專利名稱：利用集光多發(fā)色團(tuán)的多核苷酸的檢測和分析的方法以及組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在樣品中檢測和分析多核苷酸的方法、商品和組合物。
背景技術(shù)：
允許實時和高靈敏度地檢測DNA序列的方法具有很大的科學(xué)和經(jīng)濟(jì)利益1，2，3。它們的應(yīng)用包括醫(yī)學(xué)診斷、遺傳突變的鑒定、基因送遞監(jiān)控和特定的基因組技術(shù)4。陽離子有機(jī)染料如溴化乙錠和噻唑橙，當(dāng)插入雙鏈DNA(dsDNA)的溝槽中時發(fā)射，并作為直接的DNA雜交探針而起作用，但是缺乏序列特異性5，6。進(jìn)行鏈特異性分析的能量/電子傳遞發(fā)色團(tuán)對存在，但需要兩種核酸的化學(xué)標(biāo)記，或相同變化鏈的雙重修飾(例如分子信標(biāo))7，8。在標(biāo)記兩種DNA位點(diǎn)中的困難導(dǎo)致了低得率、高成本和單一標(biāo)記的雜質(zhì)，這降低了檢測敏感性9。
本領(lǐng)域需要檢測和分析樣品中特定多核苷酸的方法，以及在這種方法中有用的組合物和生產(chǎn)商品。
發(fā)明概述提供檢測和分析樣品中目標(biāo)多核苷酸的方法、組合物和生產(chǎn)的商品。
將一種懷疑含有目標(biāo)多核苷酸的樣品與聚陽離子多發(fā)色團(tuán)和一種同該目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的傳感器多核苷酸相接觸。傳感器多核苷酸包含一個陰離子主鏈，如一般的磷酸糖類主鏈，并與一種信號發(fā)色團(tuán)綴合。在樣品中目標(biāo)多核苷酸存在的情況下，信號發(fā)色團(tuán)能夠從激發(fā)的聚陽離子多發(fā)色團(tuán)中更有效地獲得能量并發(fā)出增加的能夠檢測的光或信號。目標(biāo)多核苷酸能夠當(dāng)其在樣品中出現(xiàn)時得到分析，或能夠在分析之前或結(jié)合分析進(jìn)行擴(kuò)增。
盡管陰離子傳感器能夠與陽離子多發(fā)色團(tuán)在缺少目標(biāo)的情況下結(jié)合，相對于由非互補(bǔ)序列混合物所產(chǎn)生的信號，在結(jié)合目標(biāo)多核苷酸以形成雙鏈復(fù)合物之后已發(fā)現(xiàn)令人驚訝的信號增強(qiáng)。這種信號的增強(qiáng)能夠用來在測試樣品中目標(biāo)多核苷酸的檢測方法中進(jìn)行應(yīng)用。
提供了含有對于實施本發(fā)明方法有用的試劑的溶液，以及含有這種試劑的試劑盒。還提供了由多發(fā)色團(tuán)和傳感器多核苷酸形成的傳感或檢測復(fù)合物。這些方法能夠用于多重配置中，其中多個不同的傳感器多核苷酸用于測試多個不同的目標(biāo)多核苷酸。這些方法能夠任選在一種表面上進(jìn)行，例如利用一種表面結(jié)合的聚陽離子多發(fā)色團(tuán)；該表面可以是一種傳感器。這些方法還能夠以均一的形式提供。本文所述的這些方法和商品能夠用作其它檢測多核苷酸技術(shù)的替代物。
附圖簡述

圖1描述了聚合物1和一種熒光素綴合傳感器多核苷酸的吸收(a(點(diǎn)狀線)和c(短劃線))和發(fā)射(b(正方形)和d(圓圈))光譜。分別對聚合物1和傳感器多核苷酸于380nm和480nm進(jìn)行激發(fā)。于380nm激發(fā)的聚合物1和傳感器多核苷酸的能量傳遞復(fù)合物也以黑色(e，實線)顯示。
圖2給出了傳感器系統(tǒng)的發(fā)射光譜，所述傳感器系統(tǒng)于pH＝8的10mmol檸檬酸鈉和100mmol氯化鈉緩沖液中包含雜交的(實線)和未雜交的(點(diǎn)狀線)傳感器多核苷酸。光譜相對于聚合物1的發(fā)射進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。
圖3描述了由多發(fā)色團(tuán)(聚合物1)的激發(fā)以及向傳感器多核苷酸的能量傳遞以及隨后向多核苷酸特異性染料(溴化乙錠)的能量傳遞所產(chǎn)生的傳感器系統(tǒng)的發(fā)射光譜，所述傳感器系統(tǒng)包含雜交的(實線)和未雜交的(點(diǎn)狀線)傳感器多核苷酸。測量是在磷酸鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(50mM，pH＝7.40)中。見實施例4。
圖4描述了在傳感器系統(tǒng)中一種多核苷酸特異性染料(溴化乙錠，EB)的放大的發(fā)射光譜，所述傳感器系統(tǒng)包含雜交的(實線)傳感器多核苷酸。放大的發(fā)射信號是多發(fā)色團(tuán)(聚合物1)的激發(fā)以及向傳感器多核苷酸的能量傳遞以及隨后向EB的能量傳遞的結(jié)果。在雙鏈DNA(點(diǎn)狀線)中的直接的EB發(fā)射以及由傳感器多核苷酸激發(fā)以及隨后向EB的能量傳遞所產(chǎn)生的發(fā)射(短劃線)證明了由聚陽離子多發(fā)色團(tuán)所提供的增強(qiáng)的信號。測量是在磷酸鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(50mM，pH＝7.40)中。見實施例5。
圖5給出了在磷酸鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(50mM，pH＝7.40)中EB以及雜交的(實線)和未雜交的(點(diǎn)狀線)傳感器多核苷酸都存在的情況下，在聚合物1激發(fā)后EB的發(fā)射光譜。見實施例6。發(fā)射是僅僅在雜交的雙鏈DNA的情況下由聚陽離子多發(fā)色團(tuán)向插入的EB的能量傳遞的結(jié)果。
發(fā)明詳述目前的DNA和RNA傳感器的技術(shù)(包括“基因芯片”和“DNA芯片”)依賴于熒光標(biāo)記(生光團(tuán))與DNA單鏈的共價附著，從而依賴于樣品或樣品組分的標(biāo)記，具有由樣品間標(biāo)記反應(yīng)效率的不同所產(chǎn)生的不可避免的問題，因而需要復(fù)雜的相互校準(zhǔn)。其它的系統(tǒng)依賴于多重標(biāo)記的探針(例如，分子信標(biāo)，Taqman、Scorpion探針、Eclipse探針)，從而需要生光團(tuán)和猝滅劑與精確設(shè)計的序列之間的多重附著。
發(fā)明方法包括將樣品與包含至少兩種組分的水溶液相接觸；(a)一種集光的、聚陽離子的、發(fā)光的多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)如，例如一種綴合的聚合物、半導(dǎo)體量子點(diǎn)狀或樹狀結(jié)構(gòu)，它是水溶性的，和(b)一種與發(fā)光信號發(fā)色團(tuán)(稱作“寡-C*”)綴合的傳感器多核苷酸。具有信號發(fā)色團(tuán)波長特性的光的發(fā)射表明具有與傳感器多核苷酸序列互補(bǔ)的堿基序列的目標(biāo)多核苷酸溶液的存在。通過利用具有不同堿基序列和不同信號發(fā)色團(tuán)的多個傳感器多核苷酸(寡1-C1*、寡2-C2*等)，能夠獨(dú)立地檢測多個各自具有特異性堿基序列的多核苷酸?？梢砸氲谌N組分如多核苷酸特異性染料以通過進(jìn)一步將能量從傳感器多核苷酸傳遞給多核苷酸特異性染料來提高選擇性。
選擇集光發(fā)色團(tuán)和信號發(fā)色團(tuán)(C*)以便兩個物種的吸收波段具有最小的重疊，從而兩個物種的發(fā)光發(fā)射光譜具有不同的波長。當(dāng)在水溶液中進(jìn)行制備時，集光和發(fā)光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)帶正電(例如帶正電的綴合聚合電解質(zhì))。通過靜電引力確保帶負(fù)電傳感器多核苷酸和帶正電集光和發(fā)光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)之間的接近。當(dāng)暴露于具有集光發(fā)色團(tuán)吸收波段中波長的入射輻射時，有來自信號發(fā)色團(tuán)的發(fā)射，例如通過Frster能量傳遞機(jī)制。在加入目標(biāo)多核苷酸如具有與傳感器多核苷酸序列相互補(bǔ)的堿基序列的單鏈DNA(ssDNA)之后，ssDNA與傳感器多核苷酸雜交，導(dǎo)致沿著DNA鏈負(fù)電荷密度的升高10，11。在這些環(huán)境下，并考慮到嚴(yán)格的靜電力，傳感器多核苷酸和帶正電的集光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)之間的相互作用將是有利的，導(dǎo)致有效的能量傳遞和來自信號發(fā)色團(tuán)的強(qiáng)烈發(fā)射。當(dāng)加入具有與傳感器多核苷酸序列不相互補(bǔ)的堿基序列的ssDNA時，不發(fā)生堿基對雜交。通過與非互補(bǔ)ssDNA的競爭來篩選集光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)與傳感器多核苷酸之間的靜電絡(luò)合。因而，集光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)和寡-C*之間的平均距離在非互補(bǔ)序列存在的情況下較大，導(dǎo)致較低效率的向信號發(fā)色團(tuán)的能量傳遞。當(dāng)在其互補(bǔ)目標(biāo)存在的情況下信號寡-C*的發(fā)射比在其非互補(bǔ)鏈存在的情況下要強(qiáng)烈。整個方案提供了一種傳感器以在試驗溶液中檢測具有特異性堿基序列的目標(biāo)多核苷酸的存在。通過使用具有不同堿基序列和不同信號發(fā)色團(tuán)的多個傳感器多核苷酸，能夠單獨(dú)檢測多個目標(biāo)。
