專利名稱：抑制蛋白質(zhì)和酶活性的具有配位的雙(二苯基膦)二茂鐵配體的環(huán)鈀化合物和相關(guān)的疾病 ...的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有雙二苯基膦-二茂鐵配位配體的環(huán)鈀化合物和其類似物，其作為肽和酶的活性抑制劑，這些肽和酶包括絲氨酸肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和肽鏈內(nèi)切酶家族，其中的一些是惡性腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移路線所必需的。通過(guò)作用于這些酶并參與DNA分子的插入，這些化合物調(diào)控免疫系統(tǒng)。
本發(fā)明的基礎(chǔ)在制藥領(lǐng)域，研究者特別關(guān)注無(wú)機(jī)化學(xué)的研究，因?yàn)槠湓谥委熞幌盗屑膊》矫娴挠猛颈葌鹘y(tǒng)藥物具有明顯的優(yōu)點(diǎn)。
得到最佳研究的無(wú)機(jī)藥物是順鉑，一種臨床用來(lái)治療許多種腫瘤的藥物。人們相信，其是以與DNA發(fā)生相互作用而抑制腫瘤細(xì)胞的增生的方式而發(fā)揮作用的(Lippard，Science 2181075-1082(1982)；Rosenberg，Nature 222385(1969)；Cleare等，Bioinorg.Chem.2187(1973))。這種化合物能有效地對(duì)抗不同種腫瘤，具有高細(xì)胞毒性，并廣泛地作用于正常細(xì)胞(Ebert，U.，Loffler，H.，Kirch，W.，Pharmacology & Therapeutics，74(2)207-2201997；Spencer C.M.，Goa K.L.，Drugs，50(6)1001-1031 DEC 1995)。
基于金的復(fù)合體已用于治療關(guān)節(jié)炎，其作用路徑包括與蛋白質(zhì)硫醇基團(tuán)連接，從而抑制使其變性的二硫鍵橋(disulphite bridges)出現(xiàn)。
鈷的金屬?gòu)?fù)合體也已指出具有抗病毒、抗腫瘤和抗微生物活性及抗炎癥屬性。
能夠改變或連接蛋白質(zhì)的功能性位點(diǎn)，從而使其生物活性喪失的金屬化合物在美國(guó)專利No.5,880,149中有描述。該文獻(xiàn)公開(kāi)了一些鈀復(fù)合體(屬于配位化合物)，作為半胱氨酸蛋白酶的不可逆性抑制劑，作為有效的抗腫瘤藥物和作為對(duì)大量感染過(guò)程非常有效的藥物，其中涉及到半胱氨酸蛋白酶的作用路徑。例如，我們提到鈀復(fù)合體對(duì)組織蛋白酶(Cathepsins)B、H、J、L、N、S、T和C及對(duì)白介素轉(zhuǎn)化酶(白介素Converter Enzyme，ICE)的酶抑制作用，從而組成對(duì)抗阿米巴病、錐蟲(chóng)病和利什曼病的活性藥物。該美國(guó)專利是已發(fā)表的關(guān)于抗腫瘤藥物，包括化學(xué)元素鈀化合物的作用的產(chǎn)生和路徑的最新成果。
本發(fā)明的公開(kāi)本發(fā)明提供了改良了的鈀復(fù)合體(屬于有機(jī)金屬化合物家族)，其含有δC-PD鍵和配位鍵Y→Pd，形成有機(jī)環(huán)，因而將這些化合物命名為環(huán)鈀，也稱為鈀環(huán)。
本發(fā)明所涵蓋的上述化合物可以用如下示意
圖1的通式A、B或C定義
示意圖1 其中-X代表選自下列的元素鹵素(Cl、F、Br、I)；擬鹵素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根；和-Y代表選自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3雜化的碳原子，其與鈀原子共價(jià)連接。含有C、Y和D的所示的環(huán)可以由三到八個(gè)原子組成。
-C和Y之間，用曲線表示，具有連續(xù)的原子形成環(huán)鈀的環(huán)，由三到八個(gè)原子組成，包括鈀原子。典型地，非限制性地，所述原子選自碳、氮、氧或硫。另一方面，構(gòu)成該環(huán)的每一個(gè)原子與其它原子或基團(tuán)相連，形成該環(huán)的可變外部結(jié)構(gòu)，線狀或環(huán)狀，本申請(qǐng)人對(duì)此不作特別限制。
-L代表配位配體，其是來(lái)源于元素周期表V組(N、P、As、Sb、Bi)的供體原子(donating atom)，位于雙二苯基膦-二茂鐵化合物中，具體如下示意圖2所示，所示存在的L-L表明在所述的雙二苯基膦-二茂鐵化合物中存在兩個(gè)連接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分別代表了下列基團(tuán)，可以任何順序出現(xiàn)氫(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羥基(OH)、氨基(-NH2)、亞胺基、鹵素(F、Cl、Br、I)、亞氨基、硝基(-NO2)。
示意圖2 依據(jù)用于合成的雙二苯基膦-二茂鐵配體的比例及溶劑的比例，可以產(chǎn)生單核分子化合物(結(jié)構(gòu)1A，單齒環(huán)鈀化合物)、單核離子(結(jié)構(gòu)1B，鰲合的雙齒環(huán)鈀化合物)和雙核分子(結(jié)構(gòu)1C，橋狀的雙齒環(huán)鈀化合物)。當(dāng)使用2mol的雙齒(bidentade)配體L-L與1mol的起始復(fù)合物時(shí)產(chǎn)生結(jié)構(gòu)1A和1B的化合物，當(dāng)使用的比例是1∶1時(shí)，獲得結(jié)構(gòu)1C所示的化合物。
在本申請(qǐng)中，[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]代表示意圖1A的具有單齒dppf配體的單核分子鈀復(fù)合物，[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]代表示意圖1B的以dppf連接子作為雙齒鰲合劑的離子型單核鈀復(fù)合物，[Pd2(C2，N-R+dmpa)2(μ-dppf)Cl2]顯示了以dppf連接子作為橋狀雙齒連接子的雙核分子鈀復(fù)合物。
在本發(fā)明的特定具體實(shí)施方案中，所獲得環(huán)鈀化合物如示意圖3和4所示，分別來(lái)源于N，N-二甲基-芐胺(示意圖3)和炔，即嘧啶基-苯基-乙炔(示意圖4A)和1-苯基-3-N，N二甲胺-丙炔(propine)(示意圖4B)。
示意圖3 示意圖4
本發(fā)明的更特定的具體實(shí)施方案是N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)，下面的示意圖5由N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)-對(duì)映異構(gòu)體R(+)和對(duì)映異構(gòu)體S(-)形成的環(huán)金屬環(huán)。
示意圖5 僅作為說(shuō)明，上文示意圖3至5所示顯示了環(huán)鈀環(huán)，其應(yīng)該理解為下面示意圖6所解釋的構(gòu)象(以示意圖3的結(jié)構(gòu)為例)示意圖6
在這個(gè)圖中，所述環(huán)鈀環(huán)含有5個(gè)原子，如A1至A5所示，如前文所述方式連接，即-碳原子(A1)通過(guò)δ鍵與鈀(A5)連接；-氮原子(A4，在通式中一般定義為Y)通過(guò)共價(jià)的供體成鍵與鈀(A5)連接；-原子A2是碳，其還與A1一起是環(huán)鈀環(huán)“外部”苯環(huán)的一部分；-氮原子A4與環(huán)鈀環(huán)“外部”的兩個(gè)乙基連接；-原子A3是另一碳原子，其與環(huán)鈀環(huán)“外部”的兩個(gè)氫原子連接；-鈀，即原子A5，與雙二苯基膦-二茂鐵連接，其中R1至R12是氫原子；-示意圖6的點(diǎn)部分表明了與鈀一起形成環(huán)鈀環(huán)的原子。
作為對(duì)所述例子的補(bǔ)充，所述的環(huán)鈀化合物與1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵配體一起在某一情況下可以產(chǎn)生如下所示的復(fù)合結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明獲得大量的環(huán)鈀化合物，特別是來(lái)源于用(dmpa)表示的有機(jī)化合物N，N-二甲基-1-苯乙胺(三乙胺)的對(duì)映異構(gòu)體R(+)和S(-)的化合物，其在其結(jié)構(gòu)中含有配位的配體1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵。這些化合物作為用來(lái)治療許多疾病的藥物具有許多優(yōu)點(diǎn)。
這是因?yàn)樗龅幕衔锞哂幸种泼负偷鞍踪|(zhì)的能力，該酶和蛋白質(zhì)包括屬于半胱氨酸蛋白酶(組織蛋白酶B)和絲氨酸肽酶(脯氨?；央拿?家族的酶和蛋白質(zhì)以及血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)和組織蛋白酶D。環(huán)鈀復(fù)合體形式的這些酶和蛋白質(zhì)的抑制劑以前沒(méi)有描述，雖然該復(fù)合物是用已知的方法合成，但是含有雙二苯基膦-二茂鐵配體的這種化合物是全新的。
本發(fā)明的所述化合物對(duì)酶或蛋白質(zhì)的作用路徑主要以可逆的形式發(fā)生，尤其是對(duì)酶底物復(fù)合體。這種可逆性意味著給藥時(shí)的低毒性和不良副作用的減少，而不會(huì)影響其藥物效果。
所述環(huán)鈀復(fù)合體對(duì)大量酶都表現(xiàn)出抑制效果，如屬于組織蛋白酶B、脯氨?；央拿讣易濉⒔M織蛋白酶D和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的酶，因而這些化合物具有免疫調(diào)節(jié)屬性。抑制和免疫調(diào)節(jié)效果使待研究的環(huán)鈀化合物具有抗轉(zhuǎn)移、抗血管生成的屬性并參與細(xì)胞的凋亡，從而使它們成為藥物，特別是治療與這些蛋白有關(guān)的疾病，更特別地是治療實(shí)體或腹水惡性腫瘤(血液和淋巴系統(tǒng))的藥物。
對(duì)甲狀腺癌至今還沒(méi)有特別的化學(xué)治療藥物，本發(fā)明的環(huán)鈀化合物是對(duì)抗甲狀腺癌、成神經(jīng)細(xì)胞瘤的藥物。這主要是因?yàn)榄h(huán)鈀化合物與免疫系統(tǒng)間的干擾，導(dǎo)致抑制組織蛋白酶D和保護(hù)骨髓細(xì)胞的能力喪失。這些性質(zhì)使本發(fā)明所述的化合物具有免疫學(xué)保護(hù)作用以對(duì)抗放射療法治療中產(chǎn)生的不需要的次級(jí)效果。
附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明圖1顯示了所述環(huán)鈀化合物對(duì)組織蛋白酶B的活性的影響；圖2A和2B分別顯示了CD光譜/與DNA分子相互作用；圖3顯示了在未接受治療測(cè)試動(dòng)物中的Walker’s腫瘤(10天)；圖4顯示了沒(méi)有腫瘤痕跡(Walker’s腫瘤)的接受治療的測(cè)試動(dòng)物(10天)；圖5顯示了具有Walker’s腫瘤(10天)的測(cè)試動(dòng)物，其中右邊的沒(méi)有接受治療(12g腫瘤塊)，左邊的接受了局部治療(2g腫瘤塊)；圖6顯示了具有Ehrlich腹水瘤的動(dòng)物的壽命，其中該動(dòng)物用1mg/kg化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]或[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)(N3)2]連續(xù)治療4天。用腫瘤細(xì)胞(1×106細(xì)胞/ml)接種該動(dòng)物，并在所述步驟后72小時(shí)開(kāi)始用所研究的化合物治療(p＜0.05Kaplan-Meier，Cox-Mantel)；圖7顯示了粘附在長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)物上清中的細(xì)胞數(shù)目，該培養(yǎng)物加入1mg/kg的環(huán)鈀化合物[Pd(C2N-(S-dmpa)(dppf)Cl]。除去非粘附細(xì)胞并每周計(jì)數(shù)(P＜0.05 ANOVA，Tukey)；圖8顯示了粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞(CFU-GM)的造血細(xì)胞前體的數(shù)量，其從來(lái)自正常動(dòng)物的骨髓細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)物的上清中獲得，該動(dòng)物用1mg/kg的環(huán)鈀化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl)]處理。每周除去非粘附細(xì)胞，測(cè)定CFU-GM的數(shù)量(P＜0.05 ANOVA，Tukey)；
圖9顯示了來(lái)自正常動(dòng)物的骨髓細(xì)胞的長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)物的粘附細(xì)胞的數(shù)量，該動(dòng)物每周用1mg/kg的環(huán)鈀化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl)]處理。在培養(yǎng)的最后(第9周)除去粘附細(xì)胞(P＜0.05-Wilcoxon)；圖10顯示了HL60細(xì)胞的細(xì)胞壽命延長(zhǎng)百分率，其用不同環(huán)鈀化合物培養(yǎng)72小時(shí)；圖11顯示了K-562細(xì)胞的細(xì)胞壽命延長(zhǎng)百分率，其用不同環(huán)鈀化合物培養(yǎng)72小時(shí)；圖12顯示了HL60細(xì)胞的形態(tài)，其與環(huán)鈀化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl)]一起培養(yǎng)72小時(shí)。有可能可以清楚地觀察到凋亡細(xì)胞，如核片斷和形成固縮核(picnotic nuclei)(著色Harry’shematoxyline-400×放大率)；圖13顯示了所述環(huán)鈀化合物的細(xì)胞毒性作用；圖14顯示了10uM環(huán)鈀化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性；圖15顯示了30uM環(huán)鈀化合物的體內(nèi)抗腫瘤活性；圖16顯示了藥品1的化合物類似物的體內(nèi)抗腫瘤活性，其如今含有功能炔作為環(huán)狀金屬。
對(duì)半胱氨酸蛋白酶的抑制效果組織蛋白酶B半胱氨酸蛋白酶包括在其活性位點(diǎn)具有巰基(-SH)的酶家族，它們夠通過(guò)活性位點(diǎn)中的特定半胱氨酸和組氨酸間的協(xié)同交互反應(yīng)而以已知的方式切斷酰胺鍵(美國(guó)專利No.5,880,149)。在具有四個(gè)或多個(gè)超級(jí)家族的細(xì)菌、病毒、真核微生物、植物和動(dòng)物中能發(fā)現(xiàn)這些蛋白。本發(fā)明所述的環(huán)鈀化合物對(duì)組織蛋白酶B的抑制作用被首先指出是這些化合物顯示出抗腫瘤活性的主要原因。但是，本發(fā)明化合物的活性并不限于這種半胱氨酸蛋白酶，他們作為藥物的用途也不限于對(duì)抗癌癥。
本說(shuō)明書(shū)所描述的環(huán)鈀化合物是下列半胱氨酸蛋白酶的活性抑制劑組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉(zhuǎn)化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內(nèi)切酶、腺病毒肽鏈內(nèi)切酶和口瘡病毒(aphthovirus)肽鏈內(nèi)切酶，和寄生蟲(chóng)生命周期所必須的蛋白酶，如來(lái)自變形蟲(chóng)、阿米巴、盤(pán)尾絲蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、線蟲(chóng)、網(wǎng)柄菌、Therilerium、血吸蟲(chóng)和錐蟲(chóng)種(克氏錐蟲(chóng)，這些酶也稱作cruzain或cruzipain)的蛋白酶。Rawlings等(J.Biochem.290205-218，1993)和Sajid M.等(Molecular and Biochem.Parasitology，120(1)1-21，2002)給出了這些化合物可以抑制的所有半胱氨酸蛋白酶。
因此，環(huán)鈀化合物作為藥物的用途涉及很大的范圍。具體來(lái)說(shuō)，其作為抑制劑對(duì)組織蛋白酶B、L、S、Cruzaine和白介素-1β轉(zhuǎn)化酶發(fā)揮作用。這些酶是溶酶體蛋白酶，與組織退化所導(dǎo)致的許多疾病過(guò)程有關(guān)。這些疾病包括關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲(chóng)造成的骨質(zhì)感染、牙周疾病和腫瘤轉(zhuǎn)移等。
JBC中公開(kāi)的Schotte等的工作(VOL.276，N°24，Issue of June15，pp.21153-21157，2001)證實(shí)了組織蛋白酶B抑制劑在轉(zhuǎn)錄水平防止白介素-1α、白介素-1β和腫瘤壞死因子的產(chǎn)生。由于基因表達(dá)，其也與核因子κB(NF-κB)的轉(zhuǎn)錄激活潛能的抑制有關(guān)。因此，對(duì)組織蛋白酶B和NF-κB表現(xiàn)出抑制活性的環(huán)鈀化合物形成治療大量炎性疾病如支氣管炎、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕、骨質(zhì)疏松、急性胰腺炎和癌擴(kuò)散的藥物。
