一種新型3-差向異構(gòu)酶以及對其進(jìn)行編碼的多核苷酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型3?差向異構(gòu)酶和編碼所述多肽的多核苷酸。本發(fā)明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、載體和宿主細(xì)胞，生產(chǎn)所述3?差向異構(gòu)酶以及該3?差相異構(gòu)酶應(yīng)用用途的方法。
【專利說明】
[0001] 一種新型3-差向異構(gòu)酶以及對其進(jìn)行編碼的多核苷酸
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及具有3-差向異構(gòu)酶活性的多肽或蛋白質(zhì)，編碼具有3-差向異構(gòu)酶活性 的多肽或蛋白質(zhì)的多核苷酸序列，包含所述多核苷酸序列的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，產(chǎn)生 所述酶的方法，和所述酶在多種工業(yè)應(yīng)用中的用途。
[0003] 此外，木發(fā)明涉及通過使用具有3-差向異構(gòu)酶活性的多肽或蛋白質(zhì)催化果糖、葡 萄糖、淀粉糖等單糖或混合糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法，以及使用所述多肽或蛋白質(zhì)催化山 梨糖、淀粉糖等單糖或混合糖生產(chǎn)D-塔格糖的方法。
[0004] 發(fā)明背景 隨著人們對健康飲食的日益重視，研發(fā)健康安全的低熱量功能性甜味劑成為食品行業(yè) 研究的重點(diǎn)。D-阿洛酮糖和D-塔格糖作為自然界中天然存在但含量極少的天然低熱量功能 性甜味劑，已經(jīng)成為人們研究的熱點(diǎn)。
[0005] D-阿洛酮糖(D-allulose)又名D-核糖-2-己酮糖，是D-果糖的C-3位的差向異構(gòu) 體。D-阿洛酮糖是一種天然存在但有含量極少的低熱量功能性甜味劑，其甜度為蔗糖的 70%，但能量僅為蔗糖的0.3%，可以用作低卡路里減肥食品的甜味劑，同時，D-阿洛酮糖還 具有抑制肝中脂質(zhì)合成有關(guān)酶活性的功能，有助于減少腹部脂肪堆積，并能一定程度上控 制體重，可以用于健康食品等各種各樣的功能性食品。此外，D-阿洛酮糖還能夠改善食品 風(fēng)味、外觀等，延長食品的保存期限。因此，D-阿洛酮糖這種健康安全的低熱量功能性甜味 劑已獲得越來越多學(xué)者的關(guān)注，成為最具市場競爭力的新型甜味劑之一。
[0006] 由于D-阿洛酮糖是一種較為稀有的天然單糖，從自然界中分離提取產(chǎn)量低，成本 高，難以滿足人們作為低熱量健康甜味劑的需要，也不適宜工業(yè)化大生產(chǎn)的要求，因此為了 應(yīng)用于食品工業(yè)，需要有高效的D-阿洛酮糖生產(chǎn)方法。傳統(tǒng)的D-阿洛酮糖生產(chǎn)方法主要為 化學(xué)法，生產(chǎn)過程需要消耗大量費(fèi)用、產(chǎn)生許多副產(chǎn)物和污染物。而生物法制備D-阿洛酮糖 具有反應(yīng)專一性強(qiáng)，產(chǎn)物組分簡單易純化且屬于天然產(chǎn)品等特點(diǎn)，已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。
[0007] 生物法制備D-阿洛酮糖最為有效的方法是尋找能使果糖轉(zhuǎn)變?yōu)镈-阿洛酮糖的酶。 然而，目前的阿洛酮糖-3-差相異構(gòu)酶酶存在高溫下穩(wěn)定性降低或者活性低反應(yīng)速度慢等 問題，不利于工業(yè)化生產(chǎn)D-阿洛酮糖的成本控制。因此，需要開發(fā)高溫穩(wěn)定性優(yōu)良、活性高 的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn)的需求。