除了所述的方法，發(fā)明還提供含有至少兩種組分的主要含水的溶液；(a)一種陽離子多發(fā)色團(tuán)，和(b)一種包含與信號發(fā)色團(tuán)綴合的陰離子多核苷酸的“傳感器多核苷酸”(寡-C*)。
如在實施例中所表明的，由水溶性多發(fā)色團(tuán)如綴合的聚合物所提供的光學(xué)放大能夠用來檢測多核苷酸與傳感器多核苷酸的雜交。這種放大能夠通過利用較高分子量的水溶性綴合聚合物或其它結(jié)構(gòu)如本文所述的聚陽離子多發(fā)色團(tuán)增強(qiáng)。發(fā)明能夠以利用熒光檢測法的簡易性的均一形式提供。發(fā)明能夠用于檢測擴(kuò)增的目標(biāo)多核苷酸或，由于大的信號放大，用作一種單獨(dú)鏈的分析，而不需要多核苷酸的擴(kuò)增。
不像基因芯片技術(shù)，本發(fā)明不必需要在分析之前通過將生光團(tuán)或發(fā)色團(tuán)共價結(jié)合到包含于或源于樣品的多核苷酸而對每個待分析樣品進(jìn)行標(biāo)記。那些偶聯(lián)方法在偶聯(lián)效率的重復(fù)性上具有固有的困難并且產(chǎn)生對樣品間相互校準(zhǔn)的需要。
本文所述的發(fā)明對于任何測試都是有用的，在所述測試中能夠關(guān)于目標(biāo)多核苷酸對樣品進(jìn)行分析。一般的測試包括測定樣品中目標(biāo)多核苷酸的存在或其相對量，或者測試可以是定量的或半定量的。
發(fā)明的方法都能夠以多種形式實施。通過與各個傳感器多核苷酸綴合的不同信號發(fā)色團(tuán)的應(yīng)用，可以使用多種不同的傳感器多核苷酸來檢測樣品中相應(yīng)不同的目標(biāo)多核苷酸。利用2、3、4、5、10、15、20、25、50、100、200、400或更多不同傳感器多核苷酸提供多種方法，所述傳感器多核苷酸能夠同時用來測試相應(yīng)不同的目標(biāo)多核苷酸。
這些方法能夠在基片上，以及溶液中實施，盡管由于擴(kuò)散問題溶液形式預(yù)計更快。因而測試能夠，例如，在基片上以陣列形式實施，所述基片可以是一種傳感器。這能夠通過將一種測試組分錨定于或整合入基片，例如傳感器多核苷酸、聚陽離子多發(fā)色團(tuán)或二者之上。這些基片可以是玻璃、硅、紙、塑料的表面，或用作光電轉(zhuǎn)換器的光電半導(dǎo)體(如，但不限于，摻銦的硝酸鎵或聚合的聚苯胺等)的表面。給定的傳感器多核苷酸的定位可以是已知的或在陣列形式中是可測定的，并且陣列形式可以是可微尋址的(microaddressable)或可納尋址的(nanoaddressable)。在一種變異型中，能夠?qū)⒁粋€或多個含有擴(kuò)增產(chǎn)物的樣品附著于基片，并且基片能夠與一種或多種標(biāo)記的傳感器多核苷酸以及聚陽離子多發(fā)色團(tuán)相接觸。
在進(jìn)一步詳述本發(fā)明之前，應(yīng)理解本發(fā)明并不限于所述的特定方法、設(shè)備、溶液或裝置，因為這些方法、設(shè)備、溶液或裝置當(dāng)然能夠變化。還應(yīng)理解本文所用的術(shù)語僅僅是為了描述特定的實施方案的目的，并不限制本發(fā)明的范圍。
單數(shù)形式的使用包括復(fù)數(shù)含義，除非上下文清楚地另外指定。因而，例如，“一種目標(biāo)多核苷酸”的含義包括多種目標(biāo)多核苷酸，“一種信號發(fā)色團(tuán)”的含義包括多種這類發(fā)色團(tuán)，“一種傳感器多核苷酸”的含義包括多種傳感器多核苷酸等。此外，特定復(fù)數(shù)寫法，如“二”、“三”等的使用理解為相同事物的較大數(shù)目，除非上下文清楚地另外指定。
術(shù)語如“連接的”、“附著的”和“鍵合的”在本文中可交換使用并且包括直接以及間接的連接、附著、鍵合或綴合，除非上下文清楚地另外指定。當(dāng)敘述一個范圍的值時，應(yīng)理解在所敘述的該范圍的上限和下限之間的每一個中間整數(shù)值及其每個分?jǐn)?shù)值也與這些值之間的小范圍一起得到具體地公開。任何范圍的上限和下限都能夠獨(dú)立地包括在該范圍之內(nèi)或排除于該范圍之外，并且每個其中包括一個、零個或兩個界限的范圍也包括在發(fā)明之內(nèi)。在討論值具有固有的界限時，例如在一種組分能夠以0-100％的濃度存在時，或在水溶液的pH值能夠由1到14時，對那些固有的界限進(jìn)行具體地公開。在明確敘述一個值時，應(yīng)理解與所敘述的值相同量的值也在發(fā)明的范圍內(nèi)，基于該值的范圍也在發(fā)明的范圍內(nèi)。當(dāng)公開一種組合時，該組合的要素的每種亞組合也得到具體地公開并且在發(fā)明的范圍之內(nèi)。相反地，在公開了不同的要素或要素組時，其組合也得到公開。在一個發(fā)明的任何要素公開為具有多個選擇時，該發(fā)明的實施例也由此得到公開，所述發(fā)明中單一地將每一種選擇或與其它選擇組合排除在外；一個發(fā)明的一種以上的要素能夠具有這類排除，并且由此也公開了具有這類排除的要素的所有組合。
除非另外定義或上下文清楚地另外指定，本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員所通常理解的相同意義。盡管能夠?qū)⑴c本文所述的那些相似或等同的任何方法和材料用于發(fā)明的實施或測試上，現(xiàn)在還是要描述優(yōu)選的方法和材料。
為了公開和描述參考文獻(xiàn)所引的特定的材料和方法，在此將所提及的所有出版物引入作為參考。本文所討論的出版物僅是基于其公開內(nèi)容在本申請的申請日之前而提供。本文沒有內(nèi)容可以解釋為承認(rèn)本發(fā)明無權(quán)依靠優(yōu)先權(quán)發(fā)明而早于這些公開內(nèi)容。
定義在描述本發(fā)明中，將會用到以下術(shù)語，并且如下所示進(jìn)行定義。
術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”在本文中可以交換使用指一種任何長度的核苷酸的聚合形式，并且可以包括核糖核苷酸、脫氧核糖核苷酸及其類似物，或其混合物。這些術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因而，這些術(shù)語包括三鏈、雙鏈和單鏈脫氧核糖核苷酸(“DNA”)，以及三鏈、雙鏈和單鏈核糖核苷酸(“RNA”)。它還包括多核苷酸的例如通過烷基化和/或通過加帽反應(yīng)修飾的和未修飾的形式。
不論是修飾的還是未修飾的，傳感器多核苷酸都是陰離子化的并且能夠在不存在目標(biāo)多核苷酸的情況下與陽離子多發(fā)色團(tuán)相互作用。目標(biāo)多核苷酸在理論上能夠加上電荷或去除電荷，盡管它一般預(yù)期是陰離子化的，例如RNA或DNA。
更具體地，術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”包括多脫氧核糖核苷酸(包含2-脫氧-D-核糖)，多核糖核苷酸(包含D-核糖)，包括剪接的或未剪接的tRNA、rRNA、hRNA和mRNA，和其它類型的嘌呤或嘧啶堿基的N-或C-糖苷多核苷酸，和其它包含磷酸或其它聚陰離子主鏈的聚合物，和其它合成的序列特異性核酸聚合物，前提是該聚合物包含構(gòu)型允許如在DNA或RNA中所發(fā)現(xiàn)的堿基配對和堿基堆積的核堿基。在術(shù)語“多核苷酸”、“寡核苷酸”、“核酸”和“核酸分子”，之間沒有長度上的區(qū)別，且這些術(shù)語在本文可互換使用。這些術(shù)語僅僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因而，這些術(shù)語包括，例如3’-脫氧-2’，5’-DNA、寡脫氧核糖核苷酸N3’P5’氨基磷酸酯、2’-O-烷基取代RNA、雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA，及其雜交物包括例如DNA和RNA之間的雜交物，并且還包括已知類型的修飾，例如標(biāo)記、烷基化、“帽”、一個或多個用類似物進(jìn)行的核苷酸的替代，核苷酸間修飾如，例如那些以帶負(fù)電的鍵合(例如，硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等)進(jìn)行的修飾、那些包含側(cè)基部分例如蛋白質(zhì)(包括酶(例如核酸酶)、毒素、抗體、信號肽、聚-L-賴氨酸等)的修飾、那些包含插入物(例如，吖啶、補(bǔ)骨脂素等)的修飾、那些包含螯合物(例如，金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、那些包含烷基化物的修飾、那些具有改進(jìn)的鍵合(例如，α異頭核酸等)的修飾、以及多核苷酸或寡核苷酸的未修飾形式。
應(yīng)當(dāng)理解如本文所用的術(shù)語“核苷”和“核苷酸”將包括那些不但包含已知的嘌呤和嘧啶堿基，還包含其它已進(jìn)行修飾的雜環(huán)堿基的部分。這類修飾包括甲基化的嘌呤或嘧啶、?；泥堰驶蜞奏?，或其它雜環(huán)。經(jīng)修飾的核苷或核苷酸還能夠包括在糖部分上的修飾，例如，其中一個或多個羥基為鹵素、脂肪族所取代，或功能化為醚、胺等。術(shù)語“核苷單位(nudeotidic unit)”包括核苷和核苷酸。
另外，對核苷單位的修飾包括重排、添加、替代或在嘌呤或嘧啶堿基上改變功能基，所述功能基與各自互補(bǔ)的嘧啶或嘌呤形成氫鍵。得到的經(jīng)修飾的核苷單位可以任選地與其它這種經(jīng)修飾的核苷單位但不與A、T、C、G或U形成堿基對?？梢哉喜粫柚苟嗪塑账峁δ艿拿搲A基位點(diǎn)；優(yōu)選多核苷酸不包含脫堿基位點(diǎn)。在多核苷酸中的一些或全部殘基能夠任選以一種或多種方式進(jìn)行修飾。
