基于dc的乳腺癌治療性疫苗及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物工程和生物醫(yī)藥領(lǐng)域，特別設(shè)及一種基于DC的乳腺癌治療性疫苗 及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 乳腺癌是女性排名第一的常見惡性腫瘤，且發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)?，F(xiàn)有的乳腺 癌治療過程中對(duì)患者免疫系統(tǒng)的損害極大，導(dǎo)致腫瘤治療過程遇到無法突破的瓶頸，殺瘤 能力差，腫瘤無法完全治愈?，F(xiàn)階段細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞是具有細(xì)胞毒作用的免疫活 性細(xì)胞;樹突狀細(xì)胞是最具潛力的抗原提呈細(xì)胞，在初始性免疫和獲得性免疫中具有重要 作用;樹突狀細(xì)胞是已知機(jī)體內(nèi)抗原提呈遞能力最強(qiáng)的細(xì)胞，它能捕獲抗原，并將信息傳遞 給T、B淋己細(xì)胞，從而引發(fā)一系列的特異性免疫應(yīng)答反應(yīng)。因此，如果將腫瘤抗原注入樹突 狀細(xì)胞，將可引起機(jī)體特異性的抗腫瘤免疫反應(yīng)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是，針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中乳腺癌治療性疫苗存在免疫反應(yīng) 弱、殺瘤能力差等缺陷，提供一種免疫原性及特異性強(qiáng)的基于DC的乳腺癌治療性疫苗及其 制備方法。
[0004] 本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:提供一種基于DC的乳腺癌治療性疫 苗的制備方法，所述制備方法包括W下步驟：
[0005] 獲取未成熟DC;
[0006] 將乳腺癌抗原復(fù)合物與未成熟DC于DC培養(yǎng)基中進(jìn)行共培養(yǎng)5~9天；
[0007] 再加入腫瘤壞死因子-a繼續(xù)培養(yǎng)，至DC成熟且負(fù)載有乳腺癌抗原復(fù)合物；
[000引其中，所述乳腺癌抗原復(fù)合物是由滅活后的乳腺癌細(xì)胞和MUCl單抗復(fù)合物共培養(yǎng) 獲得的。
[0009] 在本發(fā)明提供的基于DC的乳腺癌治療性疫苗的制備方法中，所述未成熟DC與所述 乳腺癌抗原復(fù)合物的體積比為(3~7): 1。
[0010] 在本發(fā)明提供的基于DC的乳腺癌治療性疫苗的制備方法中，所述MUCl單抗復(fù)合物 的濃度為(0.5~1.5)iig/(lX10 5)個(gè)乳腺癌細(xì)胞。
[0011] 在本發(fā)明提供的基于DC的乳腺癌治療性疫苗的制備方法中，
[001^ 所述滅活后的乳腺癌細(xì)胞與MUCl單抗復(fù)合物共培養(yǎng)的過程，包括W下步驟：
[0013] 取滅活后的乳腺癌細(xì)胞，加入0.5~2%牛血清白蛋白，再加入MUCl單抗復(fù)合物共 培養(yǎng)0.5~1.5小時(shí)。
[0014] 在本發(fā)明提供的基于DC的乳腺癌治療性疫苗的制備方法中，
[0015] 所述滅活后的乳腺癌細(xì)胞獲取過程，包括W下步驟：
[0016] 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞，洗涂并離屯、后，制成（0.5~2) X IO7個(gè)/ml的乳腺癌 細(xì)胞懸液，放入液氮中，并于水浴中完全融化，再次放入液氮中，反復(fù)多次置于液氮和水浴 中，然后過濾，收集濾液，即滅活后的乳腺癌細(xì)胞。
[0017] 在本發(fā)明提供的基于DC的乳腺癌治療性疫苗的制備方法中，所述未成熟DC的濃度 為(2 ~5)X105 個(gè)/ml。
[0018] 在本發(fā)明提供的基于DC的乳腺癌治療性疫苗的制備方法中，
[0019] 所述未成熟DC的獲取過程包括W下步驟：
[0020] 取外周血，通過磁珠篩選出CD14+單核細(xì)胞，加入體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)2 ~6天，至CD14+單核細(xì)胞誘導(dǎo)分化成未成熟DC。
[0021] 在本發(fā)明提供的基于DC的乳腺癌治療性疫苗的制備方法中，所述DC培養(yǎng)基中添加 有750~850U/mL粒-巨隧細(xì)胞和900~llOOU/mL白介素-4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。
[0022] 在本發(fā)明提供的基于DC的乳腺癌治療性疫苗的制備方法中，所述腫瘤壞死因子-a 在培養(yǎng)基中的終濃度為800~1200U/ml。