對(duì)絲氨酸肽酶的抑制效果脯氨酰基-寡肽酶脯氨?；?寡肽酶組成了一個(gè)屬于絲氨酸肽酶集團(tuán)的酶家族，其不能水解30個(gè)以上殘基的肽。這組酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨?；?肽酶和寡肽酶B及原型(prototype)脯氨?；?寡肽酶。最近測(cè)試脯氨?；?寡肽酶(80kDa)的晶體結(jié)構(gòu)表明該酶具有一個(gè)肽酶決定基和折疊的α/β水解酶，其催化三元體由一具有不常見(jiàn)的含有七個(gè)側(cè)頁(yè)(blade)的β折疊結(jié)構(gòu)的中間通道組成，該通道即作為大肽過(guò)濾器的決定基。這個(gè)家族的酶抑制劑是研制新藥的重要來(lái)源，因?yàn)楦滨；?寡肽酶與大量的失調(diào)如健忘癥，調(diào)節(jié)憂郁癥和血壓有關(guān)，并作為重要的分子伴侶發(fā)揮跨內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和線粒體膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的作用(Sharova，E.I.；Russian Joumal of Plant Physiology，49(2)，255，2002)。
二肽基-肽酶IV與糖尿病有關(guān)，寡肽酶-B與錐蟲(chóng)病有關(guān)(PolgarL.，Cellular and Molecular Life Sciences，59(2)，349-62，2002and Folop，V.等，Cell，94(2)，161-70，1998)。另外，在Psychoneuroendocrinology，26(1)，17-26，2001中Maes，M.等證實(shí)了該酶與食物性失調(diào)、暴食癥和厭食癥有關(guān)。脯氨?；?寡肽酶(PEP)和二肽基-肽酶IV(DPP IV)在酒精中毒中的活性也得到證實(shí)，對(duì)于生產(chǎn)細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體如白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆(GM-CSF)的生長(zhǎng)刺激因子，PEP和DPPIV濃度的降低使這些因子的產(chǎn)量增加(Maes，M.等，Alcohol，17(1)，1-6，1999)。這些酶在人體中的高活性還與心理壓力有關(guān)，參照Maes，M.和其同伴的Psychoneuroendocrinology，23(5)，485-495，1998。
DPP IV，也稱作CD26、EC 3.4.14.5，是糖蛋白受體，具有多種特征，包括細(xì)胞粘附、通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì)的細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)子和在T細(xì)胞激活過(guò)程中的潛在的共刺激因子。由于它是肽鏈外切酶，因此其是調(diào)節(jié)激素肽的代謝的關(guān)鍵。其中，這些酶的選擇性抑制已經(jīng)用于治療II型糖尿病，在其中該酶參與復(fù)雜的調(diào)控循環(huán)，如Hildebrandt與其同伴在Clinical Science，99(2)，93-104，2000中的描述。
一回顧性工作表明了DPP IV的屬性和其抑制劑的藥物潛能(Augustyns，K.；Bal，G.；Thonus，G.；Belyaev，A.等，Current MedicinalChemistry，6(4)，311-327，1999)，證明了其作為白細(xì)胞CD26的抗原的特征和其對(duì)新底物胰高血糖素化學(xué)因子的作用。該工作還討論了其抑制劑對(duì)抗HIV病毒(AIDS)感染的藥物學(xué)潛能和它們與免疫系統(tǒng)的相互關(guān)系。
在另一方面，Joyeau和其同伴證明了特定的脯氨?；?寡肽酶Tc80是克氏錐蟲(chóng)代謝所必需的，其抑制劑是對(duì)抗查格斯氏病(Chagasdisease)的潛在藥物(European Journal of Medicinal Chemistry，35(2)，257-266，2000)。
寡肽酶B是在革蘭氏陰性細(xì)菌和錐體蟲(chóng)中發(fā)現(xiàn)的絲氨酸肽酶新家族中的一員(Juhasz，T.；Szeltner，Z.；Renner，V.；Polgar，L.，Biochemistry，4(12)，4096-4106，2002)。布魯氏錐蟲(chóng)含有絲氨酸寡肽酶(OP-TB)，在非洲錐體蟲(chóng)(Tripanosoma africana)感染期間由宿主釋放到血液中(Morty，R.E.；Lonsdale-Eccles，J.D.；Morehead，J.等，Journal of Biological Chemistry，274(37)，26149-156，1999)。
中性肽酶也具有血管緊張素II的調(diào)節(jié)屬性(Maric，C.；Walther，T.，F(xiàn)ASEB JOURNAL，16(4)，A93，Part 1，2002)，此類酶日益明顯地表現(xiàn)出所描述的ACE的性質(zhì)及其與免疫調(diào)節(jié)的關(guān)系。(Inguimbert，N.等；Journal of Medicinal Chemistry，45(7)，1477，2002)。
組織蛋白酶D組織蛋白酶D是酸性肽鏈內(nèi)切酶，其是乳癌的先兆因子(Kraimps，J.L.，Metaye，T.，Millet，C.，Margerit，D.，Ingrand，P.，Goujon，J.M.，Levillain，P.，Babin，P.，Begon，F(xiàn).，Barbier，J.，Surgery1995 Dec.，118(6)1036-40)，在骨髓癌和甲狀腺腫瘤中高濃度表達(dá)(Holm，R.，Hoie，J.，Kaalhus，O.，Nesland，J.M.，Virchows Arch1995；427(3)289-94)。組織蛋白酶D位于腫瘤和正常細(xì)胞中，分別地，其在癌細(xì)胞、腺瘤和嚴(yán)重的甲狀腺疾病中比在正常細(xì)胞中具有更高的活性(Metaye，T.，Kraimps，J.L.，Goujon，J.M.，F(xiàn)ernandez，B.，Quellard，N.，Ingrand，P.，Barbier，J.，Begon，F(xiàn).，J.Clin.Endocrinol.Metab.1997 Oct；82(10)3383-8)。組織蛋白酶B和L在皮膚癌(黑素瘤和神經(jīng)瘤)中活性很高，組織蛋白酶D僅在黑素瘤中高水平表達(dá)，相反，組織蛋白酶H與損傷的侵入潛能有關(guān)(Frohlich，E.，Schlagenhauff，B.，Mohrle，M.，Weber，E.，Klessen，C.，Rassner，G.，Cancer，2001Mar 1；91(5)972-82)。組織蛋白酶D、nm23、EGFR和LR(通過(guò)免疫組織化學(xué)方法檢測(cè))是陰性瘤乳癌轉(zhuǎn)移擴(kuò)散距離的潛在標(biāo)記，其中前三個(gè)酶的結(jié)合是更有把握的方法(Niu，Y.，F(xiàn)u，X.，Lv，A.，F(xiàn)an，Y.，Wang，Y.，Int J.Cancer，2002Apr 10；98(5)754-60)。免疫組織化學(xué)表明癌細(xì)胞表達(dá)的組織蛋白酶D與胃和腸腫瘤侵入的深度相關(guān)聯(lián)(Ikeguchi，M.，F(xiàn)ukuda，K.，Oka，S.，Yamaguchi，K.，Hisamitsu，K.，Tsujitani，S.，Sakatani，T.，Ueda，T.，Kaibara，N.，Oncology 2001；61(1)71-8)。根據(jù)免疫組織化學(xué)分析，在食道癌細(xì)胞中組織蛋白酶D的表達(dá)與蛋白p53的表達(dá)相關(guān)聯(lián)。在發(fā)聲食道(sound gullet)細(xì)胞中檢測(cè)不到組織蛋白酶D。很明顯，組織蛋白酶D的高度表達(dá)與所述腫瘤的侵入性生長(zhǎng)有關(guān)系(Ikeguchi，M.，Sakatani，T.，Ueta，T.，F(xiàn)ukuda，K.，Oka，S.，Hisamitsu，K.，Yamaguchi，K.，Tsujitani，S.，Kaibara，N.，J.Clin.Pathol.2002Feb；55(2)121-6)。通過(guò)人組織蛋白酶D的表達(dá)載體在乳癌中的轉(zhuǎn)移對(duì)大鼠進(jìn)行檢測(cè)表明，組織蛋白酶D與腫瘤的轉(zhuǎn)移過(guò)程直接相關(guān)。該酶的抑制劑，其中含有待研究的環(huán)鈀化合物，直接影響腫瘤轉(zhuǎn)移的減少和抑制(Marcel Garcia，Nadine Platet，Emmanuelle Liaudet，Volerie Laurent，Danielle Derocq，Jean-Paul Brouille，HenriRochefort，Stem Cells 1996；14642-650)。
本發(fā)明的鈀化合物是組織蛋白酶D的有效抑制劑，在劑量1-10ug時(shí)還是甲狀腺腫瘤的有效抑制劑。對(duì)這些腫瘤的三個(gè)細(xì)胞系WRO、NPA、ARO進(jìn)行研究，結(jié)果表明本說(shuō)明書(shū)所描述的化合物可以用于制備抗腫瘤的藥物，所述腫瘤在實(shí)踐中不能通過(guò)化學(xué)治療藥物治療。該環(huán)鈀化合物的免疫調(diào)節(jié)作用、抑制進(jìn)入細(xì)胞分裂(S期)的幼骨髓細(xì)胞的作用使這些可能的藥物化合物可以用來(lái)聯(lián)合治療甲狀腺腫瘤，包括放射治療及抑制不需要的副作用，如白血病。
已經(jīng)證實(shí)用酶抑制劑抑制溶酶體蛋白酶導(dǎo)致神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞死亡(Castino，R.，Pace，D.，Demoz，M.，Gargiulo，M.，Ariatta，C.，Raiteri，E.，Isidoro，C.，Int J.Cancer 2002 Feb 20；97(6)775-9)。在這一方面，本發(fā)明的環(huán)鈀化合物對(duì)于治療這種癌癥提供了一個(gè)選擇，主要是在兒童中，在其中，該化合物是非常有效的，不存在使用已知化合物所產(chǎn)生的問(wèn)題。
對(duì)金屬蛋白酶的抑制效果血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)
血管緊張素轉(zhuǎn)化酶是金屬蛋白酶組的一部分，在其一個(gè)位點(diǎn)中含有鋅，與血管緊張素I向血管緊張素II的轉(zhuǎn)化有關(guān)。該酶有兩個(gè)決定基，命名為決定基C和決定基N，即其有兩個(gè)活性中心。血管緊張素II誘導(dǎo)造血系統(tǒng)(HPC)中的祖細(xì)胞增生，而血管緊張素I抑制該增生。另外，乙?；?N-Ser-Asp-Lys-Pro(AcSDKP)肽也是該ECA酶的底物，其是造血系統(tǒng)母細(xì)胞增生的調(diào)節(jié)子。
在文獻(xiàn)中我們能找到大量的有關(guān)這些底物(血管緊張素I、血管緊張素II和肽AcSDKP)在調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)方面的效果和路徑的報(bào)道，如下文所述 Chisi等(Inhibitory Action of the PeptideAcSDKP...，Stem Cells 1997；15455-460)描述了組合使用AcSDKP與合適的ACE抑制劑來(lái)體外調(diào)節(jié)造血細(xì)胞增生。在巰甲脯氨酸(Captopryl)，一種有效的ACE抑制劑存在的情況下，所述肽AcDSKP的作用明顯抑制了該幼細(xì)胞的循環(huán)，其對(duì)該酶的活性位點(diǎn)N產(chǎn)生了作用。
在另一文章中，Chisi(Captopryl Inhibits TheProliferation of Hematopoietic Stem and progenitorCells...，Stem Cells 1999；17339-344)也揭露了用ACE抑制劑治療高血壓可能會(huì)導(dǎo)致全血細(xì)胞減少(pancitopeny)，但該原因仍不清楚。研究表明巰甲脯氨酸對(duì)骨髓細(xì)胞并不具有毒性，但其減少S階段巨噬細(xì)胞的比例。這些結(jié)果表明巰甲脯氨酸導(dǎo)致骨髓抑制(mielosuppression)。
Azizi等(Angiotensin I-converting Enzyme...，Clin.Exp.Pharmacol.Physiol.2001 Dec；28(12)1066-9)描述了AcSDKP在體外被ACE水解，其是該酶活性位點(diǎn)的N末端的優(yōu)選底物，但也是天然肽，該肽在體內(nèi)被ACE活性位點(diǎn)的N末端水解。于是，ACE能通過(guò)永久地降解在S階段細(xì)胞中循環(huán)的天然抑制劑而調(diào)節(jié)造血。該次瞵酸肽(phosphinic peptide)RXP407(ACE的N決定基的體外選擇性抑制劑)并不影響血壓調(diào)節(jié)。
Aidoudi和其同伴(The Tetrapeptide AcSDKPReduces...，Int.J.Hematol.1998 Aug；68(2)145-55)測(cè)試了在用低劑量的胞核嘧啶阿拉伯糖苷(Ara-C)處理過(guò)的鼠中CFU-MK和CFU-GM祖細(xì)胞中的AcSDKP保護(hù)作用，包括體內(nèi)和體外。這表明了在開(kāi)始用Ara-C處理之前給藥AcSDKP，第一次注射Ara-C之后6到8天之間，CFU-GM、CFU-MK和MK成熟細(xì)胞數(shù)量出現(xiàn)明顯增加。結(jié)果表明在Ara-C處理期間AcSDKP對(duì)祖細(xì)胞具有保護(hù)作用。
Rousseau-Plasse(Lisinopryl，an angiotensinI-converting Enzyme Inhibitor...Exp.Hematol.1998 Oct；26(11)1074-9)報(bào)道了向人口服給藥ACE抑制劑增加了血漿中的AcSDKP濃度。通過(guò)放射對(duì)lisinopryl在鼠造血細(xì)胞S階段的增生階段的體內(nèi)效果進(jìn)行研究，放射后1小時(shí)用lisinopryl給藥。由于AcSDKP的內(nèi)源血漿水平升高，因此100％的ACE鼠血漿活性受到抑制。
Li等(Production and Consumption Of theTetrapeptide AcSDKP...，Exp.Hematol.1997 Feb；25(2)140-6)利用長(zhǎng)期骨髓培養(yǎng)(LTMC)分析了在AcSDKP代謝中人細(xì)胞微環(huán)境的作用。獲得的結(jié)果表明巨噬細(xì)胞在上清中合成并釋放AcSDKP；基質(zhì)細(xì)胞的該肽遭ACE降解和細(xì)胞外基質(zhì)和LTMC的成分起到儲(chǔ)存該肽的作用。
在檢測(cè)本發(fā)明的化合物在長(zhǎng)效液態(tài)培養(yǎng)系統(tǒng)中的效果(延長(zhǎng)體外暴露時(shí)間)，即檢測(cè)該化合物對(duì)負(fù)責(zé)維持幼骨髓細(xì)胞(干細(xì)胞)的骨髓基質(zhì)(由成纖維細(xì)胞、脂信號(hào)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞等形成)形成的效果時(shí)，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照相比較，延長(zhǎng)對(duì)這些化合物的暴露時(shí)間，特別是含有配位配體1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵的化合物，如通式A和B所示，的暴露時(shí)間，會(huì)明顯增加骨髓基質(zhì)的粘附細(xì)胞。另一方面，發(fā)現(xiàn)在液體培養(yǎng)基上清中非粘附細(xì)胞數(shù)目的減少，且從這些培養(yǎng)基上清中獲得的細(xì)胞克隆(CRU-GM)數(shù)目減少。使用抑制血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的藥物，如巰甲脯氨酸觀察到這種反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。上述這些研究表明這種藥物抑制ACE，并增加四肽AcSDKP(ACE的底物)的濃度，該AcSDKP由骨髓基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生并抑制骨髓中的全能細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞循環(huán)。這個(gè)事實(shí)是特別有利的，因?yàn)榛瘜W(xué)治療性藥物在細(xì)胞循環(huán)的S階段(DNA合成)發(fā)生顯著作用，其不僅作用于惡性細(xì)胞，而且還作用于來(lái)自迅速更新組織，如骨髓的細(xì)胞。所述環(huán)鈀化合物所產(chǎn)生的該短暫的細(xì)胞循環(huán)中斷與骨髓細(xì)胞的更高保護(hù)相關(guān)聯(lián)，從而對(duì)抗常規(guī)化學(xué)治療的髓毒性作用。
本發(fā)明的所述化合物是免疫調(diào)節(jié)子，因?yàn)楣撬杓?xì)胞增生(粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)的可逆性減少與噬菌細(xì)胞的活性降低和巨噬細(xì)胞釋放的白介素-1減少及相應(yīng)的淋巴細(xì)胞刺激的減少有關(guān)，另外，所述的刺激還參與自體免疫疾病的進(jìn)程，因此，本發(fā)明所述的化合物可以用作免疫抑制劑。
途徑本發(fā)明中化合物的作用途徑主要以可逆方式發(fā)生，因此具有低細(xì)胞毒性且不良副作用減少。
