專利名稱：用于誘發(fā)抗過敏原保護(hù)性免疫應(yīng)答的重組核酸的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于誘發(fā)抗過敏原保護(hù)性免疫應(yīng)答的重組核酸及包含該核酸的疫苗。
背景技術(shù)：
近年來過敏疾病發(fā)病率在世界范圍內(nèi)急劇增加，尤其在發(fā)達(dá)國家，如美國、西歐、澳大利亞、日本和新加坡，這使得旨在抑制或改變遺傳性過敏癥的個體由于暴露于過敏原而誘發(fā)的免疫應(yīng)答的新的治療和預(yù)防藥劑及方法的需求日益顯現(xiàn)(1-8)。
簡而言之，免疫應(yīng)答的活化需要激活T細(xì)胞，要么是細(xì)胞毒性T(殺傷)細(xì)胞，要么是T輔助細(xì)胞。細(xì)胞毒性T細(xì)胞(一般稱作CD8+細(xì)胞)負(fù)責(zé)基于細(xì)胞的免疫。抗原表位在抗原提呈細(xì)胞表面MHC I類分子復(fù)合物中的提呈刺激了這些細(xì)胞。然后抗原活化的細(xì)胞毒性T細(xì)胞誘導(dǎo)出現(xiàn)特異性抗原表位的被感染細(xì)胞攝入。進(jìn)入MHC I類提呈途徑的抗原通常來自于宿主細(xì)胞胞質(zhì)中增殖的病原體，如病毒。
T輔助細(xì)胞(一般稱作CD4+細(xì)胞)涉及體液免疫。T輔助細(xì)胞通過抗原表位在MHC II類分子復(fù)合物中的提呈而活化，并且活化的T輔助細(xì)胞產(chǎn)生能刺激抗原特異性抗體產(chǎn)生的細(xì)胞因子。源自胞外病原體的抗原，如來自細(xì)菌的，或在巨噬細(xì)胞中合成的，典型進(jìn)入MHC II類提呈。MHC II類相關(guān)的恒定鏈(Ii)伴隨新合成的MHC II類分子從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)入核內(nèi)體途徑，而且與溶酶體相關(guān)膜蛋白(LAMP-1)相關(guān)聯(lián)的信號用于把抗原靶向到核內(nèi)體系統(tǒng)以增強(qiáng)MHC II類提呈(17和18)。
效應(yīng)器T輔助細(xì)胞可以被分成兩個亞群，分泌IFN-？的Th1亞群，和分泌IL-4、IL-5以及IL-13的Th2亞群。源自巨噬細(xì)胞胞囊中的抗原一般刺激Th1亞群，然后其誘導(dǎo)產(chǎn)生IgG型抗體。胞外抗原趨于刺激產(chǎn)生Th2細(xì)胞，其誘導(dǎo)B細(xì)胞產(chǎn)生IgM，隨后刺激產(chǎn)生包括IgE的不同異體，并且誘導(dǎo)某些類型的IgG抗體。
抗原特異性IgE與過敏原誘發(fā)的疾病中的I類超敏反應(yīng)有關(guān)。I類超敏反應(yīng)相關(guān)的癥狀包括哮喘、鼻炎、結(jié)膜炎和過敏性皮炎。有報道說CD8+抑制性T細(xì)胞會對IgE的產(chǎn)生起調(diào)節(jié)的作用。
把DNA用作抗過敏原誘發(fā)的過敏疾病的預(yù)防和治療新藥是非常吸引人的應(yīng)用方法。至今，過敏疾病的DNA治療涉及使用各種DNA制劑，包括基于基因的疫苗；與免疫刺激性脫氧寡核苷酸(ISS-ODN)混合的蛋白質(zhì)抗原；抗原-ISS-ODN配合物(AIC)；以及利用ISS-ODN單獨(dú)進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)?？墒?，基于ISS-ODN的疫苗的應(yīng)用增加了在宿主內(nèi)誘導(dǎo)自身免疫反應(yīng)的潛在危險(9&10)。相反，由基于基因的疫苗誘導(dǎo)的自身免疫性風(fēng)險卻顯得非常低(11)。
典型地，基于基因的疫苗是質(zhì)粒，其編碼感興趣的過敏原基因，該基因處于廣泛特異性的強(qiáng)真核啟動子的控制下，如細(xì)胞肥大病毒(″CMV″)啟動子。DNA可由多種細(xì)胞處理，包括抗原提呈細(xì)胞，其表達(dá)過敏原并且通過MHC分子途徑提呈處理它。過敏原可來自于各種各樣的來源，包括塵螨、真菌、花粉、寵物、食品、水果等。
以往已證實(shí)了用編碼過敏原基因的質(zhì)粒肌肉注射實(shí)驗(yàn)室嚙齒動物會造成誘發(fā)Th1主導(dǎo)的過敏原特異性體液免疫和細(xì)胞免疫(12&13)。通過施用過敏原基因而產(chǎn)生的特異性免疫應(yīng)答顯示出能夠在過敏原敏感的動物中下調(diào)過敏原特異性IgE的生成并且抑制氣管的超應(yīng)激性(12&13)。可是，該方法并不適用于所有的過敏原，因?yàn)橐恍┻^敏原會刺激基于IgG2a的弱免疫應(yīng)答，或基于IgE的提高了的免疫應(yīng)答(14-16)。體內(nèi)表達(dá)這種過敏原會妨礙過敏原基因免疫應(yīng)用于抗過敏原誘發(fā)的疾病的預(yù)防和治療中。
Kwon等(The effect of vaccination with DNA encoding murine T-cellepitopes on the Der p1 and 2 induced immunoglobulin E sythesis.S.S.Kwon，N.Kim和T.J.Yoo.2001，Allergy 56741-748.)報道用編碼T細(xì)胞表位的基因免疫能激活CD8+細(xì)胞并抑制過敏原誘導(dǎo)的IgE合成(也可參見美國專利第5,958,891和6,251,663號)，并且提示了CD8+T細(xì)胞的活化可以為其后過敏反應(yīng)提供保護(hù)。
除了寵物家貓(Felis domesticus)和蟑螂，住宅塵螨物種Dermatophagoides pteronyssinus、(ID.p.)Dermatophagoides farinae(D.f.)以及Blomia tropicalis(B.t.)是室內(nèi)過敏原誘發(fā)的疾病的主要引發(fā)因素。在地理上Blomia tropicalis分布于熱帶和亞熱帶地區(qū)，而Dermatophagoidespteronyssinus很好地適應(yīng)于溫帶、熱帶和亞熱帶地區(qū)，Dermatophagoidesfarinae在寒溫帶地區(qū)更普遍(1&2)。這些物種中鑒定出的住宅塵螨主要過敏原有Der p1、Der p2、Der f1、Der f2和Blo t5，它們與超過60％的螨的皮膚提取物穿刺測試陽性患者中的IgE反應(yīng)有關(guān)(1-3，6-8)。D.p.和D.f.的主要過敏原的人特異性IgE有著高度的交叉反應(yīng)性，而在B.t.和D.p.之間僅有很小程度的IgE交叉反應(yīng)。開發(fā)出安全有效的預(yù)防或治療過敏疾病中IgE反應(yīng)和I型超敏反應(yīng)的疫苗仍舊是重要的目標(biāo)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種重組核酸，其包含與編碼過敏原基因可操作相連的編碼第一信號肽的基因，其中第一信號肽介導(dǎo)過敏原進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)。在一個實(shí)例中，當(dāng)在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)時，核酸進(jìn)一步包含一種可操作相連的基因，其編碼把過敏原靶向至核內(nèi)體或溶酶體的第二信號。
該重組核酸可用于誘發(fā)抗過敏原的免疫保護(hù)應(yīng)答，并且本發(fā)明在一個方面提供一種包含如本發(fā)明所述重組核酸的疫苗。本發(fā)明也提供包含如本發(fā)明所述重組核酸的組合物或疫苗，以及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
本發(fā)明另一方面提供i)免疫患者抗過敏；ii)誘發(fā)Th1型免疫應(yīng)答；iii)抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生；iv)預(yù)防或治療針對過敏原的過敏反應(yīng)的方法，這些方法包括施用如本發(fā)明所述的重組核酸、疫苗或組合物。本發(fā)明在另一方面提供了如本發(fā)明所述的重組核酸、疫苗或組合物在i)免疫患者抗過敏；ii)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答；iii)抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生；iv)預(yù)防或治療針對過敏原的過敏反應(yīng)上的應(yīng)用，以及在制備i)免疫患者抗過敏；ii)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答；iii)抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生；iv)預(yù)防或治療針對過敏原的過敏反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用?；颊呖梢允遣溉閯游?，在一個實(shí)例中，患者是人。
本發(fā)明在另一方面提供一種新的免疫患者抗過敏的方法，包括在第一階段向患者施用多劑包含可表達(dá)的過敏原基因的核酸，其經(jīng)過一段時間從而足以誘導(dǎo)出患者的長期記憶，并在第二階段施用過敏原。在一個實(shí)例中，在第一階段施用核酸約一年以上。在不同的實(shí)例中，過敏原可與佐劑一起施用，并且可以施用多劑過敏原。


圖1顯示了在用明礬吸附的重組Blo t5蛋白免疫的BALB/cJ小鼠中的典型Th2型免疫應(yīng)答，其由Th2和Th1特異性細(xì)胞因子產(chǎn)生的量、過敏原特異性IgE產(chǎn)生的水平、和氣管過度反應(yīng)的應(yīng)答所測得。
圖2顯示了在用編碼全長Blo t5基因的DNA疫苗免疫的BALB/cJ小鼠中誘發(fā)的特異性Th1型體液應(yīng)答。
圖3顯示了在用編碼嵌合蛋白的DNA疫苗肌肉注射并接著用明礬吸附的Blo t5蛋白強(qiáng)化的BALB/cJ小鼠中誘發(fā)的特異性Th1體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，該蛋白包含LAMP-1信號序列、編碼H-2d-限制性Th表位的Blot5基因片段以及LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
圖4顯示了在用編碼嵌合蛋白的DNA疫苗皮下注射并接著用明礬吸附的Blo t5蛋白強(qiáng)化的BALB/cJ小鼠中誘發(fā)的特異性Th1型體液應(yīng)答，該嵌合蛋白包含LAMP-1信號序列、編碼H-2d-限制性Th表位的Blo t5基因片段以及LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
圖5顯示了在用編碼嵌合蛋白的DNA疫苗皮下注射和接著用明礬吸附的Blo t5過敏原蛋白強(qiáng)化并繼續(xù)施用Blo t5過敏原蛋白噴霧劑的BALB/cJ小鼠中誘發(fā)的特異性Th1型體液應(yīng)答，該嵌合蛋白包含LAMP-1信號序列、編碼H-2d-限制性Th表位的Blo t5基因片段以及LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
圖6顯示了在用編碼嵌合蛋白的DNA疫苗肌肉注射并在長時間間隔后再用明礬吸附的Blo t5過敏原蛋白強(qiáng)化的BALB/cJ小鼠中誘發(fā)的長期Blo t5特異性免疫記憶，該嵌合蛋白包含LAMP-1信號序列、編碼H-2d-限制性Th表位的B1o t5基因片段以及LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
圖7顯示了用編碼嵌合蛋白的DNA疫苗肌肉注射并再用明礬吸附的Blo t5過敏原蛋白強(qiáng)化的BALB/cJ小鼠中誘發(fā)的長期Blo t5特異性免疫記憶，該嵌合蛋白包含LAMP-1信號序列、編碼H-2d-限制性Th表位的Blo t5基因片段以及LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在進(jìn)行強(qiáng)化前，DNA疫苗在長時間期間給藥三劑。
圖8顯示了用編碼嵌合蛋白的DNA疫苗肌肉注射并接著用明礬吸附的Blo t5蛋白強(qiáng)化的BALB/cJ小鼠中誘發(fā)的特異性Th1型體液免疫應(yīng)答，該嵌合蛋白包含LAMP-1信號序列、Blo t5基因以及有或沒有LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
圖9顯示了用編碼嵌合蛋白的DNA疫苗肌肉注射并接著用明礬吸附的Der p1蛋白強(qiáng)化的BALB/cJ小鼠中誘發(fā)的Der p1特異性Th1型免疫，該嵌合蛋白包含LAMP-1信號序列、Der p1基因以及LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
圖10顯示了在用基因免疫的BALB/cJ小鼠中抑制了Der p1特異性Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生并抑制了氣管對Der p1的過度反應(yīng)。免疫是通過肌肉注射編碼嵌合蛋白的DNA疫苗并接著用明礬吸附的Der p1蛋白強(qiáng)化而進(jìn)行的，該嵌合蛋白包含LAMP-1信號序列、Der p1基因以及LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
圖11顯示了用編碼嵌合蛋白的DNA疫苗肌肉注射并接著用明礬吸附的Der p1蛋白免疫的BALB/cJ小鼠中抗Der p1的Th1特異性抗體的產(chǎn)生，該嵌合蛋白包含人組織纖溶酶原活化子信號序列、Der p1基因以及LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
圖12顯示了用口服殼聚糖-DNA納米顆粒免疫的BALB/cJ小鼠中抗Der p1的Th1特異性抗體的產(chǎn)生情況，該納米顆粒包含編碼嵌合蛋白的DNA疫苗，其嵌合蛋白包含人組織纖溶酶原活化子信號序列、Der p1基因以及LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。給藥后接著用明礬吸附的Der p1蛋白強(qiáng)化。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了一種用于誘發(fā)抗過敏原保護(hù)性免疫應(yīng)答的重組核酸。本文中使用的術(shù)語過敏原指的是主要由IgE和Th2細(xì)胞因子介導(dǎo)的任何能夠引發(fā)過敏反應(yīng)的抗原。這種過敏反應(yīng)也就是現(xiàn)有技術(shù)中所述的I型超敏反應(yīng)。術(shù)語過敏反應(yīng)廣泛用于指這些反應(yīng)和與這些反應(yīng)相關(guān)的疾病或癥狀，包括過敏性鼻炎、過敏性哮喘、過敏癥、水泡和紅腫、濕疹、風(fēng)疹和皮炎。
過敏原通常是來源于環(huán)境或食品的蛋白質(zhì)，大多是相對較小、高度可溶的蛋白質(zhì)，其由諸如花粉?；蝌S等的干粉顆粒攜帶。例如，可溶性過敏原在接觸氣管的粘膜時，從顆粒上洗脫下來從而擴(kuò)散進(jìn)入粘膜。
這里用的術(shù)語蛋白質(zhì)和肽，其意是指任何氨基酸鏈而無論其長度或翻譯后的修飾(例如糖基化或磷酸化)，術(shù)語蛋白質(zhì)和肽，如所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的，僅僅區(qū)別于術(shù)語肽一般指相對較短的氨基酸序列。