在允許形成分別在胸腺嘧啶核苷的N3-H和C4-氧與腺嘌呤核苷的N1和C6-NH2之間和分別在胞嘧啶核苷的C2-氧、N3和C4-NH2與鳥嘌呤核苷的C2-NH2、N′-H和C6-氧之間的氫鍵的條件下，標(biāo)準(zhǔn)的A-T和G-C堿基對形成。因而，可以修飾鳥嘌呤核苷(2-氨基-6-氧-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)以形成異鳥嘌呤核苷(2-氧-6-氨基-9-β-D-呋喃核糖基-嘌呤)。這種修飾產(chǎn)生了一種核苷堿基，它不再有效地與胞嘧啶形成標(biāo)準(zhǔn)的堿基對。但是，修飾胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氧-4-氨基-嘧啶)以形成異胞嘧啶(1-β-D-呋喃核糖基-2-氨基-4-氧-嘧啶)產(chǎn)生一種修飾的核苷酸，它將不會有效地與鳥嘌呤核苷形成堿基對但將與異鳥嘌呤核苷形成堿基對。異胞嘧啶由Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)可購得；異胞嘧啶核苷可以通過Switzer等(1993)Biochemistry 3210489-10496和其中引用的參考文獻(xiàn)中所述的方法制備；2′-脫氧-5-甲基-異胞嘧啶核苷可以通過Tor等(1993)J.Am.Chem.Soc.1154461-4467和其中引用的參考文獻(xiàn)的方法制備；而異鳥嘌呤核苷酸可以利用Switzer等(1993)，同上，和Mantsch等(1993)Biochem.145593-5601所述的方法，或通過在授予Collins等的美國專利號5,780,610中所述的方法制備。其它非天然的堿基對可以通過在Piccirilli等(1990)Nature34333-37中所述的合成2，6-二氨基嘧啶及其互補(bǔ)體(1-甲基吡唑-[4，3]嘧啶-5，7-(4H，6H)-二酮)的方法進(jìn)行合成。其他這種形成獨(dú)特堿基對的修飾的核苷單位是已知的，如在Leach等(1992)J.Am.Chem.Soc.1143675-3683和Switzer等，同上中所描述的。
“優(yōu)選結(jié)合”或“優(yōu)先雜交”指與樣品中非互補(bǔ)性聚合物相比，一種多核苷酸或PNA結(jié)合到樣品中它的互補(bǔ)體上的增強(qiáng)的傾向。
雜交條件將一般包括小于大約1M的鹽濃度，更通常小于大約500mM并且優(yōu)選小于大約200mM。在肽核酸和多核苷酸之間雜交的情況下，雜交能夠在含有小量或不含鹽的溶液中進(jìn)行。雜交溫度能夠低至5℃，但一般大于22℃，更通常大于大約30℃，并且優(yōu)選超過大約37℃。較長的片段可以需要較高的雜交溫度以進(jìn)行特異性雜交。其它因素可以影響雜交的嚴(yán)格性，包括堿基組成和互補(bǔ)鏈的長度，有機(jī)溶劑的存在以及堿基錯配的程度，并且所用參數(shù)的組合比任何單一參數(shù)的絕對測量更加重要。對于一種給定測試形式的適當(dāng)?shù)碾s交條件能夠由本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行測定；可以進(jìn)行調(diào)節(jié)的非限制性參數(shù)包括測試組分的濃度、所用的鹽及其濃度、離子強(qiáng)度、溫度、緩沖液類型和濃度、溶液pH、降低背景結(jié)合封閉劑如重復(fù)序列或封閉蛋白質(zhì)溶液的存在和濃度、去污劑的類型和濃度、提高多核苷酸相對濃度的分子如聚合物、金屬離子及其濃度、螯合劑及其濃度，以其其它本領(lǐng)域公知的條件。
“多重性的”在此指一種測試或其它分析性方法，其中能夠同時測試多個被分析物。
“任選的”或“任選地”意為隨后所述的事件或環(huán)境可以發(fā)生或可以不發(fā)生，以及說明書包括發(fā)生了事件或環(huán)境的情況和其未發(fā)生的情況。
樣品含有或懷疑含有目標(biāo)多核苷酸的樣品的部分能夠是任何來源的生物學(xué)材料，它含有能夠直接或間接獲自一種活體生物的多核苷酸，所述生物包括細(xì)胞、組織或流體，以及由該生物所遺留的沉積物，包括病毒、支原體和化石。樣品可以包含通過合成方法制備的完整的或部分的多核苷酸。一般地，樣品在一種主要含水的介質(zhì)中獲得或分散在該介質(zhì)中。樣品的非限制性例子包括血液、尿液、精液、乳、痰、粘液、口腔棉拭、陰道棉拭、直腸棉拭、吸出物、針刺活組織檢查、例如通過外科手術(shù)或尸體解剖所獲組織的切片、血漿、血清、脊髓液、淋巴液、皮膚、呼吸道、腸道和泌尿生殖道的外分泌物、眼淚、口水、腫瘤、器官、體外細(xì)胞培養(yǎng)組分樣品(包括但不限于源自細(xì)胞培養(yǎng)基中細(xì)胞生長的條件培養(yǎng)基、推定為病毒感染的細(xì)胞、重組細(xì)胞和細(xì)胞組分)以及包含多核苷酸序列的重組文庫。樣品可以存在于本文所述基片上?；梢允前瑯悠返妮d玻片，如用在熒光原位雜交(FISH)中的載玻片。
樣品可以是一種陽性對照樣品，它已知包含目標(biāo)多核苷酸或其替代品。也能夠使用一種陰性對照樣品，盡管預(yù)期其不含目標(biāo)多核苷酸，但懷疑包含它(通過一種或多種試劑的污染)或能夠產(chǎn)生假陽性的其它組分，并通過用于給定分析中的試劑的目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行試驗從而確認(rèn)沒有污染，以及測定一套給定的分析條件是否產(chǎn)生假陽性(即使在樣品中沒有目標(biāo)多核苷酸的情況下的陽性信號)。
樣品能夠進(jìn)行稀釋、溶液、懸浮、提取或另外進(jìn)行處理來溶解和/或純化任何存在的目標(biāo)多核苷酸或使它易為用于擴(kuò)增方案中的試劑或檢測試劑所接近。在樣品包含細(xì)胞的情況下，能夠?qū)⒓?xì)胞裂解或透化以釋放細(xì)胞內(nèi)的多核苷酸。能夠使用一步透化緩沖液裂解細(xì)胞，它允許在裂解后直接進(jìn)行進(jìn)一步的步驟，例如聚合酶鏈反應(yīng)。
目標(biāo)多核苷酸和由其產(chǎn)生的擴(kuò)增產(chǎn)物目標(biāo)多核苷酸可以是單鏈的、雙鏈的，或更高級的，并可以是線性的或環(huán)狀的。例示性的單鏈目標(biāo)多核苷酸包括mRNA、rRNA、tRNA、hnRNA、ssRNA或ssDNA病毒基因組，盡管這些多核苷酸可以包含內(nèi)部互補(bǔ)序列和顯著的二級結(jié)構(gòu)。例示性的雙鏈目標(biāo)多核苷酸包括基因組DNA、線粒體DNA、葉綠體DNA、dsRNA或dsDNA病毒基因組、質(zhì)粒、噬菌體和類病毒。目標(biāo)多核苷酸能夠合成制備或由生物來源純化?？梢詫δ繕?biāo)多核苷酸進(jìn)行純化以去除或減少一種或多種不希望的樣品組分或濃縮目標(biāo)多核苷酸。相反地，在目標(biāo)多核苷酸太濃而不能進(jìn)行特定分析的情況下，可以稀釋目標(biāo)多核苷酸。
在樣品收集和任選的核酸提取之后，含有目標(biāo)多核苷酸的樣品核酸部分能夠進(jìn)行一種或多種預(yù)備性反應(yīng)。這些預(yù)備性反應(yīng)能夠包括體外轉(zhuǎn)錄(IVT)、標(biāo)記、片段化、擴(kuò)增和其它反應(yīng)。能夠在檢測和/或擴(kuò)增之前首先以反轉(zhuǎn)錄酶和引物處理mRNA以產(chǎn)生cDNA；這能夠在體外以純化的mRNA進(jìn)行或原位進(jìn)行，例如在附著于載玻片上的細(xì)胞或組織中。核酸擴(kuò)增提高了目的序列如目標(biāo)多核苷酸的拷貝數(shù)。多種擴(kuò)增方法適于應(yīng)用；適合的擴(kuò)增反應(yīng)的非限制性例子包括聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR)、自動維持序列擴(kuò)增(3SR)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)、Q Beta復(fù)制酶的使用、反轉(zhuǎn)錄、切口平移等。
在目標(biāo)多核苷酸為單鏈的情況下，擴(kuò)增的第一個循環(huán)形成了與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物。如果目標(biāo)多核苷酸為單鏈RNA，在第一擴(kuò)增中使用具有反轉(zhuǎn)錄酶活性的聚合酶以將RNA反轉(zhuǎn)錄成DNA，另外的擴(kuò)增循環(huán)就能夠進(jìn)行以拷貝引物延伸產(chǎn)物。PCR的引物當(dāng)然必須設(shè)計為與在其相應(yīng)模板中將產(chǎn)生可擴(kuò)增片段的區(qū)域雜交；因而，每個引物必須雜交以便其3’核苷酸與在其互補(bǔ)模板鏈中的一個核苷酸配對，所述核苷酸位于用來在PCR中復(fù)制該互補(bǔ)模板的引物的3’核苷酸的3’。
目標(biāo)多核苷酸一般通過將一種或多種目標(biāo)多核苷酸的鏈與引物和聚合酶相接觸來擴(kuò)增，所述聚合酶具有延伸引物并拷貝目標(biāo)多核苷酸以生產(chǎn)全長互補(bǔ)的多核苷酸或其較小部分的活性。可以使用任何具有能夠拷貝目標(biāo)多核苷酸的聚合酶活性的酶，包括DNA聚合酶、RNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、具有一種以上類型聚合酶活性的酶，并且酶可以是不耐熱的或熱穩(wěn)定的。還能夠使用酶的混合物。例示性的酶包括DNA聚合酶如DNA聚合酶I(″PolI″)、PolI的克列諾片段、T4、T7、SequenaseT7、SequenaseVersion 2.0T7、Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球菌屬物種(Pyrococcus sp) GB-D DNA聚合酶；RNA聚合酶如大腸桿菌(E.coli)、SP6、T3和T7RNA聚合酶；和反轉(zhuǎn)錄酶如AMV、M-MuLV、MMLV、RNAse、H-MMLV(SuperScript)、SuperScriptII、ThermoScript、HIV-1和RAV2反轉(zhuǎn)錄酶。所有這些酶都是商業(yè)上現(xiàn)有的。具有多重特異性的例示性聚合酶包括RAV2和Tli(exo-)聚合酶。例示性的熱穩(wěn)定聚合酶包括Tub、Taq、Tth、Pfx、Pfu、Tsp、Tfl、Tli和火球菌屬物種GB-D DNA聚合酶。