不考慮與之相關(guān)的理論方面，酶的抑制途徑可以用包含[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)]X型二齒dppf配體的離子化環(huán)鈀復(fù)合物為例進(jìn)行解釋。首先，二膦連接中的磷原子與離子Pd(II)間的配位鍵發(fā)生斷裂，同時(shí)與溶劑分子DMSO配位生成復(fù)合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X。同樣地包含DMSO的復(fù)合物(或其他配位溶劑，如二甲基甲酰胺、嘧啶、THF及其他)還可以通過(guò)[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)X]分子型的環(huán)鈀復(fù)合物形成，其中溶液中的X-離子遷移到金屬配位層的外面。對(duì)于含有[Pd2(C2，N-dmpa)2(dppf)2X2]型橋式dpf連接的環(huán)鈀復(fù)合物，該復(fù)合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X很可能是由于環(huán)鈀復(fù)合物在DMSO溶液中缺乏穩(wěn)定性而在DMSO/水的混合溶液中發(fā)生部分降解形成的。該復(fù)合物在DMSO中溶解數(shù)分鐘后生成Pd(0)使此事實(shí)進(jìn)一步清晰化。[Pd2(C2，N-dmpa)2(μ-dppf)2(N3)2]的硝基甲烷溶液在加入若干滴DMSO后，其在25℃的摩爾電導(dǎo)率從9.3S.cm2增加到60S.cm2。
接下來(lái)，通過(guò)斷開(kāi)配位鍵N-Pd并與新的DMSO分子配位，所述復(fù)合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X可能會(huì)生成復(fù)合物[Pd(C2-dmpa)(dppf)(DMSO)2]X。溶液中最終生成的該有機(jī)金屬分子最有可能是酶作用的抑制劑。
鑒于游離的dppf配體和由其它類型的二膦配體形成的其他復(fù)合物均不能抑制酶活性的事實(shí)，我們可以得出結(jié)論酶活抑制現(xiàn)象極大地依賴于dppf二膦配體以及鈀復(fù)合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)。在此方式中，我們認(rèn)為溶液中產(chǎn)生的有機(jī)金屬抑制劑，即復(fù)合物[Pd(C2，N-dmpa)(dppf)(DMSO)]X，與四面體中間復(fù)合物之間達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，該中間復(fù)合體由巰基咪唑離子對(duì)與底物聚合形成。此反應(yīng)的發(fā)生需要該復(fù)合物中存在的兩個(gè)金屬中心(Pd、Fe)的參與。在此模型中，高密度的帶負(fù)電荷的?；鶊F(tuán)與離子Pd(II)相互作用，同時(shí)取代DMSO分子并與半胱氨酸中高度活化的硫原子配位。另一方面，該硫原子與dppf配體中的鐵原子相互作用。溶液中各物質(zhì)之間的平衡產(chǎn)生可逆抑制途徑。
本發(fā)明涉及作為蛋白質(zhì)活性抑制，特別是酶抑制劑的環(huán)鈀化合物，該化合物含有雙二苯基膦-二茂鐵連接或其它由相同的磷基團(tuán)作為供體原子的類似連接。這些化合物通過(guò)對(duì)相關(guān)酶產(chǎn)生作用以及插入DNA分子而調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。
在特定的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及的化合物可抑制屬于絲氨酸肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶以及肽鏈內(nèi)切酶家族的酶的活性。
在本發(fā)明的其它具體實(shí)施方案中，由本發(fā)明所揭露的化合物抑制的半胱氨酸蛋白酶是組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基肽酶-I)，白介素轉(zhuǎn)化酶(ICE)，鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶(Calpaine)I和II，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內(nèi)切酶，腺病毒肽鏈內(nèi)切酶和口瘡病毒肽鏈內(nèi)切酶，以及寄生蟲(chóng)生命周期中必需的蛋白酶，如來(lái)自變形蟲(chóng)、阿米巴蟲(chóng)、盤(pán)尾絲蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、線蟲(chóng)、網(wǎng)柄菌、Therilerium、血吸蟲(chóng)和錐蟲(chóng)(T.cruzi，該酶也被稱為cruzaine或cruzipain)種中的蛋白酶。
在本發(fā)明更特定的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物抑制的半胱氨酸蛋白酶為組織蛋白酶B，Cruzipain和白介素-1β轉(zhuǎn)化酶。
在更特定的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物抑制的絲氨酸肽酶包括二肽基肽酶IV，酰氨?；?acylaminacyl)肽酶，寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶。
在本發(fā)明更特定的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物抑制的金屬蛋白酶是血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)。四類基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)，即膠原酶，基質(zhì)裂解素(Stromelisines)，膜型(membrane-type)金屬蛋白酶和Genatinases可以由本發(fā)明中的化合物抑制。因此，本發(fā)明中的化合物可有效地治療引起髓鞘(mieline)退化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥，包括多發(fā)性硬化癥以及自身免疫性腦脊髓炎(Cuzner，M.L.，Opdenakker，G；Journal of Neuroimmunology；94，1-14，1999)。
在另一特定的具體實(shí)施方案中，本發(fā)明的化合物抑制的肽鏈內(nèi)切酶是組織蛋白酶D。腦啡肽酶(Encephalinase)或肽鏈內(nèi)切酶24.11同樣受到所述化合物的抑制。因此，所述化合物可用于與心房利鈉因子(ANF)降解有關(guān)的心臟疾病。Varin，J.，Duboc，D.，Weber，S.，F(xiàn)ouchard，J.，Schwartz，J.C.，Muffatjoly，M.，Guerin，F(xiàn)；ArchivesDes Maladies Du Coeur Et Des Vaisseaux；84，1465-1471，1991。
在特定的具體實(shí)施方案中，可采用本發(fā)明中的化合物治療的疾病包括由于組織退化造成的疾病如關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomerulonephrithis)、寄生蟲(chóng)造成的骨質(zhì)感染、parasitomies、牙周病和腫瘤轉(zhuǎn)移及其他；心房利鈉因子的降解有關(guān)的心臟疾??；炎性疾病如支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、急性胰腺炎和癌擴(kuò)散；失調(diào)如健忘癥，抑郁癥和血壓的調(diào)控；糖尿病，錐蟲(chóng)病，查格斯氏病，食物性失調(diào)，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體如白介素-6(IL-6)、腫瘤死亡因子α(TNF-α)、干擾素-γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆的生長(zhǎng)促進(jìn)因子(GM-CSF)的產(chǎn)生有關(guān)的疾病相關(guān)的疾病，心理緊張，對(duì)抗HIV病毒(AIDS)引起的感染；引起髓鞘(mieline)退化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病，包括多發(fā)性硬化癥以及自身免疫性腦脊髓炎(Encephalomielitis)。除了參與與免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)有關(guān)的ACE抑制外，本發(fā)明的化合物還調(diào)節(jié)造血系統(tǒng)母細(xì)胞的增殖并顯著抑制幼細(xì)胞周期，缺乏骨髓抑制的高血壓。本發(fā)明所公開(kāi)的環(huán)鈀化合物的作用可抑制腫瘤的入侵性生長(zhǎng)，比如乳房，骨髓，腺瘤，甲狀腺，黑素瘤，胃，腸，食道以及甲狀腺腫瘤。在甲狀腺癌的治療中，當(dāng)與放射性治療同時(shí)運(yùn)用時(shí)，環(huán)鈀化合物可抑制不良副作用，比如白血病。環(huán)鈀化合物也可用于對(duì)抗成神經(jīng)細(xì)胞瘤。所述環(huán)鈀化合物在惡性腫瘤的治療中體現(xiàn)出抗血管生長(zhǎng)和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的性質(zhì)。
通過(guò)對(duì)酶作用和參予插入DNA分子，這些化合物調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，因此不僅可以組成有效的主要用以對(duì)抗惡性腫瘤的抗腫瘤制劑，也可以作為其他組織退化相關(guān)疾病，炎癥過(guò)程引起的疾病和/或由病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)引起的疾病，自身免疫性疾病，糖尿病，健忘癥，神經(jīng)和食物性紊亂，壓力過(guò)大，酒精中毒和高血壓以及其他疾病治療中的活性成分。除了作為免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑具有高度有效性外，本發(fā)明藥品可在低濃度下發(fā)揮作用，細(xì)胞毒性低，且在癌癥特定病例的治療中呈現(xiàn)抗血管生長(zhǎng)和抗腫瘤轉(zhuǎn)移的性質(zhì)。
合成本發(fā)明的鈀復(fù)合物含有疊氮基團(tuán)(N3-)，合成復(fù)合物以在紅外區(qū)構(gòu)成一個(gè)“光譜探針”，用以對(duì)復(fù)合物的離子或分子特征，其單核或二核性質(zhì)進(jìn)行更準(zhǔn)確的結(jié)構(gòu)描述。該基團(tuán)在2040-2060CM-1區(qū)間(非對(duì)稱性伸展)和1400-1500CM-1區(qū)間(對(duì)稱性伸展)IV內(nèi)具有正常的振動(dòng)模式，，從而實(shí)現(xiàn)所述屬性。盡管此類化合物作為抗腫瘤劑和酶抑制劑具有生物效果，但由于它們呈現(xiàn)出的不良細(xì)胞毒性和副作用，影響細(xì)胞呼吸周期，因此此類化合物不用作藥品的最合適化合物。對(duì)于所有合成的含有疊氮基團(tuán)的復(fù)合物，所獲的含氯離子(Cl-)的類似物不呈現(xiàn)所述的次級(jí)效應(yīng)，可組成具有同等活性的藥物。
上述化合物的合成在常溫下進(jìn)行，所用試劑為從商業(yè)供應(yīng)商處購(gòu)買的高純度試劑，不需要進(jìn)一步純化。元素分析在IQ-USP-SP-Brazil分析中心完成。FT-IR光譜用Perkin-Elmer Spectrum-One分光光度計(jì)在4000-400cm-1范圍內(nèi)測(cè)定用片狀KBr樣品獲取。1H和31P{1H}NMR譜由多核光譜儀Bruker Avance DPX-300分別于300和81MHz處獲取。質(zhì)子NMR數(shù)據(jù)以ppm標(biāo)記，采用0.00ppm的TMS作為參照。31P{1H}的化學(xué)置換以H3PO4為參照測(cè)量。所有的NMR測(cè)量在溶劑CDCl3中進(jìn)行。復(fù)合物摩爾電導(dǎo)率以硝基甲烷為溶劑，用電導(dǎo)儀Metrohmmod.712測(cè)量。實(shí)施例1中說(shuō)明了起始復(fù)合物。本發(fā)明的特定具體實(shí)施方案可在起始復(fù)合物的制備和進(jìn)一步的實(shí)施例中得到說(shuō)明。
用二膦配體制備復(fù)合物從實(shí)施例1中描述的起始復(fù)合物出發(fā)，根據(jù)本發(fā)明的特定具體實(shí)施方案，通過(guò)與1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵(dPPf)進(jìn)行反應(yīng)，可合成大量的環(huán)鈀復(fù)合物。生成的產(chǎn)物決定于所用的化學(xué)計(jì)量比以及溶劑。分離得到的分子和離子復(fù)合物含有1或2個(gè)金屬中心，并含有單齒或二齒的與鈀離子(II)配位的二膦配體。
一般流程含有[Pd(C2，N-dmpa)(L)]X(L＝二齒配體)型螯合的二膦配體的離子化合物通過(guò)起始環(huán)鈀復(fù)合物與二膦連接(L-L)反應(yīng)合成。二膦連接與相應(yīng)的鈀復(fù)合物之間的摩爾比為2∶1。因此，將0.2mmol的環(huán)鈀化合物二聚體部分溶解于錐形瓶中的50ml丙酮中。隨后，將0.4mmol(L-L)加入所得到的懸浮液中。在室溫下持續(xù)搖晃混合溶液1小時(shí)。終溶液的溶劑在近干燥壓力下蒸發(fā)，加入正己烷使生成的固體沉淀析出。該固體隨即用乙醚洗滌，在真空中干燥。
含有[Pd(C2，N-dmpa)(L)X](L＝單齒配體)型的二膦單齒配體的分子化合物以二氯甲烷為溶劑，用類似流程合成。
含有[Pd2(C2，N-dmpa)2(μ-L)X2](L＝橋式二膦連接子)型的橋式二膦連接的二核環(huán)鈀復(fù)合物的合成以二氯甲烷為溶劑，二膦連接子和相應(yīng)的鈀復(fù)合物的摩爾比為1∶1。本發(fā)明的所述優(yōu)選具體實(shí)施方案在實(shí)施例2至4中予以說(shuō)明。
化合物和酶的相互作用組織蛋白酶B和木瓜蛋白酶由Calbiochem Co.公司提供，酶活濃度用半胱氨酸蛋白酶抑制劑E-64通過(guò)滴定(titulation)來(lái)測(cè)定。組織蛋白酶B和木瓜蛋白酶于4℃保存于含有10μM的MMTS的50mM醋酸鈉緩沖液(pH5.0)中。熒光底物氨甲基香豆基Z-PHE-ARG-MCA，Tripsin和不可逆木瓜蛋白酶抑制劑E-64由Sigma公司提供。
有機(jī)金屬化合物對(duì)肽鏈內(nèi)切酶組織蛋白酶B活性的影響運(yùn)用熒光底物Z-Phe-Arg-MCA，由熒光分光光度計(jì)測(cè)定。此肽為組織蛋白酶B的優(yōu)選底物，Kcat/Ks＝4.5×105M-1.s-1，其中的苯丙氨酸和精氨酸分別落在P2和P1位。該底物覆蓋了與木瓜蛋白酶類似半胱氨酸蛋白酶的主要連接位點(diǎn)S2，S1和S1’(Turk，D.et al，Revised definition ofsubstrate binding sites of papain-like cysteine proteases，J.Biol.Chem.；1998，379，137-147)。
熒光信號(hào)的強(qiáng)度由可控溫的熒光分光光度計(jì)Hitachi F-2000檢測(cè)。校準(zhǔn)激發(fā)波長(zhǎng)為380nm，發(fā)射波長(zhǎng)為440nm。將酶置于含有200mMNaCl，1mM EDTA和2mM DTT的50mM磷酸鈉緩沖液中(pH6.4)中，于37℃放置5分鐘活化。測(cè)量在組織蛋白酶B的相同活化緩沖液中進(jìn)行，動(dòng)力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)通過(guò)在不同濃度有機(jī)金屬化合物存在或不存在的情況下，測(cè)量不同濃度的底物的起始水解速率來(lái)確立。其結(jié)果采用軟件GraFit 3.01進(jìn)行非線性回歸分析(Erithacus Software Ltd.)。
圖解1的動(dòng)力學(xué)模型描述了肝磷脂對(duì)組織蛋白酶B水解Z-Phe-Arg-MCA的影響。
圖解1 其中，S代表底物Z-Phe-Arg-MCA；I代表環(huán)化金屬化合物；E代表組織蛋白酶B；Ks代表底物的解離常數(shù)；KI代表有機(jī)金屬的表觀解離常數(shù)；α是Ks的干擾系數(shù)(disturbance standard)；β是Vmax(Kcat)的干擾系數(shù)，這些干擾系數(shù)與下列等式中的一致
v=Vmax.[S]Ks(1+[I]KI)(1+β.[I]α.KI)+[S](1+[I]α.KI)(1+β.[I]α.KI)]]>動(dòng)力學(xué)研究針對(duì)環(huán)鈀復(fù)合物[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)N3]進(jìn)行。如圖1A所示，在組織蛋白酶B的動(dòng)力學(xué)測(cè)試中有機(jī)金屬的存在導(dǎo)致Z-Phe-Arg-MCA水解Kcat值減小。另一方面，圖1B顯示化合物同時(shí)顯著提高了組織蛋白酶B和底物Z-Phe-Arg-MCA的親和力。該有機(jī)金屬對(duì)肽鏈內(nèi)切酶組織蛋白酶B的作用可描述為如圖解1所示的抑制標(biāo)準(zhǔn)的一混合性雙曲線。該底物水解系統(tǒng)的效率可通過(guò)改變Ks(參數(shù)α)或Vmax(參數(shù)β)而改變。數(shù)據(jù)根據(jù)等式1進(jìn)行非線性回歸處理，計(jì)算常數(shù)值。結(jié)果顯示[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3與組織蛋白酶B(E)結(jié)合，其解離常數(shù)KH＝12±1μM，該化合物與酶-底物復(fù)合物(ES)結(jié)合，其解離常數(shù)為αKH＝2.4±0.3μM。該復(fù)合物還誘導(dǎo)組織蛋白酶B和底物Z-Phe-Arg-MCA的親和力提高了5.3倍；在有機(jī)金屬化合物存在的情況下，Ks值從110±15降低到21±2μM，α＝0.19±0.02(圖1B)，同時(shí)Kcat值在存在[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3的情況下也降低了5.6倍，β＝0.18±0.02。該環(huán)鈀化合物降低產(chǎn)物形成常數(shù)至36(β＝0.18±0.02)，同時(shí)以相同比例提高組織蛋白酶B與底物Z-Phe-Arg-MCA的親和力(a＝0.19±0.02)，即a＝β。盡管有機(jī)金屬?gòu)?fù)合物強(qiáng)有力地抑制了組織蛋白酶B(81％抑制率)，但它的存在并不改變酶對(duì)底物的催化效率，β/α＝1.1±0.1。二級(jí)底物的水解效率在[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3存在或不存在的情況下不變，Kcat/Ks＝4.5×105M-1.S-1。