重組核酸可以是DNA或RNA。在一個實(shí)例中，重組核酸是包含與編碼過敏原基因可操作連接的編碼第一信號肽基因的DNA，其中第一信號肽介導(dǎo)曾表達(dá)于細(xì)胞中的過敏原進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)。編碼第一信號肽的基因可以是編碼氨基酸序列的任意序列，其充當(dāng)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)折疊機(jī)件的信號，從而指導(dǎo)與該氨基酸序列相連的過敏原到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上。例如，但并不僅限于此，第一信號肽可以是基因的N-末端信號序列，這些基因來自于LAMP-1、人組織纖溶酶原活化因子(如參見SEQ ID NO49)、溶酶膜蛋白LIMP-II(如參見SEQ ID NO8，10，12，28，30，32)(CD4+TCells Induced by a DNA VaccineImmunological Consequences of Epitope-Specific Lysosomal Targeting.Fernando Rodriguez，StephanieHarkins，Jeffrey M.Redwine，Jose M.De Pereda，和J.Lindsay Whitton.JOURNAL OF VIROLOGY.Vol.75(21)10421-10430.2001；The ResiduesLeu(Ile)475-Ile(Leu，Val Ala)476，Contained in the Extended CarboxylCytoplasmic Tail，Are Critical for Targeting of the Resident LysosomalMembrane Protein LIMP Il to Lysosomes.Ignacio V.Sandoval JuanJ.ArredondoS，Jose Alcalde，Alfonso Gonzalez Noriegall，JoelVandekerckhove，Maria A.Jimenezll，和Manuel Rico.The Journal ofBiochemistry，Vol.269(9)6622-6631，1994；Targeting of LysosomalIntegral Membrane Protein LIMP11 THE TYROSINE-LACKINGCARBOXYL CYTOPLASMIC TAIL OF LIMP Il IS SUFFICIENT FORDIRECT TARGETING TO LYSOSOMES.Miguel A.Vega，F(xiàn)ernandoRodriguezSV；Bartolome Segui，Carmela Calesll，Jose Alcalde，和Ignacio V.Sandoval.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.266(25)16269-16272，1991；Cloning，Sequencing，and Expression of a cDNAEncoding Rat LIMP 11，a Novel 74-kDa Lysosomal Membrane ProteinRelated to the Surface Adhesion Protein CD36.Miguel A.Vega，BartolomeSegui-Real，Jose Alcalde Garcia，Carmela Cales，F(xiàn)emando Rodriguez，JoelVanderkerckhovev，和Ignacio V.Sandoval.THE JOURNAL OFBIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.266(25)16818-16824，1991)、DEC-205(如參見SEQ ID NO14，16，34，36)(The Dendritic Cell Receptor forEndocytosis，DEC-205，Can Recycle and Enhance Antigen Presentation viaMajor Histocompatibility Complex Class II-positive LysosomalCompartments KarstenMahnke，Ming Guo，Sena Lee，HomeroSepulveda，Suzy L.Swain，Michel Nussenzweig，和Ralph M.Steinman.The Journal ofCell 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OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.273(43)27896-27903，1998；Targeting of P-Selectin to Two RegulatedSecretory Organelles in PC12 Cells.John P.Norcott，Roberto Solari，和Daniel F.Cutler.The Journal of Cell Biology，Vol.134(5)1229-1240，1996；Structural and Functional Characterization of Monomeric SolubleP-selectinand Comparison with Membrane P-selectin.Shigeru Ushiyama，ThomasM.LaueTl，Kevin L.Moore，Harold P.Erickson，和Rodger P.McEver.THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.268(20)15229-15237，1993；Structure of the Human Gene Encoding Granule MembraneProtein-140，a Member of the Selectin Family of Adhesion Receptors forLeukocytes.GeoffreyI.Johnston，Greg A.Bliss，Peter J.Newman和Rodger P.McEver.THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.265(34)21381-21385，1990)，酪氨酸酶(如參見SEQ ID NO20，40)(THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol.274，No.18，4月30日發(fā)行，pp.12780-12789，1999.A Cytoplasmic Sequence in Human TyrosinaseDefines a Second Class of Di-leucine-based Sorting Signals for LateEndosomal and Lysosomal Delivery.Paul A.Calvo，David W.Frank，Bert M.Bieler，Joanne F.Berson，和Michael S.Marks)，葡萄糖運(yùn)輸?shù)鞍譍LUT4(如參見SEQ ID NO22，42)(The cytosolic C-terminus of the glucosetransporter GLUT4 contains an acidic cluster endosomal targeting motif distalto the dileucine signal.Annette M.Shewan，BradJ.Marsh，Derek R.Mmelvin，Sally Martin，Gwyn W.Ggoulda和David E.James.Biochem.J.35099-107，2000；Cloning and Characterization of the Major Insulin-responsiveGlucose Transponer Expressed in Human Skeletal Muscle and Other Insulin-responsive Tissues.Hirofumi FukumotoS，Toshiaki Kayanol，John B.Busel，Yvonne Edwards，Paul F.PilcbW，Graeme I.Bell，and Susumu Seino.THEJOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.264(14)7776-7779，1989)、內(nèi)管纖維蛋白(endotubin)(如參見SEQ ID NOS24，44)(Cytoplasmic Signals Mediate Apical Early Endosomal Targeting ofEndotubin in MDCK Cells.K.E.Gokay，R.S.Young和J.M.Wilson.Traffic.2487-500，2001；Targeting of an Apical Endosomal Protein toEndosomes in Madin-Darby Canine Kidney Cells Requires Two SortingMotifs.K.E.Gokay和J.M.Wilson.Traffic，1354-365，2000)、或Nef蛋白或功能等價物，功能等價物指序列中不影響介導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)功能的任何變化，例如等位基因變體、保守氨基酸替換和實(shí)質(zhì)上同源的序列，下文會有更詳細(xì)的敘述。在一個實(shí)例中，基因編碼LAMP-1或功能等價物的N-末端信號序列。在另一個實(shí)例中，基因編碼人組織纖溶酶原活化因子或功能等價物的N-末端信號序列。
LAMP-1是發(fā)現(xiàn)于溶酶體和核內(nèi)體中的膜蛋白。LAMP-1包括能使LAMP-1定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的N-末端信號序列，以及能把LAMP-1靶向至溶酶體和核內(nèi)體的C-末端穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。LAMP-1/人乳頭瘤病毒E7(HPV-16 E7)嵌合抗原構(gòu)建體以往就顯示相對于包含野生型HPV-16 E7基因的牛痘，能產(chǎn)生更大的E7-特異性免疫應(yīng)答，這暗示了把抗原靶向至溶酶體和核內(nèi)體小室可以增強(qiáng)MHC II類提呈和疫苗效力(18)。
對于過敏原的DNA疫苗來說，已表明CD8+細(xì)胞能下調(diào)正在產(chǎn)生的IgE，而缺少CD4+細(xì)胞則沒有效果。進(jìn)一步講，在疫苗接種組的肺中比對照檢測到了更多的CD8+細(xì)胞。這暗示了疫苗接種可能誘導(dǎo)內(nèi)源性過敏原蛋白的產(chǎn)生并進(jìn)行MHC I類提呈，活化的CD8+T細(xì)胞能夠?yàn)槠浜筮^敏反應(yīng)賦予保護(hù)作用(參見美國專利第5,958.891和6,251,663，以及Kwan等的文獻(xiàn))。相反，并沒有提示認(rèn)為增強(qiáng)MHC II類提呈或加工會對抑制IgE的產(chǎn)生有利。
本發(fā)明中，發(fā)明人做了令人驚訝的發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)在免疫接種組中把過敏原靶向于MHC II類加工或提呈途徑能誘發(fā)由IgG2a介導(dǎo)的強(qiáng)Th1免疫應(yīng)答，而相對于對照組，其卻是由IgE介導(dǎo)的抑制Th2免疫應(yīng)答。發(fā)明人進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)介導(dǎo)曾表達(dá)于細(xì)胞中的過敏原到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的轉(zhuǎn)運(yùn)足以誘發(fā)Th1免疫應(yīng)答。相信并不僅限于任何特定理論，一旦進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，至少一些過敏原會被傳遞進(jìn)行MHC II類加工和提呈。
優(yōu)選地，重組DNA進(jìn)一步包括可操作連接的編碼第二信號肽的基因，其中第二信號肽把過敏原靶向至溶酶體和核內(nèi)體。相信這能進(jìn)一步增強(qiáng)了在MHC II類途徑中的過敏原提呈。編碼第二信號肽的基因可以是任何編碼氨基酸序列的序列，其與細(xì)胞機(jī)件相互作用以使過敏原靶向附著到溶酶體和核內(nèi)體上。例如，但并不局限于此，第二信號肽可以是C-末端溶酶體/核內(nèi)體靶向序列，其來自以下基因LAMP-1、人組織纖溶酶原活化因子、LIMP-11(如SEQ ID NO9，11，13，29，31，33)、DEC-205(如SEQID NO15，17，35，37)、P-選凝素(如SEQ ID NO19，39)、人酪氨酸酶(如見SEQ ID NO21，41)、葡萄糖運(yùn)輸?shù)鞍譍LUT4(如SEQ ID NO23，43)、內(nèi)管纖維蛋白(endotubin)(如SEQ ID NO25，45)或者Nef蛋白，或功能等價物，功能等價物指序列中不影響介導(dǎo)向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)的功能的任何變化，例如等位基因變體、保守氨基酸替換和實(shí)質(zhì)上同源的序列，下文會有更詳細(xì)的敘述。在一個實(shí)例中，基因編碼LAMP-1穿膜或胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域或功能等價物。
術(shù)語編碼過敏原的基因用于指任何編碼全長過敏原、其T輔助細(xì)胞表位或其包含一個或多個T輔助細(xì)胞表位的抗原片段、或功能等價物的基因。過敏原包括螨蟲過敏原、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶、花粉、動物皮屑、住宅粉塵和花生。實(shí)踐中可以接受能在免疫學(xué)領(lǐng)域中使用的抗原的片段和變體作為疫苗，這種抗原的片段和變體為小的(如8至10個氨基酸)、免疫原性的蛋白質(zhì)區(qū)域，只要能誘導(dǎo)出針對蛋白質(zhì)的免疫應(yīng)答就行。對于過敏原DNA疫苗來說，編碼T細(xì)胞表位的基因已經(jīng)可以作為有效的疫苗了。有用的片段和T輔助細(xì)胞表位可以用諸如現(xiàn)有的氨基酸序列計算機(jī)輔助分析來識別。
術(shù)語“功能等價物”用于描述過敏原氨基酸序列中的一個或多個缺失、取代、修飾或添加，但不影響過敏原的抗原性質(zhì)。在一個實(shí)例中，功能等價序列會通過一個或多個保守氨基酸取代而改變。保守氨基酸取代是指同類氨基酸間的取代。同類氨基酸包括，比如，具有未帶電荷極性側(cè)鏈的氨基酸，如天冬酰胺、谷氨酰胺、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸；具有堿性側(cè)鏈的氨基酸，如賴氨酸、精氨酸和組氨酸；具有酸性側(cè)鏈的氨基酸，如天冬氨酸和谷氨酸；具有非極性側(cè)鏈的氨基酸，如甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和半胱氨酸。
功能等價物可以是天然形成的，如等位基因變體，或者可以是利用已知識別抗原區(qū)方法設(shè)計的，其可能要在氨基酸序列上進(jìn)行改變。比如，比較不同物種的過敏原并識別保守序列。較多差異的序列更可能要進(jìn)行序列改變。基于可能的T或B細(xì)胞表位的計算機(jī)輔助分析，序列也可以修飾成針對T和/或B細(xì)胞更具反應(yīng)性的序列。該過敏原的功能等價物可以通過免疫動物而迅速鑒別，如用假定的等價物處理小鼠，再用過敏原刺激動物，來確定等價物是否提供了抗過敏原的保護(hù)性免疫應(yīng)答。
在另一個實(shí)例中，基因可以編碼實(shí)質(zhì)上同源的功能等價物，這指的是在等價物的氨基酸序列和過敏原的氨基酸序列之間有著實(shí)質(zhì)性的對應(yīng)。在具體的例子中，功能等價物至少約50％、75％、90％和95％同源。同源性用序列分析軟件來測定，如基因組計算機(jī)組織的序列分析軟件包(位于威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心，大學(xué)大街1710號，麥迪遜，WI53705)。排列氨基酸序列以使其同一性最大化。可以人工向序列中導(dǎo)入缺位以獲得適當(dāng)?shù)呐帕?。一旦得出?yōu)選的排列，就通過記錄所有兩個氨基酸序列相同的位置相對于總位置數(shù)來得出同源程度。
在一個實(shí)例中，重組DNA包含來自以下住宅塵螨物種的過敏原的基因Blomia tropicalis、Dermatophagoides pteronyssinus或者Dermatophagoides farinae。在一個實(shí)例中，過敏原是Blo t1、Blo t5、Derp1、Der p2、Der p3、Der f1、Der f2或是Der f3或是T輔助細(xì)胞表位或其包含一個或多個T輔助細(xì)胞表位的抗原性片段、或是功能等價物。許多過敏原基因已被克隆并被測序了，如美國專利第6,441,157、6,268,491、6,214,358、6,147,201、6,086,897、6,077,517、6,060,057、5,973,132、5,876,722、5,869,288、5,798,099、5,773,002、5,770,202、5,710,126、5,556,953、5,552,142、5,433,948和5,405,758號所述的那樣。
當(dāng)一個氨基酸可以用基因密碼中超過一個的密碼子來表示時，特定的生物會表現(xiàn)出特定的偏好或?qū)σ粋€密碼子比另一個更普遍使用。如，密碼子AGG、AGA和CGT都可以編碼精氨酸。AGG和AGA常用于人編碼的序列中，而密碼子CGT很少用到。因此，在DNA編碼區(qū)中進(jìn)行同義突變能選出特定生物偏好的密碼子，但仍表達(dá)相同的過敏原氨基酸序列，這納入本發(fā)明的范圍，而且術(shù)語“人源化”用于指改變基因序列從而選出偏好的或常在人編碼序列中發(fā)現(xiàn)的密碼子。
