用的施用是安全的。劑量限制性毒性包括低數(shù)量的淋巴細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和血小板，以及低的肝毒性。

白細(xì)胞介素12(IL-12)是由樹突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和人B類淋巴母細(xì)胞(NC-37)響應(yīng)于抗原刺激而天然產(chǎn)生的白細(xì)胞介素。IL-12參與初始T細(xì)胞分化為Th1細(xì)胞。它被稱為T細(xì)胞刺激因子，能夠刺激T細(xì)胞的生長(zhǎng)和功能，從而落入本發(fā)明的構(gòu)思中。已知IL-12刺激干擾素γ(IFN-γ)和腫瘤壞死因子α(TNF-α)從T細(xì)胞和天然殺傷(NK)細(xì)胞中產(chǎn)生，并且減少IL-4介導(dǎo)的IFN-γ的抑制。IL-12還具有已知的抗血管生成活性。IL-12通過(guò)提高IFN-γ的產(chǎn)生起作用，這轉(zhuǎn)而提高了趨化因子CXCL10的產(chǎn)生。

白細(xì)胞介素12(IL-12)通過(guò)調(diào)節(jié)炎性應(yīng)答、對(duì)感染的固有抗性和適應(yīng)性免疫，尤其關(guān)于對(duì)抗癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答，在免疫的固有分支和適應(yīng)性分支之間的相互作用中起作用(Colombo等人,細(xì)胞因子生長(zhǎng)因子(Cytokine Growth Factor)Rev.2002Apr；13(2):155-68)。IL-12對(duì)于對(duì)許多病原體和對(duì)可移植或化學(xué)誘導(dǎo)的腫瘤的抗性是需要的。已知重組IL-12治療對(duì)可移植的腫瘤，對(duì)化學(xué)誘導(dǎo)的腫瘤和基因修飾小鼠中自發(fā)產(chǎn)生的腫瘤顯示抗腫瘤作用。因?yàn)檫@種能力，IL-12在癌癥中具有有效的佐劑活性。

然而直到目前，在臨床試驗(yàn)中觀察到過(guò)度的臨床毒性和中度的臨床應(yīng)答，因此需要使毒性最小化而不影響IL-12的抗腫瘤作用的新方法和施用方案。IL-12到目前為止在以對(duì)受試者無(wú)毒的劑量經(jīng)由全身施用所測(cè)試的腫瘤中，沒(méi)有顯示出具有實(shí)質(zhì)活性。

因此，本發(fā)明涉及如本文描述的MSC和其醫(yī)學(xué)用途，其中外源核酸編碼IL-12。有助于IL-12的位點(diǎn)特異性表達(dá)的基于MSC的方法代表了有助于避免在IL-12全身施用中固有的毒性的新穎且有利的方法。

本發(fā)明經(jīng)由在本文描述的MSC中表達(dá)免疫刺激因子使得驚人的和有利的抗腫瘤活性成為可能。由MSC表達(dá)如本文描述的刺激性細(xì)胞因子支持抗腫瘤免疫應(yīng)答，并且引起腫瘤尺寸和/或生長(zhǎng)的減小，以及顯示了由全身施用本領(lǐng)域已知的這樣的細(xì)胞因子產(chǎn)生的副作用的顯著減小和/或避免。副作用如惡心和嘔吐、口腔或唇部潰瘍、腹瀉、困倦、過(guò)敏反應(yīng)、發(fā)熱或發(fā)冷、蕁麻疹、瘙癢、頭痛、咳嗽、呼吸短促，或臉部、舌或喉部腫脹，可以通過(guò)本文描述的基于MSC的治療來(lái)避免。

因此，本發(fā)明提供了減少細(xì)胞因子治療的副作用的手段，以及細(xì)胞因子與免疫治療的共同使用，這通過(guò)使局部的(或局部限制的)腫瘤特異性作用成為可能，優(yōu)選通過(guò)細(xì)胞的全身施用實(shí)現(xiàn)，但是以組織特異性方式，經(jīng)由在合適的組織特異性條件下使用包含并表達(dá)所述細(xì)胞因子的MSC的細(xì)胞治療發(fā)揮作用。

因此本發(fā)明涉及用作本文描述的藥物的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中外源核酸包含編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域，所述編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合，其中細(xì)胞因子選自由IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL21、IFNγ和IFNβ組成的組。

因此本發(fā)明涉及用作本文描述的藥物的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中外源核酸包含編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域，所述編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合，其中所述細(xì)胞因子至少包括IL-7和IL-21、IL-12和IL-2、IL-15和IL-12、IL-7和IL-12、或IL-21和IL-12。

本發(fā)明還涉及包含外源核酸分子的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述外源核酸分子包括編碼誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和/或分化(和/或成熟為記憶細(xì)胞和避免腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制)的免疫刺激分子的區(qū)域，該區(qū)域可操作地連接于啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合。

誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和/或分化的免疫刺激分子可以是如本文描述的細(xì)胞因子或其他免疫刺激分子，如趨化因子或細(xì)胞因子和趨化因子的組合。組合可以是優(yōu)選的以確保免疫細(xì)胞被趨化因子適當(dāng)?shù)匚?，被適當(dāng)?shù)丶せ?通過(guò)引起激活的適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子)，以及針對(duì)記憶表型(通過(guò)促進(jìn)記憶效應(yīng)免疫細(xì)胞成熟的適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子)。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和/或分化的免疫刺激分子是CD28。CD28(分化群28)是表達(dá)于T細(xì)胞上的提供對(duì)T細(xì)胞的激活所需要的共刺激信號(hào)的蛋白質(zhì)之一。還發(fā)現(xiàn)了CD28刺激嗜酸性粒細(xì)胞，其中CD28與抗CD28抗體的結(jié)合引起IL-2、IL4、IL-13和IFNγ的釋放。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是趨化因子。

本發(fā)明還涉及用作本文描述的藥物的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中外源核酸包括編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域，所述編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合，其中至少一種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是趨化因子。

本發(fā)明還涉及用作本文描述的藥物的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中外源核酸包括編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域，所述編碼兩種或更多種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子的區(qū)域可操作地連接于一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子或啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合，其中至少一種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是趨化因子，以及至少一種免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子選自由IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL21、IFNγ和IFNβ組成的組。

在一種實(shí)施方式中，基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是炎性趨化因子。

在一種實(shí)施方式中，基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的特征在于，免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子是具有用于吸引T細(xì)胞的趨化特性的趨化因子，例如CCL1、CCL2和/或CCL17。

趨化因子是指由細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子(信號(hào)傳導(dǎo)蛋白)的亞組。趨化因子具有在附近的應(yīng)答細(xì)胞中誘導(dǎo)指向趨化性的能力，它們是趨化細(xì)胞因子。根據(jù)共同結(jié)構(gòu)特征如小的尺寸(尺寸典型為約8～10千道爾頓)和在對(duì)形成其三維形態(tài)關(guān)鍵的保守位置中存在4個(gè)半胱氨酸殘基將蛋白分類為趨化因子。在供選擇的定義下，細(xì)胞因子是已知的，如細(xì)胞因子的SIS家族、細(xì)胞因子的SIG家族、細(xì)胞因子的SCY家族、血小板因子-4超家族或間分泌(intercrines)。趨化因子被分類為四個(gè)主要亞族：CXC、CC、CX3C和XC。所有這些蛋白均通過(guò)與G蛋白偶聯(lián)膜受體(稱為趨化因子受體)相互作用發(fā)揮它們的生物作用，所述趨化因子受體選擇性地發(fā)現(xiàn)于它們的靶細(xì)胞的表面上。

趨化因子的主要作用是起化學(xué)引誘物的作用，以誘導(dǎo)免疫細(xì)胞或指導(dǎo)免疫細(xì)胞遷移。由趨化因子吸引的細(xì)胞循著增加趨化因子濃度的信號(hào)朝向趨化因子的來(lái)源。在免疫監(jiān)視的過(guò)程中，某些趨化因子控制免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，比如指導(dǎo)淋巴細(xì)胞到達(dá)淋巴結(jié)，因此它們能夠通過(guò)與存在于這些組織中的抗原提呈細(xì)胞相互作用篩選病原的入侵。某些趨化因子在發(fā)育中具有作用；它們促進(jìn)血管生成(新血管的生長(zhǎng))，或指導(dǎo)細(xì)胞到達(dá)提供對(duì)細(xì)胞成熟關(guān)鍵的特定信號(hào)的組織。其他趨化因子是炎性的并且響應(yīng)于細(xì)菌感染、病毒和導(dǎo)致身體損傷的試劑如痛風(fēng)中出現(xiàn)的二氧化硅或尿酸鹽結(jié)晶，從多種細(xì)胞中釋放。通常由促炎細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素1刺激它們的釋放。炎性細(xì)胞因子主要起對(duì)白細(xì)胞的化學(xué)引誘物的作用，將來(lái)自血液的單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和其他效應(yīng)細(xì)胞募集至感染或組織損傷的部位。某些炎性趨化因子激活細(xì)胞以起始免疫應(yīng)答或促進(jìn)創(chuàng)傷愈合。

趨化因子通常被認(rèn)為是促炎或體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的。在免疫應(yīng)答期間可以誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子以將免疫系統(tǒng)的細(xì)胞募集至感染的部位或其他免疫靶標(biāo)如腫瘤，然而體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的細(xì)胞因子參與在組織保持或發(fā)育的過(guò)程中控制細(xì)胞的遷移。炎性細(xì)胞因子和趨化因子典型地在病理?xiàng)l件下形成(在促炎刺激下，如IL-1、TNF-α、LPS或病毒)，以及主動(dòng)地參與到吸引免疫細(xì)胞至炎癥部位的炎性應(yīng)答中。

因此，本發(fā)明涉及本文描述的間充質(zhì)干細(xì)胞，其中外源核酸編碼炎性趨化因子。這樣的趨化因子對(duì)技術(shù)人員是已知的。炎性趨化因子的例子涉及CXCL-8、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL11和CXCL10、CXCL1、CXCL2。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，趨化因子能夠誘導(dǎo)T細(xì)胞(T淋巴細(xì)胞)遷移至表達(dá)趨化因子的MSC的部位。參與到將T淋巴細(xì)胞募集至炎癥部位的趨化因子的例子是CCL2、CCL1、CCL22和CCL17。這些趨化因子是已知的T細(xì)胞引誘物，并且因此可以被用于吸引內(nèi)源患者的T細(xì)胞或提高過(guò)繼免疫治療劑(例如CART)歸巢至腫瘤。腫瘤中過(guò)繼免疫治療劑的歸巢是許多這樣的治療的已知缺陷，因此本發(fā)明帶來(lái)了顯著提高過(guò)繼免疫治療劑如CART的歸巢以及隨后的治療效果的潛力。