[0008] D-塔格糖(D-Tagat〇Se)，是D-山梨糖的C-3位的差向異構(gòu)體。D-塔格糖是一種天然 存在但有含量極少的低熱量功能性甜味劑，其甜度為蔗糖的92%，在人體內(nèi)吸收率較低，僅 為20%~25%，不會引起機(jī)體血糖水平的明顯變化，很適合糖尿病人食用，而且絕大部分塔格 糖直接進(jìn)入結(jié)腸，被其中微生物菌群所選擇性發(fā)酵，促進(jìn)有益菌增殖，抑制有害菌的生長， 起到明顯的改善腸道菌群的作用，是一種很好的益生素，可以用于健康食品等各種各樣的 功能性食品。此外，D-塔格糖還能夠改善食品風(fēng)味、外觀等。因此，D-塔格糖這種健康安全 的低熱量功能性甜味劑已獲得越來越多學(xué)者的關(guān)注，成為極具市場前景的新型甜味劑之 o
[0009] 使山梨糖異構(gòu)為D-塔格糖是生物法制備D-塔格糖最為有效的方法之一，這種方法 的關(guān)鍵是尋找能使山梨糖轉(zhuǎn)變?yōu)镈-塔格糖的酶。目前的塔格糖-3-差相異構(gòu)酶存在高溫下 穩(wěn)定性降低或者活性低反應(yīng)速度慢等問題，不利于工業(yè)化生產(chǎn)D-塔格糖的成本控制和規(guī)模 放大。因此，需要開發(fā)高溫穩(wěn)定性優(yōu)良、活性高的塔格糖-3-差相異構(gòu)酶以適應(yīng)工業(yè)化生產(chǎn) 的需求。
[0010]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011]本發(fā)明人從Thermogemmatispora carboxidivorans菌種發(fā)現(xiàn)了一種新型具有3_ 差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)。相應(yīng)地，本發(fā)明提供了具有3-差向異構(gòu)酶活性的新型蛋白質(zhì)，和 編碼所述蛋白質(zhì)或多肽的多核苷酸。所述蛋白質(zhì)或多肽具有阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶及塔 格糖-3-差向異構(gòu)酶活性。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽具有良好的活性和優(yōu)秀的熱穩(wěn)定性，這兩 點(diǎn)對較高溫度條件下生產(chǎn)D-阿洛酮糖和D-塔格糖而言是優(yōu)良的性能。
[0012] 本發(fā)明涉及具有阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶及塔格糖-3-差向異構(gòu)酶活性的分離的 蛋白質(zhì)或多肽，其選自下組： (a) 蛋白質(zhì)或多肽，其與SEQ ID N〇:2的氨基酸序列具有至少70%序列同一性； (b) 蛋白質(zhì)或多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等-高嚴(yán)格條件下與以下雜 交：（i)SEQ ID N〇:l的多肽編碼序列，（ii)包含SEQ ID N〇:l的多肽編碼序列的基因組DNA 序列，或（iii) (i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈； (c) 蛋白質(zhì)或多肽，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQ ID NO: 1的蛋白質(zhì)或多肽 編碼序列具有至少70%序列同一性； (d) SEQ ID N0:2的蛋白質(zhì)或多肽包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插 入的變體;和 (e) 任何(a)、（b)或（c)的蛋白質(zhì)或多肽，其包含SEQ ID N〇:2或由SEQ ID N〇:2組成， 和 (f) (&)，（13)，（〇)，（(1)，或(6)的蛋白質(zhì)或多肽的片段，其具有阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶 及塔格糖-3-差向異構(gòu)酶活性。
[0013] 本發(fā)明亦涉及包含所述多核苷酸的核酸構(gòu)建體、表達(dá)載體和重組宿主細(xì)胞:并涉 及產(chǎn)生多核苷酸的方法。
[0014] 本發(fā)明亦涉及酶法生產(chǎn)D-阿洛酮糖和D-塔格糖的方法。