術(shù)語基因根據(jù)其常用意義來使用，其指一個可操作相連的核酸序列組。術(shù)語重組指重組的東西，如重組核酸指的是通過分子生物學(xué)技術(shù)手段把包括核酸序列的分子連接到一起或產(chǎn)生出來。當(dāng)序列置于功能關(guān)系中時，第一核酸序列就與第二核酸序列可操作相連了。比如，如果啟動子激活編碼序列的轉(zhuǎn)錄，則編碼序列就與啟動子可操作地相連了。相似地，如果重組DNA表達(dá)了，信號肽可介導(dǎo)過敏原轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，則編碼第一信號肽的基因就與編碼過敏原的基因可操作地相連了。相似地，如果重組DNA表達(dá)了，第二信號肽可使過敏原靶向到核內(nèi)體或溶酶體，則編碼第二信號肽的基因可操作地連接上了。
在一個實(shí)例中，編碼第一信號肽的基因可操作地連接到編碼過敏原的基因的上游，而且編碼第二信號肽的基因可操作地從編碼過敏原的基因的下游相連。在具體的實(shí)例中，重組DNA包含一個或多個SEQ ID NO.3至7和28至48的序列。
在一個實(shí)例中，重組DNA進(jìn)一步包括可操作相連的啟動子，從而使編碼序列表達(dá)。啟動子優(yōu)選是廣泛特異性的強(qiáng)啟動子，其能形成編碼序列的高水平的表達(dá)，如強(qiáng)病毒啟動子，諸如勞氏肉瘤病毒(RSV)啟動子(Gorman CM，Merlino GT，Willingham MC，PastanI，Howard BH.TheRous sarcoma virus long terminal repeat is a strong promoter whenintroduced into a variety of eukaryotic cells by DNA-mediated transfection.Proc Natl Acad Sci USA 1982；796777-6781)、SV40啟動子(Ghosh PK，Lebowitz P，F(xiàn)risque RJ，Gluzman Y.Identification of a promoter componentinvolved in positioning the 5′termini of simian virus 40 early mRNAs.ProcNatl Acad Sci USA 1981；78100-104)、包括CMV即時早期(IE)基因增強(qiáng)子(CMVIE增強(qiáng)子)的CMV增強(qiáng)子或啟動子(Boshart M，Weber F，Jahn G，Dorsch-Hasler K，F(xiàn)leckenstein B.Schaffner W.A very strong enhancer islocated upstream of an immediate early gene of human cytomegalovirus.Cell1985；41521-530；Niwa H，Yamamura H，Miyazaki J.Efficient selection forhigh-expression transfectants with a novel eukaryotic vector.Gene 1991；108193-200；也可參見美國專利第5,849,522和5,168,062號)。在一個實(shí)例中，啟動子是人CMV啟動子。
過敏原的DNA序列和信號肽是公知的，并且本發(fā)明的重組核酸分子可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的和諸如Sambrook等的(2001)《Molecular CloningA Laboratory Manual》(第3版，Cold Spring Harbor，Laboratory Press)和其他實(shí)驗(yàn)手冊所述的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來構(gòu)建。在本發(fā)明的不同方面，核酸分子可以利用已公開的技術(shù)來化學(xué)合成，如Itakura等的美國專利第4,598,049號、Caruthers等的美國專利第4,458,066號以及Itakura的美國專利第4,401,796和4,373,071號。正如本文所用的術(shù)語那樣，這種合成的核酸從其性質(zhì)來看是“重組”的(是化合分子構(gòu)成成分連續(xù)步驟的產(chǎn)物)。
在可選的實(shí)例中，可以化合分離的核酸。分離指的是被分離的物質(zhì)實(shí)質(zhì)上從諸如生物成分的其他成分中被分開或純化，從而可以操作或處理該分離物質(zhì)本身，而不會混在一起，比如在體內(nèi)。因此術(shù)語“分離”包括用標(biāo)準(zhǔn)純化方法純化的物質(zhì)、和宿主重組表達(dá)制備的物質(zhì)、以及化學(xué)合成的物質(zhì)。例如，在啟動子沒有直接和編碼序列接觸(如，共價連接)的時候，啟動子就是分離的，而通常啟動子在其來源生物天然產(chǎn)生的基因組中是接觸的。大量方法適用于化合或連接DNA片段，而且對于所屬領(lǐng)域技術(shù)人員按照DNA片段末端的性質(zhì)，選擇適合的方法是顯而易見的。
本發(fā)明的另一方面提供一種包含本發(fā)明重組核酸分子的表達(dá)載體。載體可以是質(zhì)粒或病毒或是衍生的病毒。通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建這樣的載體對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來說是公知的。本發(fā)明的載體也可以包括其他序列元件從而使載體在宿主細(xì)胞中增殖和篩選更容易，例如，帶有選擇標(biāo)記和報告基因的編碼序列，這對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員是公知的。另外，本發(fā)明的載體可以包括具有一個或多個限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)的核苷序列。
本發(fā)明的表達(dá)載體可以導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中，其包括能夠表達(dá)由表達(dá)載體編碼的蛋白質(zhì)的細(xì)胞。因此，本發(fā)明也提供包含本發(fā)明表達(dá)載體的宿主細(xì)胞。術(shù)語“宿主細(xì)胞”不僅指特定的細(xì)胞，而且指這種細(xì)胞的后代或潛在后代。因?yàn)橛捎诩?xì)胞分化、突變或環(huán)境影響會在隨后的世代中產(chǎn)生某些修飾，所以實(shí)際上，這些后代可以不與親代細(xì)胞完全一樣，但是這些細(xì)胞也納入在此使用的該術(shù)語的范圍之中。
載體DNA可以通過常規(guī)的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染技術(shù)來導(dǎo)入到細(xì)胞中。術(shù)語“轉(zhuǎn)化”和“轉(zhuǎn)染”指把外來核酸導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中去的技術(shù)，包括磷酸鈣或氯化鈣共沉淀、DEAE-葡聚糖介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染、脂質(zhì)體包埋、電穿孔、顯微注射以及病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染。合適的轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的方法是公知的，比如可以從Sambrook等的(Molecular CloningA Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory press(2001))和其他的實(shí)驗(yàn)手冊中找到。
被導(dǎo)入外來核酸的細(xì)胞、組織或生物體被稱作是“轉(zhuǎn)化”、“轉(zhuǎn)染”或“轉(zhuǎn)基因”的。轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞或生物體也包括細(xì)胞或生物體的后代，其從使用轉(zhuǎn)基因親代的培養(yǎng)過程中產(chǎn)生并顯示出由重組核酸構(gòu)建體所改變的表型。因此轉(zhuǎn)基因生物體是指轉(zhuǎn)化了異源核酸的生物體或包括了轉(zhuǎn)化基因的該生物體的后代。
本發(fā)明另一方面提供了一種包括根據(jù)本發(fā)明各實(shí)例的重組核酸分子的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞和一種非人動物。
為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞，已知根據(jù)所用的表達(dá)載體和轉(zhuǎn)染技術(shù)，經(jīng)由一小部分細(xì)胞可以把外來DNA整合到其基因組中。為了鑒定篩選這些整合子，編碼選擇標(biāo)記(如抗生素抗性)的基因可以和感興趣的基因一起導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中。優(yōu)選的選擇標(biāo)記包括那些可以帶來藥物抗性的標(biāo)記，如G418、潮霉素和氨甲蝶呤。編碼選擇標(biāo)記的核酸導(dǎo)入到宿主細(xì)胞中去可以用編碼肽化合物的同一個載體或者再用一個分開的載體。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了導(dǎo)入核酸的細(xì)胞可以用藥物篩選來鑒別。
重組核酸能用于誘發(fā)抗過敏原的免疫保護(hù)性應(yīng)答，這指的是其誘導(dǎo)出Th1型主導(dǎo)的免疫并抑制IgE產(chǎn)生。因此本發(fā)明也提供一種包含根據(jù)本發(fā)明的重組核酸的疫苗。根據(jù)本發(fā)明的疫苗利用過敏原基因或基因片段產(chǎn)生免疫，能夠用于免疫患者抗特定過敏原。相信不僅限于特定的理論，通過向宿主提供產(chǎn)生大量內(nèi)生過敏原特異性Th表位，疫苗可以增加用藥效果并產(chǎn)生抗原特異性Th1效應(yīng)器細(xì)胞。相信是由過敏原特異性Th1效應(yīng)器細(xì)胞提供的這種抗原特異性Th1微環(huán)境介導(dǎo)了過敏原特異性B細(xì)胞中的Th1免疫應(yīng)答，從而導(dǎo)致在以后的過敏原刺激時產(chǎn)生過敏原特異性血漿細(xì)胞。
因此本發(fā)明另一方面提供i)免疫患者抗過敏原；ii)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答；iii)抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生；iv)預(yù)防或治療針對過敏原的過敏反應(yīng)的方法，這些方法包括施用根據(jù)本發(fā)明各個實(shí)例的重組核酸或疫苗。本發(fā)明另一方面提供了根據(jù)本發(fā)明各個實(shí)例的重組核酸或疫苗在i)免疫患者抗過敏原；ii)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答；iii)抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生；iv)預(yù)防或治療針對過敏原的過敏反應(yīng)上的應(yīng)用，以及在制備i)免疫患者抗過敏；ii)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答；iii)抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生；iv)預(yù)防或治療針對過敏原的過敏反應(yīng)中的應(yīng)用，以及根據(jù)本發(fā)明各個實(shí)例的重組核酸或疫苗在制備i)免疫患者抗過敏；ii)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答；iii)抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生；iv)預(yù)防或治療針對過敏原的過敏反應(yīng)上的應(yīng)用，以及根據(jù)本發(fā)明各個實(shí)例的重組核酸或疫苗在制備i)免疫患者抗過敏原；ii)誘導(dǎo)Th1型免疫應(yīng)答；iii)抑制過敏原特異性IgE的產(chǎn)生；iv)預(yù)防或治療針對過敏原的過敏反應(yīng)的藥物中的應(yīng)用。患者可以是哺乳動物，在一個實(shí)例中，患者是人。
在一個實(shí)例中，疫苗是質(zhì)粒DNA表達(dá)載體。質(zhì)粒可以包括真核復(fù)制起始點(diǎn)以確保在宿主細(xì)胞中保持住疫苗。另外，質(zhì)?？梢园ㄔ藦?fù)制起始點(diǎn)和原核篩選基因從而使質(zhì)粒在原核宿主系統(tǒng)中增殖。優(yōu)選在細(xì)菌宿主中增殖的質(zhì)粒DNA，其DNA不被甲基化。DNA骨架中的未甲基化的CpG二核苷酸用作佐劑，可以刺激Th1型免疫。
在另一個實(shí)例中，疫苗是DNA或RNA病毒載體。比如，病毒載體可以是腺病毒、腺相關(guān)病毒、皰疹病毒、牛痘，或者優(yōu)選地是諸如反轉(zhuǎn)錄或α病毒的RNA病毒。RNA病毒載體在感染的宿主細(xì)胞中反轉(zhuǎn)錄，可提供根據(jù)本發(fā)明的重組DNA，這對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見的。
現(xiàn)有可用的活疫苗載體包括病毒載體，如腺病毒、痘病毒，以及細(xì)菌載體，如志賀代菌、沙門氏菌、霍亂弧菌、乳酸菌卡介苗(BCG)和鏈球菌。
腺病毒載體的例子以及構(gòu)建能表達(dá)本發(fā)明DNA分子的腺病毒載體的方法如美國專利第4,920,209所述。痘病毒載體包括牛痘和雀痘病毒，其如美國專利第4,722,848和美國專利第5,364,773各自所述。(也可參見，如，Tartaglia等，Virology(1992)188217)對于牛痘病毒載體的敘述以及Taylor等的Vaccine(1995)13539的對于雀痘病毒的參考文獻(xiàn))。能表達(dá)本發(fā)明重組核酸的痘病毒載體通過如Kieny等的Nature(1984)312163所述的同源重組獲得，從而使本發(fā)明的核酸插入病毒基因組并在合適條件下在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)。一般地，用于治療或預(yù)防的疫苗病毒載體的劑量可以是每千克約1×104至約1×1011個噬菌斑形成單位，更好是從約1×107至約1×1010，優(yōu)選是從約1×107至約1×109。優(yōu)選地，腸道外注射病毒載體；如3劑分4周施用。優(yōu)選包含本發(fā)明的病毒載體的組合物中不加入化學(xué)佐劑，從而使對病毒載體本身的免疫應(yīng)答最小化。
已知非致毒性霍亂弧菌突變株可用作口服活疫苗。Mekalanos等的Nature(1983)306551和美國專利第4,882,278號描述了沒有功能性霍亂毒素產(chǎn)生的菌株，該菌株兩個ctxA等位基因編碼序列實(shí)質(zhì)上都缺失了。WO 92/11354描述了irgA基因座位突變失活的菌株；該突變可以和ctxA突變發(fā)生在同一條鏈中。WO 94/01533描述了缺少ctxA和attRS1 DNA序列功能的缺失突變。如WO 94/19482所述，這些突變株可通過基因工程表達(dá)異源抗原。能表達(dá)由本發(fā)明DNA分子編碼的多肽或多肽衍生物的霍亂弧菌的有效疫苗劑量在所選給藥途徑的適合體積中包含約1×105至約1×109個，優(yōu)選約1×106至約1×108個活菌。優(yōu)選的給藥途徑包括所有的粘膜途徑；最優(yōu)的，鼻內(nèi)或口服施用這些載體。
用于重組表達(dá)或不表達(dá)異源抗原的減毒基因工程鼠傷寒沙門氏菌株及其用于口服疫苗如Nakayama等(Bio/Technology(1988)6693)和WO92/11361所述。優(yōu)選的給藥途徑包括所有的粘膜途徑；最優(yōu)的，鼻內(nèi)或口服施用這些載體。
本發(fā)明文中提到的用作疫苗載體的其他菌株還有由High等的EMBO(1992)111991和Sizemore等的Science(1995)270299所述的福我氏痢疾桿菌、由Medaglini等的Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1995)926868所述的鏈球菌以及由Flynn J.L.的Cell.Mol.Biol.(1994)40(suppl.I)31、WO88/06626、WO 90/00594、WO 91/13157、WO 92/01796和WO 92/21376所述的卡介苗。
細(xì)菌載體中，本發(fā)明核酸可以插入細(xì)菌基因組中或仍作為質(zhì)粒部分而自由存在。
本發(fā)明也提供了一種包含根據(jù)本發(fā)明重組核酸或疫苗的組合物以及藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑。該組合物適用于如上所述的方法和應(yīng)用。因此該組合物指的是影響免疫應(yīng)答的免疫組合物，因此本發(fā)明一方面提供一種包括根據(jù)本發(fā)明各種實(shí)例的重組核酸或疫苗的免疫組合物及藥學(xué)上可接受載體或稀釋劑。該藥物組合物適于諸如口服、非腸道注射、鼻腔、肌肉、靜脈、皮下、腹腔、舌下給藥等施用方式。