從屬于木瓜蛋白酶超級(jí)家族的組織蛋白酶B和其它半胱氨酸蛋白酶有著高度保守的折疊結(jié)構(gòu)(Turk，V.；Bode，W.，Lysosomal cysteineProteinases and their inhibitors cystatins.Innovations inProteases and their Inhibitors.Aviles，F(xiàn).X.(編)，Walter deGruyter & Co.，Berlin，Germany，1993)。這些酶與肽鏈底物相連通過(guò)巰基咪唑離子對(duì)實(shí)現(xiàn)其蛋白質(zhì)水解活性。半胱氨酸殘基和組氨酸之間的關(guān)聯(lián)保證了對(duì)半胱氨酸活性位點(diǎn)處的高度親核性(Michaud，S；Gour，B.J.，Cathepsin B inhibitors as potential anti-metastaticagents.Exp.Opin.Patents.，1998，8，645-672)。底物酰氨連接斷裂的同時(shí)形成酰基酶中間體。在形成米氏非共價(jià)復(fù)合物后，活性位點(diǎn)的巰基攻擊肽鏈生成氧化陰離子，該離子在所謂的由谷氨酰胺殘基形成的“氧化陰離子通道”中穩(wěn)定。該四面體中間體的解體生成?；福尫懦霎a(chǎn)物。隨后，?；杆馍纱呋x子對(duì)，釋放出新的產(chǎn)物，即羧酸。實(shí)施例5以本發(fā)明化合物的方式顯示了酶活抑制分析。
這些結(jié)果證實(shí)了有關(guān)本發(fā)明化合物的作用的聲明，特別是在酶-底物復(fù)合物中的可逆作用。
化合物和DNA的相互作用(插入)
通過(guò)運(yùn)用圓二色性技術(shù)進(jìn)行研究(圖2)表明環(huán)鈀化合物引起DNA分子的結(jié)構(gòu)變化，該變化具有時(shí)間和藥物濃度依賴性。這表明這些變化與細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期調(diào)控過(guò)程有關(guān)。
抗腫瘤效應(yīng)本發(fā)明中的化合物在體內(nèi)模型中進(jìn)行了測(cè)試，采用大鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，用Walker-256乳房腫瘤，即″Walker’s腫瘤″作為實(shí)體的、入侵的、轉(zhuǎn)移性的腫瘤的模型，對(duì)這些模型上述化合物顯示出了很強(qiáng)的活性。實(shí)施例6和圖3、4和5顯示了實(shí)驗(yàn)及所獲得的結(jié)果。
我們注意到化合物除了抑制腫瘤生長(zhǎng)外，在90％的病例中成功地逆轉(zhuǎn)了腫瘤的生長(zhǎng)。對(duì)上述Walker’s腫瘤，在體內(nèi)模型中，上述化合物體現(xiàn)出對(duì)腫瘤細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒性，而在將藥物施加到正常組織上時(shí)未出現(xiàn)任何慢性炎癥信號(hào)。該化合物的另一個(gè)重要作用是其在細(xì)胞培養(yǎng)中對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，說(shuō)明其重要的抗血管生長(zhǎng)的作用。該化合物在體內(nèi)模型中還顯示了對(duì)組織蛋白酶B和組織蛋白酶D強(qiáng)大的抑制作用，使其成為有效的抗轉(zhuǎn)移試劑，避免了腫瘤在骨骼肌中的轉(zhuǎn)移。
值得強(qiáng)調(diào)的是，在所有的動(dòng)物治療試驗(yàn)中均未發(fā)現(xiàn)任何副作用，這顯示了藥物高度專一性。以下的圖3，4和5顯示了所獲得的一部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
對(duì)免疫系統(tǒng)的效果
Ehrlich’s腹水性腫瘤(Ehrlich’s Ascitic Tumor)(EAT)為了觀察本發(fā)明的化合物對(duì)接受治療的動(dòng)物可能產(chǎn)生的保護(hù)作用，對(duì)于接受或未接受治療的患有Ehrlich’s腹水性腫瘤的動(dòng)物，繪制壽命曲線。
運(yùn)用Kaplan-Meier壽命曲線對(duì)存活率進(jìn)行分析。組間對(duì)比(腫瘤患者vs.腫瘤患者/接受治療)通過(guò)Log-Rank法-非常系數(shù)程序(non-parametrical procedures)(Cox-Mantel)進(jìn)行。用ANOVA偏差分析對(duì)各組進(jìn)行分析。差異明顯時(shí)，采用Tukey’s測(cè)試。對(duì)于兩組樣品數(shù)目較少的情況，采用Wilcoxon’s非常系數(shù)測(cè)試。
實(shí)施例7和圖6所示的測(cè)試顯示用本發(fā)明的化合物進(jìn)行動(dòng)物治療可延長(zhǎng)患有Ehrlich’s腹水性腫瘤的動(dòng)物壽命，這表明這類藥可以干擾腫瘤的升級(jí)。
毒性小鼠骨髓造血細(xì)胞前體(CFU-C)的克隆培養(yǎng)按照示意圖C(一般結(jié)構(gòu))及在實(shí)施例8中說(shuō)明的流程，在對(duì)動(dòng)物骨髓粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的造血前體(CFU-GM)連續(xù)4天用以1∶2的結(jié)構(gòu)含有1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵配體的環(huán)鈀化合物治療后，對(duì)其數(shù)目進(jìn)行測(cè)定，1mg/kg的劑量被證實(shí)沒(méi)有骨髓毒性。因?yàn)楹蛯?duì)照組比較，接受治療的動(dòng)物的骨髓粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的造血前體(CFU-GM)的數(shù)量沒(méi)有顯示出顯著的差異，因而證明該劑量對(duì)骨髓沒(méi)有毒性。相同的劑量在體外試驗(yàn)中得到了相似的結(jié)果(將所述化合物和正常動(dòng)物細(xì)胞一起培育)。另一方面，當(dāng)劑量高于5mg/L時(shí)，導(dǎo)致劑量依賴性CFU-GM的數(shù)量減少，這表明化合物對(duì)骨髓效應(yīng)是劑量依賴的。
在長(zhǎng)效液體培養(yǎng)系統(tǒng)中骨髓基質(zhì)的形成按照示意圖C(一般結(jié)構(gòu))以及可以用來(lái)評(píng)估化合物在骨髓基質(zhì)形成中的效果的實(shí)施例9所示的程序，在長(zhǎng)效液體培養(yǎng)系統(tǒng)中檢測(cè)以1∶2的結(jié)構(gòu)含有1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵配體的環(huán)鈀化合物的效果，我們證實(shí)了延長(zhǎng)細(xì)胞暴露于化合物的時(shí)間可以同時(shí)減少液體培養(yǎng)基上清液中的非粘附細(xì)胞的數(shù)量(圖7)和從這些培養(yǎng)的上清液中可以獲得的細(xì)胞克隆數(shù)(圖8)。另一方面，和對(duì)照相比，在環(huán)鈀產(chǎn)物存在的情況下，骨髓基質(zhì)中的粘附細(xì)胞的數(shù)量有了顯著的增加(圖9)。此反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)在使用抑制血管緊張縮素轉(zhuǎn)化酶(ECA)的藥物，如巰甲脯氨酸時(shí)也可觀察到，該藥物抑制骨髓全能細(xì)胞(干細(xì)胞)進(jìn)入細(xì)胞周期。因此，暫時(shí)性地中斷細(xì)胞周期可能與更好地保護(hù)骨髓細(xì)胞免受化療產(chǎn)生的骨髓毒性作用有關(guān)系。
考慮到示意圖C(一般結(jié)構(gòu))的以1∶2的結(jié)構(gòu)含有1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵配體的環(huán)鈀化合物是一個(gè)ECA的抑制劑，以及考慮到在長(zhǎng)效液體培養(yǎng)系統(tǒng)中的骨髓基質(zhì)的形成的相關(guān)結(jié)果，比如粘附細(xì)胞的增加與母細(xì)胞克隆CFU-GM的減少的有關(guān)聯(lián)，這表明藥物即使在低濃度(1mg/kg)下仍具有抑制幼骨髓細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的能力。
由于可逆地減少骨髓細(xì)胞(粒細(xì)胞和噬菌細(xì)胞)增殖與降低噬菌細(xì)胞活性和減少由噬菌細(xì)胞釋放的白介素-1有關(guān)，進(jìn)而與淋巴細(xì)胞刺激的減少有關(guān)，該淋巴刺激與自身免疫性疾病的升級(jí)有關(guān)，因而這些結(jié)果還說(shuō)明本發(fā)明的化合物是免疫調(diào)節(jié)劑。因此本發(fā)明的化合物可用作免疫抑制劑。
這些結(jié)果證實(shí)的另一個(gè)方面是骨髓基質(zhì)中的很多群落呈現(xiàn)微紅的特征，意味著所述化合物對(duì)微紅系列具有刺激活性，該刺激源于鐵的存在，鐵可以干擾細(xì)胞的新陳代謝。
急性毒性的檢測(cè)通過(guò)進(jìn)行固定劑量試驗(yàn)，本研究中使用的本發(fā)明的環(huán)鈀化合物濃度得以確定。在該試驗(yàn)中，將待檢測(cè)物質(zhì)以特定劑量施予小鼠，該特定劑量是根據(jù)法規(guī)部門的分類選擇的預(yù)定劑量，其最高濃度不得超過(guò)2000mg/kg。相比LD50試驗(yàn)，該固定劑量試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)在于該試驗(yàn)中的評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)并不需要?jiǎng)游锼劳?，因此用于每次試?yàn)的動(dòng)物的數(shù)量以及其承受的痛苦可以達(dá)到最小化(Barros & Davino，1996)。
給藥之后緊接14天的觀察期。在急性毒性的癥狀出現(xiàn)時(shí)，如毛發(fā)、黏膜和皮膚的變化，以及腹瀉和抽搐的發(fā)生，結(jié)膜炎，騷動(dòng)或動(dòng)作遲緩出現(xiàn)時(shí)所用的劑量用來(lái)對(duì)被測(cè)材料進(jìn)行分級(jí)和分類。
依照實(shí)施例10所示方案獲得的結(jié)果顯示，由對(duì)映異構(gòu)體S(-)dmpa和配體dppf以1∶1或1∶2的比例按照結(jié)構(gòu)A，B和C(一般結(jié)構(gòu))生成的環(huán)鈀化合物分別在劑量增加到500和200mg/kg時(shí)仍沒(méi)有急性毒性，這標(biāo)志著它們的低毒潛力以及隨后副作用的較低發(fā)生率。由于目前市場(chǎng)上可用藥品的系統(tǒng)毒性時(shí)常在個(gè)人化療的初始階段致死，因此本結(jié)果特別具有意義。
對(duì)白血病株HL-60和K-562的體外細(xì)胞毒性和原癌基因BCL-2的表達(dá)細(xì)胞毒性評(píng)估采用MTT-四唑還原法進(jìn)行(二苯基四唑3-(4，5-二甲噻唑-2-基-2，5-溴))，該方法可通過(guò)線粒體氧化還原系統(tǒng)對(duì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞毒性進(jìn)行評(píng)估。在該方法中，四唑通過(guò)活細(xì)胞還原，形成甲臢(Formazan)鹽，可溶解該鹽(Mosmman，1983)，以通過(guò)ELISA在560nm處讀取。
根據(jù)實(shí)施例11所示的試驗(yàn)所得到的結(jié)果，我們用兩種相似化合物所獲得的結(jié)果(圖10和11)證明了所述環(huán)鈀化合物在兩細(xì)胞株中都具有細(xì)胞毒性。結(jié)果顯示這些藥物為抗白血病藥，因?yàn)樵囼?yàn)所用的細(xì)胞株代表了對(duì)目前市場(chǎng)上提供的化學(xué)治療性藥物具有很強(qiáng)的耐受性的細(xì)胞。此外，其中的一個(gè)被測(cè)定的化合物，由對(duì)映異構(gòu)體S(-)dmpa和配位配體dppf按照結(jié)構(gòu)A(一般結(jié)構(gòu))以1∶2的比例合成的環(huán)鈀化合物，在12.5μg/ml的劑量下可以減少原癌基因bcl-2在白血病細(xì)胞HL60中的表達(dá)。鑒于bcl-2的大量表達(dá)會(huì)干擾細(xì)胞程序性死亡或凋亡進(jìn)而干擾細(xì)胞對(duì)化療的反應(yīng)過(guò)程，因而該結(jié)果表明該藥可誘導(dǎo)白血病細(xì)胞凋亡。當(dāng)測(cè)試細(xì)胞在接受含疊氮基的化合物治療后其形態(tài)學(xué)方面的變化時(shí)，觀察到大量細(xì)胞的死亡(玻片上有破碎的細(xì)胞膜和細(xì)胞碎片)，這表明含疊氮的化合物會(huì)干擾氧化代謝過(guò)程。這與急性毒性研究中的結(jié)果一致。另一方面，接受環(huán)鈀化合物治療的白血病細(xì)胞HL60的形態(tài)學(xué)特征如圖12所示表現(xiàn)為細(xì)胞的程序性死亡或細(xì)胞凋亡。
黑素瘤的生物學(xué)分析在體外生物學(xué)分析中，將鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10-Nex2與環(huán)鈀化合物共同培養(yǎng)24小時(shí)以證實(shí)藥物的細(xì)胞毒效應(yīng)。體內(nèi)分析在母鼠C57BI/6中進(jìn)行，在其皮下植入105腫瘤細(xì)胞。在腫瘤植入后，用10μM的環(huán)鈀化合物每周3次進(jìn)行腹膜腔內(nèi)注射治療。
試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)實(shí)施例12和圖13、14、15和16。
細(xì)胞培養(yǎng)分析甲狀腺腫瘤甲狀腺腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行分析，該細(xì)胞培養(yǎng)物來(lái)源于細(xì)胞株WRO、NPA和ARO。[Pd(C2，N-(S(-)dmpa)(L)X]型的分子化合物對(duì)細(xì)胞株WRO、NPA、ARO的抑制劑量(IC50)分別為0.48μg、0.59μg、0.60μg?；衔颷Pd2(C2，N-(S(-)dmpa)2(μ-L)X2]呈現(xiàn)相似的抑制劑量(IC50)。由對(duì)映異構(gòu)體R(+)dmpa合成的環(huán)鈀化合物類似物得到以下的抑制劑量(IC50)細(xì)胞株WRO為5.56μg，NPA為6.04μg，ARO為7.57μg。我們同樣觀察到對(duì)于[Pd2(C2，N-(R(+)dmpa)2(μ-L)X2]型化合物抑制劑量沒(méi)有顯著變化。所獲的結(jié)果清楚地顯示R(+)對(duì)映異構(gòu)體的抑制劑量(IC50)比S(-)對(duì)映異構(gòu)體高出10倍。該事實(shí)表明，由該化合物引起的細(xì)胞毒性過(guò)程具有對(duì)映體選擇依賴性，同時(shí)顯示結(jié)構(gòu)中含有S(-)dmpa異構(gòu)體的化合物具有更高的效率。
所得結(jié)果顯示這些化合物可成功地用于甲狀腺腫瘤的治療。此類腫瘤屬于過(guò)量表達(dá)組織蛋白酶D且目前尚沒(méi)有專一有效的化學(xué)療法對(duì)其進(jìn)行治療的腫瘤。如果我們考慮到本發(fā)明的鈀復(fù)合物如同所證明的那樣可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)，那么這些復(fù)合物對(duì)所述疾病的對(duì)抗能力甚至?xí)?。這意味著，除了給治療這類腫瘤帶來(lái)希望外，在此呈現(xiàn)的環(huán)鈀化合物還可以成為放療中的重要輔助藥用以抑制許多不良副作用，如白血病，脫發(fā)和對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的破壞。
本發(fā)明中的環(huán)鈀化合物，特別是由N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)和配位配體1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵(dppf)合成的R(+)和S(-)對(duì)映異體構(gòu)形式的環(huán)鈀化合物，其呈現(xiàn)出顯著的抗癌潛力，特別是對(duì)白血病株和一些黑素瘤株，該化合物可以使細(xì)胞進(jìn)入凋亡程序。
本發(fā)明中的化合物顯示出低毒潛力和副作用的低發(fā)生率。我們證實(shí)，和絕大部分具有骨髓毒性的化學(xué)療法相反，本發(fā)明中的化合物沒(méi)有骨髓毒性跡象。結(jié)果顯示這些藥物對(duì)造血功能具有作用，該作用是劑量依賴性的。在低劑量下，該環(huán)鈀化合物比傳統(tǒng)的化學(xué)療法對(duì)正常細(xì)胞產(chǎn)生的毒性低。
在測(cè)定此藥對(duì)長(zhǎng)效液體培養(yǎng)系統(tǒng)的效果時(shí)，得到用藥物抑制血管緊張縮素轉(zhuǎn)化酶(ACE)觀察到的反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)，因此產(chǎn)生細(xì)胞周期的暫時(shí)性干擾，于是更好地保護(hù)骨髓細(xì)胞對(duì)抗由傳統(tǒng)化療造成的骨髓毒性效應(yīng)。
這些結(jié)果還顯示出了本發(fā)明的化合物作為免疫調(diào)節(jié)劑和免疫抑制劑的活性。
在同樣的測(cè)定中，我們證實(shí)了骨髓基質(zhì)細(xì)胞群微紅系列呈現(xiàn)出的特征，這表明藥物對(duì)微紅系列可能存在刺激活性。
劑量與配方為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，所述受體是動(dòng)物或人，特別是人。