選擇適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)條件以允許進(jìn)行目標(biāo)多核苷酸的擴(kuò)增，包括pH、緩沖液、離子強(qiáng)度、一種或多種鹽的存在和濃度、反應(yīng)物和輔因子如核苷酸和鎂和/或其它金屬離子(例如，錳)的存在和濃度、任選的助溶劑、溫度、包含一個聚合酶鏈反應(yīng)的擴(kuò)增方案的熱循環(huán)曲線，并且可以部分依賴所用的聚合酶以及樣品的性質(zhì)。助溶劑包括甲酰胺(一般于大約2％到大約10％)、甘油(一般于大約5％到大約10％)和DMSO(一般于大約0.9％到大約10％)?？梢栽跀U(kuò)增方案中使用技術(shù)從而使假陽性產(chǎn)物或擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的假象最小化。這些包括″降落(touchdown)″PCR、熱啟動技術(shù)、使用嵌套引物或設(shè)計PCR引物使它們在引物二聚體形成的結(jié)果中形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)并因而不被擴(kuò)增。能夠利用加速PCR的技術(shù)，例如離心PCR，它允許在樣品中更強(qiáng)的對流，并且包括紅外加熱步驟以進(jìn)行樣品的快速加熱和冷卻。能夠進(jìn)行一個或多個擴(kuò)增循環(huán)。能夠使用過量的一種引物以在PCR過程中產(chǎn)生過量的一種引物延伸產(chǎn)物；優(yōu)選地，過量產(chǎn)生的引物延伸產(chǎn)物是待檢測的擴(kuò)增產(chǎn)物?？梢允褂枚喾N不同的引物以擴(kuò)增不同的目標(biāo)多核苷酸或樣品中特定目標(biāo)多核苷酸的不同區(qū)域。
擴(kuò)增的目標(biāo)多核苷酸可以進(jìn)行擴(kuò)增后處理。例如，在一些情況下，希望在雜交之前將目標(biāo)多核苷酸片段化從而提供更易接近的片段。核酸的片段化能夠通過任何產(chǎn)生在實施的分析中有用大小的片段的方法進(jìn)行；適當(dāng)?shù)奈锢?、化學(xué)和酶學(xué)方法是本領(lǐng)域公知的。
擴(kuò)增反應(yīng)能夠在允許傳感器多核苷酸在一個擴(kuò)增循環(huán)的至少一部分過程中雜交到擴(kuò)增產(chǎn)物上的條件下進(jìn)行。當(dāng)分析以這種方式進(jìn)行時，通過監(jiān)控來自信號發(fā)色團(tuán)的光發(fā)射的變化能夠進(jìn)行這種雜交事件的實時檢測，該光發(fā)射基于該擴(kuò)增方案過程中的雜交而發(fā)生。聚陽離子多發(fā)色團(tuán)由于它們包含的多個發(fā)色團(tuán)，集光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)已證實是有效的光吸收劑。例子包括，但不限于綴合的聚合物、綴合分子的聚集體、附著于飽和聚合物上的發(fā)光染料、半導(dǎo)體量子點(diǎn)狀和樹狀結(jié)構(gòu)。例如，在綴合聚合物上的每個重復(fù)單位能夠認(rèn)為是一個起作用的發(fā)色團(tuán)，量子點(diǎn)由許多原子組成，飽和的聚合物能夠為在側(cè)鏈上的許多發(fā)光染料分子所功能化，包含許多共價連接的個體發(fā)色團(tuán)的樹枝狀化合物(dendrimer)能夠得到合成。發(fā)色團(tuán)組件附著于固體支持物，如聚合物珠或表面上，也能夠用于集光。
集光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)能夠?qū)⒛芰坑行У貍鬟f給附近的發(fā)光物(例如，“信號發(fā)色團(tuán)”)。能量傳遞的機(jī)制包括，例如，共振能量傳遞(Frster(或熒光)共振能量傳遞，F(xiàn)RET)、量子電荷交換(Dexter能量傳遞)等。但是一般地，這些能量傳遞機(jī)制是相對短范圍的；即，需要集光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)密切接近信號發(fā)色團(tuán)以進(jìn)行有效的能量傳遞。在進(jìn)行有效能量傳遞的條件下，當(dāng)集光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)中的個體發(fā)色團(tuán)數(shù)目很大時會發(fā)生來自信號發(fā)色團(tuán)發(fā)射的擴(kuò)大；即，當(dāng)入射光(“泵光(pump light)”)處于集光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)吸收的波長時來自信號發(fā)色團(tuán)的發(fā)射比當(dāng)信號發(fā)色團(tuán)被泵光直接激發(fā)時更加強(qiáng)烈。
綴合聚合物(CPs)的特征是非定域電子結(jié)構(gòu)，它能夠用作化學(xué)和生物學(xué)目標(biāo)的高度易傳感的光學(xué)報道分子12，13。因為有效的綴合長度基本上比聚合物鏈的長度短，所以骨架在靠近處包含大量的綴合片段。因而，綴合的聚合物對集光是有效的并使得通過Frster能量傳遞進(jìn)行光學(xué)放大成為可能14。
已經(jīng)對陽離子聚電解質(zhì)和DNA之間自發(fā)的共聚體絡(luò)合進(jìn)行過描述，并且主要是協(xié)同靜電力的結(jié)果15，16，17。近來還認(rèn)定了在芳香族聚合物單元和DNA堿基之間的疏水相互作用18，19。聚電解質(zhì)/DNA相互作用的自由能受與溶液變量相關(guān)使用的參與物的結(jié)構(gòu)控制，所述變量如pH、離子強(qiáng)度和溫度20。近來對這些相互作用的強(qiáng)度和特異性進(jìn)行了協(xié)調(diào)以識別質(zhì)粒DNA的三級結(jié)構(gòu)21。
用于本發(fā)明的多發(fā)色團(tuán)是聚陽離子的并能夠與傳感器多核苷酸靜電相互作用?？梢栽谒龇椒ㄖ惺褂萌魏文軌蛭展獠⒛芰總鬟f給傳感器多核苷酸上信號發(fā)色團(tuán)的聚陽離子多發(fā)色團(tuán)。能夠使用的例示性的多發(fā)色團(tuán)包括綴合的聚合物、飽和的聚合物或以任何活的方式整合多個發(fā)色團(tuán)的樹枝狀化合物，以及半導(dǎo)體納晶體(SCNCs)?？梢灾苽渚Y合的聚合物、飽和的聚合物和樹枝狀化合物以整合多個陽離子物或使它們在合成后衍生化為聚陽離子的；可以通過將陽離子物加至它們的表面上使半導(dǎo)體納晶體聚陽離子化。
在一個優(yōu)選的實施方案中，使用一種綴合的聚合物作為聚陽離子多發(fā)色團(tuán)。一個具體的例子示于結(jié)構(gòu)1中，其中可溶于水的陽離子綴合聚合物是具有碘化物相反陰離子的聚(9，9-雙(6′-N，N，N-三甲基銨)-已基)-亞苯基芴(fluorene phenylene))22。這種聚合物的特定大小并不重要，只要它能夠吸收光并將能量傳遞給帶至近處的信號發(fā)色團(tuán)。一般的“n”值落入2到大約100,000的范圍內(nèi)。這種具體的分子結(jié)構(gòu)并不重要；能夠使用任何具有足夠發(fā)光量子效率的水溶性陽離子綴合聚合物。
水溶性綴合寡聚體也能夠用作聚陽離子多發(fā)色團(tuán)。這種具有碘化物相互陰離子的水溶性陽離子發(fā)光綴合寡聚體的一個例子示于下面(這里表示為寡聚體2) 盡管較小的寡聚體2并不呈現(xiàn)一種高分子量聚合物的大的信號放大特性，但這種小分子對于使結(jié)構(gòu)特性關(guān)系簡單化(deconuolute)是有用的，所述關(guān)系由于固有的多分散性和在聚合物中所發(fā)現(xiàn)的一批批之間的變化而難以測定。另外，在含水介質(zhì)中寡聚體如2比它們的多聚對應(yīng)體更加可溶，并且預(yù)計疏水相互作用對于2比對于聚合物結(jié)構(gòu)更不重要。因而可以如愿地利用寡聚體的集合進(jìn)行特異性的應(yīng)用。加入有機(jī)溶劑，例如一種可混于水的有機(jī)溶劑如乙醇能夠?qū)е卤尘癈*發(fā)射的減少。有機(jī)溶劑的存在能夠降低疏水相互作用并減弱背景C*發(fā)射。
傳感器多核苷酸提供一種陰離子性的和與待測目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的，并且具有預(yù)定序列的傳感器多核苷酸。傳感器多核苷酸可以是帶分枝的、多聚體的或環(huán)狀的，但一般是線性的，并且可以包含非天然堿基?？梢灾苽渚哂腥魏纹谕膲A基序列的傳感器多核苷酸。將信號發(fā)色團(tuán)附著于傳感器多核苷酸多核苷酸上的化學(xué)方法是本領(lǐng)域公知的23。具體的傳感器多核苷酸結(jié)構(gòu)，包括綴合到發(fā)色團(tuán)上的結(jié)構(gòu)，能夠利用商業(yè)來源進(jìn)行定做或進(jìn)行化學(xué)合成。