在某些實(shí)施方式中，趨化因子是CXC趨化因子，優(yōu)選是CXCL13。

CXC趨化因子涉及其中CXC趨化因子(或α-趨化因子)的兩個(gè)N末端半胱氨酸被一個(gè)氨基酸(在該名稱中以“X”表示)分開的趨化因子。典型地存在兩類CXC趨化因子，一類是在CXC基序的第一個(gè)半胱氨酸之前緊接谷氨酸-亮氨酸-精氨酸基序(ELR基序)(ELR陽(yáng)性)，以及一類是不具有ELR基序(ELR陰性)。ELR陽(yáng)性CXC趨化因子的例子是白細(xì)胞介素8(IL-8)，其誘導(dǎo)嗜中性粒細(xì)胞離開血流并且進(jìn)入周圍組織。ELR陰性趨化因子的例子是CXCL13，其顯示了對(duì)淋巴細(xì)胞的化學(xué)引誘物特性。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，趨化因子是CX3CL1，其屬于稱為CX3C趨化因子的趨化因子組。CX3C趨化因子涉及在兩個(gè)半胱氨酸之間具有三個(gè)氨基酸的趨化因子。CX3CL1被分泌并限制于表達(dá)它的細(xì)胞的表面，從而起到化學(xué)引誘物和粘附分子的作用。

在本發(fā)明的某些實(shí)施方式中，趨化因子選自由以下組成的組：基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1(SDF-1；CXCL12)、趨化因子(C-C基序)配體23(CCL23；巨噬細(xì)胞炎性蛋白3(MIP-3))、趨化因子(C-C基序)配體19(CCL19；EBI1；ELC或巨噬細(xì)胞炎性蛋白3-β(MIP-3-β))和趨化因子(C-C基序)配體4(CCL4；巨噬細(xì)胞炎性蛋白1-β(MIP-1-β))。

基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1也被稱為C-X-C基序趨化因子12(CXCL12)?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1-α和基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1-β是屬于趨化因子家族的小細(xì)胞因子，是激活白細(xì)胞的成員，以及通常由促炎刺激物如脂多糖、TNF或IL1誘導(dǎo)。趨化因子被表征為存在形成2個(gè)二硫鍵的4個(gè)保守半胱氨酸。它們可以被分為2個(gè)亞家族。在CC亞家族中，半胱氨酸殘基是彼此相鄰的。在CXC亞家族中，它們被介于中間的氨基酸所分開。SDF1蛋白屬于后一組。SDF-1是通過(guò)交替拼接相同的基因以兩種形式，即SDF-1α/CXCL12a和SDF-1β/CXCL12b產(chǎn)生。因此，本發(fā)明涉及本文描述的MSC，其中外源核酸編碼SDF-1趨化因子，如SDF-1α/CXCL12a和/或SDF-1β/CXCL12b。

趨化因子(C-C基序)配體23(CCL23)是屬于CC趨化因子家族的細(xì)胞因子，也被稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白3(MIP-3)和髓系祖細(xì)胞(Myeloid progenitor)抑制因子1(MPIF-1)。CCL23主要表達(dá)于肺和肝臟組織中，然而其也在骨髓和胎盤中被發(fā)現(xiàn)。CCL23針對(duì)休眠T細(xì)胞和單核細(xì)胞是趨化性的。

趨化因子(C-C基序)配體19(CCL19)是屬于CC趨化因子家族的細(xì)胞因子，也被稱為EBI1配體趨化因子(ELC)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白3-β(MIP-3-β)。CCL19在胸腺和淋巴結(jié)中豐富表達(dá)，在氣管和結(jié)腸中具有中等水平，以及在胃、小腸、肺、腎和脾臟中具有低水平。已知CCL19在T細(xì)胞在胸腺中的運(yùn)輸和在將T細(xì)胞和B細(xì)胞遷移至次級(jí)淋巴器官中起重要作用。

CCL4，也被稱為巨噬細(xì)胞炎性蛋白1-β(MIP-1-β)，是對(duì)CCR5受體具有特異性的CC趨化因子。它是對(duì)天然殺傷細(xì)胞、單核細(xì)胞和各種其他免疫細(xì)胞的化學(xué)引誘物。

所有免疫治療依賴于免疫應(yīng)答的局部和適時(shí)激活，并且這轉(zhuǎn)而大大依賴于效應(yīng)細(xì)胞的存在以發(fā)揮其功能。在腫瘤學(xué)的情況下，該功能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞的殺傷。然而，在許多情況下，僅不足量的免疫效應(yīng)細(xì)胞被吸引至腫瘤，并且免疫治療的效果降低。

本文描述的趨化因子能夠展示對(duì)于在對(duì)抗腫瘤疾病的免疫應(yīng)答中有利的T細(xì)胞募集特性。在基于MSC的表達(dá)和分子的遞送的情況下使用這樣的趨化因子能夠使關(guān)于位點(diǎn)特異性T細(xì)胞募集的驚人益處，以及減少與非靶向作用相關(guān)的副作用成為可能，所述非靶向作用由這樣的細(xì)胞因子/趨化因子的全身施用所導(dǎo)致。

在本發(fā)明的另一方面，基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞用作本文描述的藥物的用途的特征在于，所述治療包括所述間充質(zhì)干細(xì)胞與檢查點(diǎn)抑制劑的聯(lián)合施用。

正常地，由免疫系統(tǒng)破壞潛在癌性的細(xì)胞。所有癌細(xì)胞經(jīng)歷將其與其鄰近細(xì)胞區(qū)別開的變化，最明顯的變化是能夠不受抑制地繁殖。癌細(xì)胞使用避免常規(guī)免疫系統(tǒng)控制的機(jī)制。檢查點(diǎn)蛋白已經(jīng)被顯示為通過(guò)向免疫系統(tǒng)傳達(dá)潛在癌性的細(xì)胞將不被破壞而起作用?？赡艽嬖谛盘?hào)傳導(dǎo)細(xì)胞是癌性的其他分子，但是如果在細(xì)胞表面存在足夠的檢查點(diǎn)蛋白，免疫系統(tǒng)可能忽視癌性信號(hào)。

已經(jīng)被研究作為癌癥治療靶標(biāo)的配體受體相互作用是跨膜程序性死亡1蛋白(PD-1；也稱為CD279)和它的配體PD-1配體1(PD-L1)之間的相互作用。在正常生理下，細(xì)胞表面上的PD-L1結(jié)合于免疫細(xì)胞表面上的PD1，抑制免疫細(xì)胞的活性。由此看來(lái)癌細(xì)胞表面上的PD-L1的上調(diào)可以允許它們通過(guò)抑制可能另外攻擊腫瘤細(xì)胞的T細(xì)胞而逃逸宿主免疫系統(tǒng)。結(jié)合于PD-1或PD-L1并因此阻斷相互作用的抗體可以使T細(xì)胞攻擊腫瘤。

檢查點(diǎn)抑制劑(也被稱為免疫檢查點(diǎn)調(diào)節(jié)劑，或CPM)被設(shè)計(jì)為減輕檢查點(diǎn)蛋白的效力。雖然它們可能具有各種作用機(jī)制，但是如果是有效的，它們能夠使免疫系統(tǒng)識(shí)別癌細(xì)胞的表面上的其他分子。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)用途的特征在于，檢查點(diǎn)抑制劑與所述MSC的聯(lián)合施用，所述檢查點(diǎn)抑制劑優(yōu)選為PD-L1和/或PD-1抑制劑。例子包括：納武單抗(Nivolumab)(BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538)，一種完全人免疫球蛋白G4(IgG4)單克隆PD-1抗體；蘭博利珠單抗(Lambrolizumab)(MK-3475)，一種人源化單克隆IgG4PD-1抗體；和BMS-936559，一種完全人IgG4PD-L1抗體。

在一種實(shí)施方式中，如本文描述的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞的醫(yī)學(xué)用途的特征在于，檢查點(diǎn)抑制劑與所述MSC的聯(lián)合施用，所述檢查點(diǎn)抑制劑優(yōu)選為CTLA-4抑制劑。例子包括曲美母單抗(Tremelimumab)(Pfizer,NY,USA)和伊匹單抗(ipilimumab)，兩種抗CTLA-4的完全人單克隆抗體。

表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和/或分化的免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子和/或免疫刺激分子的MSC與檢查點(diǎn)抑制劑一起聯(lián)合施用引起關(guān)于希望的抗癌作用的協(xié)同作用。細(xì)胞因子或其他免疫刺激物提供對(duì)抗癌組織的T細(xì)胞應(yīng)答的局部增強(qiáng)，同時(shí)檢查點(diǎn)抑制劑也使T細(xì)胞能夠更有效地攻擊和破壞癌組織。這兩種藥劑的作用是以協(xié)同方式聯(lián)合，導(dǎo)致技術(shù)效果大于單獨(dú)考慮時(shí)這兩個(gè)方面的總和。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用作本文描述的藥物的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中免疫治療包括腫瘤抗原的施用。

本發(fā)明用于提高癌癥疫苗的治療效果。癌癥疫苗指揮免疫系統(tǒng)增強(qiáng)對(duì)體內(nèi)癌細(xì)胞的攻擊。它們激活免疫系統(tǒng)以攻擊已經(jīng)存在的疾病，而不是像用于防止感染的疫苗一樣防止疾病。某些癌癥治療疫苗是由癌細(xì)胞、細(xì)胞的部分或純抗原制成的。有時(shí)，將患者自身的免疫細(xì)胞如T細(xì)胞或抗原提呈細(xì)胞移出并且在實(shí)驗(yàn)室中暴露于這些物質(zhì)以制造疫苗。一旦準(zhǔn)備好疫苗，將其注入體內(nèi)以介導(dǎo)對(duì)抗癌細(xì)胞的免疫應(yīng)答。疫苗通常與幫助更進(jìn)一步加強(qiáng)免疫應(yīng)答的稱為佐劑的其他物質(zhì)或細(xì)胞聯(lián)合。癌癥疫苗引起免疫系統(tǒng)攻擊具有一個(gè)或多個(gè)特異性抗原的細(xì)胞。細(xì)胞適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活引起免疫學(xué)記憶，因此，希望在給予疫苗后，疫苗可以繼續(xù)長(zhǎng)時(shí)間工作。在許多情況下，腫瘤介導(dǎo)的免疫抑制阻礙了癌癥疫苗的效果和免疫激活。期望癌癥疫苗與所述間充質(zhì)干細(xì)胞的聯(lián)合以去除或降低免疫抑制，或不管任何持續(xù)免疫抑制而促進(jìn)免疫激活。