在一個實(shí)例中，重組核酸或疫苗在有或沒有載體的情況下以生理上可接受溶液來稀釋，如用無菌鹽水或無菌鹽水緩沖液。當(dāng)前，載體優(yōu)選是等滲、低滲或弱高滲的并具有相對較低的離子強(qiáng)度，如蔗糖溶液，比如包含20％蔗糖的溶液。
在一個實(shí)例中，重組核酸或疫苗可以和輔助細(xì)胞吸收的試劑一起聯(lián)用。這種試劑的例子有(i)改變細(xì)胞滲透性的化學(xué)品，如丁哌卡因(參見WO 94/16737)，(ii)包埋多核苷酸的脂質(zhì)體，(iii)可以和多核苷酸相連的陽離子脂類或多聚物或硅土、金或鎢微粒，或者(iv)殼聚糖納米顆粒(參見J.L.Chew等，(2003)Vaccine 212720-2729.)。
陰離子和中性脂質(zhì)體是現(xiàn)有技術(shù)中所熟知的(制備脂質(zhì)體的方法可參見LiposomesA Practical Approach，RPC New Ed，IRL press(1990)中的詳細(xì)描述)，并且它們可用于傳遞的許多種產(chǎn)物，包括多核苷酸。
陽離子脂質(zhì)也是現(xiàn)有技術(shù)中所熟知的并且常用于基因傳送。這樣的脂質(zhì)包括LipofectinTM，其也被稱為DOTMA(N-[1-(2，3-二油基氧)丙基]-N，N，N-氯化三甲基銨)、DOTAP(1，2-二(油酰)-3-(三甲基氨基)丙烷)、DDAB(二甲基二-十八烷基溴化胺)、DOGS(二辛癸胺甘氨酰精胺)以及膽固醇衍生物，如DC-Chol(3 beta-(N-(N′，N′-二甲基氨基甲烷)-氨基甲酰)膽固醇)。可以從EP 187,702、WO 90/11092、美國專利第5,283，185號、WO 91/15501、WO 95/26356和美國專利第5,527,928號中找到這些陽離子脂質(zhì)的描述。比如像WO 90/11092所述的，用于基因遞送的陽離子脂質(zhì)優(yōu)選與諸如DOPE(二油烯基磷脂酰乙醇胺)的中性脂質(zhì)一起聯(lián)用。
包含陽離子脂質(zhì)體的制劑可以任選包含其他促進(jìn)轉(zhuǎn)染的化合物。WO93/18759、WO 93/19768、WO 94/25608和WO 95/02397描述了許多這類化合物。它們包括用于促進(jìn)DNA穿過核膜的精胺衍生物(參見，如，WO 93/18759)和膜滲透性化合物，如GALA、短桿菌肽S和陽離子膽鹽(參見，如，WO93/19768)。
如WO 91/00359、WO 93/17706和Tang等.Nature(1992)356152所述，金或鎢微粒用于基因遞送。利用無針尖注射設(shè)備(“基因槍”)，比如美國專利第4,945,050號、美國專利第5,015,580號和WO 94/24263所述的那些，通過皮下或表皮內(nèi)給藥途徑，注射微粒包埋的多核苷酸。
利用陽離子多聚殼聚糖納米顆粒遞送多核苷酸的方法在現(xiàn)有技術(shù)中是熟知的，比如J.L.Chew等.(2003)Vaccine 21 2720-2729所述的。殼聚糖是幾丁質(zhì)的脫酰基形式，可以由不同的脫?；潭?。多核苷酸可與殼聚糖劇烈混合從而產(chǎn)生包含多核苷酸的殼聚糖納米顆粒。這種顆粒能用于遞送通過口服或粘膜途徑施用的DNA。
在一個實(shí)例中，組合物包括有效量的根據(jù)本發(fā)明的重組核酸或疫苗。“有效量”指有效劑量和必要的時間從而能獲得預(yù)想的治療效果，比如減少1型超敏反應(yīng)并進(jìn)而減輕過敏疾病的進(jìn)程，或者能獲得預(yù)想的預(yù)防效果，比如防止或抑制1型超敏反應(yīng)的比率或過敏疾病的發(fā)生或進(jìn)程。
向患者施用的DNA的量根據(jù)的是，諸如DNA構(gòu)建體中使用的啟動子強(qiáng)度、表達(dá)的基因產(chǎn)物的免疫原性、要給藥的患者的狀況(比如患者的體重、年齡和全面的健康狀況)、給藥模式和制劑類型。一般而言，對成人施用的治療或預(yù)防有效量為約100μg至5000μg，優(yōu)選約200至2000μg的質(zhì)粒形式的重組核酸?？梢杂脝蝿┧幓蜷g隔重復(fù)給藥來進(jìn)行給藥。
給藥的途徑可以是任何疫苗領(lǐng)域中使用的常規(guī)途徑，其由所選的制劑而定。通過肌肉、皮內(nèi)、皮下或口服給藥途徑可以方便地使用重組核酸?？诜f送時，重組核酸可以和膠狀物或相似的易攝食的物質(zhì)一起聯(lián)用，從而更方便遞送。
根據(jù)本發(fā)明的另一方面，可以裝在容器或商品包裝或試劑盒中來提供如本發(fā)明所述的重組核酸、DNA疫苗或組合物，其中進(jìn)一步包括所述用途的說明書，所述用途包括其預(yù)防或治療過敏反應(yīng)的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一方面提供一種新的免疫法。該方法包括用本發(fā)明的重組核酸引發(fā)患者的免疫應(yīng)答并且接著輔以過敏原。因而本發(fā)明提供一種抗過敏原的免疫方法，包括在第一階段向患者施用如本發(fā)明所述的重組核酸，并在第二階段向患者施用過敏原。患者可以是任何哺乳動物，包括人類患者。
在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不通過過度實(shí)驗(yàn)的情況下，該針對任何特定過敏原的療法就可以通過任選改變參數(shù)來進(jìn)行優(yōu)化，如DNA劑量、過敏原劑量、佐劑類型、免疫期限和免疫途徑。
可以施用多劑重組核酸?？梢栽诮o定的時間跨度中施用藥劑。例如，在第一階段的兩天至約一年的時間里可以施用二劑或多劑藥?？梢栽跁r間跨度中平均安排施用藥劑的時間，或者在時間跨度中以不規(guī)則間隔給藥。在一個實(shí)例中，約在相隔的2周中施用至少兩劑藥。在另一個實(shí)例中，約在1周中施用至少三劑藥。在一段時間中可以施用多劑藥，從而誘導(dǎo)出患者體內(nèi)的長期免疫記憶。例如，在一個實(shí)例中，在第一階段的約1年期間施用多劑藥。
在第二階段可以和佐劑一起聯(lián)合施用一劑或多劑過敏原。優(yōu)選地，選擇佐劑以引發(fā)出過敏原特異的Th1型免疫應(yīng)答?？梢酝ㄟ^Th1特異性免疫球蛋白和細(xì)胞因子的產(chǎn)生量來測定這樣的應(yīng)答。在一個實(shí)例中，過敏原與明礬聯(lián)合施用。
施用過敏原和佐劑的量可由普通技術(shù)人員常規(guī)實(shí)驗(yàn)來確定。在一個實(shí)例中，施用約100ng和1mg過敏原，優(yōu)選約1μg至100μg。在進(jìn)一步的實(shí)例中，過敏原與約1mg至10mg佐劑聯(lián)用，優(yōu)選約2mg至5mg佐劑?？梢杂涩F(xiàn)有常規(guī)方法來施用過敏原或過敏原加佐劑。例如，可以由口服、舌下、腹腔、鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、肌肉、皮下、皮內(nèi)等方式給藥。
第二階段可以使用一劑或多劑過敏原。第二階段可以緊接著第一階段，或者在第一階段的最后一次施用核酸和第二階段的最初施用過敏原之間可以有間隔時間。如果給定了若干劑量的過敏原，可以在給定的時間跨度中用不同給藥途徑施用藥劑。例如，在兩天至約10周期間施用二劑或多劑藥?？梢栽跁r間跨度中平均安排施用藥劑的時間，或者在時間跨度中以不規(guī)則間隔給藥。
在一個實(shí)例中，該方法包括用噴霧劑施用至少一劑過敏原，最后一劑藥優(yōu)選用噴霧劑給藥。
因此，在該免疫法的一個實(shí)例中，在第一階段，通過用本發(fā)明的重組核酸免疫來引發(fā)Th1型過敏原特異性細(xì)胞免疫，促進(jìn)大量內(nèi)生性過敏原特異性Th表位的產(chǎn)生。免疫法的第二階段包括一個強(qiáng)化過程，其由以腹腔或腹腔及噴霧劑給藥方式向患者施用過敏原和佐劑來實(shí)現(xiàn)的，從而導(dǎo)致激活過敏原特異性細(xì)胞和體液免疫，并進(jìn)一步施用過敏原噴霧來提供額外的過敏原特異性Th1體液免疫水平。
本發(fā)明的接種方法可以和任何DNA疫苗一起使用，并不僅限于使用本發(fā)明的核酸。因此，利用任何合適的針對所需免疫的過敏原的疫苗，可提供一種接種方法，其包括第一階段使用編碼過敏原的DNA疫苗，接著在第二階段用如上所述的過敏原強(qiáng)化。對于任何給定的過敏原，該療法在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員不通過過度實(shí)驗(yàn)的情況下就可以任選改變參數(shù)，如DNA劑量、過敏原劑量、佐劑類型、免疫期限和免疫途徑。
在一個實(shí)施粒中，提供的免疫方法包括在第一階段向患者施用包含可表達(dá)的過敏原基因的核酸；在第二階段向患者施用過敏原，其中第一階段在約一年期間施用多劑核酸以誘導(dǎo)出患者的長期免疫記憶。在另一個實(shí)例中，該方法包括在第二階段中噴霧施用過敏原。
如果過敏原基因(過敏原)的基因產(chǎn)物一傳遞到要被接種的患者的細(xì)胞中就在患者細(xì)胞中表達(dá)，則核酸就是編碼了可表達(dá)的過敏原基因這里列舉的所有文獻(xiàn)均納入本文參考。
盡管這里公開了本發(fā)明的各種實(shí)例，但是根據(jù)所屬領(lǐng)域技術(shù)人員的公知常識，可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)進(jìn)行大量改變和修改。這些修改包括在本發(fā)明任何方面用已知的等價物進(jìn)行替換從而以實(shí)質(zhì)上相同的方法達(dá)到相同的結(jié)果。如果沒有另外定義，所有本發(fā)明中使用的科技術(shù)語與所屬領(lǐng)域技術(shù)人員所通常理解的具有相同的意義。
“包含”一詞用作為開放式的術(shù)語，實(shí)質(zhì)上與“包括，但不僅限于”一詞等價。以下的實(shí)例舉例說明本發(fā)明的各個方面，但不對本發(fā)明公開的大范圍進(jìn)行限制。
具體實(shí)施例方式
材料與方法動物與免疫六至八周大的雌性BALB/cJ小鼠購置于實(shí)驗(yàn)動物中心，Lorong Chencharu，Sembawang，新加坡。動物飼養(yǎng)于NUS動物保存單位的常規(guī)動物房中。對于用未包被的DNA免疫，分別在第0、7(對于Blot5，僅用微基因注射)和14天用每劑100μg質(zhì)粒(2次注射，每次50μl)肌肉或皮下注射動物。在第21天以及第42或第49天，用合適劑量的明礬吸附的螨蟲過敏原(Blo t5或Der p1)向動物腹腔給藥。對于一些特定的實(shí)驗(yàn)，在第63、66和69天進(jìn)一步把動物暴露于酵母重組塵螨過敏原噴劑(每ml PBS中含0.5mg)中。每周收集血清并儲存于-20℃直至進(jìn)行試驗(yàn)。用ELISA試驗(yàn)確定塵螨過敏原特異性抗血清的滴度和分型。把動物暴露于超聲波噴霧器(UltrNEB 99型，DeVilbiss Health Care，Sommerset，PA)產(chǎn)生的過敏原噴霧(0.05％)中20分鐘進(jìn)行吸入刺激。在舌后部接種含20μg Der p1的50μl PBS以進(jìn)行氣管給藥。
質(zhì)粒制備在菌株E.coli中制備和克隆質(zhì)粒。按照NucleoBondRPC/BAC試劑盒(MACHEREY-NAGEL，德國)的用戶手冊培養(yǎng)E.coli轉(zhuǎn)化體(DH5α株)并純化DNA質(zhì)粒。純化的質(zhì)粒DNA溶解于磷酸緩沖液鹽(″PBS″0.144g/L KH2PO4，9.00g/L NaCI，0.795g/LNa2HPO4·7H2O)中，達(dá)到DNA終濃度為2mg/ml PBS。
對于利用殼聚糖顆粒進(jìn)行的口服給藥，殼聚糖(Sigma 22742)溶于25mM、pH5.5的乙酸中，達(dá)到終濃度為0.02％。質(zhì)粒DNA溶解劑45mM硫酸鈉中。兩種溶液等體積混合產(chǎn)生納米顆粒。用ZEISS Axiovert 25型倒置顯微鏡(Carl Zeiss，NY)觀察納米顆粒，并用Zetasizer 3000(MelvernInstruments Ltd.，UK)光子相干光譜儀對納米顆粒按大小進(jìn)行分級，從而獲得納米顆粒的平均大小。用Zetasizer 3000(Melvern Instruments Ltd.，英國)在中性去礦物質(zhì)水中進(jìn)行激光多普勒測定，測出納米顆粒的Zeta電位。5組BALB/c小鼠被喂以含殼聚糖-DNA納米顆粒的膠狀物。喂養(yǎng)前把小鼠分籠安置并可隨意飲水。然后在橙味女用精選膠狀晶體(CPC國際公司，香港)中混合新制的納米顆粒，該晶體溶于加熱到50℃的雙蒸水中以達(dá)到濃度為150％(w/v)(10ml水中含15g膠狀晶體)。然后在喂給小鼠之前將混合物注入稱量皿中，讓其在4℃凝結(jié)。包含50μg DNA的殼聚糖納米顆?；烊肽z狀物中并在第0天喂給每只小鼠吃。小鼠吃完膠狀物后，用標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料喂養(yǎng)小鼠。
基因構(gòu)建在CMV啟動子的調(diào)控下表達(dá)所有的嵌合基因。
通過將全長Bt5 cDNA(參考文獻(xiàn)18.gene bank登陸號為U27479)插入到pCI哺乳動物表達(dá)載體(Promega公司)的EcoRI和XbaI位點(diǎn)中從而形成質(zhì)粒pCI-Bt5。
通過將由LAMP-1前導(dǎo)序列和編碼LAMP-1穿膜和胞質(zhì)尾部序列所構(gòu)成的人工合成寡核苷酸插入到pCI載體的XhoI(在以下序列的5′端用粗體表示插入的相應(yīng)位點(diǎn))和NotI(在以下序列的3′端用粗體表示插入的相應(yīng)位點(diǎn))位點(diǎn)上，從而形成對照載體pCI-LAMPss-T/C。在編碼LAMP-1前導(dǎo)序列的3′端和在編碼LAMP-1穿膜和胞質(zhì)尾部序列的5′端各自設(shè)計出一個唯一的NheI位點(diǎn)和一個唯一的NdeI位點(diǎn)(均用下劃線表示)。在克隆位點(diǎn)上插入了過敏原基因的pCI-LAMPss-T/C的編碼序列如下所示[SEQID NO1]。小鼠LAMP-1前導(dǎo)序列和小鼠LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域所翻譯出的蛋白質(zhì)序列也如[SEQ ID NO25，SEQ ID NO26]所示M A A P G A R R P L L L L L L A G L A H G5’ctcgagccaccatggccgcccccggcgcccggaggcccctgctcctgctgctgctggcaggccttgcacatggcA S M L I P I A V G G A L A G L V LgctagcgaattcccggggatccatatgttgatccccattgctgtgggcggtgccctggcagggctggtcctI V L I A Y L I G R K R S H A G Y E T Iatcgtcctcatcgcctacctcattggcaggaagaggagtcacgccggctatcagaccatctagcggccgc 3’利用由編碼H-2d-限制性Th表位的Blo t5基因片段所構(gòu)成的人工合成寡核苷酸構(gòu)建出質(zhì)粒pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C。該寡核苷酸插入到LAMP-1前導(dǎo)序列3′端的NheI位點(diǎn)和編碼LAMP-1穿膜和胞質(zhì)尾部序列的5′端NdeI位點(diǎn)之中。編碼序列為[SEQ ID NO2]小鼠LAMP-1信號序列