本發(fā)明中的環(huán)鈀化合物和含有至少一種本發(fā)明的化合物的組合物可以通過(guò)口服方式，注射方式，特別是腹膜腔注射方式，以本領(lǐng)域公知的藥物學(xué)上可接受的劑量給藥。在特定的具體實(shí)施方案中，該化合物以及含有本發(fā)明的化合物的組合物作為注射劑提供，其不會(huì)被消化系統(tǒng)改變。
該活性成分可以以固態(tài)劑型提供，如干粉，顆粒，片劑或膠囊，或以液態(tài)劑型提供，如糖漿或水懸浮劑。本發(fā)明的化合物的給藥還可以通過(guò)但不局限于諸如口服、皮下、靜脈內(nèi)，鼻腔、跨皮膚、腹腔內(nèi)、局部、肌肉內(nèi)、肺內(nèi)、陰道、直腸、眼部或舌下方式進(jìn)行。在某些情況下，該化合物可以局部地應(yīng)用，如通過(guò)噴霧或溶液應(yīng)用。
該活性成分可以以獨(dú)立的形式給藥，但通常與藥物載體一同給藥。本發(fā)明的目標(biāo)包括含有至少一種當(dāng)前所揭示的環(huán)鈀化合物的組合物。Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Publishing中提供了檢測(cè)藥物劑型有用方法。
本發(fā)明中的化合物和基于這些化合物的組合物可以以口服劑型給藥，如片劑、膠囊(每種分別包括定時(shí)釋放或延遲釋放配方)、丸劑、粉末、顆粒、西也劑、香精、懸浮劑、糖漿和乳劑。以同樣的方式，其給藥可以通過(guò)靜脈內(nèi)(以混合液或灌輸液)、腹腔內(nèi)，皮下或肌肉內(nèi)進(jìn)行。所有方式均采用制藥領(lǐng)域?qū)＜宜熘膭┬?。使化合物產(chǎn)生理想效應(yīng)的有效但非毒性的劑量可用于腫瘤的避免或治療，主要用于抵抗惡性腫瘤，與組織退化相關(guān)的疾病，由炎癥過(guò)程引起的和/或源自病毒、細(xì)菌或寄生蟲(chóng)的疾病，自身免疫性疾病，糖尿病，健忘癥，精神和食物性疾病，緊張，酒精中毒和高血壓等。
本發(fā)明中的化合物的給藥方案自然地根據(jù)已知因素變動(dòng)，比如特定制劑的藥效特征及其給藥的方式和途徑；物種，年齡，性別，健康狀況，醫(yī)療條件以及受體體重；癥狀的性質(zhì)和范圍；正在進(jìn)行的治療的類型；治療的頻率；給藥的途徑；受體的一般狀態(tài)以及需要達(dá)到的效果。具有常識(shí)的醫(yī)生或獸醫(yī)可以容易地根據(jù)預(yù)防，抵抗或延緩病情升級(jí)的需要決定藥物的有效用量，并開(kāi)出處方。
本發(fā)明中的化合物可以方便地進(jìn)行給藥，每日一次，或者每日的全藥量通過(guò)每日兩次、三次、四次或多次而部分地給予。在有些情況下，隔日給藥是合適的，循環(huán)或非循環(huán)給藥。
本發(fā)明中的化合物可以通過(guò)局部使用合適的鼻內(nèi)載體的方式鼻內(nèi)給藥，或者通過(guò)該領(lǐng)域?qū)＜沂熘母鞣N跨皮膚路徑給藥。當(dāng)采用跨皮膚路徑給藥系統(tǒng)時(shí)，按照給藥方案的給藥劑量應(yīng)該是連續(xù)的而不是間斷性的。
對(duì)于以片劑或膠囊口服給藥，例如，可以將上述藥物活性成分與藥物學(xué)上可接受的口服惰性載體結(jié)合，該載體如乳糖，淀粉，蔗糖，葡萄糖，甲基纖維素，硬脂酸鎂，磷酸二鈣，硫酸鈣，甘露醇，山梨醇和類似物。對(duì)于以液態(tài)劑型口服給藥，口腔藥物成分可以與任何一種藥物學(xué)上可接受的口服惰性載體結(jié)合，該載體比如乙醇，甘油，水及類似物。此外，如果希望或需要，合適的膠合劑，潤(rùn)滑劑，裂解劑和著色劑可以加入到混合物中。合適的膠合劑包括淀粉，凝膠，天然糖如葡萄糖或β-乳糖，玉米甜料，天然或合成的膠如阿拉伯樹(shù)膠，黃芪膠或藻酸鈉，羧甲基纖維素，聚乙二醇，蠟及類似物。在這些劑型中可以使用的潤(rùn)滑劑包括油酸鈉，硬脂酸鈉，硬脂酸鎂，苯甲酸鈉，醋酸鈉，氯化鈉及類似物。裂解劑包括但于限于淀粉，甲基纖維素，瓊脂，皂土，黃原膠及類似物。
本發(fā)明中的化合物也可以通過(guò)脂質(zhì)體給藥系統(tǒng)給藥，該系統(tǒng)如小的單層膜囊泡，大的單層膜囊泡和多層膜囊泡。脂質(zhì)體也可以由一系列磷脂組成，如膽固醇，硬脂胺或卵磷脂。
本發(fā)明中的化合物也可以與可作為藥物載體的可溶性多聚體偶合。這些多聚體可以包括聚乙烯吡咯烷酮，吡喃(piran)共聚體，聚羥丙基甲基丙烯酰胺苯酚，聚羥乙基天冬酰胺苯酚或棕櫚酸基取代的聚乙烯氧化聚賴氨酸。此外，本發(fā)明的化合物可以與生物可降解類多聚體偶合從而實(shí)現(xiàn)藥物的可控釋放，如聚乳酸，聚葡糖酸，聚乳酸與聚葡糖酸的共聚體，聚ε-己內(nèi)酯，聚羥基丁酸，聚原酸酯，聚縮醛，聚二氫吡喃(polydi-hydropirans)，聚氰基丙烯酸酯和交聯(lián)的或兩性分子阻斷(amphypathic block)的水凝膠共聚體。
明膠膠囊可以含有粉狀的活性成分和載體，比如乳糖，淀粉，纖維素衍生物，硬脂酸鎂，硬脂酸及類似物。類似的稀釋液可以用于制作壓片。片劑和膠囊均可制成緩釋產(chǎn)品的形式，以實(shí)現(xiàn)在數(shù)小時(shí)內(nèi)藥物的連續(xù)釋放。壓片可在表面覆蓋糖或薄膜以掩蓋其不良味道并保護(hù)藥片不受空氣影響，或者可以以腸膜覆裹以實(shí)現(xiàn)在胃腸系統(tǒng)中的選擇性裂解。
口服給藥的液態(tài)劑型可含有著色劑和風(fēng)味劑以提高受體的接受性。通常，除了DMSO或其他包括水在內(nèi)的配位溶劑外，水，合適的油，鹽溶液，水溶的右旋糖(葡萄糖)，糖相關(guān)溶液和二元醇，如丙二醇或聚乙二醇，磷酸鹽緩沖液均是用于液態(tài)劑型，腸胃外給藥溶液或腹膜腔內(nèi)給藥的合適載體。
特別地，用于腸胃外給藥的溶液包含活性成分的水溶性鹽和DMSO，或另一配位溶劑，如需要，還包含合適的穩(wěn)定劑和緩沖物質(zhì)?？寡趸瘎鐏喠蛩釟溻c，亞硫酸鈉或抗壞血酸，分離或混合形式的，均是合適的穩(wěn)定劑。檸檬酸和檸檬酸鹽以及EDTA鈉鹽也用作穩(wěn)定劑。此外，腸胃外溶液可含有防腐劑，如殺藻胺，甲基丙基對(duì)羥基苯甲酸酯和氯丁醇。
用于腹膜內(nèi)應(yīng)用的組合物特定地包含水，鹽溶液和/或pH7.4的磷酸鹽緩沖液和0.1到30％的DMSO，如果需要，更特定地包含重量占該組合物1到10％的穩(wěn)定劑或防腐劑。
合適的藥物載體在Remington’s Pharmaceutical Sciences，MackPublishing Company中有所描述，該書(shū)為本領(lǐng)域內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)，其內(nèi)容在此引為參考。
活性成分的每日劑量約為0.0001到500mg/kg體重，特定地約為0.0001到100mg/kg體重，更特定地約為0.0001到30mg/kg體重。每日劑量也可以依據(jù)受藥患者血藥終濃度來(lái)計(jì)算，該終濃度應(yīng)為0.01到200μM，特定地為0.1到50μM，更特定地為10到25μM。
用于合適組合物給藥的劑型每單位可包含0.0001到250mg，更特定地為0.1到100mg活性成分。在這些藥物組合物中，該活性成分的含量通常為配方總重量的0.001到99％，特定地為0.1到70％，更特定地為0.1到40％。該組合物還可包含至少一種藥物學(xué)上可接受的載體。該活性成分可以以固態(tài)劑型口服給藥，如膠囊，片劑或粉末，也可以采用諸如西也劑，糖漿，溶液和懸浮劑的液態(tài)劑型給藥。該活性成分還可采用消毒的液態(tài)劑型腸胃外或腹膜內(nèi)給藥。
本發(fā)明的優(yōu)選藥物劑型是用于注射給藥，特別是腹膜內(nèi)給藥的液態(tài)組合物。合適的用于腸胃外注射給藥的組合物可用如下方法制備，如將質(zhì)量百分比為1.5％的活性成分在含有體積百分比為10％ DMSO的pH 7.4磷酸鹽緩沖液中搖勻。該溶液采用慣常方法消毒。
本發(fā)明的復(fù)合產(chǎn)物劑型可以是片劑，其中的一種活性成分用腸膜覆蓋，于是用腸膜覆蓋的成分和其他活性成分就不會(huì)混合在一起，然后壓制成片劑或類似物。因此，用腸膜覆蓋的成分壓在一個(gè)片劑層中，而其它活性成分壓在另一片劑層中?？蛇x擇性地，為了進(jìn)一步分離這兩層，可加入一層或多層隔離層(placebo)，使隔離層存在于活性物質(zhì)層之間。此外，本發(fā)明中的藥物劑型可以以膠囊的形式存在，其中一種活性成分壓成片劑或許多微小片劑，顆粒，丸劑或非球狀顆粒，然后用腸膜覆蓋。這些用腸膜覆蓋的微小片劑，顆粒，丸劑或非球狀顆粒和其他活性成分顆粒一起被裝入或壓入膠囊中。
在以單一劑型或獨(dú)立劑型同時(shí)給藥或同時(shí)同一方式給藥時(shí)，為了盡可能減少本發(fā)明的復(fù)合產(chǎn)物各組分之間的接觸，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)，本領(lǐng)域的專業(yè)人員可以清楚容易地決定各種劑型。
定義“造血系統(tǒng)”指與血細(xì)胞形成相關(guān)的系統(tǒng)。
“免疫系統(tǒng)”指由白細(xì)胞形成的生物體的防御細(xì)胞系統(tǒng)，其通過(guò)產(chǎn)生抗體直接或間接地幫助生物體抵抗陌生化學(xué)或生物源。
“蛋白質(zhì)抑制劑”指能夠抑制蛋白質(zhì)行使其生物學(xué)功能的制劑，通常通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)活性位點(diǎn)的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)的破壞實(shí)現(xiàn)抑制作用。
“選擇性抑制劑”指在大量分子(如蛋白質(zhì))中只抑制特定分子和/或擁有相似活性位點(diǎn)的特定家族的抑制劑。
“幼細(xì)胞周期”指在細(xì)胞快速生長(zhǎng)如組織培養(yǎng)中發(fā)生的循環(huán)結(jié)構(gòu)和生化過(guò)程。該循環(huán)可分為Go期，間歇期1(G1)，合成期(S)，間歇期2(G2)和有絲分裂期(M)。當(dāng)其產(chǎn)生如粒細(xì)胞系列的幼細(xì)胞，骨髓單核細(xì)胞時(shí)，該周期被稱為幼細(xì)胞周期。
“骨髓抑制(Myelosuppression)”指對(duì)髓細(xì)胞，即粒細(xì)胞系列的幼細(xì)胞的生成的抑制，通常發(fā)生在骨髓中，而不發(fā)生在循環(huán)血液中(某些疾病除外)。
“骨髓毒性”指制劑能夠?qū)撬杓?xì)胞產(chǎn)生毒性作用。
“自身免疫性疾病”指各種由于生物體免疫系統(tǒng)的防御細(xì)胞不能識(shí)別自身的生物體組成器官和/或組織的正常細(xì)胞而引起的各種疾病。
“免疫抑制劑”指各種能夠引起免疫抑制的制劑，即阻止或干擾免疫應(yīng)答的進(jìn)程；其可以是缺乏免疫應(yīng)答(耐受)的結(jié)果，可以由化學(xué)，生物或物理制劑人工誘導(dǎo)或由疾病引起。
“免疫調(diào)節(jié)劑”指在免疫系統(tǒng)細(xì)胞應(yīng)答細(xì)胞環(huán)境狀況變化時(shí)能引起其功能和形態(tài)波動(dòng)的各種試劑。
″螯合的二膦配體″指各種含有兩個(gè)磷原子的有機(jī)連接，磷原子帶有自由電子對(duì)，通過(guò)提供配位鍵和同一金屬中心連接。
“DNA插入”指化學(xué)分子在形成DNA分子雙螺旋的堿基對(duì)間的插入。
“類似連接”指所有的同構(gòu)連接，即具有相似的空間結(jié)構(gòu)。本發(fā)明中指以化學(xué)元素周期表第V族的任何元素替代磷原子與1，1’-雙二苯基膦-二茂鐵的環(huán)戊二烯環(huán)連接，該元素可以是N，As，Sb或Bi。
“受體血液總量”指接受藥物的生物體循環(huán)血液的總體積。就人體而言，該體積在6到8升范圍間變動(dòng)。
本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能夠理解，根據(jù)以上指導(dǎo)，可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行大量的改進(jìn)和變化。因此應(yīng)該清楚，在所附權(quán)利要求書(shū)的范圍之內(nèi)，本發(fā)明除了本說(shuō)明書(shū)所作的具體描述外還可以通過(guò)其他途徑實(shí)施。
以下僅提供了本發(fā)明的特定具體實(shí)施方案的解釋性實(shí)施例，這些實(shí)施例對(duì)所附權(quán)利要求書(shū)范圍不產(chǎn)生任何限定。
實(shí)施例1起始復(fù)合物的制備2；dmpa＝依據(jù)Ryabov等(Reaction paths inthe cyclopalladated NN-dialkylbenzylamine-substituted styrenesystem in acetic acid as solvent.The structure of palladated2-dialkylaminomethylstilbenes.J.Chem.Soc.，Perkin Trans；1983，2，1503-1509)和(Enantioselective cleavage of activatedamino acid esters promoted by chiralpalladacycles.Inorg.Chim.Acta；1988，280，57-61)制備的N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)的R(+)和S(-)對(duì)映異構(gòu)體。百分比分析(calcd.C20H28N2Cl2Pd2)a)R(+)C，40.4(40.6)；H，4.8(4.7)；N，4.8(4.4)。b)S(-)C，40.4(40.9)；H，4.8(4.2)；N，4.8(4.3)。2-這些化合物通過(guò)離子交換反應(yīng)用[Pd(C2，N-dmpa)μ-Cl]2的R(+)和S(-)對(duì)映異構(gòu)二聚體制備。在含有[Pd(C2，N-dmpa)μ-Cl]2(1.740g，3.0mmol)的THF(100mL)溶液中加入含有NaN3(0.390g，6.00mmol)的甲醇(20mL)。所獲的黃色固體經(jīng)過(guò)過(guò)濾，用乙醚洗滌之后在真空中干燥。從甲苯中重結(jié)晶獲得微晶體產(chǎn)物(95％R(+)；87％S(-))。百分比分析(Calcd.C20H28N8Pd2)a)R(+)C，40.6(40.2)；H，4.7(4.4)；N，18.9(18.3).IRvasN32066cm-1，vsimN31447cm-1；B)S(-)C，40.6(41.1)；H，4.7(4.5)；N，18.9(18.4).IRvasN32058cm-1，vsimN31443cm-1。
實(shí)施例2含有PD(C2，N-DMPA)(L)]X(X＝Cl，N3，L＝二齒配體)型螯合二膦配體的離子化合物說(shuō)明這些化合物有時(shí)用文字描述為PdR(+)或S(-)dmpa dppf 1:2(帶有N3或Cl)。
(2a)[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)]N3百分比分析(calcd.)C，60.9(62.1)；H，4.8(5.0)，N，6.1(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，d，1.55)；-N(CH3)2(3H，s，2.16)；Cp(5H，m，3.99)Cp(5H，m，4.25)-CH*-CH3(2H，q，3.99)；H-芳香環(huán)35)。31P{1H}-NMR(ppm)2個(gè)信號(hào)23.0，32.1.ΛM＝44.5S.cm2.mol-1。Cl(相同)。
(2b)[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)N3百分比分析(calcd.)C，61.9(62.1)；H，5.5(5.0)，N，5.9(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，1.55)；-N(CH3)2(3H，S，2.16)；Cp(5H，M，4.21)Cp(5H，M，4.49)-CH*-CH3(2H，q，3.97)；H-芳香環(huán)(24，m，7.25-7.32。31P{1H)-NMR(ppm)2個(gè)信號(hào)23.0，32.1.ΛM＝51.1S.cm2.mol-1。Cl(相同)。
實(shí)施例3含有[PD(C2，N-DMPA)(L)]X(X＝Cl，N3，L＝二齒配體)型螯合二膦配體的分子化合物說(shuō)明這些化合物有時(shí)以文字描述為PdR(+)或S(-)dmpa dppf 1:2(帶有N3或Cl)。
(3a)[Pd(C2，N-(R+dmpa)(dppf)N3]百分比分析(calcd.)C，61.3(62.1)；H，4.9(5.0)，N，6.1(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，1.55)；-N(CH3)2(3H，S，2.16)；Cp(5H，Q，3.99)Cp(5H，t，4.25)-CH*-CH3(2H，Q，3.77)；H-芳香環(huán)(24，m，7.25-7.32。31P{1H}-NMR(ppm)2個(gè)信號(hào)31.9；-16.0.ΛM＝15.5S.cm2.mol-1。(相同)。
(3b)[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)N3]百分比分析(calcd.)C，61.9(62.1)；H，4.5(5.0)，N，5.9(6.6)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，1.55)；-N(CH3)2(3H，S，2.16)；Cp(5H，Q，3.99)Cp(5H，t，4.25)-CH*-CH3(2H，Q，3.77)；H-芳香環(huán)(24，m，7.25-7.32。31P{1H}-NMR(ppm)2個(gè)信號(hào)31.9；-16.0.ΛM＝15.5S.cm2.mol-1。(相同)。
實(shí)施例4含有[Pd2(C2，N-DMPA)2(μ-L)X2](X＝Cl，N3，L＝二齒配體)型螯合二膦配體的分子化合物說(shuō)明這些化合物有時(shí)以文字描述為PdR(+)或S(-)dmpa dppf 1:1(帶有N3或Cl)。