因此，如本文描述的MSC可以被認(rèn)為是免疫治療劑本身，或作為用于共同施用的免疫治療劑或藥劑的佐劑。

本發(fā)明的進(jìn)一步的方面涉及用作如本文描述的藥物的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中所述治療包括所述間充質(zhì)干細(xì)胞與免疫細(xì)胞的聯(lián)合施用。本發(fā)明涵蓋了，由于適當(dāng)?shù)内吇蜃拥谋磉_(dá)，在施用免疫細(xì)胞(例如CART)前施用基因修飾MSC會(huì)提供CART和其他免疫效應(yīng)細(xì)胞的趨化性。刺激細(xì)胞因子的表達(dá)會(huì)僅僅局部地，優(yōu)選在腫瘤內(nèi)或接近于腫瘤處提高T細(xì)胞的激活，并且隨后導(dǎo)致記憶效應(yīng)細(xì)胞表型，從而延長(zhǎng)治療的療效。

通過(guò)參與免疫應(yīng)答的大量不同類型的細(xì)胞的復(fù)雜相互作用和活性，安排對(duì)病原體和癌組織的應(yīng)答。如本文使用的免疫細(xì)胞可以涉及如以下過(guò)程的情況中所描述的任何如下的細(xì)胞類型：固有免疫應(yīng)答是第一道防線，并且在病原體暴露或暴露于“外來(lái)”或癌性物質(zhì)之后不久發(fā)生。這通過(guò)吞噬細(xì)胞(如嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)、細(xì)胞毒性天然殺傷(NK)細(xì)胞和粒細(xì)胞進(jìn)行。隨后的適應(yīng)性免疫應(yīng)答包括抗原特異性防御機(jī)制，并且可能需要幾天以發(fā)展。在適應(yīng)性免疫中具有關(guān)鍵作用的細(xì)胞類型是包括巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的抗原提呈細(xì)胞。包括T細(xì)胞亞集、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的各種細(xì)胞類型的抗原依賴性刺激都在宿主防御中起關(guān)鍵作用。如本文描述的免疫細(xì)胞涉及參與受試者的免疫應(yīng)答的生物細(xì)胞。免疫細(xì)胞優(yōu)選選自T細(xì)胞、B細(xì)胞、樹突細(xì)胞、粒細(xì)胞、固有淋巴樣細(xì)胞(ILC)、巨核細(xì)胞、單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞、天然殺傷(NK)細(xì)胞、血小板、紅細(xì)胞(RBC)和/或胸腺細(xì)胞。

由其獲得間充質(zhì)干細(xì)胞和/或免疫細(xì)胞的受試者可以與細(xì)胞培養(yǎng)后所要施用的受試者是相同的。因此，這樣的細(xì)胞可以被認(rèn)為是自體的。然而，細(xì)胞可以獲得自與預(yù)期患者不同的受試者，因此被認(rèn)為是同種異體的。如本文使用的，相對(duì)于受試者，如果細(xì)胞或任何其前體細(xì)胞來(lái)自相同物種的另一受試者，則該細(xì)胞是“同種異體的”。如本文使用的，就受試者而言，如果細(xì)胞或任何其前體細(xì)胞來(lái)自相同的受試者，則該細(xì)胞是“自體的”。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫細(xì)胞對(duì)醫(yī)學(xué)治療的受試者是自體的。

在優(yōu)選的實(shí)施方式中，免疫細(xì)胞是T細(xì)胞。在其他實(shí)施方式中，免疫細(xì)胞是包括人工T細(xì)胞受體(如嵌合抗原受體(CART))的T細(xì)胞，其中所述T細(xì)胞受體特異性結(jié)合于腫瘤抗原(Lee,DW等人,Clin Cancer Res；2012；18(10)；2780–90)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，免疫細(xì)胞是巨噬細(xì)胞，優(yōu)選是M1巨噬細(xì)胞和/或單核細(xì)胞。

單核細(xì)胞是一類白細(xì)胞(白細(xì)胞(leukocyte))。它們是所有白細(xì)胞中最大的。它們是包括所有哺乳動(dòng)物(包括人類)的脊椎動(dòng)物的固有免疫系統(tǒng)的一部分。單核細(xì)胞通過(guò)骨髓由稱為成單核細(xì)胞的前體產(chǎn)生，所述成單核細(xì)胞是由造血干細(xì)胞分化的雙能(bipotent)細(xì)胞。單核細(xì)胞在血液中循環(huán)大約1至3天，然后典型地移動(dòng)入遍及全身的組織中。它們構(gòu)成了血液中3％～8％的白細(xì)胞。在組織中，單核細(xì)胞在不同的解剖學(xué)位置成熟為不同類型的巨噬細(xì)胞。

巨噬細(xì)胞(macrophage)，有時(shí)稱為巨噬細(xì)胞(macrophagocyte)，是通過(guò)組織中的單核細(xì)胞分化產(chǎn)生的細(xì)胞。單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是吞噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞在非特異性防御(固有免疫)中起作用，以及幫助啟動(dòng)脊椎動(dòng)物的特異性防御機(jī)制(適應(yīng)性免疫)。主要表達(dá)殺傷表型的巨噬細(xì)胞被稱為M1巨噬細(xì)胞，而參與組織修復(fù)的巨噬細(xì)胞被稱為M2巨噬細(xì)胞。巨噬細(xì)胞的作用是作為靜止細(xì)胞或移動(dòng)細(xì)胞吞噬或吞入然后消化細(xì)胞碎片和病原體。它們還刺激淋巴細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞以應(yīng)答病原體。它們是通過(guò)破壞和攝取攻擊外來(lái)物質(zhì)、感染性微生物和癌細(xì)胞的專門的吞噬細(xì)胞。

因此，在一種實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及癌癥免疫治療和包括過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移的方法，其涵蓋了用于攻擊癌細(xì)胞的基于T細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答。

癌癥免疫治療試圖刺激免疫系統(tǒng)以排斥和破壞腫瘤。首先，免疫療法治療涉及細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素的施用。然后，因?yàn)殪o脈和全身施用細(xì)胞因子的不良作用，使用從血液提取淋巴細(xì)胞，并且在體外針對(duì)腫瘤抗原擴(kuò)增這些細(xì)胞，然后將所述細(xì)胞與適當(dāng)?shù)拇碳ば约?xì)胞因子注射來(lái)嘗試供選擇的方法。然后所述細(xì)胞特異性地靶向并破壞針對(duì)它們所產(chǎn)生的腫瘤表達(dá)抗原。盡管有這些方法，用于用細(xì)胞因子適當(dāng)刺激這樣的細(xì)胞的方法不足以有效地產(chǎn)生令人信服的腫瘤減小。顯著的副作用也由所需要的大量細(xì)胞因子產(chǎn)生。

免疫治療的這些之前嘗試的一種方法涉及使患者自身的免疫細(xì)胞工程化以識(shí)別和攻擊他們的腫瘤。而且雖然這種稱為過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移(ACT)的方法目前被限制于臨床試驗(yàn)，但是使用這些工程化的免疫細(xì)胞的治療已經(jīng)對(duì)患有晚期癌癥的患者產(chǎn)生了治療應(yīng)答。

因此，本發(fā)明涵蓋與施用本文描述的MSC聯(lián)合的過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移。本發(fā)明涵蓋了，由于適當(dāng)?shù)募?xì)胞因子的表達(dá)，在施用免疫細(xì)胞(CART)前施用基因修飾MSC會(huì)提高CART和在過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移期間施用的其他免疫效應(yīng)細(xì)胞的趨化性。刺激細(xì)胞因子的表達(dá)會(huì)僅僅局部地優(yōu)選在腫瘤內(nèi)或接近于腫瘤處提高T細(xì)胞的激活，隨后導(dǎo)致記憶效應(yīng)細(xì)胞表型，從而延長(zhǎng)治療的療效。

過(guò)繼細(xì)胞轉(zhuǎn)移使用基于T細(xì)胞的細(xì)胞毒性應(yīng)答來(lái)攻擊癌細(xì)胞。在體外產(chǎn)生對(duì)患者的癌細(xì)胞具有天然或基因工程化的反應(yīng)性的T細(xì)胞，然后轉(zhuǎn)移回至癌癥患者。使用自體腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞作為對(duì)患有轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的患者有效的治療。這可以通過(guò)取患者的腫瘤中發(fā)現(xiàn)的T細(xì)胞，培養(yǎng)所述T細(xì)胞以攻擊癌細(xì)胞來(lái)實(shí)現(xiàn)。這些T細(xì)胞可以被稱為腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TIL)。可以使用高濃度的IL-2、抗CD3和異常反應(yīng)性飼養(yǎng)細(xì)胞刺激這樣的T細(xì)胞以在體外擴(kuò)增。習(xí)慣上，然后將這些T細(xì)胞轉(zhuǎn)移回至患者，同時(shí)外源施用IL-2以進(jìn)一步加強(qiáng)它們的抗癌活性。

在一種實(shí)施方式中本發(fā)明涵蓋經(jīng)由如本文描述的基因修飾MSC施用用IL-2。通過(guò)該方法，避免了全身施用IL-2的副作用，同時(shí)保持和/或提高了T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的有利作用。對(duì)于單獨(dú)的IL-12、IL-7、IL-21和/或IL-15或其組合，獲得相似的效果以實(shí)現(xiàn)免疫學(xué)記憶的激活和建立。

因此，本發(fā)明提供了用于產(chǎn)生局部和組織特異性細(xì)胞因子以刺激抗腫瘤免疫應(yīng)答，優(yōu)選由細(xì)胞毒性T細(xì)胞和/或NK細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫應(yīng)答的新方法。

人工T細(xì)胞受體(也稱為嵌合T細(xì)胞受體、嵌合免疫受體、嵌合抗原受體(CAR))是將任意的特異性移入免疫效應(yīng)細(xì)胞上的工程化受體。典型地，這些受體用于將單克隆抗體的特異性移入T細(xì)胞上；通過(guò)反轉(zhuǎn)錄病毒載體促進(jìn)所述受體的編碼序列的轉(zhuǎn)移。