M A A P G A R R P L L L L L L A G L A H G A S5’atggccgcccccggcgcccggaggcccctgctcctgctgctgctggcaggccttgcacatggcgctagc 3’Blo t5 H-2d-限制性T細(xì)胞表位A E L Q E K I I R E L D V V C A M N5’gcagaattgcaagagaaaatcattcgagaacttgatgttgtttgcgccatgaat 3’小鼠LAMP-1穿膜&胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域M L I P I A V G G A L A G L V L I V L I A Y L5’atgttgatccccattgctgtgggcggtgccctggcagggctggtcctcatcgtcctcattgcctacctc小鼠LAMP-1穿膜&胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域I G R K R S H A G Y E T I AMBattggcaggaagaggagtcacgccggctatcagaccatctag 3’把PCR擴(kuò)增出的編碼成熟蛋白的Blo t5 cDNA插入到LAMP-1前導(dǎo)序列3′端的NheI位點(diǎn)和編碼LAMP-1穿膜和胞質(zhì)尾部序列的5′端NdeI位點(diǎn)之中從而形成質(zhì)粒pCI-LAMPss-Bt5-T/C。Blo t5-LAMP編碼序列為[SEQ ID NO3]小鼠LAMP-1信號序列M A A P G A R R P L L L L L L A G L A H G A S5’Atggccgcccccggcgcccggaggcccctgctcctgctgctgctggcaggccttgcacatggcgctagc 3’Blo t5編碼序列Q E H K P K K D D F R N E F D H L L I E Q A N H5’caagagcacaagccaaagaaggatgatttccgaaacgaattcgatcacttgttgatcgaacaggcaaaccatA I E K G E H Q L L Y L Q H Q L D E L N E N K SgctatcgaaaagggagaacatcaattgctttacttgcaacaccaactcgacgaattgaatgaaaacaagagcK E L Q E K I I R E L D V V C A M I E G A Q G AaaggaattgcaagagaaaatcattcgagaacttgatgttgtttgcgccatgatcgaaggagcccaaggagctL E R E L K R T D L N I L E R F N Y E E A Q T LttggaacgtgaattgaagcgaactgatcttaacattttggaacgattcaactacgaagaggctcaaactctcS K I L L K D L K E T E Q K V K D I Q T Q Nagcaagatcttgcttaaggatttgaaggaaaccgaacaaaaagtgaaggatattcaaacccaaaat 3’小鼠LAMP-1穿膜&胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域
M L I P I A V G G A L A G L V L I V L I A Y L I5’atgttgatccccattgctgtgggcggtgccctggcagggctggtcctcatcgtcctcatcgcctacctcattG R K R S H A G Y E T Iggcaggaagaggagtcacgccggctatcagaccatctag 3’質(zhì)粒pCI-LAMPss-Bt5衍生自pCI-LAMPss-Bt5-T/C，就是用pCI-Bt5的EcoRI/NotI片段替換編碼部分Blo t5和LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的EcoRI/1NotI片段而形成的。該編碼序列為[SEQ ID NO4]小鼠LAMP-1信號序列M A A P G A R R P L L L L L L A G L A H G A S5’Atggccgcccccggcgcccggaggcccctgctcctgctgctgctggcaggccttgcacatggcgctagc 3’Blo t5編碼序列Q E H K P K K D D F R N E F D H L L I E Q A N H5’caagagcacaagccaaagaaggatgatttccgaaacgaattcgatcacttgttgatcgaacaggcaaaccatA I E K G E H Q L L Y L Q H Q L D E L N E N K SgctatcgaaaagggagaacatcaattgctttacttgcaacaccaactcgacgaattgaatgaaaacaagagcK E L Q E K I I R E L D V V C A M I E G A Q G AaaggaattgcaagagaaaatcattcgagaacttgatgttgtttgcgccatgatcgaaggagcccaaggagctL E R E L K R T D L N I L E R F N Y E E A Q T LttggaacgtgaattgaagcgaactgatcttaacattttggaacgattcaactacgaagaggctcaaactctcS K I L L K D L K E T E Q K V K D I Q T Q Nagcaagatcttgcttaaggatttgaaggaaaccgaacaaaaagtgaaggatattcaaacccaaaattaa 3’把PCR擴(kuò)增出的編碼成熟Der p1蛋白(參考文獻(xiàn)20.gene bank登陸號為U11695)的Der p1片段插入到LAMP-1前導(dǎo)序列3′端的NheI位點(diǎn)和LAMP-1編碼穿膜和胞質(zhì)尾部序列的5′端NdeI位點(diǎn)之中從而形成質(zhì)粒pCI-LAMPss-Der p1-T/C。該編碼序列為[SEQ ID NO5]小鼠LAMP-1信號序列M A A P G A R R P L L L L L L A G L A H G A S5’atggccgcccccggcgcccggaggcccctgctcctgctgctgctggcaggccttgcacatggcgctagc 3’(+1)成熟Der p1編碼序列
T N A C S I N G N A P A E A D L R Q M R T V T P I5’actaacgcctgcagtatcaatggaaatgctccagctgaaatcgatttgcgacaaatgcgaactgtcactcccattR M Q G G C G S C W A F S G V A A T E S A Y L A YcgtatgcaaggaggctgtggttcatgttgggctttctctggtgttgccgcaactgaatcagcttatttggcttacR N Q S L D L A E Q E L V D C A S Q H G C H G D TcgtaatcaatcattggatcttgctgaacaagaattagtcgattgtgcttcccaacacggttgtcatggtgataccI P R G I E Y I Q H N G V V Q E S Y Y R Y V A R EattccacgtggtattgaatacatccaacataatggtgtcgtccaagaaagctactatcgatacgttgcacgagaaQ S C R R P N A Q R F G I S N Y C Q I Y P P N V NcaatcatgccgacgaccaaatgcacaacgtttcggtatctcaaactattgccaaatttacccaccaaatgtaaacK I R E A L A Q T H S A I A V I I G I K D L D A FaaaattcgtgaagctttggctcaaacccacagcgctattgccgtcattattggcatcaaagatttagacgcattcR H Y D G R T I I Q R D N G Y Q P N Y H A V N I VcgtcattatgatggccgaacaatcattcaacgcgataatggttaccaaccaaactatcacgctgtcaacattgttG Y S N A Q G V D Y W I V R N S W D T N W G D N GggttacagtaacgcacaaggtgtcgattattggatcgtacgaaacagttgggataccaattggggtgataatggtY G Y F A A N I D L M M I E E Y P Y V V I L N(+222)tacggttattttgctgccaacatcgatttgatgatgattgaagaatatccatatgttgtcattctcaat 3’小鼠LAMP-1穿膜&胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域M L I P I A V G G A L A G L V L I V L I A Y L I G5’atgttgatccccattgctgtgggcggtgccctggcagggctggtcctcatcgtcctcatcgcctacctcattggcR K R S H A G Y E T Iaggaagaggagtcacgccggctatcagaccatctag 3’把編碼人組織纖溶酶原活化因子前導(dǎo)序列、人源化Der p1成熟蛋白和LAMP-1穿膜和胞質(zhì)尾部的PCR擴(kuò)增片段插入到pVax(Invitrogen)的BamHI和XbaI位點(diǎn)之中從而形成質(zhì)粒pVax-htpa-hDpl-LAMP，其中pVax是FDA批準(zhǔn)的可在人身上使用的質(zhì)粒載體。該編碼序列為[SEQ IDNO6]人組織纖溶酶原活化因子前導(dǎo)序列5’atg gat gca atg aag aga ggg ctc tgc tgt gtg ctg ctg ctg tgt gga gca gtc ttc gtt tcg cccagc cag gtt ggt gtg cag gac ccc tgt gtc ccg ccc ctc 3’
人源化Der p1序列5’ acc aac gcc tgc agc atc aac ggc aat gcc ccc gct gag att gat ctg cgc cag atg agg accgtg act ccc atc cgc atg caa ggc ggc tgc ggg tct tgt tgg gcc ttc tca ggc gtg gcc gcg accgag tct gca tac ctc gcg tat cgg aat cag agc ctg gac ctc gct gag cag gag ctc gtt gac tgcgcc tcc caa cac gga tgt cat ggg gat acg att ccc aga ggt atc gaa tac atc cag cat aat ggcgtc gtg cag gaa agc tat tac cga tac gta gct agg gag cag tcc tgc cgc cgt cct aac gcc cagcgc ttc ggc att tcc aac tat tgc cag atc tac ccc cct aat gtg aac aag atc agg gag gcc ctg gcgcag acg cac agc gcc atc gct gtc atc atc gga atc aag gat ctg gac gca ttc cgg cac tat gacggg cgc aca atc atc cag cgc gac aac gga tac cag cca aac tat cac gcg gtc aac atc gtg ggttac tcg aac gcc cag ggg gtg gac tac tgg atc gtg cgg aac agt tgg gac acc aac tgg ggc gacaac ggc tac ggc tac ttt gcc gcc aac atc gac ctg atg atg atc gaa gag tac ccg tac gtg gtgatc ctg 3’LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域5’ttg atc ccc att gat gtg ggc ggt gcc ctg gca ggg ctg gtc ctc atc gtc ctc att gcc tac ctcatt ggc agg aag agg agt cac gcc ggc tat cag acc atc tag 3’重組Blo t5過敏原的制備和天然Der p1的純化兩個不同的表達(dá)系統(tǒng)，即基于E.coli的GST基因融合系統(tǒng)和基于酵母菌的畢氏酵母表達(dá)系統(tǒng)，被用來表達(dá)重組Blo t5過敏原。對于基于E.coli的表達(dá)系統(tǒng)來說，把成熟Blo t5的完整編碼序列亞克隆到載體pGEX-4T(Amersham PhamaciaBiotech)中。為了獲得具有天然Blo t5翻譯后修飾性質(zhì)的重組Blo t5，利用EasySelectTM畢氏酵母表達(dá)試劑盒(InvitrogenTM生命技術(shù))把成熟Blo t5的編碼序列亞克隆到載體pPICZα中。按照廠商提供的說明書進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)和純化。通過親和層析，利用mAb 4C1從廢棄的螨蟲培養(yǎng)基中提純出天然的Der p1。
脾細(xì)胞和純化的T細(xì)胞的體外初級或次級刺激用未純化的脾細(xì)胞進(jìn)行次級Blo t5特異性T細(xì)胞增殖試驗(yàn)。從脾懸浮液中用尼龍纖維純化出T細(xì)胞，其用于初級Blo t5特異性T細(xì)胞增殖培養(yǎng)。簡而言之，在20μg GST-Blo t5存在或缺失的情況下，在96孔U型底板中共培養(yǎng)1.5×105純化的T細(xì)胞和4.5×105絲裂霉素處理的APC3至4天。在第2和第3天收集培養(yǎng)物的上清液并在-80℃保存直至進(jìn)行小鼠INF-γ和小鼠IL-4的ELISA試驗(yàn)。對于次級再刺激培養(yǎng)，在20μg GST-Blo t5存在的情況下，在6孔板中培養(yǎng)2～3×107脾細(xì)胞4天。收集Ficoll-Plaque純化的T細(xì)胞，并在含20ng每ml小鼠重組IL-2的RP10培養(yǎng)基中再繼續(xù)培養(yǎng)6天。把1×105活的T細(xì)胞加到預(yù)先用抗小鼠CD3ε抗體包被的孔(96孔U型底板)中，并在1mg每ml抗小鼠CD28抗體存在或缺失的情況下再培養(yǎng)24或48小時。收集24或48小時的培養(yǎng)物上清液并在-80℃保存直至進(jìn)行IL-4 ELISA試驗(yàn)。
免疫球蛋白和細(xì)胞因子的ELISA試驗(yàn)Costar高度結(jié)合性96孔ELISA平板于4℃用GST-Blo t5、天然Der p1、鼠的抗小鼠IL-4或鼠的抗小鼠IFNγ(2-5μg/ml)包背過夜。用10％FCS或1％BSA封閉孔后，加入稀釋度合適的血清/培養(yǎng)物上清液，并將平板于4℃溫浴過夜。加入生物素綴合的mAb、鼠的抗小鼠IgE、鼠的抗小鼠IgG2a、鼠的抗小鼠IL-4、或鼠的抗小鼠IFNγ，接著加入ExtrAvidin堿性磷酸酶。用對硝基苯磷酸底物來顯出信號并測量OD405nm處的光密度。把小鼠IgE、IgG2a、重組小鼠IL-4&IFNγ用作標(biāo)準(zhǔn)樣品。
氣管反應(yīng)的測量利用全身瀑體積測量法(PLY3211型，BuxcoElectronics Inc.，Troy，紐約，美國)，通過在有意識的動物上造成乙酰甲膽堿誘導(dǎo)的氣流障礙來測量氣管反應(yīng)。過敏原刺激的動物首先暴露于PBS以作為測量基準(zhǔn)，接著漸漸增加乙酰甲膽堿噴霧劑的劑量。根據(jù)方程式Penh＝(Te/RT-1)×(PEF/PIF)，其中Penh＝增加的停頓，Te＝呼氣的時間，RT＝松弛時間，PEF＝最大呼氣氣流，而PIF＝最大吸氣氣流(21)，測量的指標(biāo)表示為Penh。
實(shí)施例1分別在第0和第21天向六至八周大的動物(n＝4個每組)腹腔給藥，施用含10μg和5μg酵母重組Blo t5的4mg明礬(氫氧化鋁凝膠R)。每周收集血清并儲存于-20℃直至進(jìn)行ELISA試驗(yàn)。用ELISA試驗(yàn)測定Blo t5特異性IgE抗血清的水平。一個抗體生成單位相當(dāng)于每ml血清中有一納克鼠Ig(圖1A)。在第21天，從用明礬吸附的Blo t5或單獨(dú)用明礬(第0天)預(yù)先給藥的小鼠中制備脾單細(xì)胞懸浮液。用Bt550-67肽(5μM)刺激脾細(xì)胞72小時。用ELISA試驗(yàn)測定培養(yǎng)物上清液中IFNγ和IL-4的水平(圖1B)。分別在第0和第21天向六至八周大的動物(n＝3或4個每組)腹腔給藥，施用含10μg和5μg酵母重組Blo t5的2mg明礬。在第28、31和34天，用Blo t5噴霧(0.025％)進(jìn)一步加強(qiáng)免疫這些動物。在第35天測量氣管的過度反應(yīng)性(圖1C)。
結(jié)果顯示成功建立了具有Th2型免疫特征的過敏原誘導(dǎo)小鼠模型。IL-4是關(guān)鍵的細(xì)胞因子，其調(diào)節(jié)IgE的合成。相對于對照組，用明礬吸附的Blo t5給藥的動物中的脾細(xì)胞在用H-2d-限制性Blo t5 Th表位體外刺激時分泌了統(tǒng)計學(xué)上顯著水平的IL-4(P＝0.01)(圖1A)。在第21天進(jìn)一步用明礬吸附的Blo t5強(qiáng)化就馬上在第28天造成了Blo t5特異性IgE水平的波動，接著Blo t5特異性滴度就急劇下降(圖1B)。實(shí)驗(yàn)組的Blot5特異性IgE滴度大小持續(xù)超過6周高于背景水平(數(shù)據(jù)未顯示)。暴露于乙酰甲膽堿噴霧后，具有Th2型Blo t5特異性免疫性質(zhì)的動物相對于對照動物顯示了統(tǒng)計學(xué)上顯著的哮喘癥狀(P＝0.03)(圖1C)。因此在有哮喘癥狀的BALB/cJ動物中，利用明礬作為Th2佐劑的免疫規(guī)程對誘導(dǎo)出長久且顯著的Blo t5特異性Th2型免疫是可行的。