信號發(fā)色團(tuán)本文所述的在發(fā)明中有用的發(fā)色團(tuán)包括任何能夠在適當(dāng)溶液中吸收來自聚陽離子多發(fā)色團(tuán)的能量并發(fā)射光的物質(zhì)。為了進(jìn)行多重分析，可以使用多種具有可檢測不同發(fā)射光譜的不同信號發(fā)色團(tuán)。發(fā)色團(tuán)可以是生光團(tuán)或熒光團(tuán)。一般的熒光團(tuán)包括熒光染料、半導(dǎo)體納晶體、鑭系元素螯合物、多核苷酸特異性染料和綠色熒光蛋白。
例示性的熒光染料包括熒光素、6-FAM、羅丹明、德克薩斯紅、三甲基羅丹明、羧基羅丹明、羧基羅丹明6G、羧基對甲氨基酚、羧基羅丹明110、Cascade藍(lán)、Cascade黃、香豆素、Cy2、Cy3、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy-Chrome、藻紅蛋白、PerCP(多甲藻素葉綠素a蛋白)、PerCP-Cy5.5、JOE(6-羧基-4′，5′-二氯-2′，7′-二甲氧基熒光素)、NED、ROX(5-(和-6)-羧基-X-羅丹明)、HEX、螢光黃、Marina藍(lán)、俄勒岡綠488、俄勒岡綠500、俄勒岡綠514、Alexa Fluor350、AlexaFluor430、Alexa Fluor488、Alexa Fluor532、Alexa Fluor546、Alexa Fluor568、Alexa Fluor594、Alexa Fluor633、AlexaFluor647、Alexa Fluor660、Alexa Fluor680、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、BIODIPYFL、BIODIPYFL-Br2、BIODIPY530/550、BIODIPY558/568、BIODIPY564/570、BIODIPY576/589、BIODIPY581/591、BIODIPY630/650、BIODIPY650/665、BIODIPYR6G、BIODIPYTMR、BIODIPYTR、其綴合物以及其組合物。例示性的鑭系元素螯合物包括銪螯合物、鋱螯合物和釤螯合物。
許多熒光半導(dǎo)體納晶體(“SCNCs”)是本領(lǐng)域公知的；在公開于1999年5月27日的PCT公開號WO99/26299，發(fā)明人Bawendi等；1999年11月23日授權(quán)給Weiss等的美國專利號5,990,479；和Bruchez等，Science2812013，1998中描述了生產(chǎn)和利用半導(dǎo)體納晶體的方法。能夠獲得具有充分定義的峰發(fā)射波長的非常窄的發(fā)射波段的半導(dǎo)體納晶體，從而允許在同一分析中將大量不同的SCNCs任選與其它非SCNC類型的信號發(fā)色團(tuán)結(jié)合用作信號發(fā)色團(tuán)。
例示性的多核苷酸特異性染料包括吖啶橙、吖啶同型二聚體、放線菌素-D、7-氨基放線菌素D(7-AAD)、9-氮基-6-氯-2-甲氧基吖啶(ACMA)、BOBOTM-1碘化物(462/481)、BOBOTM-3碘化物(570/602)、BO-PROTM-1碘化物(462/481)、BO-PROTM-3碘化物(575/599)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚、二氫氯化物(DAPI)、4′，6-二脒基-2-苯基吲哚，二乳酸鹽(DAPI，二乳酸鹽)、二氫乙錠(氫乙錠)、溴化乙錠、二疊氮氯化乙錠、乙錠同型二聚體-1(EthD-1)、乙錠同型二聚體-2(EthD-2)、單疊氮溴化乙錠(EMA)、hexidium iodide、Hoechst 33258、Hoechst 33342、Hoechst 34580、Hoechst S769121、羥司替巴脒、甲磺酸鹽、JOJOTM-1碘化物(529/545)、JO-PROTM-1碘化物(530/546)、LOLOTM-1碘化物(565/579)、LO-PROTM-1碘化物(567/580)、NeuroTraceTM435/455、Neu roTraceTM500/525、NeuroTraceTM515/535、NeuroTraceTM530/615、NeuroTraceTM640/660、OliGreen、PicoGreenssDNA、PicoGreendsDNA、POPOTM-1碘化物(434/456)、POPOTM-3碘化物(534/570)、PO-PROTM-1碘化物(435/455)、PO-PROTM-3碘化物(539/567)、碘化丙啶、RiboGreen、SlowFade、SlowFadeLight、SYBRGreen I、SYBRGreenII、SYBRGold、SYBR101、SYBR102、SYBR103、SYBRDX、TO-PRO-1、TO-PRO-3、TO-PRO-5、TOTO-1、 TOTO-3、YO-PRO-1(唑黃)、YO-PRO-3、YOYO-1、YOYO-3、TO、SYTOXBlue、SYTOXGreen、SYTOXOrange、SYTO9、SYTOBC、SYTO40、SYTO41、SYTO42、SYTO43、SYTO44、SYTO45、SYTOBlue、SYTO11、SYTO12、SYTO13、SYTO14、SYTO15、SYTO16、SYTO20、SYTO21、SYTO22、SYTO23、SYTO24、SYTO25、SYTOGreen、SYTO80、SYTO81、SYTO82、SYTO83、SYTO84、SYTO85、SYTOOrange、SYTO17、SYTO59、SYTO60、SYTO61、SYTO62、SYTO63、SYTO64、SYTORed、紡錘菌素、偏端霉素、吖啶橙、3，4-苯并芘、噻唑橙、TOMEHE、道諾霉素、吖啶、戊基-TOTAB和丁基-TOTIN。非對稱性花青染料可以用作多核苷酸特異性染料。其它目標(biāo)染料包括由Geiersta nger，B.H.和Wemmer，D.E.，Annu.Rev.Vioshys.Biomol.Struct.1995，24，463-493，由Larson，C.J.和Verdine，G.L.，BioorganicChemistryNudeic Acids，Hecht，S.M.編輯，牛津大學(xué)出版社紐約，1996，第324-346頁，和由Glumoff，T.和Goldman，A.Nudeic Acids iuChem istryand Biology，第二版，Blackburn，G.M.和Gait，M.J.，編輯，牛津大學(xué)出版社牛津，1996，第375-441頁所介紹的那些染料。多核苷酸特異性染料可以是一種嵌入性染料，并對雙鏈多核苷酸是特異性的。其它染料和熒光團(tuán)在www.probes.com(Molecular Probes，Inc.)中進(jìn)行了描述。
術(shù)語“綠色熒光蛋白”指天然多管水母屬(Aequorea)綠色熒光蛋白和已經(jīng)鑒定為顯示變化了的熒光特性的突變型，包括變化的激發(fā)和發(fā)射最大值，以及不同形狀的激發(fā)和發(fā)射光譜(Delagrave，S.等(1995)Bio/Technology 13151-154；Heim，R.等(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9112501-12504；Heim，R.等(1995)Nature 373663-664)。Delgrave等分離了具有向紅效應(yīng)的激發(fā)光譜的克隆的水母(Aequoreavictoria)GFP的突變型。Bio/Technology 13151-154(1995)。Heim，R.等報道了一種具有藍(lán)色熒光的突變型(Tyr66變?yōu)镠is)(Proc.Natl.Acad.Sci.(1994)USA 9112501-12504)。
在一種變型中，利用第二信號發(fā)色團(tuán)接收來自起始信號發(fā)色團(tuán)的能量，所述第二信號發(fā)色團(tuán)可以直接或間接附著于另一種分析組分和/或基片上。在具體的應(yīng)用中，這能夠提供顯著的額外選擇性。例如，能夠?qū)⒁环N多核苷酸特異性染料用作起始或第二信號發(fā)色團(tuán)，并且可以是對于雙鏈序列特異性的。隨后能夠?qū)⒛芰坑杉ぐl(fā)的陽離子多發(fā)色團(tuán)傳遞至起始信號發(fā)色團(tuán)，所述起始信號發(fā)色團(tuán)接下來以一種目標(biāo)選擇性的總體形式將能量傳遞至第二信號發(fā)色團(tuán)。這種信號發(fā)色團(tuán)的級聯(lián)理論上能夠延伸為利用任何數(shù)目的具有相容的吸收和發(fā)射特征的信號發(fā)色團(tuán)。在這種變型的一個實施方案中，利用一種對于雙鏈多核苷酸特異的嵌入性染料作為第二信號發(fā)色團(tuán)，并將一種能夠傳遞能量至第二信號發(fā)色團(tuán)的起始信號發(fā)色團(tuán)綴合到傳感器多核苷酸上。嵌入性染料提供額外的選擇性要求，即傳感器和目標(biāo)多核苷酸在其補(bǔ)充到檢測復(fù)合物中之前雜交。在目標(biāo)存在的情況下，形成雙螺旋，吸收染料，并且多發(fā)色團(tuán)的激發(fā)引起來自第二信號發(fā)色團(tuán)的信號。
基片本文所述的方法能夠在任何形式的基片上進(jìn)行?；梢园◤V泛的材料，既可以是生物的、非生物的、有機(jī)的、無機(jī)的，也可以是任何這些材料的組合。例如，基片可以是一種聚合的L-B膜、功能化玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO2、SiN4、改性硅或任何一種廣泛變化的凝膠或聚合物如(聚)四氟乙烯、(聚)偏1，1-二氟乙烯、聚苯乙烯、交聯(lián)的聚苯乙烯、聚丙烯酸、聚乳酸、聚烴乙酸、交酯乙交酯共聚物、聚酐、聚甲基丙烯酸甲酯、乙烯醋酸乙烯酯共聚物、聚硅氧烷、聚合硅石、膠乳、葡聚糖聚合物、環(huán)氧物、聚碳酸酯、瓊脂糖、聚(丙烯酰胺)或其組合物。能夠使用導(dǎo)電性的聚合物和光電導(dǎo)性物質(zhì)。