在一種實(shí)施方式中，可以通過(guò)用含有T細(xì)胞受體(TCR)基因拷貝的病毒感染患者的細(xì)胞來(lái)制備基因工程化T細(xì)胞，所述T細(xì)胞受體(TCR)基因是專門識(shí)別腫瘤抗原的。病毒不能在細(xì)胞中復(fù)制，然而可以整合到人基因組中。這是有利的，因?yàn)樾碌腡CR基因在T細(xì)胞中保持穩(wěn)定。將患者自身的T細(xì)胞暴露于這些病毒，然后非特異性地?cái)U(kuò)增或使用基因工程化的TCR刺激。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移回至患者中，并且準(zhǔn)備對(duì)腫瘤具有免疫應(yīng)答。第二代和第三代CAR典型地由單克隆抗體的片段組成，稱為單鏈可變區(qū)片段(scFv)，其存在于T細(xì)胞膜的外部，并且連接于T細(xì)胞內(nèi)側(cè)的刺激部分。scFv部分引導(dǎo)細(xì)胞至靶抗原。一旦T細(xì)胞結(jié)合于它的靶抗原，刺激分子為T細(xì)胞提供必要的信號(hào)以成為完全活性的T細(xì)胞。在該完全活性狀態(tài)下，T細(xì)胞可以更有效地增殖，以及可以攻擊癌細(xì)胞。

表達(dá)誘導(dǎo)T細(xì)胞增殖和/或分化的免疫應(yīng)答刺激細(xì)胞因子和/或免疫刺激因子的MSC與免疫細(xì)胞，優(yōu)選為T細(xì)胞如本文描述的那些一起聯(lián)合施用，以及任選地與檢查點(diǎn)抑制劑的進(jìn)一步聯(lián)合施用，導(dǎo)致關(guān)于希望的抗癌作用的協(xié)同作用。檢查點(diǎn)抑制劑可以與表達(dá)刺激性細(xì)胞因子的MSC組合，以提高另外施用的免疫細(xì)胞的抗腫瘤作用，從而在抗腫瘤治療中產(chǎn)生與預(yù)料不到的效果相關(guān)的因素的組合。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用作如本文所述的藥物的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中免疫治療包括來(lái)源于患者的腫瘤物質(zhì)的施用。

在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，本發(fā)明涉及用作如本文所述的藥物的基因修飾間充質(zhì)干細(xì)胞，其中免疫治療包括靶向于腫瘤特異性抗原的抗體或抗體片段的施用。

例如，抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)是細(xì)胞介導(dǎo)的免疫防御機(jī)制，由此，免疫系統(tǒng)的效應(yīng)細(xì)胞主動(dòng)地裂解靶細(xì)胞如癌細(xì)胞，所述靶細(xì)胞的膜表面抗原被特異性抗體結(jié)合。這是作為體液免疫應(yīng)答的部件的抗體可以用于限制和控制癌生長(zhǎng)的機(jī)制之一。之前的報(bào)道已經(jīng)表明ADCC是包括曲妥單抗和利妥昔單抗的治療性單克隆抗體對(duì)抗腫瘤的重要作用機(jī)制。本發(fā)明涵蓋了如本文描述的MSC與抗腫瘤抗體治療的聯(lián)合施用。

例如，可以施用同時(shí)靶向于腫瘤特異性抗原和T細(xì)胞上的CD3分子的雙特異性抗體作為抗腫瘤免疫治療。

具體實(shí)施方式

免疫系統(tǒng)的重要作用是鑒別和消除腫瘤。腫瘤的轉(zhuǎn)化癌細(xì)胞表達(dá)在正常細(xì)胞上沒(méi)有發(fā)現(xiàn)的抗原。對(duì)于免疫系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，這些抗原表現(xiàn)出是外來(lái)的，并且它們的出現(xiàn)導(dǎo)致免疫細(xì)胞攻擊轉(zhuǎn)化的腫瘤細(xì)胞。由腫瘤表達(dá)的抗原具有幾種來(lái)源。某些抗原來(lái)源于致癌病毒如導(dǎo)致宮頸癌的人乳頭瘤病毒，而其他抗原是有機(jī)體自身的蛋白，所述蛋白在正常細(xì)胞種以低水平存在，但是在腫瘤細(xì)胞中達(dá)到高水平。一個(gè)例子是稱為酪氨酸酶的酶，當(dāng)該酶以高水平表達(dá)時(shí)使某些皮膚細(xì)胞(例如黑色素細(xì)胞)轉(zhuǎn)化為稱為黑色素瘤的腫瘤。腫瘤抗原的第三種可能的來(lái)源是對(duì)調(diào)節(jié)細(xì)胞增長(zhǎng)和存活通常重要的蛋白，其通常突變?yōu)榉Q為癌基因的癌癥誘導(dǎo)分子。

免疫系統(tǒng)對(duì)腫瘤的主要應(yīng)答是使用殺傷T細(xì)胞破壞異常細(xì)胞，有時(shí)伴隨輔助T細(xì)胞的協(xié)助。腫瘤抗原以與病毒抗原相似的方式提呈給MHC I類分子。這允許殺傷T細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞為異常的細(xì)胞。NK細(xì)胞也以相似的方式殺傷腫瘤細(xì)胞，尤其是如果腫瘤細(xì)胞在該NK細(xì)胞表面上具有比正常細(xì)胞少的MHC I類分子；這是腫瘤的常見(jiàn)現(xiàn)象。某些腫瘤細(xì)胞還釋放抑制免疫應(yīng)答的產(chǎn)物；例如通過(guò)分泌抑制巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的活性的細(xì)胞因子TGF-β。

因此，本發(fā)明提供了通過(guò)由如本文描述的基因修飾MSC表達(dá)免疫刺激細(xì)胞因子來(lái)支持抗腫瘤免疫反應(yīng)的方法。

在本發(fā)明的情況下，免疫治療被理解為涵蓋使用免疫系統(tǒng)治療癌癥的任何治療劑。免疫治療利用了如下事實(shí)：癌細(xì)胞在其表面上具有可以被免疫系統(tǒng)檢測(cè)到的微妙不同的分子。這些分子被稱為癌癥抗原，是最常見(jiàn)的蛋白質(zhì)，而且包括如碳水化合物的分子。免疫治療在攻擊腫瘤細(xì)胞中通過(guò)使用這些抗原作為靶標(biāo)激發(fā)或增強(qiáng)免疫系統(tǒng)。

免疫治療涵蓋但不限于細(xì)胞治療和抗體治療。

細(xì)胞治療典型地涉及施用從患者的血液或從患者的腫瘤中分離的免疫細(xì)胞。將針對(duì)要治療的腫瘤的免疫細(xì)胞激活、培養(yǎng)，以及轉(zhuǎn)移回患者的免疫細(xì)胞攻擊癌癥的位置。可以以該方式使用的細(xì)胞類型不限于天然殺傷細(xì)胞、淋巴因子激活的殺傷細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞和樹突細(xì)胞。樹突細(xì)胞治療通過(guò)引起樹突細(xì)胞提呈腫瘤抗原來(lái)激發(fā)抗腫瘤應(yīng)答。樹突細(xì)胞將抗原提呈至淋巴細(xì)胞，這激活了淋巴細(xì)胞并且使其致敏以殺傷提呈該抗原的其他細(xì)胞。

抗體是由免疫系統(tǒng)產(chǎn)生的結(jié)合于細(xì)胞表面上的靶抗原的蛋白質(zhì)。結(jié)合于癌癥抗原的抗體可以用于治療癌癥。細(xì)胞表面受體是用于抗體治療的常見(jiàn)靶標(biāo)，并且包括例如CD20、CD274和CD279。一旦結(jié)合于癌癥抗原，抗體可以誘導(dǎo)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性，激活補(bǔ)體系統(tǒng)，或防止受體與其配體相互作用，所有這些都可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡。多種抗體被批準(zhǔn)用于治療癌癥，包括阿倫單抗(Alemtuzumab)、伊匹單抗、納武單抗、奧法木單抗(Ofatumumab)和利妥昔單抗。

抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)是通過(guò)免疫系統(tǒng)攻擊的機(jī)制，其需要抗體結(jié)合于靶細(xì)胞表面的抗體?？贵w由可以通過(guò)免疫細(xì)胞經(jīng)由其Fc表面受體檢測(cè)到的結(jié)合區(qū)(Fab)和Fc區(qū)組成。在包括天然殺傷細(xì)胞的許多免疫系統(tǒng)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)了Fc受體。當(dāng)天然殺傷細(xì)胞遭遇抗體包覆的細(xì)胞時(shí)，后者的Fc區(qū)與天然殺傷細(xì)胞的Fc受體相互作用，導(dǎo)致穿孔素和顆粒酶B的釋放。這兩種化學(xué)物質(zhì)編程腫瘤細(xì)胞中的細(xì)胞死亡(凋亡)。有效抗體包括利妥昔單抗、奧法木單抗和阿倫單抗。

補(bǔ)體系統(tǒng)包括在抗體結(jié)合于細(xì)胞表面后引起細(xì)胞死亡的血液蛋白。通常地，系統(tǒng)處理外來(lái)病原體，但是可以用癌癥中的治療性抗體激活。如果抗體是嵌合的、人源化的或人的，就可以觸發(fā)系統(tǒng)；只要它含有IgG1的Fc區(qū)。補(bǔ)體可以通過(guò)膜攻擊復(fù)合體的激活，其被稱為補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性；增強(qiáng)抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性；以及CR3依賴性細(xì)胞毒性引起細(xì)胞死亡。當(dāng)抗體結(jié)合于癌細(xì)胞表面、C1復(fù)合體結(jié)合于這些抗體、隨后在癌細(xì)胞膜上形成蛋白孔時(shí)，補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性會(huì)發(fā)生。

可以通過(guò)優(yōu)選細(xì)胞的或基于抗體的抗腫瘤免疫療法靶向于腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原，所述腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原包括但不限于唯一地或主要地由腫瘤細(xì)胞表達(dá)并且可以被免疫治療靶向的、技術(shù)人員已知的或可以由技術(shù)人員鑒別的抗原。作為非限制性的例子，腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原涵蓋在由于突變導(dǎo)致具有異常結(jié)構(gòu)的腫瘤細(xì)胞中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，如原癌基因、ras和p53基因的異常產(chǎn)物；或與腫瘤細(xì)胞相關(guān)的其他蛋白，如組織分化抗原、分化群(通?？s寫為CD)細(xì)胞表面分子、突變蛋白抗原、致癌病毒抗原、癌-睪丸抗原(cancer-testis antigens)和血管或基質(zhì)特異性抗原。糖蛋白、糖脂、碳水化合物或生長(zhǎng)因子受體也可以被認(rèn)為是作為抗腫瘤免疫治療靶標(biāo)的腫瘤相關(guān)抗原或腫瘤特異性抗原。

本發(fā)明的MSC能夠通過(guò)它們的來(lái)源于免疫應(yīng)答刺激轉(zhuǎn)基因細(xì)胞因子的獨(dú)特特性和MSC固有的抗炎特性支持和/或增強(qiáng)本文描述的免疫治療。