實(shí)施例2在第0和第14天，向六至八周大的動物(n＝4個每組)肌肉注射100μg pCI-Blo t5和pCI。接著用含10μg(第21天)和5μg(第42天)酵母重組Blo t5過敏原的4mg明礬向這些動物腹腔給藥兩次。每周收集血清并儲存于-20℃直至進(jìn)行試驗(yàn)。用ELISA試驗(yàn)測定Blo t5特異性IgG2a(圖2A)和IgE(圖2B)抗血清的水平。一個抗體生成單位相當(dāng)于每ml血清中有一納克鼠Ig。
接受肌肉免疫無包被基因和明礬吸附的Blo t5強(qiáng)化劑的動物的免疫應(yīng)答如圖2所示。如圖所示，Blo t5全基因免疫能夠在接受三次pCI-Blot5肌肉注射的動物中形成Th1主導(dǎo)的免疫應(yīng)答，早至第21天就可見到Blo t5特異性血清IgG2a的水平有顯著地提高(圖2A)。在第21天，在注射對照pCI載體的動物中沒有Blo t5特異性血清Ig被檢測到。在pCI免疫的小鼠中產(chǎn)生了顯著的Th2型免疫狀況，與之相反，Th1型免疫應(yīng)答持續(xù)保持在用pCI-Blo t5免疫并隨后用含酵母重組Blo t5的明礬進(jìn)行蛋白質(zhì)敏化的動物中(圖2A)，這些結(jié)果與體外T細(xì)胞細(xì)胞因子的情況一致，與對照動物相比實(shí)驗(yàn)動物有超過三倍的INF-γ/IL-4比率(數(shù)據(jù)未顯示)。
實(shí)施例3正如圖3至7所述的結(jié)果所證明的那樣，增強(qiáng)DNA疫苗效力可以通過(1)把T輔助細(xì)胞表位靶向至MHC II途徑、和(2)優(yōu)化免疫時限、免疫途徑及合適佐劑來實(shí)現(xiàn)。
在第0和第14天，向六至八周大的動物(n＝4個每組)肌肉注射100μg pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C或pCI-LAMPss-T/C。隨后在第21和第42天，分別用含10μg和5μg酵母重組Blo t5過敏原的4mg明礬向這些動物腹腔給藥兩次。每周收集血清并儲存于-20℃直至進(jìn)行試驗(yàn)。用ELISA試驗(yàn)測定Blo t5特異性IgG2a(圖3A)和IgE(圖3B)抗血清的水平。一個抗體生成單位相當(dāng)于每ml血清中有一納克鼠Ig。在第二組實(shí)驗(yàn)中，實(shí)行相同的免疫規(guī)程，只是在第21和第42天，分別用含10μg和5μg酵母重組Blo t5過敏原的2mg明礬向每個動物(n＝4個每組)腹腔給藥兩次。用重組Blo t5(10μg/ml)刺激第49天制備的脾細(xì)胞72小時。用ELISA試驗(yàn)檢測培養(yǎng)物上清液中存在的IFNγ和IL-4(圖3C)。
在另一個實(shí)驗(yàn)中(圖4)，在第0、第7和第14天，向動物皮下注射100μg pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C或pCI-LAMPss-T/C。所有的其他參數(shù)如以上實(shí)驗(yàn)所述的那樣。用ELISA試驗(yàn)測定Blo t5特異性IgG2a(圖4A)和IgE(圖4B)抗血清的水平。
在另一組實(shí)驗(yàn)中(圖5)，在第63、第66和第69天，所有的動物接著再接受額外的酵母重組Blo t5噴霧劑處理。每周收集血清并儲存于-20℃直至進(jìn)行試驗(yàn)。用ELISA試驗(yàn)測定Blo t5特異性IgG2a(圖5A)和IgE(圖5B)抗血清的水平。
在第0和第14天(圖6)，或在第0、第14和第294天(圖7)，向六至八周大的動物(n＝6個每組)肌肉注射100μgpCI-LAMPss-Bt550-67-T/C或pCI-LAMPss-T/C。在第301和第322天，分別用10μg和5μg酵母重組Blo t5過敏原腹腔加強(qiáng)免疫這些動物。每周收集血清并儲存于-20℃直至進(jìn)行試驗(yàn)。用ELISA試驗(yàn)測定Blo t5特異性IgG2a(圖6A、7A)和IgE(圖6B、7B)抗血清的水平。
圖3顯示用Blo t5微基因給藥并用明礬吸附的Blo t5強(qiáng)化的BALB/cJ小鼠中的特異性Th1體液免疫應(yīng)答。盡管明礬被認(rèn)為是Th2帶動的佐劑，但是在施用了兩次明礬吸附的Blo t5之后，再接受pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C但不接受pCI-LAMPss-T/C載體的動物中，Blot5特異性血清IgG2a滴度產(chǎn)生急劇的增加(圖3A)。IgG2a是典型的Th1型免疫球蛋白。相反地，免疫了pCI-LAMPss-T/C載體的對照組動物只表達(dá)了典型的Th2免疫，其具有顯著的Blo t5特異性IgE的循環(huán)水平(圖3B)。該體液免疫差異近似地與用Blo t5體外刺激脾細(xì)胞所得的Th1/Th2細(xì)胞因子的結(jié)果相關(guān)，該結(jié)果顯示相對于對照的pCI-LAMPss-T/C免疫組，pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C免疫組的IFNγ/IL-4的比率之間有著五倍的差異(0.5995/0.01223)(圖3C)。比較圖2和圖3的結(jié)果，可以看到用pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C免疫的動物較之用pCI-Blo t5免疫的產(chǎn)生了超過二十倍的Th1體液免疫。
皮下DNA免疫是獲得高水平的抗過敏原誘發(fā)疾病保護(hù)性免疫的可選途徑。就像肌肉注射一樣，體內(nèi)皮下注射pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C能夠?qū)嵸|(zhì)上引起。Th1主導(dǎo)的免疫。一旦用含酵母重組Blo t5的明礬進(jìn)行敏化，就能在用pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C載體處理過的動物中表達(dá)類似水平的Blo t5特異性血清IgG2a(圖3A&4A)，但是在用pCI-LAMPss-T/C處理過的動物中就不表達(dá)(圖4B)。這些結(jié)果提示皮下DNA免疫是產(chǎn)生大量特異性Th1型免疫的可選途徑。
過敏原噴霧吸入法是在小鼠中提高大量保護(hù)性Th1免疫的有效強(qiáng)化途徑。噴霧吸入法是強(qiáng)化體內(nèi)抗原特異性免疫或誘導(dǎo)抗原特異性耐受的天然途徑。將動物暴露于酵母重組Bt5的噴霧中可研究噴霧吸入法用于抗原強(qiáng)化途徑的可行性。連續(xù)三次吸入酵母重組Blo t5噴霧后，具有顯著過敏原特異性Th1免疫的動物(如圖3A所示)顯示出水平顯著高于過敏原特異性血清IgE基準(zhǔn)水平的過敏原特異性血清IgG2a(增量超過100倍，圖5A)。與之相反，對照組動物卻保持了穩(wěn)定而顯著的過敏原特異性血清IgE水平和過敏原特異性血清IgG2a的基準(zhǔn)水平(＜200抗體產(chǎn)生單位，圖5B)。這些結(jié)果提示了可以通過抗原噴霧吸入來進(jìn)一步強(qiáng)化現(xiàn)有的Th1免疫。因此，給藥途徑是增強(qiáng)DNA給藥/蛋白質(zhì)強(qiáng)化法中的關(guān)鍵因素。
理想的疫苗不僅能在宿主中誘導(dǎo)出強(qiáng)而有效的免疫，而且能誘導(dǎo)出持久的免疫。圖6顯示的是保持的長期免疫記憶。在10個月的研究過程中，pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C免疫并接著用明礬吸附的Blo t5強(qiáng)化的動物能夠誘導(dǎo)出高水平的Blo t5特異性Th1免疫(圖6A)，而且能產(chǎn)生一些Th2免疫(圖6B)。這些結(jié)果暗示存在Blo t5特異性Th1記憶，或者在pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C免疫動物進(jìn)行明礬吸附的Blo t5強(qiáng)化期間，效應(yīng)細(xì)胞亞群從量和/或質(zhì)上有點(diǎn)不能防止一些新的Blo t5特異性Th2細(xì)胞的極化。
圖7顯示的是新的免疫規(guī)程造成的對長期休眠記憶的免疫強(qiáng)化作用。在使用明礬吸附的Blo t5強(qiáng)化前，在第294天進(jìn)行額外的pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C免疫(圖7)。正如預(yù)期的，在pCI-LAMPss-Bt550-67-T/C免疫組中見到了低得多的Blo t5 IgE水平，相對于圖6B所示的結(jié)果，在第329天發(fā)生了顯著的下降(P＝0.05)。則兩個免疫規(guī)程都能夠產(chǎn)生非常相似的Blo t5特異性Th1免疫水平(圖6&7)。把結(jié)果放到一起來看，這些結(jié)果提示了通過肌肉注射在體內(nèi)表達(dá)Th支配的Blo t5表位能夠產(chǎn)生長期的Blo t5特異性Th1支配的免疫。另外，DNA給藥并接著用蛋白質(zhì)強(qiáng)化的時限可能是DNA疫苗優(yōu)化的關(guān)鍵參數(shù)。
實(shí)施例4在第0、第7和第14天，向六至八周大的動物(n＝4個每組)肌肉注射100μg pCI-LAMPss-Bt5-T/C或pCI-LAMPss-Bt5。隨后分別在第21和第42天，用含有10μg和5μg酵母重組Blo t5過敏原的2mg明礬向這些動物的腹腔給藥兩次。每周收集血清并儲存于-20℃直至進(jìn)行試驗(yàn)。用ELISA試驗(yàn)測定Blo t5特異性IgG2a(圖8A)、IgE(圖8B)和IgG1(圖8C)的抗血清水平。一個抗體生成單位相當(dāng)于每ml血清中有一納克鼠Ig。
圖8顯示了先用溶酶體靶向性或非溶酶體靶向性Blot 5-LAMP嵌合基因給藥并接著用明礬吸附的Blo t5強(qiáng)化的BALB/cJ小鼠中的特異性Th1體液免疫應(yīng)答。pCI-LAMPss-Bt5-T/C免疫的動物比用pCI-LAMPss-Bt5免疫的動物更早產(chǎn)生保護(hù)性IgG2a免疫應(yīng)答。結(jié)果顯示單劑Blo t5/明礬強(qiáng)化劑足以在pCI-LAMPss-Bt5-T/C免疫的動物中誘導(dǎo)出類似水平的Blo t5異性IgG2a，而對于pCI-LAMPss-Bt5免疫的動物卻需要兩劑。
實(shí)施例5圖9和10顯示了在用Der p1-LAMP嵌和基因免疫的小鼠中抑制對Der p1刺激而產(chǎn)生的Der p1特異性IgE和氣管過渡應(yīng)答的效果。
在第0和第14天，向六至八周大的動物肌肉注射100μgpCI-LAMPss-Derp1-T/C(n＝10)或pCI-LAMPss-T/C(n＝6)。在第21和第42天，用含有1μg天然Der p1的2mg明礬向這些動物的腹腔強(qiáng)化免疫兩次。隨后在第63天向氣管施以20μg天然Der p1。每周收集血清并儲存于-20℃直至進(jìn)行試驗(yàn)。用ELISA試驗(yàn)測定Der p1特異性IgG2a(圖9A)和IgE(圖9B)的抗血清水平。一個抗體產(chǎn)生單位相當(dāng)于每ml血清中有一納克鼠Ig。在第64天測定這些動物氣管的過度反應(yīng)性(圖10B)，并用ELISA試驗(yàn)測定針對天然Der p1(10μg/ml)的次級T細(xì)胞的細(xì)胞因子反應(yīng)情況(圖10A)。
圖9顯示了用Der p1-LAMP嵌合基因免疫的動物誘導(dǎo)出的Th1體液免疫。就像Blo t5 Th表位DNA免疫一樣，在用pCI-LAMPss-Derp1-T/C免疫并接著用兩劑明礬吸附的Der p1強(qiáng)化的組中檢測出了高水平的Derp1特異性IgG2a，但沒有在對照組中檢出(圖9A)。相反，對照組中表達(dá)了顯著水平的Der p1特異性IgE，但實(shí)驗(yàn)組沒有表達(dá)(圖9B)。
Der p1-LAMP嵌合基因免疫的小鼠抑制了Der p1特異性Th2細(xì)胞因子的產(chǎn)生并抑制了氣管超敏反應(yīng)。體外T細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)表明pCI-LAMPss-Derp1-T/C免疫組顯示了典型的Th1表征，具有高水平的IFNγ和低水平的IL-4，而pCI-LAMPss-T/C免疫組顯示了典型的Th2表征，具有低水平的IFNγ和高水平的IL-4(圖10A)。在施用20mg/ml和40mg/ml乙酰甲膽堿之后，pCI-LAMPss-T/C免疫對照組相對于pCI-LAMP-Der p1-T/C實(shí)驗(yàn)組產(chǎn)生了統(tǒng)計學(xué)上顯著的氣管超敏反應(yīng)(圖10B；P＝0.0017&P＝0.0043)。把這些結(jié)果放到一起來看，這些結(jié)果提示了Der p1-LAMP DNA疫苗接種能夠在實(shí)驗(yàn)鼠中產(chǎn)生抗Der p1誘發(fā)的哮喘的保護(hù)性免疫。
實(shí)施例6雌性BALB/c小鼠(n＝5)在第0和第7天，以肌肉電穿孔給藥的方式免疫了50μg質(zhì)粒DNA(pVax-htpa-hDpl-LAMP)或pVax對照載體。在第14天向小鼠腹腔注射含有25μg Der p1蛋白的2mg明礬強(qiáng)化劑。從d0至d42每周從小鼠身上采血。用ELISA試驗(yàn)測定Der p1特異性的IgG2a血清(圖11)。
在另一組實(shí)驗(yàn)中，在第0天，BALB/cJ小鼠(n＝5)被喂以包含50μgpVax-htpa-hDpl-LAMP或pVax對照載體的殼聚糖-DNA膠狀物。在第14天向小鼠腹腔注射含有25μg Der p1蛋白的2mg明礬強(qiáng)化劑。從d0至d42每周從小鼠身上采血。用ELISA試驗(yàn)測定Der p1特異性的IgG2a血清(圖12)。
肌肉(圖11)或口服(圖12)免疫的小鼠產(chǎn)生了Der p1特異性IgG2a抗體。這些結(jié)果也顯示了用編碼Der p1基因的殼聚糖-DNA納米顆?？梢栽黾涌笵er p1過敏原的Th1特異性免疫應(yīng)答。
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序列表<110>新加坡國立大學(xué)<120>用于誘發(fā)抗過敏原保護(hù)性免疫應(yīng)答的重組核酸<130>92706-58<160>49<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>216<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼前導(dǎo)序列，小鼠LAMP-1穿膜和胞質(zhì)尾部的合成寡核苷酸，其中包含LAMP-1前導(dǎo)序列3′端的NheI位點(diǎn)和LAMP-1穿膜和胞質(zhì)尾部序列5′端的NdeI位點(diǎn)<400>1ctcgagccac catggccgcc cccggcgccc ggaggcccct gctcctgctg ctgctggcag 60gccttgcaca tggcgctagc gaattcccgg ggatccatat gttgatcccc attgctgtgg120gcggtgccct ggcagggctg gtcctcatcg tcctcatccc ctacctcatt ggcaggaaga180ggagtcacgc cggctatcag accatctagc ggccgc 216<210>2<211>234<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼LAMP-1前導(dǎo)序列、Blo t5基因的H-2d限制性Th表位片段和LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合基因<400>2atggccgccc ccggcgcccg gaggcccctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat 60ggcgctagcg caaaattgca agagaaaatc attccagaac ttgatgttgt ttgcgccatg120aatatgttga tccccattgc tgtgggcggt gccctggcag ggctggtcct catcgtcctc180attgcctacc tcattggcag gaagaggaat cacgccggct atcagaccat ctag 234<210>3<211>534<221>DNA
<213>人工序列<220>