[0023] 本發(fā)明還提供一種基于DC的乳腺癌治療性疫苗，由上述基于DC的乳腺癌治療性疫 苗制備方法所獲得的。
[0024] 實(shí)施本發(fā)明提供的基于DC的乳腺癌治療性疫苗及其制備方法，可W達(dá)到W下有益 效果:采用由滅活的乳腺癌細(xì)胞和MUCl單抗復(fù)合物共同作為腫瘤抗原信息的提供者共刺激 DC，促進(jìn)DC的抗原提呈，提高機(jī)體的免疫反應(yīng)，通過本發(fā)明獲得的基于DC的乳腺癌治療性疫 苗不僅性狀較穩(wěn)定，而且免疫原性及特異性較強(qiáng)，殺瘤能力較強(qiáng)，能夠很好的調(diào)節(jié)乳腺癌的 機(jī)體免疫機(jī)制。
【具體實(shí)施方式】
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點(diǎn)更加清楚明白，W下結(jié)合實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明 進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實(shí)施例僅用W解釋本發(fā)明，并不用于限 定本發(fā)明。
[0026] 本發(fā)明提供的一種基于DC的乳腺癌治療性疫苗，其制備方法包括W下步驟：
[0027] Sl、獲取未成熟DC;
[00%] S2、將乳腺癌抗原復(fù)合物與未成熟DC于DC培養(yǎng)基中共培養(yǎng)5~9天;其中，乳腺癌抗 原復(fù)合物是由滅火后的乳腺癌細(xì)胞和MUCl單抗復(fù)合物共培養(yǎng)所獲得的；
[0029] S3、然后再加入腫瘤壞死因子-a繼續(xù)培養(yǎng)，至DC成熟且負(fù)載有乳腺癌抗原復(fù)合物。
[0030] 步驟Sl中，未成熟DC可來源于人體血液，但由于未成熟DC在血液中僅占單核細(xì)胞 總數(shù)的0.5-1.0%，數(shù)量很少；因此，本發(fā)明優(yōu)選實(shí)施例中，采取誘導(dǎo)單核細(xì)胞的方式獲取未 成熟DC，具體步驟為：
[0031] Sl 1、從外周血中分離出單核細(xì)胞；
[0032] S12、再加入體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基培養(yǎng)2~6天，對(duì)步驟Sll中獲得的單核細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo) 培養(yǎng)至單核細(xì)胞轉(zhuǎn)化成未成熟DC。
[0033] 在步驟Sll中，單核細(xì)胞可W為CD34+和/或CD14+單核細(xì)胞，其中，CD34+單核細(xì)胞可 W從骨髓、廝帶血或脾臟等分離得到;CD14+單核細(xì)胞從人外周血分離得到的。由于從廝帶 血中純化出CD34+單核細(xì)胞費(fèi)用昂貴;骨髓采集不易，而且容易污染，患者比較痛苦，擴(kuò)增費(fèi) 用昂貴;而脾臟來源受限等使得CD34+單核細(xì)胞獲取較困難;因此，在本發(fā)明中，優(yōu)選采用從 人外周新鮮血液中分離篩選出CD14+單核細(xì)胞，從新鮮血液中獲取，相比經(jīng)過冷庫儲(chǔ)存或者 培養(yǎng)傳代之后的CD14+單核細(xì)胞，從新鮮血液中提取的CD14+單核細(xì)胞離體時(shí)間不長(zhǎng)，其細(xì)胞 活性和狀態(tài)的減弱或者形態(tài)改變程度都較少，更加利于獲取DC。優(yōu)選地，本發(fā)明中，采用免 疫磁珠法從外周血中分離出CD14+單核細(xì)胞。
[0034] 步驟S12中的體外誘導(dǎo)培養(yǎng)基優(yōu)選為適宜于DC生長(zhǎng)的含5 %~15 %胎牛血清、750 ~850U/mL粒-巨隧細(xì)胞和900~1 lOOU/mL白介素-4的基礎(chǔ)培養(yǎng)基。需要特別注意的是，由于 DC相比非貼壁細(xì)胞其能具有貼壁性，但是其貼壁性能并不強(qiáng)，而是偏向于半貼壁的類型，因 此在步驟S13中單個(gè)核細(xì)胞的培養(yǎng)過程中需采用半量換液，W避免將目的DC吹成懸浮而流 失。
[0035] 當(dāng)然可W理解的是，本發(fā)明獲得未成熟DC的途徑也并不局限于此，通過其他誘導(dǎo) 方法誘導(dǎo)單核細(xì)胞獲得的未成熟DC同樣適用于本發(fā)明。
[0036] 在步驟S2中，優(yōu)選地，采用含有750~850U/mL粒-巨隧細(xì)胞因子和900~llOOU/mL 白介素-4的DC培養(yǎng)基上將未成熟DC與乳腺癌抗原復(fù)合物共培養(yǎng)5~9天;其中，未成熟DC與 乳腺癌抗原復(fù)合物的體積比為(4~6): 1。