如本文描述的，“腫瘤”應(yīng)該包括但不限于前列腺瘤、胰腺瘤、鱗狀細(xì)胞癌、乳腺瘤、黑色素瘤、基底細(xì)胞癌、肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌、睪丸癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤、膠質(zhì)瘤或惡性星形細(xì)胞瘤如多形性成膠質(zhì)細(xì)胞瘤(glioblastma multiforme)、結(jié)腸直腸瘤、子宮內(nèi)膜癌、肺癌、卵巢瘤、宮頸瘤、骨肉瘤、橫紋肌/平滑肌肉瘤、滑膜肉瘤、血管肉瘤、艾文氏肉瘤/PNET和惡性淋巴瘤。這些包括原發(fā)腫瘤以及轉(zhuǎn)移腫瘤(血管化的和非血管化的)。

本文公開的“間充質(zhì)干細(xì)胞”可以產(chǎn)生循環(huán)系統(tǒng)和淋巴系統(tǒng)中的結(jié)締組織、骨、軟骨和細(xì)胞。在間充質(zhì)中發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞，所述間充質(zhì)是由寬松包裹的梭形或星形非專門化細(xì)胞組成的胚胎中胚層的一部分。如本文使用的，間充質(zhì)干細(xì)胞包括但不限于CD34陰性干細(xì)胞。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，間充質(zhì)干細(xì)胞是塑料粘著性細(xì)胞(plastic-adherent cells)，在某些實(shí)施方式中定義為多能間充質(zhì)干細(xì)胞，并且還包括CD34陰性細(xì)胞。為了避免任何疑問(wèn)，術(shù)語(yǔ)間充質(zhì)干細(xì)胞涵蓋多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞，該多能間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞也包括間充質(zhì)細(xì)胞、MSC和它們的前體的亞群，所述亞群由能夠在體內(nèi)分化為多種細(xì)胞類型的多能(multipotent)或多能(pluripotent)自我更新細(xì)胞組成。

如本文使用的，CD34陰性細(xì)胞應(yīng)該是指在其表面缺少CD34的細(xì)胞或僅表達(dá)可以忽略水平的CD34的細(xì)胞。CD34陰性細(xì)胞和分離這樣的細(xì)胞的方法，例如描述于Lange C.等人,“在無(wú)動(dòng)物血清的培養(yǎng)基中快速和安全地?cái)U(kuò)增人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞用于移植和再生醫(yī)學(xué)(Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine)”.J.Cell Physiol.2007,Apr.25中。

可以通過(guò)許多指標(biāo)將間充質(zhì)干細(xì)胞與造血干細(xì)胞(HSC)區(qū)別開。例如已知HSC在培養(yǎng)物中漂浮并且不黏著于塑料表面。相反，間充質(zhì)干細(xì)胞黏著于塑料表面。本發(fā)明的CD34陰性的間充質(zhì)干細(xì)胞在培養(yǎng)物中是粘附的。

本文描述的基因修飾的細(xì)胞可以根據(jù)其以固體、液體還是噴霧形式施用，以及對(duì)于這樣的施用途徑其作為注射劑是否需要無(wú)菌，包括不同類型的載體。本發(fā)明可以靜脈內(nèi)、皮內(nèi)、動(dòng)脈內(nèi)、腹腔內(nèi)、病變內(nèi)、顱內(nèi)、關(guān)節(jié)腔內(nèi)、前列腺內(nèi)、胸腔內(nèi)、氣管內(nèi)、鼻內(nèi)、玻璃體內(nèi)、陰道內(nèi)、直腸內(nèi)、總體地(topically)、瘤內(nèi)、肌內(nèi)、腹腔內(nèi)、皮下、結(jié)膜下、小泡內(nèi)(intravesicularlly)、粘膜、心包內(nèi)、臍帶內(nèi)、眼內(nèi)、經(jīng)口、總體地(topically)、局部地(locally)，吸入(例如霧化吸入)、注射、輸注、持續(xù)輸注、局部灌注直接洗滌靶細(xì)胞，經(jīng)由導(dǎo)管、經(jīng)由灌洗，以膏狀、以脂質(zhì)組合物(例如脂質(zhì)體)，或通過(guò)如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他方法或上述的任意組合施用(見(jiàn)例如，雷明頓的藥物科學(xué)(Remington's Pharmaceutical Sciences),18th Ed.Mack Printing Company,1990，通過(guò)引用在此并入)。

本發(fā)明涵蓋了通過(guò)將治療有效數(shù)目的細(xì)胞引入受試者的血流來(lái)治療患者。如本文使用，將細(xì)胞“引入受試者的血流”應(yīng)包括但不限于將這樣的細(xì)胞通過(guò)注射引入受試者的靜脈或動(dòng)脈之一。這樣的施用也可以進(jìn)行例如一次、多次和/或在一個(gè)或多個(gè)延長(zhǎng)的時(shí)間段內(nèi)。單次注射是優(yōu)選的，但是在某些情況下經(jīng)過(guò)一段時(shí)間(例如每季度、每半年或每年)重復(fù)注射是必要的。這樣的施用也優(yōu)選使用CD34-陰性細(xì)胞和藥學(xué)上可接受的載體的混合物進(jìn)行。藥學(xué)上可接受的載體對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的，其包括但不限于0.01-0.1M和優(yōu)選0.05M磷酸鹽緩沖液或0.8％鹽水，以及通常使用的專用深低溫保存培養(yǎng)基。

可以局部地進(jìn)行施用，例如通過(guò)注入患者體內(nèi)接近于腫瘤疾病的區(qū)域。MSC顯示向癌組織遷移。無(wú)論如何，局部施用如本文描述的細(xì)胞會(huì)在其作用部位導(dǎo)致高水平的細(xì)胞。

此外，這樣的藥學(xué)上可接受的載體可以是水溶液或非水溶液、懸浮液和乳液，最優(yōu)選是水溶液。含水載體包括水、酒精/水溶液、乳液和懸浮液，包括鹽水和緩沖介質(zhì)。非胃腸載體包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化鈉、乳酸林格氏液和固定油。靜脈內(nèi)載體包括流體營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑如林格氏葡萄糖、基于林格氏葡萄糖的載體等。通?？梢栽诶缋酌黝D：藥學(xué)的科學(xué)與實(shí)踐(Remington:The Science and Practice of Pharmacy),20th Ed.,p.808,Lippincott Williams S-Wilkins(2000)中找到通常用于靜脈內(nèi)施用的流體。還可以存在防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑、惰性氣體等。

如本文使用的，“治療有效數(shù)目的細(xì)胞”包括但不限于以下的量和量的范圍：(i)約1×10²至約1×10⁸個(gè)細(xì)胞/kg體重；(ii)約1×10³至約1×10⁷個(gè)細(xì)胞/kg體重；(iii)約1×10⁴至約1×10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重；(iv)約1×10⁴至約1×10⁵個(gè)細(xì)胞/kg體重；(v)約1×10⁵至約1×10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重；(vi)約5×10⁴至約0.5×10⁵個(gè)細(xì)胞/kg體重；(vii)約1×10³個(gè)細(xì)胞/kg體重；(viii)約1×10⁴個(gè)細(xì)胞/kg體重；(ix)約5×10⁴個(gè)細(xì)胞/kg體重；(x)約1×10⁵個(gè)細(xì)胞/kg體重；(xi)約5×10⁵個(gè)細(xì)胞/kg體重；(xii)約1×10⁶個(gè)細(xì)胞/kg體重；以及(xiii)約1×10⁷個(gè)細(xì)胞/kg體重。人體重預(yù)期包括但不限于約5kg、10kg、15kg、30kg、50kg、約60kg；約70kg；約80kg、約90kg；約100kg、約120kg和約150kg。這些數(shù)目基于臨床前的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和人體試驗(yàn)以及來(lái)自CD34+造血干細(xì)胞移植的標(biāo)準(zhǔn)方案。單核細(xì)胞(包括CD34+細(xì)胞)通常含有1:23000至1:300000的CD34陰性細(xì)胞。

如本文使用的，“治療”患有疾病的受試者應(yīng)該是指減慢、停止或逆轉(zhuǎn)疾病進(jìn)程。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，治療患有疾病的受試者是指理想地使疾病進(jìn)程逆轉(zhuǎn)至消除疾病本身的點(diǎn)。如本文使用的，改善疾病和治療疾病是等價(jià)的。本發(fā)明的治療也可以或供選擇地涉及所述細(xì)胞的預(yù)防性施用。這樣的預(yù)防性施用可以涉及防止任何給定的醫(yī)學(xué)疾病，或防止所述疾病的發(fā)展，由此防止或預(yù)防將不在所有條件下狹義地被解釋為絕對(duì)的防止。防止或預(yù)防可能還涉及減少受試者發(fā)展出任何給定的醫(yī)學(xué)病癥的風(fēng)險(xiǎn)，優(yōu)選對(duì)于處于所述病癥的風(fēng)險(xiǎn)中的受試者。

聯(lián)合施用涵蓋同時(shí)治療，共同治療(co-treatment)或聯(lián)合治療，并且包括施用MSC與免疫治療劑如檢查點(diǎn)抑制劑和/或免疫細(xì)胞的單獨(dú)制劑，據(jù)此，治療可以在彼此間的幾分鐘內(nèi)發(fā)生，與彼此發(fā)生在同一小時(shí)內(nèi)，在同一天，在同一周內(nèi)或在同一個(gè)月內(nèi)。術(shù)語(yǔ)“聯(lián)合施用”還涵蓋有順序地施用組合劑(例如MSC、免疫細(xì)胞和/或檢查點(diǎn)抑制劑)的任何給定的組合。還使用了包含一種或多種所述MSC與另一種免疫治療劑如檢查點(diǎn)抑制劑和/或免疫細(xì)胞的組合藥物，以共同施用單次施用或單次劑量的各種組分。

通過(guò)幾分鐘至幾周的間隔，聯(lián)合免疫治療可以在用基因修飾的干細(xì)胞治療之前或之后。在將其他免疫治療劑和基因修飾干細(xì)胞單獨(dú)施用于感興趣的部位的實(shí)施方式中，通常會(huì)確保在每次遞送的時(shí)間之間主要的時(shí)間段沒(méi)有過(guò)期，以使得藥劑和基因修飾的干細(xì)胞仍然能夠在治療部位發(fā)揮有利的聯(lián)合作用。在這樣的情況下，預(yù)期將會(huì)使兩種形式的細(xì)胞在以下時(shí)間內(nèi)接觸：在彼此間的約12-24小時(shí)內(nèi)，以及更優(yōu)選在彼此間的約6-12小時(shí)內(nèi)，最優(yōu)選具有僅約12小時(shí)的延遲時(shí)間。然而在某些情況下，顯著延長(zhǎng)治療的時(shí)期可能是希望的，其中在各自施用之間經(jīng)過(guò)幾天(2、3、4、5、6或7)至幾周(1、2、3、4、5、6、7或8)。