[0015] 定義 阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性:術(shù)語"阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶活性"意指催化果糖的C-3位異構(gòu)轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖的活性。
[0016] 塔格糖-3-差向異構(gòu)酶活性:術(shù)語"塔格糖-3-差向異構(gòu)酶活性"意指催化山梨糖的 C-3位異構(gòu)轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的活性。
[0017]分離的蛋白質(zhì)或多肽:術(shù)語"分離的蛋白質(zhì)或多肽"意指相對于如見于自然界的蛋 白質(zhì)或多肽經(jīng)人力修飾的多肽。在一個方面，多肽如通過SDS-PAGE測定的，為至少1%純，例 如至少5%純，至少10%純，至少20%純，至少40%純，至少60%純，至少80%純，并且最優(yōu)選至少 90% 純。
[0018] 分離的蛋白質(zhì)或多肽的非限定性實(shí)例包括:（1)任何非天然存在的蛋白質(zhì)或多肽， (2)任何蛋白質(zhì)或多肽，其包括但不限于任何酶、變體、核酸、蛋白質(zhì)、肽或輔因子，它們至少 部分地從與其在自然界結(jié)合的一種或多種或所有天然存在的組分移出；（3)任何蛋白質(zhì)或 多肽，其相對于見于自然界的蛋白質(zhì)或多肽經(jīng)人工修飾:或(4)任何蛋白質(zhì)或多肽，其通過 相對于與其天然結(jié)合的其它組分增加所述蛋白質(zhì)或多肽的量而受修飾。分離的蛋白質(zhì)或多 肽可存在于發(fā)酵液樣品。
[0019] 基本上純的蛋白質(zhì)或多肽:術(shù)語"基本上純的蛋白質(zhì)或多肽"意指蛋白質(zhì)或多肽制 備物，所述蛋白質(zhì)或多肽制備物含有按重量計(jì)至多10%的與其天然或重組結(jié)合的 (associated)的其它蛋白質(zhì)或多肽材料。優(yōu)選地，所述蛋白質(zhì)或多肽是按存在于制備物中 的全部蛋白質(zhì)或多肽材料的重量計(jì)至少90%純。本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽優(yōu)選是基本上純的 形式，例如，這能夠通過以下實(shí)現(xiàn):通過公知的重組方法或由經(jīng)典純化方法制備多肽。
[0020] 序列同一性:參數(shù)"序列同一性"描述兩個氨基酸序列之間或兩個核苷酸序列之間 的相關(guān)性。
[0021] 就本發(fā)明而言，兩個氨基酸序列之間的序列同一性程度通過使用如EMBOSS軟件 包（EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice 等，2000， Trends in Genetics 16:276_277)(優(yōu)選3.0.0版或更高版木）的Needle程序中執(zhí)行的 Needleman-Wunsch算法（Needleman和Wunsch, 1970,J. Mol. Biol. 48:443-453)來測定。 使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分(gap open penalty)為10,缺口延伸罰分(gap extension penalty)為0.5和EBL0SUM62(BL0SUM62的EMBOSS版）取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為"最高同 一*性(longest identity) 〃的輸出結(jié)果(使用-nobrief選項(xiàng)獲得)作為同一,性百分比，并計(jì) 算如下： (同樣的殘基X 100V(比對長度一比對中缺口的總數(shù)） 就本發(fā)明而言，兩個核苷酸序列之間的序列同一性程度通過使用如EMBOSS軟件包 (EMB0SS:The European Molecular Bi010 Open Software Suite, Rice等，見上文）（優(yōu)選 3 ? 0 ? 0版或更高版本）的Needle程序中執(zhí)行的Needleman-Wunsch算法（Needleman和 Wunsch，1970,見上文)來測定。使用的可選參數(shù)為缺口開放罰分為10,缺口延伸罰分為0.5 和EDNAFULL(NCBI NUC4. 4的EMBOSS版)取代矩陣。使用Needle標(biāo)記為"最高同一性"的輸出 結(jié)果(使用-nobrief?選項(xiàng)獲得)作為同一性百分比，并計(jì)算如下： (同樣的脫氧核糖核苷酸X 100V(比對長度一比對中缺口的總數(shù)） 片段:術(shù)語"片段"意指從成熟多肽的氨基和(或)羧基末端缺失一個或多個(幾個)氨基 酸的多肽;其中所述片段具有3-差向異構(gòu)酶活性。