(4a)[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)Cl2]百分比分析(calcd.)C，56.7(57.1)；H，5.2(5.0)，N，2.4(2.5)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，d，2.60)；-CH-CH3*(6H，d，2.90)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.63)；P(CH2)2-P(4H，m，2.57-2.85)；Cp(2H，sr-br，4.23)，Cp(2H，sr-br，4.57)，Cp(3H，m，4.96)，Cp(3H，m，5.00)，-CH*-CH3(2H，q，4.10)；H-芳香環(huán)(24，m，6.25-7.57。31P{1H}-NMR(ppm)1個(gè)信號(hào)32.7.ΛM＝9.3S.cm2.mol-1。(相同)。
(4b)[Pd2(C2，N-R+dmpa)2(μ-dppf)Cl2]百分比分析(calcd.)C，54.3(57.1)；H，4.9(5.0)，N，2.3(2.5)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，d，2.60)；-CH-CH3*(6H，d，2.90)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.63)；P(CH2)2-P(4H，m，2.57-2.85)；Cp(2H，sr-br，4.23)，Cp(2H，sr-br，4.57)，Cp(3H，m，4.96)，Cp(3H，m，5.00)，-CH*-CH3(2H，q，4.10)；H-芳香環(huán)(24，m，6.25-7.57。31P{1H}-NMR(ppm)1個(gè)信號(hào)32.7.ΛM＝2.4S.cm2.mol-1。(相同)(4c)[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)(N3)2]百分比分析(calcd.)C，55.1(55.9)；H，4.0(4.5)，N，9.5(10.0)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，2.70)；-CH-CH3*(6H，D，3.00)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，S-BR，1.65)；P(CH2)2-P(4H，m，2.60-2.90)；Cp(2H，sr-br，4.20)，Cp(2H，sr-br，4.61)，Cp(3H，m，4.93)，Cp(3H，m，5.10)，-CH*-CH3(2H，q，4.20)；H-芳香環(huán)(24，m，6.05-7.77。31P{1H}-NMR(ppm)1個(gè)信號(hào)32.7.ΛM＝7.5S.cm2.mol-1。(相同)。
(4d)[Pd2(C2，N-R+dmpa)2(μ-dppf)(N3)2]百分比分析(calcd.)C，54.8(55.9)；H，4.1(4.5)，N，9.7(10.0)。1H-NMR(ppm)-CH-CH3*(6H，D，2.70)；-CH-CH3*(6H，D，3.00)；-N(CH3)2(6H，s-br，1.61)；-N(CH3)2(6H，S-BR，1.65)；P(CH2)2-P(4H，m，2.60-2.90)；Cp(2H，sr-br，4.20)，Cp(2H，sr-br，4.61)，Cp(3H，m，4.93)，Cp(3H，m，5.10)，-CH*-CH3(2H，q，4.20)；H-芳香環(huán)(24，m，6.05-7.77。31P{1H}-NMR(ppm)1個(gè)信號(hào)32.7.ΛM＝4.4S.cm2.mol-1。(相同)實(shí)施例5對(duì)絲氨酸肽酶，金屬蛋白酶家族的酶抑制分析我們以下包括了用具有A，B和C結(jié)構(gòu)的復(fù)合物進(jìn)行的分析。這些鈀復(fù)合物由通過(guò)N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)的R(+)和S(-)異構(gòu)體形成的環(huán)金屬環(huán)和配位配體1’-雙二苯基膦-二茂鐵(dppf)組成。酶抑制常數(shù)通過(guò)經(jīng)典方法，熒光光譜測(cè)定法和間接計(jì)算獲得。在分析中，根據(jù)分析需要采用1ml的酶溶液，其中含有已知質(zhì)量為2-5ng的酶。計(jì)算所得的酶抑制常數(shù)值陳列如下絲氨酸肽酶脯氨酰基寡肽酶(POP)及兩種變體(一為Cys255，β螺旋第四片的突變體以及功能性突變體Tyr473Phe)。對(duì)于POP，緩沖液采用Tris/HCl 20mM，pH7.5。標(biāo)準(zhǔn)底物是Abz-GFSPFRQ-EDDnp(Km 0.38μM)。
(5a)帶有dmpa R(+)異構(gòu)體的復(fù)合物(以1∶1的結(jié)構(gòu))1/Kiapp＝0.0977//Kiapp＝10.24ng//Ki＝4.51ng，突變體Cys255The。1/Kiapp＝0.1234//Kiapp＝8.10ng//Ki＝3.57ng，突變體Try473Phe。
(5b)帶有dmpa R(+)異構(gòu)體的復(fù)合物(以2∶1的結(jié)構(gòu))1/Kiapp＝8.7242//Kiapp＝0.1146ng//Ki＝34.01pg，突變體Cys255The。1/Kiapp＝14.1677//Kiapp＝0.0706ng//Ki＝20.94pg，突變體Tyr473Phe。
(5c)帶有dmpa S(-)異構(gòu)體得到的復(fù)合物(以1∶1的結(jié)構(gòu))1/Kiapp＝6.9164//Kiapp＝0.1496ng//Ki＝42.90pg，突變體Cys255The。1/K，APP＝9.891411app＝0.1011ng//Ki＝30pg，突變體Tyr473Phe。
(5d)帶有dmpa S(-)異構(gòu)體得到的復(fù)合物(以2∶1的結(jié)構(gòu))1/Kiapp＝180.3018HKLAPP＝0.004982ng//Ki＝1.65pg，突變體Cys255The。1/Kiapp＝4.4990//Kiapp＝0.2223ng//Ki＝65.96pg，突變體Tyr473Phe。
金屬蛋白酶ACE(血管緊張縮素轉(zhuǎn)化酶)-使用濃度0.1-1.0nM。緩沖液采用0.1M，pH8.0磷酸鈉緩沖液+200mM NaCl。標(biāo)準(zhǔn)底物為Abz-YRK(Dnp)-P-OH(Km7.0μM)。
(5e)帶有dmpa R(+)異構(gòu)體的復(fù)合物(以1∶1的結(jié)構(gòu))1Kiapp＝18.7138//Kiapp＝0.05344ng//Ki＝22.27pg。
(5f)帶有dmpa R(+)異構(gòu)體的復(fù)合物(以2∶1的結(jié)構(gòu))1/Kiapp＝1.1578//Kiapp＝0.8637ng//Ki＝0.36ng。
(5g)帶有dmpa S(-)異構(gòu)體的復(fù)合物(以1∶1的結(jié)構(gòu))1/Kiapp＝2.0989//Kiapp＝0.4764ng//Ki＝198.51pg。
(5h)帶有dmpa S(-)異構(gòu)體的復(fù)合物(以2∶1的結(jié)構(gòu))1/Kiapp＝3.3136//Kiapp＝0.3018ng//Ki＝112.28pg。
肽鏈內(nèi)切酶CATD(組織蛋白酶D)-使用濃度0.05-0.5nM.緩沖液采用0.1mM，pH4.0檸檬酸緩沖液。標(biāo)準(zhǔn)底物為Abz-AIAFFSRQ-EDDnp(Km0.17μM)。
(5i)帶有dmpa S(-)異構(gòu)體的復(fù)合物(以1∶1的結(jié)構(gòu))1/Kiapp＝3.3136//Kiapp＝0.3018ng//Ki＝122.98pg。
(5j)帶有dmpa S(-)異構(gòu)體的復(fù)合物(以2∶1的結(jié)構(gòu))1/Kiapp＝3.5696//Kiapp＝0.2801ng//KI＝104.22pg。
實(shí)施例6抗腫瘤分析-Walker’s腫瘤進(jìn)行抗腫瘤活性分析時(shí)，將化合物分別稀釋在水溶液，鹽溶液和pH＝7.4的磷酸鹽緩沖液中，所有溶液中均含有1％二甲基亞砜(DMSO)。分析中使用等量的所述化合物，以使得試驗(yàn)動(dòng)物血液總體積(約30ml)中的活體藥物濃度達(dá)到15μM，該濃度對(duì)于動(dòng)力學(xué)步驟非常有利。
試驗(yàn)包括將本發(fā)明中的鈀化合物在腹膜內(nèi)，皮下和在腫瘤移植部位直接使用以及通過(guò)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行的腫瘤移植。
據(jù)觀察，在90％病例中，腫瘤生長(zhǎng)得到逆轉(zhuǎn)(試驗(yàn)動(dòng)物總計(jì)60只)。皮下接種106個(gè)癌細(xì)胞12天后試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)生長(zhǎng)出質(zhì)量為4.0(+/-)1.0g的實(shí)體瘤。通過(guò)給藥，腫瘤的質(zhì)量降低到0.3(+/-)0.1g。除了抑制腫瘤生長(zhǎng)，在85％的病例中，化合物逆轉(zhuǎn)了先前存在的腫瘤。對(duì)于上述的Walker’s腫瘤，化合物在體內(nèi)模型中顯示了對(duì)該腫瘤細(xì)胞的選擇性細(xì)胞毒性，而在對(duì)正常組織給藥后沒(méi)有任何慢性炎癥癥狀。在這些分析中，連續(xù)10天按15μM/大鼠×天的劑量通過(guò)注射給藥。另一個(gè)重要作用是其在細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)出了對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)，顯示重要的抗血管生長(zhǎng)作用。化合物在體內(nèi)模型中也顯示出巨大的對(duì)組織蛋白酶B和組織蛋白酶D的抑制活性，使其成為抗腫瘤轉(zhuǎn)移的有效試劑，避免腫瘤在骨骼肌中的轉(zhuǎn)移。
在對(duì)所有試驗(yàn)動(dòng)物的所有治療中沒(méi)有觀察到任何副作用，這顯示了藥物具有極高的專一性。以下圖3、4和5顯示了所得結(jié)果。
實(shí)施例7為了培育Ehrlich’s腹水性腫瘤，用0.1ml含有106個(gè)取自患病小鼠的腹膜內(nèi)的癌細(xì)胞懸浮液對(duì)小鼠進(jìn)行腹膜內(nèi)接種。在從Ehrlich腫瘤患病小鼠的腹膜中取出腹水液后，細(xì)胞的數(shù)目和活力在Neubauer盤(pán)中用錐蟲(chóng)藍(lán)(Trypan blue)染液確定。
為了觀察化合物[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)Cl2]e[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)(N3)2](根據(jù)示意圖C的一般結(jié)構(gòu))對(duì)接受治療動(dòng)物的保護(hù)作用，繪制壽命延長(zhǎng)曲線。含有12只動(dòng)物的三個(gè)試驗(yàn)組如下Ehrlich’s腹水性腫瘤的患病動(dòng)物；連續(xù)接受四次環(huán)鈀化合物(1mg/kg)皮下給藥的腫瘤患病動(dòng)物。
試驗(yàn)進(jìn)行如下Ehrlich腫瘤細(xì)胞從患病動(dòng)物的腹膜腔內(nèi)取出，然后稀釋(1∶100)在錐蟲(chóng)藍(lán)溶液確定細(xì)胞活力。將細(xì)胞在鹽溶液中的濃度調(diào)至1×106細(xì)胞/動(dòng)物。此后，用0.2ml該溶液(包含1×106個(gè)細(xì)胞)接種被研究動(dòng)物。腫瘤接種72小時(shí)后開(kāi)始環(huán)鈀化合物的治療并持續(xù)4天。每天觀察動(dòng)物以控制死亡率。
在體內(nèi)分析中，劑量為1mg/kg的化合物[Pd(C2，N-(S-dmpa)(dppf)Cl]和[Pd2(C2，N-S-dmpa)2(μ-dppf)(N3)2]均延長(zhǎng)了Ehrlich腹水性腫瘤患病動(dòng)物的壽命，標(biāo)志這些藥能夠干擾腫瘤的升級(jí)(圖6)。
實(shí)施例8小鼠骨髓細(xì)胞造血前體(CFU-C)的克隆培養(yǎng)為了對(duì)克隆生成(clogenical)細(xì)胞的計(jì)數(shù)，關(guān)鍵要確保培養(yǎng)基中存在的所有全能細(xì)胞得到誘導(dǎo)而增殖和調(diào)節(jié)培養(yǎng)條件，以避免在Petri盤(pán)中不會(huì)含有過(guò)多數(shù)量的細(xì)胞群落而之后發(fā)生重疊，從而使每一個(gè)群落能夠得到識(shí)別。同樣重要的是使用最高濃度以上的生長(zhǎng)刺激因子(GSF)。我們將使用針對(duì)粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的重組造血生長(zhǎng)因子-GM-CSF。此外，由于發(fā)現(xiàn)當(dāng)前市場(chǎng)上供應(yīng)的不同批次和品牌的胎(phoetal)小牛血清的活性存在差異，對(duì)胎小牛血清的選擇應(yīng)該慎重。
將正常小鼠或連續(xù)接受4天用由dmpa和配體dppf以1∶2的比例(按照?qǐng)D解A和B-一般結(jié)構(gòu))合成的環(huán)鈀化合物進(jìn)行皮下治療的小鼠通過(guò)斷頸法處死，小鼠皮膚用碘酒清潔。將小鼠大腿骨暴露，去除末端孔部軟骨，將骨頭從其上方關(guān)節(jié)處切斷。骨髓在針頭和注射器的幫助下被轉(zhuǎn)移至含有培養(yǎng)基或平衡鹽溶液的試管中。懸浮液中的細(xì)胞數(shù)在將細(xì)胞以1∶10稀釋于10％的曙紅中后在血細(xì)胞計(jì)數(shù)皿中計(jì)數(shù)。隨后，制備更多的瓊脂培養(yǎng)基(bacto-agar，Difco)，其中包含30％的2倍濃縮的IMDM培養(yǎng)基(Sigma)，20％ phoetal小牛血清和50％瓊脂(0.6％)。此后，將適量體積的細(xì)胞加入到37℃的該更多瓊脂培養(yǎng)基中。將細(xì)胞重懸，以1.0ml的體積分配到每個(gè)已經(jīng)含有合適的刺激因子的Petri盤(pán)中。在體外分析中，加入系列濃度的由dmpa和配體dppf以1∶2的比例(按照示意圖A和B-一般結(jié)構(gòu))合成的環(huán)鈀化合物。培養(yǎng)物在Petri盤(pán)表面分布形成膠狀。在37℃，含有5％CO2的空氣中連續(xù)培養(yǎng)7天后，細(xì)胞群落在40×放大的解剖顯微鏡下計(jì)數(shù)(Metcalf，1984)。
實(shí)施例9對(duì)通過(guò)長(zhǎng)效骨髓細(xì)胞液體培養(yǎng)過(guò)程形成的骨髓基質(zhì)的評(píng)估本培養(yǎng)完全依賴于由骨髓基質(zhì)細(xì)胞衍生出的粘附細(xì)胞層的形成。粘附細(xì)胞層的形成的發(fā)生依賴于造血生長(zhǎng)因子的合成和分泌，該因子負(fù)責(zé)基質(zhì)細(xì)胞胞外基質(zhì)的形成。因此，更多的非成熟細(xì)胞保留在粘附細(xì)胞層內(nèi)并釋放到培養(yǎng)基中以保持造血功能。因此，在外源性造血生長(zhǎng)因子存在的情況下，在進(jìn)行克隆培養(yǎng)之后，對(duì)液體培養(yǎng)基中的母細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行定量。(Spoonceretal，1993)在用斷頸法處死動(dòng)物(約8只)后，暴露大腿骨，骨頭于上方關(guān)節(jié)處切開(kāi)。骨髓和骨髓基質(zhì)細(xì)胞在針頭和注射器的幫助下轉(zhuǎn)移至含有補(bǔ)充了2mmI-谷氨酰胺，20％馬血清(cult-lab)和10-2M氫化可的松的rpmi-1640(Sigma)培養(yǎng)基的試管中。將細(xì)胞及培養(yǎng)基分配到培養(yǎng)瓶(t25)中(每瓶10ml培養(yǎng)基及細(xì)胞)。隨后，將該培養(yǎng)瓶在含有5％CO2的空氣的濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。15天后，由于骨髓基質(zhì)已經(jīng)開(kāi)始群集，將從8只小鼠骨髓中衍生出的新一代細(xì)胞加入到培養(yǎng)瓶中誘導(dǎo)母細(xì)胞的增殖。在培養(yǎng)瓶中傳代15天后，我們進(jìn)行克隆培養(yǎng)(cfu-c)，目的在于計(jì)算從體外培養(yǎng)骨髓基質(zhì)衍生出的粘附細(xì)胞所生成的造血前體的數(shù)目。為了確定非粘附細(xì)胞和母細(xì)胞的數(shù)目，每周移除50％的飽和培養(yǎng)基并加入新鮮培養(yǎng)基，該新鮮培養(yǎng)基已含有1mg/l的由dmpa和配體dppf以1∶2的比例(按照示意圖A和B-一般結(jié)構(gòu))合成的環(huán)鈀化合物。
由長(zhǎng)效液體培養(yǎng)基中獲得的母細(xì)胞生成的造血前體(CFU-C)的克隆培養(yǎng)從長(zhǎng)效液體培養(yǎng)基中獲得非粘附細(xì)胞后，將細(xì)胞用培養(yǎng)基RPMI1640(Sigma)清洗并重懸至終濃度為2×105細(xì)胞/ml。隨后這些細(xì)胞按照之前說(shuō)明的克隆培養(yǎng)方法(CFU-C)進(jìn)行培養(yǎng)。
實(shí)施例10急性毒性評(píng)估將待分析化合物稀釋于含有10％DMSO的鹽溶液中，然后將0.2ml該鹽溶液以腹膜內(nèi)方式施予動(dòng)物。因此，每10只動(dòng)物(5公5母)組成的組接受不同劑量的化合物的治療。對(duì)照動(dòng)物接受只含有10％DMSO的鹽溶液。治療結(jié)束之后，動(dòng)物持續(xù)觀察14天。
表1環(huán)鈀化合物的急性毒性評(píng)估。動(dòng)物通過(guò)腹膜內(nèi)方式接受一劑下述化合物并在此過(guò)程之后觀察14天。
含有疊氮的化合物在10mg/kg的劑量下具有毒性及10％的致死率，表明該藥具有更高的副作用率。