如本文使用的術(shù)語(yǔ)“基質(zhì)”是指組織或器官(或腺體、組織或其他結(jié)構(gòu))的支持性骨架，通常由胞外基質(zhì)(ECM)和基質(zhì)細(xì)胞組成?；|(zhì)與由該器官的關(guān)鍵功能元件組成的實(shí)質(zhì)(parenchyma)不同。與表皮(皮膚的最頂層)相鄰的(真皮層中的)基質(zhì)細(xì)胞釋放促進(jìn)細(xì)胞分裂的生長(zhǎng)因子。基質(zhì)由非惡性的宿主細(xì)胞組成?；|(zhì)提供了胞外基質(zhì)，在所述胞外基質(zhì)上腫瘤可以生長(zhǎng)并保持存在或?qū)⑺鼈冏陨韽拿庖攮h(huán)境分離。

如本文使用的，術(shù)語(yǔ)“腫瘤微環(huán)境”涉及任何給定的腫瘤所存在的細(xì)胞環(huán)境，包括腫瘤基質(zhì)、周圍的血管、免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、其他細(xì)胞、信號(hào)傳導(dǎo)分子和ECM。

如本文使用的，“細(xì)胞遷移”或“歸巢”意圖是指細(xì)胞朝向特定的化學(xué)或物理信號(hào)的移動(dòng)。細(xì)胞通常響應(yīng)于特定的外部信號(hào)而遷移，包括化學(xué)信號(hào)和機(jī)械信號(hào)。如本文描述的MSC能夠歸巢至腫瘤組織或其他炎癥信號(hào)。

趨化性是關(guān)于應(yīng)答于化學(xué)刺激的細(xì)胞遷移的一個(gè)例子。體外趨化性測(cè)定如博伊登室測(cè)定(Boyden chamber assays)可以用于確定在任何給定的細(xì)胞中是否有細(xì)胞遷移。

例如，可以純化和分析感興趣的細(xì)胞。使用板可以進(jìn)行趨化性測(cè)定(例如根據(jù)Falk等人,1980J.Immuno.Methods 33:239-247)，在所述板中將特定的化學(xué)信號(hào)關(guān)于有興趣的細(xì)胞和遷移的細(xì)胞放置，然后收集并且分析。例如，博伊登室測(cè)定需要使用通過(guò)過(guò)濾器分離的室，用作準(zhǔn)確確定趨化行為的工具。這些室的先鋒類型由Boyden構(gòu)建(Boyden(1962)"多形核白細(xì)胞上的抗原和抗體的混合物的趨化作用(The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes)".J Exp Med 115(3):453)。將運(yùn)動(dòng)細(xì)胞置于上室，同時(shí)將含有測(cè)試物質(zhì)的流體過(guò)填充至下室。要研究的運(yùn)動(dòng)細(xì)胞的尺寸決定過(guò)濾器的孔徑；選擇允許活性遷移的直徑是必要的。對(duì)于在體內(nèi)條件下建模，幾種方案優(yōu)選用胞外基質(zhì)分子(膠原蛋白、彈性蛋白等)覆蓋過(guò)濾器。通過(guò)發(fā)展多孔室(例如NeuroProbe)，增加測(cè)量的有效性，其中可平行評(píng)價(jià)24、96、384個(gè)樣本。該變體的優(yōu)勢(shì)是在相同的條件下測(cè)試多個(gè)平行樣本。

如本文使用的“移入”是指將移植的(grafted)或移植的(transplanted)組織或細(xì)胞并入宿主體內(nèi)的過(guò)程。移入也涉及將移植的細(xì)胞整合至宿主組織以及它們的存活和在某些條件下分化為非干細(xì)胞狀態(tài)。

用于評(píng)價(jià)MSC的移入和由此MSC在一定程度上的遷移和生物分布的技術(shù)可以涵蓋體內(nèi)或體外方法。體內(nèi)方法的例子包括生物發(fā)光，由此轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞以表達(dá)熒光素酶，然后可以通過(guò)它們的熒光素代謝將細(xì)胞成像，導(dǎo)致光發(fā)射；熒光，由此使細(xì)胞負(fù)載熒光染料或轉(zhuǎn)導(dǎo)以表達(dá)然后可以成像的熒光報(bào)告分子；放射性核素標(biāo)記，其中使細(xì)胞負(fù)載放射性核素并用閃爍照相法(scintigraphy)、正電子放射斷層造影術(shù)(PET)或單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層造影術(shù)(SPECT)以及磁共振成像(MRI)定位，其中用MRI掃描儀追蹤負(fù)載有順磁性化合物(例如氧化鐵納米顆粒)的細(xì)胞。評(píng)價(jià)生物分布的體外方法包括定量PCR、流式細(xì)胞術(shù)和組織學(xué)方法。組織學(xué)方法包括追蹤熒光標(biāo)記的細(xì)胞；對(duì)例如Y染色體和人特異性ALU序列原位雜交；和對(duì)物種特異性的或基因引入的蛋白(如細(xì)菌β-半乳糖苷酶)的組織化學(xué)染色。這些免疫組織化學(xué)方法用于辨別移入位置，但是有必要切除組織。對(duì)于進(jìn)一步回顧這些方法和它們的應(yīng)用，見(jiàn)Kean等人,MSC：遞送的路徑和移入細(xì)胞靶向策略以及免疫調(diào)節(jié)(MSCs:Delivery Routes and Engraftment,Cell-Targeting Strategies,and Immune Modulation),Stem Cells International,Volume 2013(2013)。

祖細(xì)胞或多能細(xì)胞，如本發(fā)明的間充質(zhì)干細(xì)胞，可以被描述為基因遞送載體，基本上能夠使治療性基因產(chǎn)物在受試者體內(nèi)的特定組織或區(qū)域內(nèi)定位和表達(dá)。這樣的治療性細(xì)胞提供了為其他治療難治的疾病提供細(xì)胞治療的能力。對(duì)于每種類型的治療性細(xì)胞，最終目標(biāo)是相同的：細(xì)胞應(yīng)該表達(dá)特異性的全部基因，優(yōu)選編碼治療性基因產(chǎn)物的外源核酸，由此修改細(xì)胞一致性以表達(dá)所述基因產(chǎn)物，以及提供治療性作用，如免疫刺激作用。當(dāng)本發(fā)明的細(xì)胞在體外擴(kuò)增時(shí)，其表現(xiàn)出包括多代間充質(zhì)(基質(zhì))細(xì)胞后代的異源群體，其缺少多數(shù)分化標(biāo)記如CD34的表達(dá)。這些群體可能保留了沿著間充質(zhì)譜系和非間充質(zhì)譜系的終末分化和成熟的有限的增殖潛力和應(yīng)答性。

如本文使用的“誘導(dǎo)型表達(dá)”或“條件性表達(dá)”涉及基因表達(dá)的狀態(tài)、多重狀態(tài)或系統(tǒng)，其中感興趣的基因如免疫刺激細(xì)胞因子優(yōu)選是不表達(dá)的，或在某些實(shí)施方式中，以可忽略的或相對(duì)低的水平表達(dá)，除非細(xì)胞中存在允許基因表達(dá)的一種或多種分子(誘導(dǎo)劑)或其他一組條件。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以涉及在特定的生物條件下以相對(duì)高水平表達(dá)的天然存在的啟動(dòng)子，或涉及包括任何給定的誘導(dǎo)型元件的其他合成啟動(dòng)子。誘導(dǎo)型啟動(dòng)子可以是指通過(guò)特定組織或微環(huán)境或存在于特定組織或微環(huán)境中的生物信號(hào)的組合所誘導(dǎo)的啟動(dòng)子，或指由外部因素，例如通過(guò)施用小的藥物分子或其他外部施加的信號(hào)誘導(dǎo)的啟動(dòng)子。

如本文使用的，接近組織包括例如在組織的50mm、10mm、5mm、1mm之內(nèi)，在組織的0.5mm之內(nèi)和在組織的0.25mm之內(nèi)。

本文描述的細(xì)胞因子可以涉及與本文所稱的細(xì)胞因子對(duì)應(yīng)的任何哺乳動(dòng)物細(xì)胞因子。優(yōu)選地，細(xì)胞因子涉及人細(xì)胞因子或小鼠細(xì)胞因子。

考慮到干細(xì)胞可以顯示在正常以及病態(tài)環(huán)境下對(duì)不同組織微環(huán)境的選擇性遷移，本發(fā)明涵蓋了與在募集的干細(xì)胞中啟動(dòng)的分化途徑聯(lián)系的組織特異性啟動(dòng)子的使用，并且所述組織特異性啟動(dòng)子理論上可以用于在限定的生物環(huán)境下僅驅(qū)動(dòng)選擇性表達(dá)治療性基因。募集至其他組織部位但是沒(méi)有經(jīng)歷分化的相同程序的干細(xì)胞不應(yīng)表達(dá)治療性基因。該方法使得顯著程度地控制治療性基因在限定的微環(huán)境內(nèi)選擇性表達(dá)，以及該方法已經(jīng)成功應(yīng)用于在新血管生成期間調(diào)節(jié)治療性基因表達(dá)。WO 2008/150368和WO 2010/119039中公開了這樣的基因修飾的可能方法，據(jù)此將其全文并入。

附圖說(shuō)明

為了描述本發(fā)明的具體實(shí)施方式，通過(guò)證明本發(fā)明的實(shí)踐實(shí)施提供了以下附圖，而不限制對(duì)本發(fā)明的范圍或本文描述的構(gòu)思。

附圖簡(jiǎn)述：

圖1：在體外表達(dá)細(xì)胞因子的基因修飾的人MSC。

圖2：本發(fā)明的優(yōu)選的病毒表達(dá)構(gòu)建體。

圖3：用病毒表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的胞內(nèi)FACS分選。

圖4：轉(zhuǎn)基因細(xì)胞因子的ELISA檢測(cè)。

附圖詳述：

圖1：在體外表達(dá)細(xì)胞因子的基因修飾的人MSC：用表達(dá)圖中所示細(xì)胞因子和pac嘌呤霉素抗性基因的反轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人MSC(MOI為0.25)。轉(zhuǎn)導(dǎo)后，使用嘌呤霉素選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC，并且通過(guò)qPCR確定每個(gè)細(xì)胞的平均載體拷貝數(shù)。然后將選擇的細(xì)胞接種用于ELISA測(cè)定(人IL-2Thermo Scientific公司(賽默飛世爾科技公司)EH2IL2，人IL-7Thermo Scientific公司EHIL7，人IL-21Thermo Scientific公司EHIL21)。接種后72小時(shí)，接種1×10⁵個(gè)細(xì)胞，收集上清，隨后測(cè)試。以1×10⁵個(gè)細(xì)胞和一個(gè)載體拷貝數(shù)歸一化生成的數(shù)據(jù)。