[0037] 粒-巨隧細(xì)胞因子和白介素-4不僅有利于DC的生長(zhǎng)增殖，而且有利于DC攝取抗原 信息。由于DC有簇狀生長(zhǎng)的習(xí)慣，濃度太高，集結(jié)成團(tuán)，位于中屯、的DC不易成熟，影響乳腺癌 抗原的負(fù)載，從而影響疫苗的免疫效果，因此，DC濃度不易過高，在該步驟中，待未成熟DC在 DC培養(yǎng)基中的濃度為（2~5) X IO5個(gè)/ml或?qū)⒉襟ESl獲得未成熟DC的濃度調(diào)整為(2~5) X IO5個(gè)/ml時(shí)，加入乳腺癌抗原復(fù)合物進(jìn)行預(yù)負(fù)載。
[0038] 由于未成熟DC具有極強(qiáng)的抗原吞隧能力，在攝取抗原(包括體外加工進(jìn)行內(nèi)吞，在 內(nèi)體中加工抗原），并提呈抗原給MHCI和MHCn，從而啟動(dòng)抗原特異性CTL反應(yīng);并且未成熟 DC表達(dá)能介導(dǎo)DC攝取抗原的一些膜受體如化受體，因而相比成熟DC擁有更強(qiáng)的抗原攝取、 加工和處理能力，因此，步驟S2中利用未成熟DC與乳腺癌抗原復(fù)合物共培養(yǎng)能夠?qū)崿F(xiàn)乳腺 癌抗原的預(yù)負(fù)載，促進(jìn)并提高乳腺癌抗原的負(fù)載量，同時(shí)，未成熟DC經(jīng)抗原致敏可至成熟。
[0039] 進(jìn)一步地，乳腺癌抗原復(fù)合物的獲取過程，包括W下步驟：
[0040] S21、獲取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞；
[0041] S22、對(duì)步驟S21中獲得的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行滅活處理；
[0042] S23、將步驟S22中獲得的滅活后的乳腺癌細(xì)胞與MUCl單抗復(fù)合物共培養(yǎng)0.5~2小 時(shí)。
[0043] 其中，在步驟21中，乳腺癌細(xì)胞可來源于自體，也可來源于異體;本發(fā)明中所采用 的乳腺癌細(xì)胞來自于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液病醫(yī)院提供的MCF-7乳腺癌細(xì)胞株。
[0044] 步驟S22中，乳腺癌細(xì)胞滅活的過程，包括W下步驟：
[0045] 取步驟S21中獲取的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期乳腺癌細(xì)胞，洗涂后離屯、，制成濃度為(0.5~2) X IO7個(gè)/ml的乳腺癌細(xì)胞懸液，加入生理鹽水中，放入液氮，2~8分鐘迅速放入30~45°C水浴 中，待乳腺癌細(xì)胞完全融化后，再次放入液氮中，反復(fù)多次置于液氮和水浴中，微孔濾膜過 濾，收集濾液，即收獲滅活后的乳腺癌細(xì)胞，于4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0046] 可W理解的是，W上僅為本發(fā)明提供的乳腺癌細(xì)胞滅活的一種方法，采用其他方 法獲得的滅活后的乳腺癌細(xì)胞同樣適用于本發(fā)明。
[0047] 步驟S23中，滅活后的乳腺癌細(xì)胞與MUCl單抗復(fù)合物共培養(yǎng)的過程為:在滅活后的 乳腺癌細(xì)胞中，加入0.5~2%牛血清白蛋白，再加入MUCl單抗復(fù)合物共培養(yǎng)0.5~1.5小時(shí)， 即獲得乳腺癌抗原復(fù)合物;其中，MUCl單抗復(fù)合物的濃度為(0.5~I. 5)yg/(l X IO5)個(gè)細(xì) 胞。
[0048] 其中，MUCU人粘蛋白核屯、膚)基因幾乎在所有的上皮細(xì)胞腺癌中有所表達(dá)，而且 其通過M肥限制和非M肥限制兩種方式誘導(dǎo)活化CTL，對(duì)表達(dá)MUCl陽性的腫瘤細(xì)胞具有殺傷 作用，因而MUCl成為主動(dòng)特異性免疫治療癌癥的理想祀抗原。本發(fā)明中將乳腺癌細(xì)胞與 MUCl單抗復(fù)合物共刺激DC細(xì)胞，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性的MUCl免疫應(yīng)答，能夠阻斷或延遲自 發(fā)性乳腺癌的發(fā)展，并且除了活化CD8+T細(xì)胞，還可W活化CD4+T細(xì)胞;且融合的DC可W遷移 到局部引流淋己結(jié)并與T細(xì)胞相互作用，促使T細(xì)胞發(fā)生增殖，產(chǎn)生MUCl特異性CD8+CTL和分 泌比-2、IFN- 丫、化-10、比-4、CD4+T細(xì)胞，從而產(chǎn)生多種抗腫瘤效應(yīng)基質(zhì)，實(shí)現(xiàn)全面殺瘤，提 高殺瘤率的目的。
[0049] 在步驟S3中，腫瘤壞死因子-a由體內(nèi)免疫細(xì)胞(如T淋己細(xì)胞、T細(xì)胞雜