基片可以是平面晶狀基片如基于硅的基片(例如玻璃、石英等)，或用于例如半導(dǎo)體和微處理器產(chǎn)業(yè)中的晶狀基片，如硅、砷化鎵、摻銦的GaN等，并且包括半導(dǎo)體納晶體。
基片可以取光電二極管、光電傳感器，或生物芯片的形式，所述光電傳感器如光電半導(dǎo)體芯片或光電薄膜半導(dǎo)體。個別傳感器多核苷酸在基片上的定位可以是可尋址的；這能夠以高密形式實現(xiàn)，并且定位可以是可微尋址的或可納尋址的。
硅石氣凝膠也能夠用作基片，并能夠通過本領(lǐng)域公知的方法制備。氣凝膠基片可以用作自由固定基片或用作涂布了其它基片物質(zhì)的表面。
基片可以取任何形式并且一般為盤、載玻片、珠、小球、圓盤、顆粒、微米顆粒、納米顆粒、束條(strand)、沉淀物、任選有孔的凝膠、薄片、管、球、容器、毛細(xì)管、墊、切片、膜、芯片、多孔板或盤、光纖等?；梢允侨魏蝿傂曰虬雱傂缘男问?。基片可以包含凸起的或降低的區(qū)域，在其上定位傳感器多核苷酸或其它分析組分?；谋砻婺軌蚴褂霉夹g(shù)進(jìn)行蝕刻以提供希望的表面特征，例如溝壕、v-溝、臺式結(jié)構(gòu)等。
基片的表面可以由與基片相同的材料組成或者可以由不同材料制成，并可以通過化學(xué)或物理方法偶聯(lián)到基片上。這種偶聯(lián)的表面可以由任何的廣泛多種材料組成，例如，聚合物、塑料、樹脂、多糖、硅石或基于硅的材料、碳、金屬、無機(jī)玻璃、膜，或任何上面所列的基片材料。表面可以是光學(xué)透明的并可以具有表面Si-OH功能性，如在硅石表面所發(fā)現(xiàn)的那些。
選擇基片和/或其任意表面以提供對于所用的合成和/或檢測方法合適的光學(xué)特征。基片和/或表面可以是透明的以允許基片暴露于來知多個方向應(yīng)用的光?？梢詾榛?或表面提供反射性的“鏡面”結(jié)構(gòu)以增強(qiáng)光的回收。
基片和/或其表面通常耐受，或經(jīng)處理以耐受它在應(yīng)用中所暴露的條件，并且能夠任選地進(jìn)行處理以在暴露于這類條件后去除任何耐受性材料。
能夠通過任何適當(dāng)方法將傳感器多核苷酸裝配或附著于基片上，例如在美國專利號5,143,854、PCT公開號WO92/10092、遞交于1990年12月6日的美國專利申請系列號07/624,120(目前放棄)、Fodor等，Science，251767-777(1991)和PCT公開號WO90/15070中所描述的方法。利用機(jī)械合成策略合成這些陣列的技術(shù)在例如PCT公開號WO93/09668和美國專利號5,384,261中進(jìn)行了描述。
更進(jìn)一步的技術(shù)包括基于珠的技術(shù)，如那些在PCT申請?zhí)朠CT/US93/04145中所描述的那些，和基于針的方法，如在美國專利號5,288,514中所描述的那些。
在遞交于1992的11月20日的美國專利申請系列號07/980,523，和美國專利號5,384,261中描述了其它的可用于將傳感器多核苷酸附著于基片上的流體通道或點(diǎn)樣法。通過(1)在定義于預(yù)定區(qū)域的通道內(nèi)流動或(2)在預(yù)定區(qū)域上″點(diǎn)樣″將試劑遞送給基片?？梢栽谝Ｗo(hù)的基片的部分上使用保護(hù)性涂層如親水性的或疏水性的涂層(依賴于溶劑的性質(zhì))，有時在其它區(qū)域與促進(jìn)由反應(yīng)溶液進(jìn)行濕潤的材料結(jié)合。以這種方式，流動溶液進(jìn)一步避免了流出它們設(shè)計的流動途徑。
一般的分配器包括一種任選由機(jī)器人控制的微量移液器、一種噴墨打印機(jī)、一系列管、一種復(fù)式接頭、陣列移液器等從而能夠?qū)⒍喾N試劑順序地或同時地遞送到反應(yīng)區(qū)域。
發(fā)色團(tuán)的激發(fā)和檢測可以使用任何提供能夠激發(fā)聚陽離子多發(fā)色團(tuán)并短于發(fā)射波長的波長的儀器來進(jìn)行激發(fā)。激發(fā)源優(yōu)選不會直接顯著激發(fā)信號發(fā)色團(tuán)。該源可以是一種寬帶紫外光源如具有適當(dāng)濾光器的氘燈、在穿過單色儀以提取出期望波長后的光源如氙燈或氘燈的輸出、連續(xù)波(cw)氣體激光器、固態(tài)二極管激光器，或任何脈沖激光器。來自信號發(fā)色團(tuán)的發(fā)射光能夠通過任何適當(dāng)?shù)脑O(shè)備或技術(shù)進(jìn)行檢測，許多適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ潜绢I(lǐng)域公知的。例如，可以使用熒光計或分光光度計檢測試驗樣品是否在多發(fā)色團(tuán)的激發(fā)之后發(fā)出信號發(fā)色團(tuán)的波長特征的光。
試劑盒還提供包含對于實施本發(fā)明方法有用的試劑的試劑盒。在一個實施方案中，試劑盒包含與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的單鏈傳感器多核苷酸和聚陽離子多發(fā)色團(tuán)。傳感器多核苷酸綴合到信號發(fā)色團(tuán)上。在樣品中目標(biāo)多核苷酸存在的情況下，傳感器多核苷酸與目標(biāo)雜交，導(dǎo)致能夠檢測的來自信號發(fā)色團(tuán)能量的增強(qiáng)的發(fā)射。
試劑盒的組分保持在一個包裝(housing)里。使用該試劑盒以實施本發(fā)明的方法的說明書可以與包裝一起提供，并且可以在任何固定的介質(zhì)中提供。說明書可以位于包裝之內(nèi)或包裝之外，并且可以在形成包裝的任何表面的里面或外面進(jìn)行印刷，這使得說明書印刷易讀。試劑盒可以是多重形式，含有多數(shù)一種或多種能夠與相應(yīng)不同的目標(biāo)多核苷酸雜交的不同傳感器多核苷酸。
實施例給出下列實施例從而為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員提供如何生產(chǎn)和使用本發(fā)明的完全的描述，并且不會限制視為本發(fā)明的范圍。已經(jīng)進(jìn)行了努力以確保關(guān)于所用數(shù)字的精確性(例如，量、溫度等)，但一些實驗誤差和偏差應(yīng)當(dāng)進(jìn)行估計。
除非另外指出，份是重量的份、溫度是攝氏度而壓力是大氣壓或接近大氣壓，并且所有的材料是商業(yè)上可獲得的。
實施例1.FRET方案的鑒定利用陽離子水溶性綴合聚合物聚(9，9-雙(6′-N，N，N-三甲基銨)-己基)-亞苯基芴)即具有碘化物相反陰離子的聚合物1證明雜交試驗，所述雜交試驗利用由集光多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)到信號發(fā)色團(tuán)的能量傳遞。傳感器多核苷酸序列為5’-GTAAATGGTGTTAGGGTTGC-3’，相應(yīng)于炭疽(炭疽芽孢桿菌(Bacillus anthracis))芽孢包裹質(zhì)粒pX02，在5’位置具有熒光素，形成寡-C*的一個例子24。聚合物和信號發(fā)色團(tuán)的吸收和發(fā)射光譜示于圖1中。數(shù)據(jù)顯示了在DNA和熒光素的吸收之間的聚合物1激發(fā)的一個光學(xué)窗口。如圖1所示，聚合物1的直接激發(fā)導(dǎo)致向熒光素的能量傳遞(ET)。選擇熒光素與聚合物1激發(fā)的吸收重疊部分以確保FRET25。ET的程度通過整合的受體與供體發(fā)射的比率進(jìn)行評估。
實施例2.在目標(biāo)多核苷酸存在的情況下證明FRET寡-C*探針的雜交導(dǎo)致ET比率的變化。在等摩爾量的含有互補(bǔ)的20個堿基對序列的一種40個堿基對鏈5′-CATCTGTAAATCCAAGAGTAGCAACCCTAACACCATTTAC-3′，和相同模式的具有序列5′-AAAATATTGTGTATCAAAATGTAAATGGTGTTAGGGTTGC-3′的非互補(bǔ)的40個堿基鏈存在的情況下，將傳感器多核苷酸([寡-C*]＝2.1×10-8M)在低于其Tm(58.4℃)2℃下進(jìn)行退火。所得熒光的直接比較顯示了一個高于雜交DNA 6倍大的ET比率。參見圖2。在10mmol檸檬酸鈉和100mmol氯化鈉緩沖液存在時觀察到這些光學(xué)差異也是具有高度意義的。緩沖離子掩蔽了互補(bǔ)DNA上的電荷，這促進(jìn)雜交但弱化CPs和相反電荷的熒光猝滅劑之間的靜電相互作用26。使用一種裝備了標(biāo)準(zhǔn)PMT的氙燈熒光計，雜交的DNA提供了比非雜交DNA超過3倍高的ET比率，[傳感器多核苷酸]＝2.8×l0-9M。
實施例3.能量傳遞的優(yōu)化通過改變聚合物1與寡-C*的比率來優(yōu)化能量傳遞。在[寡-C*]＝2.1×10-8M的濃度下，聚合物的起始添加引起ET比率的立即升高，當(dāng)聚合物1的量開始遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過寡-C*的量時ET比率降低。ET比率的最大值相應(yīng)于聚合物鏈對寡-C*的近乎1∶1的比例。在高聚合物濃度下并非每條鏈都緊密地復(fù)合至寡-C*上并且供體發(fā)射比信號發(fā)色團(tuán)發(fā)射升高得更快。這樣的關(guān)系是預(yù)料中的，因為當(dāng)[聚合物1]/[寡-C*]＜1時，并非所有的傳感器多核苷酸鏈都能夠有效地復(fù)合到獨(dú)立的聚合物鏈上。相反地，在[聚合物1]/[寡-C*]＞1時，并非所有的由聚合物1(供體)束縛的光子都能傳遞給寡-C*(受體)。一旦聚合物-寡-C*的重復(fù)單位達(dá)到大約100，報告發(fā)色團(tuán)的光致發(fā)光不再增強(qiáng)，顯示受體的飽和。在此比率的整合的熒光發(fā)射比在聚合物1缺失的情況下直接激發(fā)(480nm)的探針發(fā)射高大約4倍，給出了信號放大進(jìn)一步的證據(jù)。