圖2：本發(fā)明的優(yōu)選的病毒表達(dá)構(gòu)建體。將構(gòu)建體克隆至γ-反轉(zhuǎn)錄病毒骨架(pSERS11，EP2019134A1)。通過(guò)延長(zhǎng)因子短(pEFS)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)所有構(gòu)建體。存在被P2A分開的兩種白細(xì)胞介素。IL-12的α-鏈和β-鏈必須被T2A分開。使用人白細(xì)胞介素序列(IL-2：基因庫(kù)(GenBank)：DQ861285.1，IL-7：基因庫(kù)：EF064721.1，IL-12α：基因庫(kù)：AF101062.1，IL-12β：NCBI參考序列：NM_002187.2，IL-15：基因庫(kù)：AY720442.1，IL-21：基因庫(kù):BC066260.1)。pac基因和oPRE序列位于IRES序列之后。在構(gòu)建體的5’端和3’端是LTR。骨架含有LTR，其位于構(gòu)建體的5’端和3’端。構(gòu)建體5’端處的LTR含有SV40增強(qiáng)子、RSV啟動(dòng)子、R區(qū)和U5區(qū)。構(gòu)建體的3’端處的LTR缺失U3區(qū)、R區(qū)、U5區(qū)和多聚腺苷酸(PolyA)信號(hào)。骨架含有細(xì)菌部分：lacZ啟動(dòng)子、復(fù)制起點(diǎn)、bla基因和LacZ基因(pUC19)。

圖3：用病毒表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞的胞內(nèi)FACS分選。通過(guò)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞產(chǎn)生編碼指定載體的病毒顆粒。以0.25的MOI轉(zhuǎn)導(dǎo)原代人MSC。用嘌呤霉素(Sigma Aldrich，P9620-10ML，10mg/mL，終濃度：3μg/mL)選擇轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。通過(guò)ic-FACS分析選擇的細(xì)胞。為了增強(qiáng)對(duì)表達(dá)的細(xì)胞因子的檢測(cè)，用GolgiPlug(BD,555029)處理細(xì)胞16h以富集蛋白。根據(jù)制造商說(shuō)明，使用(BD,554722)使細(xì)胞透性化；然后使用對(duì)HA-Tag特異性的抗體(Miltenyi,130-092-257)對(duì)細(xì)胞因子染色(每次染色1.33μL)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)(FC500,美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司(Beckman coulter))分析細(xì)胞。

3A：未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞

3B：包括IL7和IL21的構(gòu)建體，重復(fù)1

3C：包括IL7和IL21的構(gòu)建體，重復(fù)2

3D：包括IL2和IL12的構(gòu)建體，重復(fù)1

3E：包括IL2和IL12的構(gòu)建體，重復(fù)2

3F：包括IL15和IL121的構(gòu)建體，重復(fù)1

3G：包括IL15和IL12的構(gòu)建體，重復(fù)2

3H：包括IL7和IL12的構(gòu)建體，重復(fù)1

3I：包括IL7和IL12的構(gòu)建體，重復(fù)2

3J：包括IL21和IL12的構(gòu)建體，重復(fù)1

3K：包括IL21和IL12的構(gòu)建體，重復(fù)2

圖4：轉(zhuǎn)基因細(xì)胞因子的ELISA檢測(cè)。用所指示的載體轉(zhuǎn)導(dǎo)人MSC。細(xì)胞是嘌呤嘧啶選擇的細(xì)胞，以及1×10⁵個(gè)細(xì)胞接種于6孔板。72h后收集上清，并通過(guò)ELISA分析。將生成的數(shù)據(jù)歸一化為1×10⁵個(gè)細(xì)胞和載體拷貝數(shù)。根據(jù)制造商說(shuō)明，使用ELISA試劑盒：人IL-2(Thermo Scientific公司，EH2IL2)，人IL-7(Thermo Scientific公司，EHIL)，人IL-15(BioLegend，431707)，人IL-21(Thermo Scientific公司，EHIL21)。

實(shí)施例

為了描述本發(fā)明的實(shí)際實(shí)施方式和在某些情況下的優(yōu)選實(shí)施方式，通過(guò)證明本發(fā)明的實(shí)踐實(shí)施提供了以下實(shí)施例，而不限制對(duì)本發(fā)明的范圍或本文描述的構(gòu)思。

實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ停?/u>

根據(jù)Lange C.等人(“在無(wú)動(dòng)物血清的培養(yǎng)基中快速和安全地?cái)U(kuò)增人間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞用于移植和再生醫(yī)學(xué)(Accelerated and safe expansion of human mesenchymal stromal cells in animal serum-free medium for transplantation and regenerative medicine)”,J.Cell Physiol.2007,Apr.25)或Soleimani(“用于分離和培養(yǎng)來(lái)自小鼠骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞的方案(A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow)”,Nat Protoc.2009；4(1):102-6)。

在細(xì)胞培養(yǎng)物中，細(xì)胞貼附和連續(xù)生長(zhǎng)?？梢杂冒幋a細(xì)胞因子的基因序列的反轉(zhuǎn)錄病毒載體或慢病毒載體轉(zhuǎn)化MSC。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案使病毒構(gòu)建體工程化，并且產(chǎn)生該病毒構(gòu)建體，所述病毒構(gòu)建體表達(dá)編碼IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、IFNγ、IFNβ、SDF-1、CCL23、CCL19、CCL1、CCL2、CCL17、CCL22和/或CCL4和其組合的基因。

選擇并進(jìn)一步培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞后，收獲以用于施用。所有載體可以包括例如抗生素抗性基因，如嘌呤霉素抗性基因。因此，嘌呤霉素可以以0.1-10μg/ml或優(yōu)選3-5μg/ml的濃度，用于選擇轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。在注射入小鼠或其他受試者之前，使細(xì)胞從培養(yǎng)瓶脫離，用PBS洗滌兩次，以及重懸于PBS或其他適當(dāng)?shù)木彌_液中。

可以在內(nèi)源性小鼠乳腺癌模型(如WO2008150368中描述的)或原位胰腺癌模型(如WO2010119039中描述的)中進(jìn)行適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)。在平行實(shí)驗(yàn)中，使用含或不含從同系受試者分離的T細(xì)胞的各種工程化的MSC，和/或檢查點(diǎn)抑制劑，注射具有生長(zhǎng)中的腫瘤的小鼠。五天后，可以將動(dòng)物處死并且檢測(cè)腫瘤。初步結(jié)果表明與適當(dāng)?shù)膶?duì)照相比，前述處理的受試者中腫瘤尺寸/生長(zhǎng)減小。

人間充質(zhì)干細(xì)胞的制備：

在本實(shí)施例中，通過(guò)塑料吸附性從骨髓中分離人MSC，并且在生長(zhǎng)培養(yǎng)基例如含有FBS的DMEM中培養(yǎng)所述人MSC，如Pittinger,M.F.(2008)來(lái)自成人骨髓的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells from adult bone marrow)，在D.J.Prockop,D.G.Phinney,B.A.Bunnell,分子生物學(xué)449中的方法(Methods in Molecular Biology 449),間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells),Totowa:Humana Press)中描述的。

用于表達(dá)細(xì)胞因子和趨化因子的載體的產(chǎn)生：

使用如Julia Lodge,Peter Lund,Steve Minchin(2007)基因克隆(Gene Cloning),New York:Tylor and Francis Group中描述的標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)，構(gòu)建由啟動(dòng)子和用于免疫刺激因子或支持免疫應(yīng)答的因子的基因(例如cDNA)組成的轉(zhuǎn)基因表達(dá)盒。啟動(dòng)子可以是組成型啟動(dòng)子如CMV啟動(dòng)子或PGK啟動(dòng)子，或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子如Tie2、RANTES或HSP70啟動(dòng)子。

編碼免疫刺激因子或支持免疫應(yīng)答的因子的基因的例子是IL-2、IL-7、IL-15、IL-21、IL-12、IFNγ、IFNβ、SDF-1、CCL23、CCL19、CCL1、CCL2、CCL17、CCL22和/或CCL4(Strengell等人,M,The Journal of Immunology,2003,170:5464–5469；Borish等人,J Allergy Clin Immunol.2003Feb；111(2Suppl):S460-7)?；蚩梢曰虿豢梢耘c標(biāo)簽序列(例如，標(biāo)記蛋白/肽，如血細(xì)胞凝集素標(biāo)簽或HIS標(biāo)簽)融合，以使得隨后容易檢測(cè)表達(dá)(Hinrik Garoff,1985,細(xì)胞生物學(xué)年度綜述(Annual Review of Cell Biology),Vol.1:403-445)。

然后，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)克隆技術(shù)將轉(zhuǎn)基因插入適當(dāng)?shù)妮d體系統(tǒng)(例如慢病毒載體或γ-反轉(zhuǎn)錄病毒載體)。適當(dāng)?shù)妮d體例如由Baum(EP 1757703A2)所描述。載體可以包括或可以不包括由啟動(dòng)子和選擇性標(biāo)記基因(細(xì)胞表面標(biāo)記或抗性基因，例如用于賦予嘌呤霉素抗性的pac基因)組成的第二轉(zhuǎn)基因盒以在隨后的過(guò)程中允許富集基因修飾的細(xì)胞(David P.Clark,Nanette J.Pazdernik,2009,生物科技：應(yīng)用基因革命(Biotechnology:Applying the Genetic Revolution),London:Elsevier)。

根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選的構(gòu)建體示于圖2中。

間充質(zhì)干細(xì)胞的基因修飾：

如Murray等人,1999，人基因治療(Human Gene Therapy).10(11):1743-1752和Davis等人,2004Biophysical Journal Volume 86 1234–1242描述的使用修飾物進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)。詳細(xì)地：

用聚L-賴氨酸(PLL)(例如Sigma-Aldrich，P4707-50ML)包被6孔細(xì)胞培養(yǎng)板(例如Corning)：用PBS將PLL溶液(0.01％)稀釋至終濃度為0.0001％～0.001％。將2ml稀釋的PLL用于每孔。在室溫下溫育板至少2h。在溫育之后，用PBS小心地洗滌板。