實(shí)施例11白血病株HL-60和K-562的體外細(xì)胞毒性和原癌基因BCL-2的表達(dá)細(xì)胞株HL-60和K-562的細(xì)胞保存于補(bǔ)充了2mML-谷氨酰胺和20％phoetal小牛血清的培養(yǎng)基RPMI-1640(Sigma)中，細(xì)胞此前被清洗(三次)并重懸于RPMI培養(yǎng)基。隨后，它們與九種濃度的被研究化合物(160、80、40、20、10、5、2.5、1.25和0.65μg/ml)共同培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板(1×106細(xì)胞/孔)中。之后它們?cè)跐衽囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時(shí)(含5％CO2的空氣)。在此之后，加入MTT溶液(5mg/ml)(Sigma)，培養(yǎng)板繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)。隨后，加入MTT穩(wěn)定液(0.04N異丙酸(isopropylicacid))，30分鐘后，于560nm處重復(fù)3次讀取ELISA值(Mosmann，1983)。在所研究的化合物存在的情況下細(xì)胞的存活百分比如下計(jì)算活細(xì)胞％＝每孔吸收值(給藥)×100/對(duì)照吸收值(未給藥)實(shí)施例12黑素瘤的生物學(xué)分析體外分析體外分析用來(lái)證實(shí)環(huán)鈀化合物對(duì)鼠黑素瘤細(xì)胞B16F10-Nex2的細(xì)胞毒性效應(yīng)。細(xì)胞在不同化合物濃度下培養(yǎng)24小時(shí)。細(xì)胞活力由MTT分析法確定。如圖13所示，觀察到1.25uM含有乙烷二膦(藥物1，2和3)的藥物具有100％有效率。相同的效率在含有雙二苯基膦-二茂鐵的藥物中也被觀察到，但是在更高濃度下，10μM(藥6)以及含有官能炔的環(huán)鈀化合物(藥10)，大約20μM。圖13顯示了所述的細(xì)胞毒效應(yīng)，與未給藥細(xì)胞對(duì)照組相比其細(xì)胞存活百分比的降低以直方圖表示。
體內(nèi)分析體內(nèi)分析在母性小鼠C57BI/6上進(jìn)行。105腫瘤細(xì)胞通過(guò)皮下植入。植入后4天，動(dòng)物開(kāi)始接受治療。一組接受10μM，另一組接受30μM如下最有效的藥物藥物1，2，3，6和10腹膜腔內(nèi)給藥，一周3次，在這段時(shí)期，腫瘤體積被定量。當(dāng)腫瘤體積達(dá)到3000mm3時(shí)，動(dòng)物被處死。在下圖中，(A)中注射藥物的動(dòng)物和對(duì)照動(dòng)物的死亡曲線，(B)，每組患腫瘤動(dòng)物腫瘤的體積。
圖14中，給藥濃度為10μM時(shí)，從A中觀察到接受藥物1，3，6和10的動(dòng)物壽命延長(zhǎng)了10天。在B中，我們注意到，在所有的藥物中，藥物1和6對(duì)于腫瘤的發(fā)展具有高出其他藥物60％的抑制效應(yīng)。
在圖15中，給藥濃度為30μM時(shí)，所有藥物均使接受治療的動(dòng)物壽命延長(zhǎng)了7天，同時(shí)接受藥物6治療的動(dòng)物組死亡數(shù)更低。在圖B中，我們可看出藥物1最有效地抑制腫瘤發(fā)展。藥物6，18天時(shí)表現(xiàn)處顯著的抑制效應(yīng)，但是該效應(yīng)在23天后出現(xiàn)逆轉(zhuǎn)。
含有官能炔的藥物按照同樣的方法進(jìn)行了體外測(cè)試(圖16)，在100μM時(shí)顯示出100％的細(xì)胞毒效應(yīng)。該效應(yīng)在下圖中呈現(xiàn)，同時(shí)顯示，其中藥物11和14在大約1μM時(shí)顯示出40到50％的顯著抑制活性。
結(jié)果分析提供了一些重要的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥物活性之間的關(guān)聯(lián)。1.25μM的含有乙烷二膦(藥物1，2和3)的藥物被觀察到100％的有效率。同樣的效率在含有官能炔的環(huán)鈀化合物沒(méi)有發(fā)生，該化合物需要20μM。在所有被測(cè)藥物中，我們注意到藥物1和6具有高于其他藥物60％的抑制腫瘤發(fā)展的效應(yīng)。我們可以看到藥物1是最有效的抑制腫瘤發(fā)展的藥物，而接受藥物6治療的試驗(yàn)動(dòng)物體現(xiàn)出更少的死亡數(shù)。對(duì)于包含關(guān)官能炔的復(fù)合物，藥物11和14呈現(xiàn)出顯著的抑制效應(yīng)，在大約1μM時(shí)有40-50％的抑制效應(yīng)。
應(yīng)該承認(rèn)，本說(shuō)明書(shū)對(duì)本發(fā)明的說(shuō)明以及所述實(shí)施例能夠使本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員實(shí)施本發(fā)明，包括在不超出所附的權(quán)利書(shū)所要求保護(hù)的范圍的情況下上運(yùn)用本領(lǐng)域的常識(shí)進(jìn)行修改。
權(quán)利要求
1.環(huán)鈀化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽或絡(luò)合物，該化合物是有機(jī)金屬化合物，其含有鈀、δC-PD鍵和配位鍵Y→Pd，形成具有如下結(jié)構(gòu)的有機(jī)環(huán) 其中-X代表選自下列的元素鹵素(Cl、F、Br、I)；擬鹵素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根(H3C-COO-)；和-Y代表選自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3雜化的碳原子，其與鈀原子共價(jià)連接，含有C、Y和D的所示的環(huán)可以由三到八個(gè)原子組成。-C和Y之間，用曲線表示，具有連續(xù)的原子形成環(huán)鈀的環(huán)，由三到八個(gè)原子組成，包括鈀原子；典型地，非限制性地所述原子選自碳、氮、氧或硫；另一方面，構(gòu)成該環(huán)的每一個(gè)原子與其它原子或基團(tuán)相連，形成該環(huán)的可變外部結(jié)構(gòu)，線狀或環(huán)狀，本申請(qǐng)人對(duì)此不作特別限制；-L代表配位配體，其是來(lái)源于元素周期表V組(N、P、As、Sb、Bi)的供體原子，位于雙二苯基膦-二茂鐵化合物中，具體如下示意圖2所示，所示存在的L-L表明在所述的雙二苯基膦-二茂鐵化合物中存在兩個(gè)連接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分別代表了下列基團(tuán)，可以以任何順序出現(xiàn)氫(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羥基(OH)、氨基(-NH2)、亞胺基、鹵素(F、Cl、Br、I)、亞氨基、硝基(-NO2)。示意圖2
2.環(huán)鈀化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽或絡(luò)合物，該化合物是有機(jī)金屬化合物，其含有鈀、δC-PD鍵和配位鍵Y→Pd，形成具有如下結(jié)構(gòu)的有機(jī)環(huán) 其中-X代表選自下列的元素鹵素(Cl、F、Br、I)；擬鹵素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根(H3C-COO-)；和-Y代表選自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3雜化的碳原子，其與鈀原子共價(jià)連接，含有C、Y和D的所示的環(huán)可以由三到八個(gè)原子組成。-C和Y之間，用曲線表示，具有連續(xù)的原子形成環(huán)鈀的環(huán)，由三到八個(gè)原子組成，包括鈀原子；典型地，非限制性地所述原子選自碳、氮、氧或硫；另一方面，構(gòu)成該環(huán)的每一個(gè)原子與其它原子或基團(tuán)相連，形成該環(huán)的可變外部結(jié)構(gòu)，線狀或環(huán)狀，本申請(qǐng)人對(duì)此不作特別限制；-L代表配位配體，其是來(lái)源于元素周期表V組(N、P、As、Sb、Bi)的供體原子，位于雙二苯基膦-二茂鐵化合物中，具體如下示意圖2所示，所示存在的L-L表明在所述的雙二苯基膦-二茂鐵化合物中存在兩個(gè)連接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分別代表了下列基團(tuán)，可以以任何順序出現(xiàn)氫(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羥基(OH)、氨基(-NH2)、亞胺基、鹵素(F、Cl、Br、I)、亞氨基、硝基(-NO2)。示意圖2
3.環(huán)鈀化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽或絡(luò)合物，該化合物是有機(jī)金屬化合物，其含有鈀、δC-PD鍵和配位鍵Y→Pd，形成具有如下結(jié)構(gòu)的有機(jī)環(huán) 其中-X代表選自下列的元素鹵素(Cl、F、Br、I)；擬鹵素(N3、NCO、NCS、SCN)；或乙酸根(H3C-COO-)；和-Y代表選自元素周期表V或VI族的元素，如N、P、As、Sb、Bi、O、S、Se、Te；-C代表sp2或sp3雜化的碳原子，其與鈀原子共價(jià)連接，含有C、Y和D的所示的環(huán)可以由三到八個(gè)原子組成。-C和Y之間，用曲線表示，具有連續(xù)的原子形成環(huán)鈀的環(huán)，由三到八個(gè)原子組成，包括鈀原子；典型地，非限制性地所述原子選自碳、氮、氧或硫；另一方面，構(gòu)成該環(huán)的每一個(gè)原子與其它原子或基團(tuán)相連，形成該環(huán)的可變外部結(jié)構(gòu)，線狀或環(huán)狀，本申請(qǐng)人對(duì)此不作特別限制；-L代表配位配體，其是來(lái)源于元素周期表V組(N、P、As、Sb、Bi)的供體原子，位于雙二苯基膦-二茂鐵化合物中，具體如下示意圖2所示，所示存在的L-L表明在所述的雙二苯基膦-二茂鐵化合物中存在兩個(gè)連接子L，而R1、R2、R3、R4、R5、R6、R7、R8、R9、R10、R11和R12分別代表了下列基團(tuán)，可以以任何順序出現(xiàn)氫(H)、烷基、芳基、二烯基、烷氧基、硅氧基、羥基(OH)、氨基(-NH2)、亞胺基、鹵素(F、Cl、Br、I)、亞氨基、硝基(-NO2)。示意圖2
4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的環(huán)鈀化合物或其藥物學(xué)上可接受的鹽或絡(luò)合物，該化合物選自N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)和N，N-二甲基-芐胺衍生物，炔，即嘧啶基-苯基-乙炔或1-苯基-3-N，N二甲胺-丙炔。
5.如權(quán)利要求4所述的環(huán)鈀化合物，該化合物是N，N-二甲基-1-苯乙胺(dmpa)。
6.如權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物抑制與失調(diào)或疾病有關(guān)的蛋白的活性。
7.如權(quán)利要求6所述的化合物，其中所述的蛋白是酶。
8.如權(quán)利要求7所述的化合物，其中所述的酶包括來(lái)自半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸肽酶和金屬蛋白酶家族的酶。
9.如權(quán)利要求8所述的化合物，其中所述的半胱氨酸蛋白酶包括組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉(zhuǎn)化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，肽鏈內(nèi)切酶，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內(nèi)切酶、腺病毒肽鏈內(nèi)切酶和口瘡病毒肽鏈內(nèi)切酶，和寄生蟲(chóng)生命周期所必需的蛋白酶，如來(lái)自變形蟲(chóng)、阿米巴蟲(chóng)、盤(pán)尾絲蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、線蟲(chóng)、網(wǎng)柄菌、Therilerium、血吸蟲(chóng)和錐蟲(chóng)種的蛋白酶。
10.如權(quán)利要求9所述的化合物，其中所述的酶是組織蛋白酶B、Cruzaine和白介素-1β轉(zhuǎn)化酶。
11.如權(quán)利要求8所述的化合物，其中絲氨酸肽酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨?；?肽酶和寡肽酶B、脯氨?；?寡肽酶和組織蛋白酶D。
12.如權(quán)利要求11所述的化合物，其中所述的酶是組織蛋白酶D。
13.如權(quán)利要求8所述的化合物，其中金屬蛋白酶包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、膠原酶、基質(zhì)裂解素、膜型金屬蛋白酶和genatinases。
14.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物可以治療與蛋白質(zhì)和酶有關(guān)的失調(diào)與疾病。
15.如權(quán)利要求14所述的化合物，其中所述疾病包括由組織退化所導(dǎo)致的疾病如關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲(chóng)造成的骨質(zhì)感染、parasitomies、牙周疾病和腫瘤轉(zhuǎn)移；與心房利鈉因子的降解有關(guān)的心臟疾病；炎性疾病如支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松癥、急性胰腺炎和癌擴(kuò)散；失調(diào)如健忘癥、抑郁癥和血壓的調(diào)控；糖尿病，錐蟲(chóng)病，查格斯氏病，食物性失調(diào)，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體如白介素-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆(GM-CSF)的生長(zhǎng)刺激因子的產(chǎn)生有關(guān)的疾??；心理緊張，對(duì)抗由HIV病毒(AIDS)引起的感染；引起髓鞘(mieline)退化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病，包括多發(fā)性硬化癥和自體免疫性腦脊髓炎；癌腫瘤，自體免疫性疾病，腫瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、黑素瘤、胃、腸、食道和甲狀腺腫瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
16.如權(quán)利要求15所要求保護(hù)的化合物，其中所述的疾病是腹水和實(shí)體腫瘤，特別地是乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、胃、腸、食道、甲狀腺腫瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
17.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物抑制幼骨髓細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂(S期)。
18.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物是抗血管生成的。
19.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物是抗轉(zhuǎn)移的。
20.如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述的化合物，該化合物可用于輔助放射治療處理。
21.如權(quán)利要求1所述的化合物，該化合物與DNA發(fā)生反應(yīng)。
22.如權(quán)利要求1所述的化合物，該化合物是免疫調(diào)節(jié)子。
23.含有如權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)所述的化合物的至少一種和其藥物學(xué)上可接受的鹽和絡(luò)合物的組合物。
24.如權(quán)利要求23所述的組合物，該組合物含有約占其總重量0.001-99％的所述化合物或一種其鹽或絡(luò)合物，和至少一種藥物學(xué)上可接受的載體。
25.如權(quán)利要求23所述的組合物，該組合物含有約占其總重量0.01-70％的所述化合物或一種其鹽或絡(luò)合物，和至少一種藥物學(xué)上可接受的載體。
26.如權(quán)利要求23所述的組合物，該組合物含有約占其總重量0.1-40％的所述化合物或一種其鹽或絡(luò)合物，和至少一種藥物學(xué)上可接受的載體。
27.如權(quán)利要求23所述的組合物，該組合物還含有溶劑。
28.如權(quán)利要求27所述的組合物，其中所述溶劑是DMSO。
29.如權(quán)利要求23所述的組合物，該組合物呈現(xiàn)為固體劑量的形式，如膠囊、片劑或粉末，或液體劑量的形式，如西也劑、糖漿、乳劑、溶液、懸液、混合物和灌輸劑。
30.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中所述的制劑是預(yù)定或延遲釋放的。
31.如權(quán)利要求29所述的組合物，其中它們給藥的方式包括口服、皮下、靜脈內(nèi)、鼻內(nèi)、跨皮膚、腹膜內(nèi)、局部、肌肉內(nèi)、肺內(nèi)、陰道、直腸、眼內(nèi)或舌下的方式、系統(tǒng)來(lái)提供脂質(zhì)體。
32.如權(quán)利要求31所述的組合物，其中它們給藥的方式是注射，具體地是腹膜內(nèi)注射。
33.如權(quán)利要求32所述的組合物，該組合物特定地包括水、鹽溶液和/或pH7.4的磷酸鹽緩沖液和0.1-30％的DMSO，更特定地，如果需要，該組合物含有占其重量1-10％的穩(wěn)定劑或防腐劑。
34.如權(quán)利要求23所述的組合物，該組合物包括約0.0001-250mg，更特定地約0.1-100mg至少一種如權(quán)利要求1-22所述化合物或一種其藥學(xué)上接受的鹽或絡(luò)合物。
35.如權(quán)利要求23所述的組合物，該組合物抑制與紊亂或疾病有關(guān)的蛋白質(zhì)的活性。
36.如權(quán)利要求35所述的組合物，其中所述的蛋白質(zhì)是酶。