實施例4.從多發(fā)色團(tuán)通過傳感器多核苷酸到多核苷酸染料的FRET傳遞以提高選擇性寡-C*探針(5′-Fl-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3′)的雜交導(dǎo)致兩種不同傳感器發(fā)色團(tuán)ET比率的差異。在等摩爾量的含有互補(bǔ)的20個堿基對序列的20個堿基對鏈(5′-AGCACCCACATAGTCAAGAT-3′)，和相同模式的具有序列(5′-CGTATCACTGGACTGATTGG-3′)的非互補(bǔ)的20個堿基對鏈存在的情況下，將傳感器多核苷酸([寡-C*]＝1×10- 8M)在低于其Tm(58.5℃)2℃下進(jìn)行退火。兩種DNA混合物與溴化乙錠([EB]＝1.1×10-6M)于室溫下在一價磷酸鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(50mM，pH＝7.40)中進(jìn)行混合，其中EB的插入發(fā)生在雜交DNA對的雙鏈體結(jié)構(gòu)之內(nèi)。在水中加入聚合物1([1]＝1.6×10-7M)以及隨后1的激發(fā)(380nm)導(dǎo)致從1到傳感器多核苷酸的能量傳遞以及隨后從傳感器多核苷酸到EB的能量傳遞。產(chǎn)生的熒光的比較提示傳感器溶液僅僅顯示在雜交DNA存在時來自插入的染料EB的發(fā)射。參見圖3。該結(jié)果證明本發(fā)明的DNA序列傳感器能夠通過在聚陽離子多發(fā)色團(tuán)的激發(fā)之后檢測來自多核苷酸特異性染料的發(fā)射而檢測目標(biāo)單鏈DNA的存在，所述目標(biāo)單鏈DNA具有與傳感器多核苷酸序列互補(bǔ)的特異性堿基序列。選擇用于本實施例的發(fā)色團(tuán)以尋求在多發(fā)色團(tuán)和兩種信號發(fā)色團(tuán)之間能量上的適當(dāng)重疊。
實施例5.利用來自多發(fā)色團(tuán)系統(tǒng)的FRET進(jìn)行多核苷酸染料光學(xué)放大的證明在1、傳感器多核苷酸和多核苷酸特異性染料(溴化乙錠，EB)的溶液中的1的激發(fā)導(dǎo)致EB的發(fā)射強(qiáng)度，它比直接激發(fā)(500nm)包含在相同雙鏈DNA序列中的EB高大約8倍，所述相同雙鏈DNA序列缺少在傳感器多核苷酸上的信號發(fā)色團(tuán)。信號寡-C*的直接激發(fā)(480nm)，在聚合物1不存在時，僅提供大約4倍的插入EB的感光作用?？傊緦嵤├@示了通過從聚陽離子多發(fā)色團(tuán)(綴合的聚合物1)到診斷性EB報道分子的FRET的信號放大的證據(jù)。參見圖4。
實施例6.向多核苷酸染料的FRET傳遞利用1和溴化乙錠(“EB”)作為信號發(fā)色團(tuán)的實驗證明從1到EB的直接能量傳遞能夠在雙鏈DNA存在的情況下顯示。在等摩爾量的含有互補(bǔ)的20個堿基對序列的20個堿基對鏈(5′-AGCACCCACATAGTCAAGAT-3′)，和相同模式的具有序列(5′-CGTATCACTGGACTGATTGG-3′)的非互補(bǔ)的20個堿基對鏈存在的情況下，將缺少信號發(fā)色團(tuán)的傳感器多核苷酸(5’-ATCTTGACTATGTGGGTGCT-3’)([寡]＝1×10-8M)在低于其Tm(58.5℃)2℃下進(jìn)行退火。兩種DNA混合物與溴化乙錠([EB]＝1.1×10-6M)于室溫下在一價磷酸鉀-氫氧化鈉緩沖溶液(50mM，pH＝7.40)中進(jìn)行混合，其中EB的插入發(fā)生在雜交DNA對的雙鏈體結(jié)構(gòu)之內(nèi)。在水中加入聚合物1([1]＝1.6×10-7M)以及隨后1的激發(fā)(380nm)僅僅在雜交的或雙鏈DNA存在的情況下導(dǎo)致從1到插入的EB的能量傳遞。僅對于雜交的序列在聚合物1的激發(fā)之后檢測到來自EB的發(fā)射。參見圖5。
盡管已經(jīng)關(guān)于優(yōu)選的實施方案在一些細(xì)節(jié)上對發(fā)明進(jìn)行了描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到，根據(jù)本文的教導(dǎo)，能夠進(jìn)行某些變化和改進(jìn)而不背離發(fā)明的精神和范圍。因此，發(fā)明僅為權(quán)利要求書所限制。
參考文獻(xiàn)1Wang，J.Nucleic Acid Res.2000 28 3011.
2Umek，R.M.；Lin，S.W.；Vielmetter，J.；Terbrueggen，R.H.；Irvine，B.；Yu，C.J.；Kayyem，J.F.；Yowanto，H.；Blackburn，G.F.；Farkas，D.H.；Chen，Y.P.J.Mol.Diag.2001 374.
3Schork N.J.；Fallin D.；Lanchbury J.S.Clini.Genet.2000 58 250.
4Balakin，K.V.；Korshun，V.A.；Mikhalev，I.I.；Maleev，G.V.；Malakhov A.D.；Prokhorenko，I.A.；Berlin，Yu.A.Biosensors and Bioelectronics 1998 13 771.
5LePecg，J.B.；Paoletti，C.J.Mol.Biol.1967 27 87.
6Petty，J.T.；Bordelon，J.A.；Robertson，M.E.J.Phys.Chem.B 2000 104 7221，7Cardullo，R.A.；Agrawal，S.；Flores，C.；Zamechnik，P.C.；Wolf，D.E.Proc.Natl.Acad.Sci.1988 8587908Castro，A.；Williams，J.G.K.Anal.Chem.1997 69 3915.
9Knemeyer，J.；Marmé，N.；Sauer，M.Anal.Chem.2000 72 3717.
10Minehan，D.S.；Marx，D.A.；Tripathy，S.K.Macromolecules 1994 27 777.
11Pullman，B.；Lavery，R.；Pullman，A.Eur.J.Biochem.1982 124 229.
12McQuade，D.T.；Pullen.A.E.；Swager，T.M.Chem.Rev.2000 100 2537.
13Chen，L.；McBranch，D.W.；Wang，H.-L.；Helgeson，R.；Wudl，F(xiàn).；Whitten，D.G.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1999 96 12287.
14Dogariu，A.，Gupta，R.，Heeger，A.J.，Wang，H.Synthetic Metals 1999 100 95.
15Kabanov，A.V.；Felgner，P.；Seymour，L.W.，Eds.Self-Assembling Complexes for Gene Delivery.From Laboratory to Clinical Trial；John WileyChichester，1998.
16Kircheis，R.；Blessing，T.；Brunner，S.；Wightman，L.；Wagner，E.J.Controlled Release 2001 72 165.
17Wolfert，M.A.；Dash，P.R.；Navarova，O.；Oupicky，D.；Seymour，L.W.；Smart，S.；Strohalm，J.；Ulbrich，K.Bioconjugate Chem.1999 10 993.
18Ganachaud，F(xiàn).； A.；Pichot，C.；Laayoun，A.；Cros，P.Langmuir 1997 13 701.
19Smith，J.O.；Olson，D.A.；Armitage，B.A.J.Am.Chem，Soc.1999 121 2628.
20Harada，A；Kataoka，K.Science 1999 283 65，21Bronich，T.K.；Nguyen，H.K.；Eisenberg，A.；Kabanov，A.V.J.Am.Chem.Soc.2000 122 8339.
22Stork，M.S.；Gaylord，B.S.；Heeger，A.J.；Bazan，G.C.Adv.Mater.2002 14 361.The molecularweight of polymer l was determined to be8，600g/mole(Mn).
23Nielsen，P.E.；Egholm，M.Peptide Nucleic AcidsProtocols and Applications.Horizon ScientificPress，Portland，1999.
24Makino，S.-I.；Uchida，I.；Terakado，N.；Sasakawa，C.；Yoshikawa，M.；J.Bacteriol.1989，171，722.
25Lakowicz，J.R.Principles of Fluorescence Spectroscopy.Kluwer Academic/Plenum PublishersNewYork，1999.
26Wang，J.； Wang，D.L.；Miller，E.K.；Moses，D.；Bazan，G.C.；Heeger，A.J.Macromolecules 2000，33，5153.