將終體積為2ml的病毒載體上清添加至每個(gè)PLL包被的孔。顆粒數(shù)目應(yīng)在2×10³～1×10⁶每孔，這會(huì)導(dǎo)致感染復(fù)數(shù)為0.25～10。將已裝載的板以2000×g，在4℃下離心30min。然后，將上清棄去，并每孔接種1×10⁵個(gè)間充質(zhì)干細(xì)胞。在37℃，5％CO₂下溫育板用于進(jìn)一步使用。

MSC中轉(zhuǎn)基因表達(dá)的分析：

流式細(xì)胞術(shù)：

為了顯示免疫刺激因子在MSC中表達(dá)，進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定。轉(zhuǎn)導(dǎo)后3天，將MSC培養(yǎng)基更換為每1ml培養(yǎng)基中含有1μl BD Golgi Plug(目錄號(hào)555029)的培養(yǎng)基，以富集轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞的高爾基體中的表達(dá)的因子。將細(xì)胞在37℃下溫育16h，然后針對(duì)因子的表達(dá)將細(xì)胞免疫染色。收獲MSC，并根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用BD Cytofix/Cytoperm細(xì)胞透性化/固定溶液(Becton Dickinson,554722)使MSC透性化以允許靶蛋白的胞內(nèi)染色。用藻紅蛋白(PE)(Milteny,120-002-687)標(biāo)記的血細(xì)胞凝集素標(biāo)簽特異性抗體用于檢測(cè)表達(dá)的因子。將2×10⁵個(gè)MSC用100μl抗體(用Perm/洗滌溶液,Becton Dickinson,554723以1:75稀釋)染色。供選擇地，根據(jù)制造商的說(shuō)明，可以使用直接針對(duì)因子的抗體(例如用PE標(biāo)記的抗-IL2抗體，ebiosience公司12-7029-41)。將細(xì)胞用PBS洗滌以及重懸于PBS中。然后在FC500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)上分析細(xì)胞。

圖3顯示了細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

ELISA:

將轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC接種于6孔板(1×10⁵個(gè)MSC每孔)。通過(guò)嘌呤霉素選擇富集攜帶pac嘌呤霉素抗性基因的轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC。為此，將嘌呤霉素(3μg/ml培養(yǎng)基)添加至培養(yǎng)基，在37℃和5％CO₂下將細(xì)胞培養(yǎng)5天，每2天更換培養(yǎng)基以從培養(yǎng)物中去除未轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞。然后將無(wú)嘌呤霉素的培養(yǎng)基用于培養(yǎng)。在6孔板中以限定的細(xì)胞數(shù)目1×10⁵個(gè)細(xì)胞每孔重接種MSC并溫育48小時(shí)。收集培養(yǎng)基，并根據(jù)制造商的說(shuō)明，將所述培養(yǎng)基用于免疫因子特異性ELISA以定量(例如IL-7ELISA：Thermo Scientific公司，EHIL7；IL-15ELISA：Thermo Scientific公司，EHIL15)。

圖4顯示了細(xì)胞因子轉(zhuǎn)基因的表達(dá)。

通過(guò)ELISA監(jiān)測(cè)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的體外激活：

如Ivan J.Fuss,Marjorie E.Kanof,Phillip D.Smith,Heddy Zola,2009Curr.Protoc.Immunol.85:7.1.1-7.1.8描述的，使用聚蔗糖梯度離心從人血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。為了評(píng)價(jià)在體外的MSC中表達(dá)的因子的免疫刺激作用，進(jìn)行共培養(yǎng)測(cè)定。將1～5×10⁵個(gè)PBMC與0.2～1×10⁵個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC(對(duì)照)或無(wú)MSC一起接種于12孔板的孔中。進(jìn)行在培養(yǎng)物中T細(xì)胞的非特異性次最優(yōu)刺激，模擬T細(xì)胞受體的銜接：因此，在細(xì)胞接種之前，用刺激性抗CD3抗體(例如OKT3,Janssen-Cilag)包被板的孔?？贵w溶液應(yīng)該具有0.5-0.1μg/mL的濃度。供選擇地，可以以20μg/ml的濃度將PHA添加至共培養(yǎng)物(Ngoumou等人,Cytokine 25(2004)172-178)。在37℃和5％CO₂下溫育孔2～5天，之后分析。

與具有未轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的孔或不具有MSC的孔相比，用免疫刺激因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC引起培養(yǎng)的T細(xì)胞的激活增高。通過(guò)測(cè)量培養(yǎng)物中INFγ濃度，評(píng)價(jià)T細(xì)胞的激活狀態(tài)，因?yàn)檫@些細(xì)胞因子指示T細(xì)胞激活(Boehm等人,Annu Rev Immunol.1997；15:749-95.)。為了評(píng)價(jià)單核細(xì)胞的激活狀態(tài)，收集培養(yǎng)基，以及確定腫瘤壞死因子α(TNFα)的釋放。收集培養(yǎng)基，以及根據(jù)制造商說(shuō)明將所述培養(yǎng)基用于IFNγ或TNFα特異性ELISA以定量(例如ELISA:IFNγ，Thermo Scientific公司，EHIFNG；TNFαELISA：Thermo Scientific公司，EH3TNFA)。

通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)監(jiān)測(cè)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的體外激活：

如Ivan J.Fuss,Marjorie E.Kanof,Phillip D.Smith,Heddy Zola,2009Curr.Protoc.Immunol.85:7.1.1-7.1.8描述的，使用聚蔗糖梯度離心從人血液中分離外周血單核細(xì)胞(PBMC)。為了評(píng)價(jià)在體外的MSC中表達(dá)的因子的免疫刺激作用，進(jìn)行共培養(yǎng)測(cè)定。將1～5×10⁵個(gè)PBMC與0.2～1×10⁵個(gè)轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC、未轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC(對(duì)照)或無(wú)MSC一起接種于12孔板的孔中。進(jìn)行在培養(yǎng)物中T細(xì)胞的非特異性次最優(yōu)刺激，模擬T細(xì)胞受體的銜接：因此，在細(xì)胞接種之前，用刺激性抗CD3抗體(例如OKT3,Janssen-Cilag)包被板的孔?？贵w溶液應(yīng)該具有0.5-0.1μg/mL的濃度。供選擇地，可以以20μg/ml的濃度將PHA添加至共培養(yǎng)物(Ngoumou等人,Cytokine 25(2004)172-178)。在37℃和5％CO₂下溫育孔2～5天，之后分析。

與具有未轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC的孔或不具有MSC的孔相比，用免疫刺激因子轉(zhuǎn)導(dǎo)的MSC引起培養(yǎng)的T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活增高。通過(guò)胞內(nèi)流式細(xì)胞術(shù)評(píng)價(jià)T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的激活狀態(tài)。在收獲細(xì)胞前24h，用每1ml培養(yǎng)基中含有1μl BD Golgi Plug(目錄號(hào)555029)的培養(yǎng)基處理細(xì)胞。然后收獲細(xì)胞，并且根據(jù)制造商說(shuō)明，用對(duì)T細(xì)胞特異性的熒光團(tuán)標(biāo)記抗體(例如抗CD4，ebioscience公司17-0048或抗CD8，ebioscience公司9017-0087)或?qū)奘杉?xì)胞/單核細(xì)胞特異性的熒光團(tuán)標(biāo)記抗體(抗CD14,ebioscience公司,9017-0149)對(duì)細(xì)胞染色。然后，根據(jù)制造商說(shuō)明，使用BD Cytofix/Cytoperm細(xì)胞透性化/固定溶液(Becton Dickinson,554722)透性化細(xì)胞，以允許IFNg(ebioscience公司,11-7319)或TNFa(ebioscience公司,11-7349)的胞內(nèi)染色。根據(jù)制造商的說(shuō)明使用抗體。然后使用FC500流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter)分析細(xì)胞。

在動(dòng)物模型中監(jiān)測(cè)施用MSC的抗腫瘤作用：

在免疫缺陷小鼠(例如SCID小鼠)中，使來(lái)自人腫瘤細(xì)胞系的腫瘤生長(zhǎng)2周，并且經(jīng)由例如尾靜脈，靜脈內(nèi)施用工程化MSC。然后，靜脈內(nèi)施用PBMC。然后，將腫瘤尺寸與未處理的動(dòng)物或僅用MSC處理的動(dòng)物或僅用PBMC處理的動(dòng)物的腫瘤尺寸比較。

在另一實(shí)驗(yàn)中，在免疫缺陷小鼠(例如SCID小鼠)中，使來(lái)自人腫瘤細(xì)胞系的腫瘤與工程化的MSC的組合生長(zhǎng)2周，并且靜脈內(nèi)施用PBMC。然后，將腫瘤尺寸與未處理的動(dòng)物或僅用MSC處理的動(dòng)物或僅用PBMC處理的動(dòng)物的腫瘤尺寸比較。

然而，可以不使用PBMC，而使用純化的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)或攜帶CAR的CART細(xì)胞進(jìn)行以上實(shí)驗(yàn)，所述CAR針對(duì)腫瘤上存在的腫瘤抗原。同樣地，可以與MSC和PBMC、或MSC和CTL、或MSC和CART，一起使用檢查點(diǎn)抑制劑(例如抗PD-1或抗PD-L1抗體)。

通過(guò)使針對(duì)這些細(xì)胞因子反應(yīng)性的抗體，組織學(xué)分析來(lái)自以上實(shí)驗(yàn)的腫瘤以評(píng)價(jià)MSC表達(dá)細(xì)胞因子和細(xì)胞因子組合的量。使用蘇木精和曙紅染料(H&E)，評(píng)價(jià)腫瘤通過(guò)PBMC、CTL和CART浸潤(rùn)的程度?？梢酝ㄟ^(guò)使用抗CD3抗體的免疫組織化學(xué)法評(píng)價(jià)腫瘤通過(guò)T細(xì)胞的浸潤(rùn)程度?？梢酝ㄟ^(guò)使用抗CD19抗體的免疫組織化學(xué)法評(píng)價(jià)腫瘤通過(guò)單核細(xì)胞浸潤(rùn)的程度?？梢酝ㄟ^(guò)使用抗CD69抗體以及IFNγ的免疫組織化學(xué)法，評(píng)價(jià)腫瘤中浸潤(rùn)的T細(xì)胞的激活程度。

為了證實(shí)以上實(shí)驗(yàn)，以不同類型的腫瘤重復(fù)這些實(shí)驗(yàn)，所述腫瘤使用不同的人腫瘤細(xì)胞系和CART生長(zhǎng)，所述CART具有針對(duì)與各自腫瘤相關(guān)抗原的特異性。