<223>編碼LAMP-1前導(dǎo)序列、全長Blo t5基因產(chǎn)物和LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合基因<400>3atggccgccc ccggcgcccg gaggcccctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat 60ggcgctagcc aagagcacaa gccaaagaag gatgatttcc gaaacgaatt cgatcacttg120ttgatcgaac aggcaaacca tgctatcgaa aagggagaac atcaattgct ttacttgcaa180caccaactcg acgaattgaa tgaaaacaag agcaaggaat tgcaagagaa aatcattcga240gaacttgatg ttgtttgcgc catgatcgaa ggagcccaag gagctttgga acgtgaattg300aagcgaactg atcttaacat tttggaacga ttcaactacg aagaggctca aactctcagc360aagatcttgc ttaaggattt gaaggaaacc gaacaaaaag tgaaggatat tcaaacccaa420aatatgttga tccccattgc tgtgggcggt gccctggcag ggctggtcct catcgtcctc480atcgcctacc tcattggcag gaagaggagt cacgccggct atcagaccat ctag 534<210>4<211>426<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼LAMP-1前導(dǎo)序列和全長Blo t5基因產(chǎn)物的嵌合基因<400>4atggccgccc ccggcgcccg gaggcccctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat 60ggcgctagcc aagagcacaa gccaaagaag gatgatttcc gaaacgaatt cgatcacttg120ttgatcgaac aggcaaacca tgctatcgaa aagggagaac atcaattgct ttacttgcaa180caccaactcg acgaattgaa tgaaaacaag agcaaggaat tgcaagagaa aatcattcga240gaacttgatg ttgtttgcgc catgatcgaa ggagcccaag gagctttgga acgtgaattg300aagcgaactg atcttaacat tttggaacga ttcaactacg aagaggctca aactctcagc360aagatcttgc ttaaggattt gaaggaaacc gaacaaaaag tgaaggatat tcaaacccaa420aattaa 426<210>5<211>849<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>編碼LAMP-1前導(dǎo)序列、全長Der p1基因產(chǎn)物和LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合基因<400>5atggccgccc ccggcgcccg gaggcccctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat 60ggcgctagca ctaacgcctg cagtatcaat ggaaatgctc cagctgaaat cgatttgcga120caaatgcgaa ctgtcactcc cattcgtatg caaggaggct gtggttcatg ttgggctttc180tctggtgttg ccgcaactga atcagcttat ttggcttacc gtaatcaatc attggatctt240gctgaacaag aattagtcga ttgtgcttcc caacacggtt gtcatggtga taccattcca300cgtggtattg aatacatcca acataatggt gtcgtccaag aaagctacta tcgatacgtt360gcacgagaac aatcatgccg acgaccaaat gcacaacgtt tcggtatctc aaactattgc420caaatttacc caccaaatgt aaacaaaatt cgtgaagctt tggctcaaac ccacagcgct480attgccgtca ttattggcat caaagattta gacgcattcc gtcattatga tggccgaaca540atcattcaac gcgataatgg ttaccaacca aactatcacg ctgtcaacat tgttggttac600agtaacgcac aaggtgtcga ttattggatc gtacgaaaca gttgggatac caattggggt660gataatggtt acggttattt tgctgccaac atcgatttga tgatgattga agaatatcca720tatgttgtca ttctcaatat gttgatcccc attgctgtgg gcggtgccct ggcagggctg780gtcctcatcg tcctcatcgc ctacctcatt ggcaggaaga ggagtcacgc cggctatcag840accatctag849<210>6<211>879<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>編碼人組織纖溶酶原活化因子前導(dǎo)序列、全長Der p1基因產(chǎn)物和LAMP-1穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的嵌合基因<400>6atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60tcgcccagcc aggttggtgt gcaggacccc tgtgtcccgc ccctcaccaa cgcctgcagc120atcaacggca atgcccccgc tgagattgat ctgcgccaga tgaggaccgt gactcccatc180cgcatgcaag gcggctgcgg gtcttgttgg gccttctcag gcgtggccgc gaccgagtct240gcatacctcg cgtatcggaa tcagagcctg gacctcgctg agcaggagct cgttgactgc300gcctcccaac acggatgtca tggggatacg attcccagag gtatcgaata catccagcat360
aatggcgtcg tgcaggaaag ctattaccga tacgtagcta gggagcagtc ctgccgccgt420cctaacgccc agcgcttcgg catttccaac tattgccaga tctacccccc taatgtgaac480aagatcaggg aggccctggc gcagacgcac agcgccatcg ctgtcatcat cggaatcaag540gatctggacg cattccggca ctatgacggg cgcacaatca tccagcgcga caacggatac600cagccaaact atcacgcggt caacatcgtg ggttactcca acgcccaggg ggtggactac660tggatcgtgc ggaacagttg ggacaccaac tggggcgaca acggctacgg ctactttgcc720gccaacatcg acctgatgat gatcgaagag tacccgtacg tggtgatcct gttgatcccc780attgctgtgg gcggtgccct ggcagggctg gtcctcatcg tcctcattgc ctacctcatt840ggcaggaaga ggagtcacgc cggctatcag accatctag 879<210>7<211>26<212>PRT<213>鼠LIMP II前導(dǎo)肽<400>7Met Ala Arg Cys Cys Phe Tyr Thr Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Val Thr Ser Val Thr Leu Leu Val Ala20 25<210>8<211>46<212>PRT<213>鼠LIMP II穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>8Leu Ile Val Thr Asn Ile Pro Tyr Ile Ile Met Ala Leu Gly Val Phe1 5 10 15Phe Gly Leu Ile Phe Thr Trp Lau Ala Cys Arg Gly Gln Gly Ser Thr20 25 30Asp Glu Gly Thr Ala Asp Glu Arg Ala Pro Leu Ile Arg Thr35 40 45<210>9<211>26
<212>PRT<213>人LIMP II前導(dǎo)肽<400>9Met Gly Arg Cys Cys Phe Tyr Thr Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Val Thr Ser Val Thr Leu Leu Val Ala20 25<210>10<211>46<212>PRT<213>人LIMP II穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>10Leu Ile Ile Thr Asn Ile Pro Tyr Ile Ile Met Ala Leu Gly Val Phe1 5 10 15Phe Gly Leu Val Phe Thr Trp Leu Ala Cys Lys Gly Gln Gly Ser Met20 25 30Asp Glu Gly Thr Ala Asp Glu Arg Ala Pro Leu Ile Arg Thr35 40 45<210>11<211>26<212>PRT<213>小鼠LIMP II前導(dǎo)肽<400>11Met Gly Arg Cys Cys Phe Tyr Thr Ala Gly Thr Leu Ser Leu Leu Leu1 5 10 15Leu Val Thr Ser Val Thr Leu Leu Val Ala20 25<210>12<211>46<212>PRT<213>小鼠LIMP II穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>12Leu Val Val Thr Asn Ile Pro Tyr Ile Ile Met Ala Leu Gly Val Phe1 5 10 15
Phe Gly Leu Val Phe Thr Trp Leu Ala Cys Arg Gly Gln Gly Ser Met20 25 30Asp Glu Gly Thr Ala Asp Glu Arg Ala Pro Leu Ile Arg Thr35 40 45<210>13<211>27<212>PRT<213>人DEC-205前導(dǎo)肽<400>13Met Arg Thr Gly Trp Ala Thr Pro Arg Arg Pro Ala Gly Leu Leu Met1 5 10 15Leu Leu Phe Trp Phe Phe Asp Leu Ala Glu Pro20 25<210>14<211>56<212>PRT<213>人DEC-205穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>14Tyr Thr Ala Ile Ala Ile Ile Val Ala Thr Leu Ser Ile Leu Val Leu1 5 10 15Met Gly Gly Leu Ile Trp Phe Leu Phe Gln Arg His Arg Leu His Leu20 25 30Ala Gly Phe Ser Ser Val Arg Tyr Ala Gln Gly Val Asn Glu Asp Glu35 40 45Ile Met Leu Pro Ser Phe His Asp50 55<210>15<211>27<212>PRT<213>小鼠DEC-205前導(dǎo)肽<400>15Met Arg Thr Gly Arg Val Thr Pro Gly Leu Ala Ala Gly Leu Leu Leu
1 5 10 15Leu Leu Leu Arg Ser Phe Gly Leu Val Glu Pro20 25<210>16<211>56<212>PRT<213>小鼠DEC-205穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>16Tyr Thr Gly Ile Ala Ile Leu Phe Ala Val Leu Cys Leu Leu Gly Leu1 5 10 15Ile Ser Leu Ala Ile Trp Phe Leu Leu Gln Arg Ser His Ile Arg Trp20 25 30Thr Gly Phe Ser Ser Val Arg Tyr Glu His Gly Thr Asn Glu Asp Glu35 40 45Val Met Leu Pro Ser Phe His Asp50 55<210>17<211>41<212>PRT<213>人P-選凝素前導(dǎo)肽<400>17Met Ala Asn Cys Gln Ile Ala Ile Leu Tyr Gln Arg Phe Gln Arg Val1 5 10 15Val Phe Gly Ile Ser Gln Leu Leu Cys Phe Ser Ala Leu Ile Ser Glu20 25 30Leu Thr Asn Gln Lys Glu Val Ala Ala35 40<210>18<211>59<212>PRT<213>人P-選凝素穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>18
Leu Thr Tyr Phe Gly Gly Ala Val Ala Ser Thr Ile Gly Leu Ile Met1 5 10 15Gly Gly Thr Leu Leu Ala Leu Leu Arg Lys Arg Phe Arg Gln Lys Asp20 25 30Asp Gly Lys Cys Pro Leu Asn Pro His Ser His Leu Gly Thr Tyr Gly35 40 45Val Phe Thr Asn Ala Ala Phe Asp Pro Ser Pro50 55<210>19<211>17<212>PRT<213>人酪氨酸酶前導(dǎo)肽<400>19Met Leu Leu Ala Val Leu Tyr Cys Leu Leu Trp Ser Phe Gln Thr Ser1 5 10 15Ala<210>20<211>30<212>PRT<213>人酪氨酸酶穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>20Cys Arg His Lys Arg Lys Gln Leu Pro Glu Glu Lys Gln Pro Leu Leu1 5 10 15Met Glu Lys Glu Asp Tyr His Ser Leu Tyr Gln Ser His Leu20 25 30<210>21<211>24<212>PRT<213>人GLUT4前導(dǎo)肽<400>21Met Pro Ser Gly Phe Gln Gln Ile Gly Ser Glu Asp Gly Glu Pro Pro1 5 10 15
Gln Gln Arg Val Thr Gly Thr Leu20<210>22<211>43<212>PRT<213>人GLUT4穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>22Arg Val Pro Glu Thr Arg Gly Arg Thr Phe Asp Gln Ile Ser Ala Ala1 5 10 15Phe His Arg Thr Pro Ser Leu Leu Glu Gln Glu Val Lys Pro Ser Thr20 25 30Glu Leu Glu Tyr Leu Gly Pro Asp Glu Asn Asp35 40<210>23<211>21<212>PRT<213>鼠內(nèi)管蛋白(endotubin)前導(dǎo)肽<400>23Met Cys Leu Pro Ser Cys Leu Leu Ser Ile Trp Val Leu Phe Met Ala1 5 10 15Ala Gln Ser Leu Gly20<210>24<211>66<212>PRT<213>鼠內(nèi)管蛋白(endotubin)前導(dǎo)肽<400>24Ala Ala Pro Val Ser Val Pro Val Ala Val Gly Gly Ala Leu Leu Leu1 5 10 15Phe Leu Leu Leu Leu Gly Leu Gly Gly Trp His Trp Leu Gln Lys Gln20 25 30His Leu Pro Cys Gln Ser Thr Asp Ala Ala Ala Ser Gly Phe Asp Asn35 40 45