權(quán)利要求
1.測試方法，包括提供懷疑含有目標(biāo)多核苷酸的樣品；提供在激發(fā)后能夠?qū)⒛芰總鬟f給信號發(fā)色團(tuán)的聚陽離子多發(fā)色團(tuán)；提供單鏈的并且與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的陰離子性傳感器多核苷酸，所述傳感器多核苷酸綴合到信號發(fā)色團(tuán)上，其中所述傳感器多核苷酸與多發(fā)色團(tuán)相互作用并且發(fā)射光能夠在目標(biāo)多核苷酸缺失的情況下于多發(fā)色團(tuán)激發(fā)之后由信號發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生，并且其中在目標(biāo)多核苷酸存在的情況下多發(fā)色團(tuán)激發(fā)后由信號發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生更大量的發(fā)射光；在傳感器多核苷酸能夠與倘若存在的目標(biāo)多核苷酸雜交的條件下，將樣品與傳感器多核苷酸和多發(fā)色團(tuán)在溶液中進(jìn)行接觸；對該溶液應(yīng)用能夠激發(fā)多發(fā)色團(tuán)的光源；以及檢測由信號發(fā)色團(tuán)發(fā)射的光是否在樣品存在的情況下增強(qiáng)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包含選自飽和的聚合物、綴合的聚合物、綴合分子的聚集體、樹枝狀化合物和半導(dǎo)體納晶體的結(jié)構(gòu)。
3.權(quán)利要求2的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包含飽和的聚合物。
4.權(quán)利要求2的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包含樹枝狀化合物。
5.權(quán)利要求2的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包含半導(dǎo)體納晶體。
6.權(quán)利要求2的方法，其中多發(fā)色團(tuán)包含綴合分子。
7.權(quán)利要求6的方法，其中綴合的聚合物具有結(jié)構(gòu)。
8.權(quán)利要求2的方法，其中多發(fā)色團(tuán)是綴合分子的聚集體。
9.權(quán)利要求8的方法，其中聚集體包含具有結(jié)構(gòu) 的分子。
10.權(quán)利要求1的方法，其中樣品在足量有機(jī)溶劑存在下與傳感器多核苷酸和多發(fā)色團(tuán)相接觸以減少傳感器多核苷酸和多發(fā)色團(tuán)之間的疏水相互作用。
11.權(quán)利要求1的方法，其中樣品與多種不同的具有相應(yīng)不同序列的傳感器多核苷酸相接觸，所述不同的傳感器多核苷酸包含相應(yīng)不同的信號發(fā)色團(tuán)，其中每種所述不同的傳感器多核苷酸都能夠選擇性地與相應(yīng)不同的目標(biāo)多核苷酸雜交。
12.權(quán)利要求1的方法，其中信號發(fā)色團(tuán)是熒光團(tuán)。
13.權(quán)利要求12的方法，其中熒光團(tuán)選自半導(dǎo)體納晶體、熒光染料和鑭系元素螯合物。
14.權(quán)利要求13的方法，其中熒光團(tuán)是半導(dǎo)體納晶體。
15.權(quán)利要求13的方法，其中熒光團(tuán)是熒光染料。
16.權(quán)利要求15的方法，其中熒光染料是熒光素。
17.權(quán)利要求13的方法，其中熒光團(tuán)是鑭系元素螯合物。
18.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)多核苷酸是DNA。
19.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)多核苷酸是RNA。
20.權(quán)利要求1的方法，其中樣品包含單鏈目標(biāo)多核苷酸。
21.權(quán)利要求1的方法，其中樣品包含雙鏈目標(biāo)多核苷酸。
22.權(quán)利要求1的方法，其中目標(biāo)多核苷酸通過擴(kuò)增反應(yīng)生產(chǎn)。
23.多核苷酸傳感溶液，包含信號發(fā)色團(tuán)；和聚陽離子多發(fā)色團(tuán)，當(dāng)將其接近信號發(fā)色團(tuán)時所述多發(fā)色團(tuán)能夠在激發(fā)后將能量傳遞給信號發(fā)色團(tuán)，其中當(dāng)多發(fā)色團(tuán)被激發(fā)時在被傳感的多核苷酸存在的情況下由信號發(fā)色團(tuán)能夠產(chǎn)生更大量的能量。
24.測試樣品中目標(biāo)多核苷酸的試劑盒，包含單鏈的并且與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的傳感器多核苷酸；信號發(fā)色團(tuán)；聚陽離子多發(fā)色團(tuán)，當(dāng)將其接近信號發(fā)色團(tuán)時所述多發(fā)色團(tuán)能夠在激發(fā)后將能量傳遞給信號發(fā)色團(tuán)，其中所述傳感器多核苷酸與多發(fā)色團(tuán)相互作用并且在目標(biāo)多核苷酸存在的情況下多發(fā)色團(tuán)激發(fā)后由信號發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生可檢測到的更大量的發(fā)射光；和一個容納試劑盒試劑的包裝。
25.權(quán)利要求1的方法，其中由信號發(fā)色團(tuán)發(fā)射的高于閾值水平的光顯示目標(biāo)多核苷酸存在于樣品中。
26.權(quán)利要求1的方法，其中由信號發(fā)色團(tuán)發(fā)射的光的量被量化并且用于測定樣品中的目標(biāo)多核苷酸的量。
27.權(quán)利要求12的方法，其中熒光團(tuán)是綠色熒光蛋白。
28.權(quán)利要求1的方法，其中不對目標(biāo)多核苷酸進(jìn)行擴(kuò)增。
29.權(quán)利要求1的方法，其中在基片上實施該方法。
30.權(quán)利要求29的方法，其中基片選自微球體、芯片、載玻片、多孔板、光纖、任選有孔的凝膠基質(zhì)、光電二極管和光電裝置。
31.權(quán)利要求30的方法，其中基片為載玻片。
32.權(quán)利要求30的方法，其中基片為光電裝置。
33.權(quán)利要求30的方法，其中基片為任選有孔的凝膠基質(zhì)。
34.權(quán)利要求33的方法，其中基片為溶膠-凝膠。
35.權(quán)利要求30的方法，其中基片是可納尋址的。
36.權(quán)利要求30的方法，其中基片是可微尋址的。
37.權(quán)利要求30的方法，其中基片綴合到多種不同的具有相應(yīng)不同序列的傳感器多核苷酸上，其中每種所述的不同傳感器多核苷酸都能夠選擇性地與相應(yīng)不同的目標(biāo)多核苷酸雜交。
38.權(quán)利要求1的方法，其中該方法包含進(jìn)行熒光原位雜交(FISH)。
39.權(quán)利要求22的方法，其中擴(kuò)增反應(yīng)包含聚合酶鏈反應(yīng)。
40.權(quán)利要求1的方法，進(jìn)一步包括將溶液中的樣品與傳感器多核苷酸、多發(fā)色團(tuán)和第二信號發(fā)色團(tuán)接觸，所述第二發(fā)色團(tuán)在目標(biāo)存在的情況下能夠從信號發(fā)色團(tuán)吸收能量并發(fā)射光，并且其中檢測由信號發(fā)色團(tuán)發(fā)射的光是否在樣品存在的情況下增強(qiáng)包括檢測由第二信號發(fā)色團(tuán)發(fā)射的光是否在樣品存在的情況下增強(qiáng)。
41.權(quán)利要求40的方法，其中第二信號發(fā)色團(tuán)是多核苷酸特異性染料。
42.由權(quán)利要求1的方法形成的信號復(fù)合物。
43.權(quán)利要求42的復(fù)合物，進(jìn)一步包含第二信號發(fā)色團(tuán)。
44.權(quán)利要求23的多核苷酸傳感溶液，進(jìn)一步包含第二信號發(fā)色團(tuán)，所述第二信號發(fā)色團(tuán)在目標(biāo)存在的情況下能夠吸收來自信號發(fā)色團(tuán)的能量并且發(fā)射光。
45.權(quán)利要求44的多核苷酸傳感溶液，其中第二信號發(fā)色團(tuán)是多核苷酸特異性染料。
46.由權(quán)利要求29的方法形成的基片結(jié)合復(fù)合物。
47.權(quán)利要求46的基片結(jié)合復(fù)合物，進(jìn)一步包含第二信號發(fā)色團(tuán)。
48.權(quán)利要求24的試劑盒，進(jìn)一步包含第二信號發(fā)色團(tuán)，所述第二信號發(fā)色團(tuán)在目標(biāo)存在的情況下能夠吸收來自信號發(fā)色團(tuán)的能量并且發(fā)射光。
49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中第二信號發(fā)色團(tuán)是多核苷酸特異性染料。
50.權(quán)利要求24的試劑盒，進(jìn)一步包含與所述包裝一起提供的說明書，它介紹如何使用試劑盒的組分來測試樣品中的目標(biāo)多核苷酸。
51.傳感復(fù)合物，包含單鏈的并且與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的傳感器多核苷酸，所述傳感器多核苷酸附著于信號發(fā)色團(tuán)上；聚陽離子多發(fā)色團(tuán)，當(dāng)將其接近信號發(fā)色團(tuán)時所述多發(fā)色團(tuán)能夠在激發(fā)后將能量傳遞給信號發(fā)色團(tuán)，其中所述傳感器多核苷酸與多發(fā)色團(tuán)相互作用并且在目標(biāo)多核苷酸缺失的情況下多發(fā)色團(tuán)激發(fā)后能夠由信號發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生發(fā)射光；并且其中在目標(biāo)多核苷酸存在的情況下多發(fā)色團(tuán)激發(fā)后由信號發(fā)色團(tuán)產(chǎn)生更大量的發(fā)射光。
52.權(quán)利要求23的多核苷酸傳感溶液，進(jìn)一步包含單鏈的并且與目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的傳感器多核苷酸。
53.權(quán)利要求23的多核苷酸傳感溶液，其中信號發(fā)色團(tuán)是多核苷酸特異性染料，它能夠在目標(biāo)存在的情況下吸收來自多發(fā)色團(tuán)的能量并且發(fā)射光。
54.權(quán)利要求23的多核苷酸傳感溶液，其中信號發(fā)色團(tuán)是多核苷酸特異性染料，它能夠在目標(biāo)存在的情況下吸收來自多發(fā)色團(tuán)的能量并且將能量傳遞給第二信號發(fā)色團(tuán)，所述第二信號發(fā)色團(tuán)綴合到隨后發(fā)射光的傳感器多核苷酸上。
55.權(quán)利要求3的方法，其中飽和的聚合物附著于發(fā)光染料上。
全文摘要
提供了測定樣品中目標(biāo)多核苷酸的方法、組合物和生產(chǎn)的商品。將一種懷疑含有目標(biāo)多核苷酸的樣品與聚陽離子多發(fā)色團(tuán)和同目標(biāo)多核苷酸互補(bǔ)的傳感器多核苷酸相接觸。傳感器多核苷酸包含一種信號發(fā)色團(tuán)以接收來自受到激發(fā)的多發(fā)色團(tuán)的能量并且在目標(biāo)多核苷酸存在的情況下增強(qiáng)發(fā)射。該方法能夠以多種形式進(jìn)行利用。還提供包含實施此方法的試劑的試劑盒。
文檔編號C07H21/00GK1694967SQ03824651
公開日2005年11月9日 申請日期2003年8月26日 優(yōu)先權(quán)日2002年8月26日
發(fā)明者G·C·巴贊, B·S·蓋洛德, S·王 申請人:加州大學(xué)評議會