37.如權(quán)利要求36所述的組合物，其中所述的酶包括來(lái)自半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶家族的酶。
38.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述的半胱氨酸蛋白酶包括組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉(zhuǎn)化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內(nèi)切酶、腺病毒肽鏈內(nèi)切酶和口瘡病毒肽鏈內(nèi)切酶，和寄生蟲(chóng)生命周期所必須的蛋白酶，如來(lái)自變形蟲(chóng)、阿米巴、盤(pán)尾絲蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、線蟲(chóng)、網(wǎng)柄菌、Therilerium、血吸蟲(chóng)和錐蟲(chóng)種的蛋白酶。
39.如權(quán)利要求38所述的組合物，其中所述的酶是組織蛋白酶B、Cruzaine和白介素-1β轉(zhuǎn)化酶。
40.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中絲氨酸肽酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨?；?肽酶和寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶。
41.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中所述的酶是組織蛋白酶D。
42.如權(quán)利要求37所述的組合物，其中金屬蛋白酶包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、膠原酶、基質(zhì)裂解素、膜型金屬蛋白酶和genatinases。
43.如權(quán)利要求37所述的組合物，該組合物可以治療與蛋白質(zhì)和酶有關(guān)的失調(diào)與疾病。
44.如權(quán)利要求43所述的組合物，其中所述的疾病包括由組織退化所導(dǎo)致的疾病如關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲(chóng)造成的骨質(zhì)感染、Parasitomies、牙周疾病和腫瘤轉(zhuǎn)移；與心房利鈉因子的退化有關(guān)的心臟疾病；炎性疾病如支氣管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、急性胰腺炎和癌擴(kuò)散；失調(diào)如健忘癥、憂郁癥和血壓的調(diào)控；糖尿病，錐蟲(chóng)病，查格斯氏病，食物性失調(diào)，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體如白介素-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆(GM-CSF)的生長(zhǎng)刺激因子的產(chǎn)生有關(guān)的疾??；心理緊張，對(duì)抗由HIV病毒(AIDS)引起的感染；導(dǎo)致髓鞘(mieline)退化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病，包括多發(fā)性硬化癥和自體免疫性腦脊髓炎；癌腫瘤，自體免疫性疾病，腫瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、黑素瘤、胃、腸、食道和甲狀腺腫瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
45.如權(quán)利要求44所述的組合物，其中所述的疾病是腹水和實(shí)體腫瘤，特別地是乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、胃、腸、食道、甲狀腺腫瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
46.如權(quán)利要求23-37任一項(xiàng)所述的組合物，該組合物抑制幼骨髓細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂(S期)。
47.如權(quán)利要求23-37任一項(xiàng)所述的組合物，該組合物是抗血管生成的。
48.如權(quán)利要求23-37任一項(xiàng)所述的組合物，該組合物是抗轉(zhuǎn)移的。
49.如權(quán)利要求23-37任一項(xiàng)所述的組合物，該組合物可用于輔助放射治療處理。
50.如權(quán)利要求23所述的組合物，該組合物與DNA發(fā)生反應(yīng)。
51.如權(quán)利要求23所述的組合物，該組合物是免疫調(diào)節(jié)子。
52.如權(quán)利要求23-37任一項(xiàng)所述的組合物，該組合物含有受體的全體積血液和濃度約為0.01-200uM，更特定地0.1-50uM，更特定地10-25uM的活性試劑。
53.含有至少一種如權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)所述的化合物或一種其藥物學(xué)上可接受的鹽或絡(luò)合劑的劑量單位。
54.含有至少一種如權(quán)利要求23-52任一項(xiàng)所述的組合物的劑量單位。
55.如權(quán)利要求53或54所述的劑量單位，其中化合物或組合物的量足夠使受體全體積血液中的活性成分的濃度約為0.01-200uM，特別地為0.1-50uM，更特別地為10-25uM。
56.如權(quán)利要求53-55任一項(xiàng)所述的劑量單位，該單位包括固體和液體形式。
57.如權(quán)利要求56所述的劑量單位，該單位包括劑量形式，如膠囊、片劑或粉末，或溶于西也劑、糖漿、乳劑、溶液、懸液、混合物和灌輸劑。
58.如權(quán)利要求53所述的劑量單位，其中所述的制劑是預(yù)定或延遲釋放的。
59.如權(quán)利要求53所述的劑量單位，該單位含有至少一覆蓋層。
60.抑制與失調(diào)或疾病有關(guān)的肽的活性的方法，該方法包括用有效量的如權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)所述的化合物，如權(quán)利要求23-52任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求53-59任一項(xiàng)所述的劑量單位給藥。
61.如權(quán)利要求60所述的方法，其中所述蛋白是酶。
62.治療失調(diào)和疾病的方法，該方法包括用有效量的如權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)所述的化合物，如權(quán)利要求23-52任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求53-59任一項(xiàng)所述的劑量單位給藥。
63.如權(quán)利要求62所述的治療方法，該方法可以用于與蛋白質(zhì)或酶活性有關(guān)的失調(diào)和疾病。
64.如權(quán)利要求60或62所述的方法，其中所述的酶包括半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸蛋白酶和金屬蛋白酶家族的酶。
65.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的半胱氨酸蛋白酶包括組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉(zhuǎn)化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，肽鏈內(nèi)切酶，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內(nèi)切酶、腺病毒肽鏈內(nèi)切酶和口瘡病毒肽鏈內(nèi)切酶，和寄生蟲(chóng)生命周期所必須的蛋白酶，如來(lái)自變形蟲(chóng)、阿米巴、盤(pán)尾絲蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、線蟲(chóng)、網(wǎng)柄菌、Therilerium、血吸蟲(chóng)和錐蟲(chóng)種的蛋白酶。
66.如權(quán)利要求65所述的方法，其中所述的酶是組織蛋白酶B、Cruzaine和白介素-1β轉(zhuǎn)化酶。
67.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的絲氨酸肽酶包括二肽基-肽酶IV、酰氨?；?肽酶和寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶。
68.如權(quán)利要求67所述的方法，其中所述的酶是組織蛋白酶D。
69.如權(quán)利要求64所述的方法，其中所述的金屬蛋白酶包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶、膠原酶、基質(zhì)裂解素、膜型金屬蛋白酶和genatinases。
70.如權(quán)利要求63所述的方法，其中所述的疾病包括由組織退化所導(dǎo)致的疾病如關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲(chóng)造成的骨質(zhì)感染、parasitomies、牙周疾病和腫瘤轉(zhuǎn)移；與心房利鈉因子的退化有關(guān)的心臟疾?。谎仔约膊∪缰夤苎?、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松、急性胰腺炎和癌擴(kuò)散；失調(diào)如健忘癥、憂郁癥和血壓的調(diào)控；糖尿病，錐蟲(chóng)病，查格斯氏病，食物性失調(diào)，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體如白介素-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆(GM-CSF)的生長(zhǎng)刺激因子的產(chǎn)生有關(guān)的疾?。恍睦砭o張，對(duì)抗由HIV病毒(AIDS)引起的感染；導(dǎo)致髓鞘(mieline)退化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病，包括多發(fā)性硬化癥和自體免疫性腦脊髓炎；癌腫瘤，自體免疫性疾病，腫瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、黑素瘤、胃腸瘤、食道和甲狀腺腫瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
71.如權(quán)利要求70所述的方法，其中所述的疾病是腹水和實(shí)體腫瘤，特別地是乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、胃、腸、食道、甲狀腺腫瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
72.如權(quán)利要求60-63任一項(xiàng)所述的方法，該方法抑制幼骨髓細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂(S期)。
73.如權(quán)利要求60-63任一項(xiàng)所述的方法，其是抗血管生成的。
74.如權(quán)利要求60-63任一項(xiàng)所述的方法，其是抗轉(zhuǎn)移的。
75.如權(quán)利要求60-63任一項(xiàng)所述的方法，其可用于輔助放射治療處理。
76.如權(quán)利要求60-63任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括用活性成分給藥，劑量約為0.0001-500mg/kg體重，特定地為0.0001-100mg/kg體重和更特定地約為0.0001-30mg/kg體重。
77.如權(quán)利要求60-63任一項(xiàng)所述的方法，該方法包括用足夠量的活性成分給藥而使受體全體積血液中的活性成分的濃度約為0.01-200uM，特別地為0.1-50uM，更特別地為10-25uM。
78.如權(quán)利要求60-63任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的給藥是通過(guò)如權(quán)利要求53-59任一項(xiàng)所述的劑量單位的方式進(jìn)行的。
79.如權(quán)利要求60-63任一項(xiàng)所述的方法，其中所述的給藥是連續(xù)的、非連續(xù)的或循環(huán)的。
80.調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的方法，該方法包括用有效量的如權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)所述的化合物，如權(quán)利要求23-52任一項(xiàng)所述的組合物或如權(quán)利要求53-59任一項(xiàng)所述的劑量單位給藥。
81.如權(quán)利要求1-22任一項(xiàng)所述的化合物用于制備組合物的用途。
82.如權(quán)利要求81所述的用于制備藥品以抑制蛋白質(zhì)和酶活性的用途。
83.如權(quán)利要求23-52任一項(xiàng)所述的組合物用于制備藥品以抑制蛋白質(zhì)和酶活性的用途。
84.如權(quán)利要求81-83任一項(xiàng)所述的用途，其中所述的酶包括來(lái)自半胱氨酸蛋白酶、絲氨酸肽酶和金屬蛋白酶家族的酶。
85.如權(quán)利要求84所述的用途，其中所述的酶包括組織蛋白酶B、H、J、L、N、S、T和C(二肽基-肽酶-I)，白介素轉(zhuǎn)化酶(ICE)，由鈣激活的中性蛋白酶，鈣蛋白酶I和II，肽鏈內(nèi)切酶，病毒半胱氨酸蛋白酶，如心病毒肽鏈內(nèi)切酶、腺病毒肽鏈內(nèi)切酶和口瘡病毒肽鏈內(nèi)切酶，和寄生蟲(chóng)生命周期所必須的蛋白酶，如來(lái)自變形蟲(chóng)、阿米巴、盤(pán)尾絲蟲(chóng)、利什曼原蟲(chóng)、線蟲(chóng)、網(wǎng)柄菌、Therilerium、血吸蟲(chóng)和錐蟲(chóng)種的蛋白酶，組織蛋白酶D或腦啡肽酶(Encephalinase)，二肽基-肽酶IV，酰氨?；?肽酶和寡肽酶B和脯氨酰基-寡肽酶，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶，膠原酶，基質(zhì)裂解素，膜型金屬蛋白酶和genatinases。
86.如權(quán)利要求83所述的用途，其中所述的疾病包括由組織退化所導(dǎo)致的疾病如關(guān)節(jié)炎、肌肉萎縮、腫瘤入侵、腎小球腎炎(glomeronephritis)、寄生蟲(chóng)造成的骨質(zhì)感染、parasitomies、牙周疾病和腫瘤轉(zhuǎn)移；與心房利鈉因子的退化有關(guān)的心臟疾??；炎性疾病如支氣管炎、關(guān)節(jié)炎、風(fēng)濕、骨質(zhì)疏松、急性胰腺炎和癌擴(kuò)散；失調(diào)如健忘癥、憂郁癥和血壓的調(diào)控；糖尿病，錐蟲(chóng)病，查格斯氏病，食物性失調(diào)，暴食癥和厭食癥；酒精中毒，與細(xì)胞因子和細(xì)胞因子受體如白介素-6、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、干擾素γ(INFN-γ)、IL-1拮抗劑受體(IL-1RA)、IL-10和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞克隆(GM-CSF)的生長(zhǎng)刺激因子的產(chǎn)生有關(guān)的疾病；心理緊張，對(duì)抗由HIV病毒(AIDS)導(dǎo)致的感染；導(dǎo)致髓鞘(mieline)退化的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病，包括多發(fā)性硬化癥和自體免疫性腦脊髓炎；癌腫瘤，自體免疫性疾病，腫瘤包括乳房、骨髓、腺瘤、甲狀腺、黑素瘤、胃腸瘤、食道和甲狀腺腫瘤和成神經(jīng)細(xì)胞瘤。
87.如權(quán)利要求81或83所述的用于制備藥物以治療與蛋白或酶活性有關(guān)的失調(diào)和疾病的用途。
88.如權(quán)利要求81或83所述的用途，其抑制抑制幼骨髓細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞分裂(S期)。
89.如權(quán)利要求81或83所述的用途，其是抗血管生成的。
90.如權(quán)利要求81或83所述的用途，其是抗轉(zhuǎn)移的。
91.如權(quán)利要求81或83所述的用于輔助放射治療處理的用途。
92.如權(quán)利要求81或83所述的用途，其與DNA反應(yīng)。
93.如權(quán)利要求81或83所述的用途，其是免疫調(diào)節(jié)子。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有雙二苯基膦－二茂鐵配位配體的環(huán)鈀化合物和其類似物，其作為肽和酶的活性抑制劑，如絲氨酸肽酶、半胱氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶和肽鏈內(nèi)切酶家族的酶，這些酶的其中一些與惡性腫瘤，如甲狀腺腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移有關(guān)。該化合物的例子如圖所示。通過(guò)作用于上述酶并參與DNA分子的插入，這些化合物調(diào)控免疫系統(tǒng)。
文檔編號(hào)C07F15/00GK1741797SQ03824724
公開(kāi)日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2003年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月30日
發(fā)明者安東尼奧·卡洛斯·法韋羅·凱雷斯, 克羅迪婭·賓科萊托·特林達(dá)德, 伊瓦爾·路易斯·多斯·桑托斯·泰爾薩瑞爾 申請(qǐng)人:圣保羅國(guó)家資助研究基金會(huì)