Ile Leu Phe Asn Ala Asp Gln Val Thr Leu Pro Glu Ser Ile Thr Ser50 55 60Asn Pro65<210>25<211>23<212>PRT<213>小鼠LAMP-1前導(dǎo)肽<400>25Met Ala Ala Pro Gly Ala Arg Arg Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala1 5 10 15Gly Leu Ala His Gly Ala Ser20<210>26<211>36<212>PRT<213>小鼠LAMP-1穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>26Met Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu1 5 10 15Ile Val Leu Ile Ala Tyr Leu Ile Gly Arg Lys Arg Ser His Ala Gly20 25 30Tyr Glu Thr Ile35<210>27<211>78<212>DNA<213>鼠LIMP II前導(dǎo)肽<400>27atggcccgat gctgcttcta cacggcgggg acactgtccc tgctgctgct ggtgaccagt60gtcacgctgc tagtggct 78<210>28
<211>141<212>DNA<213>鼠LIMP II穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>28ttgattgtca ccaacatacc ctacatcatc atggcactgg gcgtgttctt tggcttgatt 60ttcacgtggc tggcgtgtcg aggacagggg tctacggatg agggaactgc agatgaaagg120gcacccctca tacggaccta a 141<210>29<211>78<212>DNA<213>人LIMP II前導(dǎo)肽<400>29atgggccgat gctgcttcta cacggcgggg acgttgtccc tgctcctgct ggtgaccagc60gtcacgctgc tggtggcc 78<210>30<211>141<212>DNA<213>人LIMP II穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>30ttgatcatca ccaacatacc ctacatcatc atggcgctgg gtgtgttctt tggtttggtt 60tttacctggc ttgcatgcaa aggacaggga tccatggatg agggaacagc ggatgaaaga120gcacccctca ttcgaaccta a 141<210>31<211>78<212>DNA<213>小鼠LIMP II前導(dǎo)肽<400>31atgggcagat gctgcttcta cacggcgggg acgctgtctc tgctgctgct ggtgaccagc60gtcacgctgc tagtggct 78<210>32<211>141<212>DNA<213>小鼠LIMP II穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>32ttggttgtca ccaacatacc ctacatcatt atggcactgg gtgtgttctt tggcttggtt 60ttcacgtggc tggcgtgtcg aggacagggg tctatggatg agggaactgc agatgaaaga120
gcacccctca tacgaaccta a 141<210>33<211>81<212>DNA<213>人DEC-205前導(dǎo)肽<400>33atgaggacag gctgggcgac ccctcgccgc ccggcggggc tcctcatgct gctcttctgg60ttcttcgatc tcgcggagcc c 81<210>34<211>171<212>DNA<213>人DEC-205穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>34tacacagcaa tagctatcat agttgccaca ctaagtatct tagttctcat gggcggactg 60atttggttcc tcttccaaag gcaccgtttg cacctggcgg gtttctcatc agttcgatat120gcacaaggag tgaatgaaga tgagattatg cttccttctt tccatgacta a 171<210>35<211>81<212>DNA<213>小鼠DEC-205前導(dǎo)肽<400>35atgcggacgg gccgggtgac cccgggcctg gcggcggggc tactcctgct gttgctgcgg60tccttcgggc ttgtggagcc t 81<210>36<211>171<212>DNA<213>小鼠DEC-205穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>36tacacaggca tagccatcct gtttgccgtg ctgtgcctct tagggctcat cagcttggcg 60atttggttcc tcttgcaacg atcccatatc cgctggaccg gcttctcctc ggttcggtat120gaacatggaa ccaacgaaga cgaggtgatg ctcccttctt tccacgacta a 171<210>37<211>123<212>DNA<213>人P-選凝素前導(dǎo)肽
<400>37atggccaact gccaaatagc catcttgtac cagagattcc agagagtggt ctttggaatt 60tcccaactcc tttgcttcag tgccctgatc tctgaactaa caaaccagaa agaagtggca120gca 123<210>38<211>180<212>DNA<213>人P-選凝素穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>38ctgacttact ttggtggagc ggtggcttct acaataggtc tgataatggg tgggacgctc 60ctggctttgc taagaaagcg tttcagacaa aaagatgatg ggaaatgccc cttgaatcct120cacagccacc taggaacata tggagttttt acaaacgctg catttgaccc gagtccttaa180<210>39<211>51<212>DNA<213>人酪氨酸酶前導(dǎo)肽<400>39atgctcctgg ctgttttgta ctgcctgctg tggagtttcc agacctccgc t51<210>40<211>93<212>DNA<213>人酪氨酸酶穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>40tgtcgtcaca agagaaagca gcttcctgaa gaaaagcagc cactcctcat ggagaaagag60gattaccaca gcttgtatca gagccattta taa 93<210>41<211>72<212>DNA<213>人GLUT4前導(dǎo)肽<400>41atgccgtcgg gcttccaaca gataggctcc gaagatgggg aaccccctca gcagcgagtg60actgggaccc tg72<210>42<211>129<212>DNA
<213>人GLUT4穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>42gtacctgaaa ctcgaggccg gacgtttgac cagatctcag ctgccttcca ccggacaccc 60tctcttttag agcaggaggt gaaacccagc acagaacttg agtatttagg gccagatgag120aacgactga129<210>43<211>63<212>DNA<213>鼠內(nèi)管纖維蛋白(endotubin)前導(dǎo)肽<400>43atgtgcctgc ctagctgcct cctctcaatc tgggtcctat ttatggctgc acagtctcta60ggc 63<210>44<211>201<212>DNA<213>鼠內(nèi)管纖維蛋白(endotubin)穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>44gcagcacccg tgtctgtgcc ggttgcagtc ggaggagccc tcctcctctt cctgttgctc 60ctgggccttg gaggttggca ctggctgcag aagcagcacc tcccctgcca aagtacagat120gcagcagcct ctggctttga caatatcctc ttcaatgcgg atcaagttac cctcccagaa180tcaatcacca gtaacccata g 201<210>45<211>69<212>DNA<213>小鼠LAMP-1前導(dǎo)序列<400>45atggccgccc ccggcgcccg gaggcccctg ctcctgctgc tgctggcagg ccttgcacat60ggcgctagc69<210>46<211>108<212>DNA<213>小鼠LAMP-1穿膜胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域<400>46atgttgatcc ccattgctgt gggcggtgcc ctggcagggc tggtcctcat cgtcctcatc 60gcctacctca ttggcaggaa gaggagtcac gccggctatc agaccatc 108
<210>47<211>105<212>DNA<213>人組織溶酶原活化因子前導(dǎo)序列<400>47atggatgcaa tgaagagagg gctctgctgt gtgctgctgc tgtgtggagc agtcttcgtt 60tcgcccagcc aggttggtgt gcaggacccc tgtgtcccgc ccctc105<210>48<211>35<212>PRT<213>人組織溶酶原活化因子前導(dǎo)序列<400>48Met Asp Ala Met Lys Arg Gly Leu Cys Cys Val Leu Leu Leu Cys Gly1 5 10 15Ala Val Phe Val Ser Pro Ser Gln Val Gly Val Gln Asp Pro Cys Val20 25 30Pro Pro Leu3權(quán)利要求
1.一種重組核酸，其包含與編碼過敏原基因可操作相連的編碼第一信號肽的基因，其中第一信號肽介導(dǎo)過敏原進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的轉(zhuǎn)運(yùn)。
2.權(quán)利要求1所述的核酸，其為DNA。
3.權(quán)利要求1或權(quán)利要求2所述的核酸，其中第一信號肽是LAMP-1、人組織纖溶酶原活化因子、LAMP-II、DEC-205、P-選凝素、酪氨酸酶、GLUT4、內(nèi)管纖維蛋白(endotubin)或Nef蛋白的N-末端信號肽或其功能特價物。
4.權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所述的核酸，其中第一信號肽是LAMP-1或人組織纖溶酶原活化因子的N-末端信號肽或其功能特價物。
5.權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的核酸，其進(jìn)一步包含可操作相連的編碼第二信號肽的基因，其中第二信號肽把過敏原靶向至核內(nèi)體或溶酶體。
6.權(quán)利要求5所述的核酸，其中第二信號肽是LAMP-1、人組織纖溶酶原活化因子、LAMP-II、DEC-205、P-選凝素、酪氨酸酶、GLUT4、內(nèi)管纖維蛋白(endotubin)或Nef蛋白的C-末端溶酶體或核內(nèi)體靶向序列或其功能特價物。
7.權(quán)利要求6所述的核酸，其中第二信號肽是LAMP-1的穿膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
8.權(quán)利要求1至7任一項(xiàng)所述的核酸，其編碼過敏原Blot5、Blot1、Derp1或Derp2、Derp3、Derf1、Derf2、Derf3、其T輔助細(xì)胞表位、或其包含一個或多個T輔助細(xì)胞表位的抗原片段或功能特價物。
9.權(quán)利要求1至8任一項(xiàng)所述的核酸，其包含SEQ ID NO3、SEQID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6或SEQ ID NO7的序列。
10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述的核酸，其為質(zhì)粒。
11.權(quán)利要求1至10任一項(xiàng)所述的核酸，其進(jìn)一步包含可操作相連的啟動子。
12.權(quán)利要求11所述的核酸，其中啟動子是人CMV啟動子。
13.權(quán)利要求11或12所述的核酸，其為表達(dá)載體。
14.一種包含如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述重組核酸的疫苗。
15.一種包含如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述重組核酸的組合物及藥學(xué)上可接受的載體或稀釋劑。
16.一種抗過敏原的免疫方法，其包括在第一階段向患者施用如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的重組核酸；并在第二階段向患者施用過敏原。
17.權(quán)利要求16所述的方法，其中過敏原與佐劑一起聯(lián)合給藥。
18.權(quán)利要求16或17所述的方法，其中在第一階段施用核酸一段時間從而足以誘導(dǎo)出患者的長期免疫記憶。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中在第一階段施用多劑核酸約一年以上。
20.權(quán)利要求16至19任一項(xiàng)所述的方法，其包括用腹腔給藥并隨后用噴霧劑的方式向患者施用過敏原。
21.權(quán)利要求16至20任一項(xiàng)所述的方法，其中在第一階段口服施用核酸。
22.權(quán)利要求22所述的方法，其包括施用包含核酸的殼聚糖納米顆粒。
23.權(quán)利要求16至20任一項(xiàng)所述的方法，其中通過肌肉或皮下注射來施用核酸。
24.一種抗過敏原的免疫方法，其包括在第一階段向患者施用包含可表達(dá)過敏原的基因的核酸約一年以上從而誘導(dǎo)出患者的長期免疫記憶；并在第二階段向患者施用過敏原。
25.一種治療或預(yù)防患者過敏反應(yīng)的方法，其包括向患者施用如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的重組核酸。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中口服或通過肌肉或皮下注射來施用核酸。
27.權(quán)利要求25或26所述的方法，其中過敏反應(yīng)是哮喘或鼻炎。
28.如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的重組核酸在抗過敏原免疫中的應(yīng)用。
29.如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的重組核酸在制備抗過敏原免疫藥物中的應(yīng)用。
30.如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的重組核酸在治療或預(yù)防過敏反應(yīng)中的應(yīng)用。
31.如權(quán)利要求1至13任一項(xiàng)所述的重組核酸在制備治療或預(yù)防過敏反應(yīng)藥物中的應(yīng)用。
32.如權(quán)利要求30或31所述的應(yīng)用，其中過敏反應(yīng)是哮喘或鼻炎。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于誘發(fā)抗過敏原保護(hù)性免疫應(yīng)答的重組核酸。該重組核酸編碼一個過敏原和一個介導(dǎo)過敏原轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的信號肽，并且還優(yōu)選編碼一個把基因靶向至核內(nèi)體或溶酶體的第二信號肽。該重組核酸，在向患者施用時，能誘發(fā)Th 1型免疫并且抑制IgE產(chǎn)生，因此可以用于預(yù)防和治療過敏反應(yīng)。因此在許多方面，本發(fā)明還提供一種包含該重組核酸的疫苗和免疫原組合物。
文檔編號C07K14/435GK1705492SQ03824754
公開日2005年12月7日 申請日期2003年8月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月29日
發(fā)明者蔡考圓, 劉立人 申請人:新加坡國立大學(xué)