[0022] 等位變體(allelic variant):術(shù)語"等位變體"意指占據(jù)相同染色體基因座的基 因的任何兩種或兩種以上可選形式。等位變異通過突變天然地發(fā)生，并且可導(dǎo)致種群內(nèi)的 多態(tài)性?；蛲蛔兛梢允浅聊?在編碼的多肽中無變化)或可以編碼具有改變的氨基酸序 列的多肽。多肽的等位變體是由基因的等位變體編碼的多肽。
[0023] 分離的多核苷酸:術(shù)語"分離的多核苷酸"意指相對于見于自然界的多核苷酸經(jīng)人 力修飾的多核苷酸。在一個方面，分離的多核苷酸如通過瓊脂糖電泳測定的，為1%至95%純。 所述多核苷酸可為基因組、cDNA、RNA、半合成、合成來源，或其任意組合。
[0024] 基本上純的多核苷酸:術(shù)語"基本上純的多核苷酸〃意指不含其它外來的或不期望 的核苷酸的多核苷酸制備物，并且所述多核苷酸制備物處于適合于在遺傳工程的蛋白質(zhì)生 產(chǎn)體系中使用的形式。因此，基本上純的多核苷酸含有按重量計(jì)〇. 5%至10 %的與其天然或 重組結(jié)合的其它多核苷酸材料。然而，基本上純的多核苷酸可以包括天然存在的5'和3'非 譯區(qū)，如啟動子和終止子。優(yōu)選地，基本上純的多核苷酸是按重量計(jì)90%至99.5%純的。本發(fā) 明所述多核苷酸優(yōu)選為基木上純的形式。
[0025] 編碼序列：術(shù)語"編碼序列"意指直接指定多肽氨基酸序列的多核苷酸。編碼序列 的邊界通常由開放閱讀框決定，所述開放閱讀框通常以ATG起始密碼子或可供選擇的起始 密碼子例如GTG和TTG開始，并且以終止密碼子如TAA、TAG和TGA結(jié)束。編碼序列可以是DNA、 cDNA、合成的或重組的多核苷酸。
[0026] cDNA:術(shù)語" cDNA "意指能夠通過反轉(zhuǎn)錄從得自真核細(xì)胞的成熟的、己剪接的 mRNA分子制備的DNA分子。cDNA缺少通常存在于相應(yīng)基因組DNA中的內(nèi)含子序列。起始的 (initial )、初級的RNA轉(zhuǎn)錄物是mRNA的前體，其通過一系列的步驟(包括剪接)加工然后作 為成熟的己剪接的mRNA出現(xiàn)。
[0027] 核酸構(gòu)建體:術(shù)語"核酸構(gòu)建體"意指單鏈或雙鏈的核酸分子，其分離自天然存在 的基因，或?qū)⑵湟员緛聿淮嬖谟?not otherwise exist)自然界中的方式修飾以含有核酸 的區(qū)段，或其為合成的。當(dāng)所述核酸構(gòu)建體含有表達(dá)本發(fā)明的編碼序列所需的調(diào)控序列時， 術(shù)語核酸構(gòu)建體與術(shù)語"表達(dá)盒"同義。
[0028]調(diào)控序列（control sequence):術(shù)語"調(diào)控序列"意指對編碼本發(fā)明多肽的多核苷 酸表達(dá)是必需的所有成分。各個調(diào)控序列對于編碼所述多肽的核苷酸序列可以是天然的或 外源的，或各個調(diào)控序列對于彼此可以是天然的或外源的。這些調(diào)控序列包括但不限于前 導(dǎo)序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、啟動子、信號肽序列和轉(zhuǎn)錄終止子。最低限度，調(diào)控序 列包括啟動子以及轉(zhuǎn)錄和翻譯的終止信號。調(diào)控序列可以和用于引入特異性限制位點(diǎn)目的 的接頭一起提供，所述特異性限制位點(diǎn)促進(jìn)調(diào)控序列與編碼多肽的多核苷酸的編碼區(qū)的連 接。
[0029] 可操作地連接:術(shù)語"可操作地連接"意指這樣的構(gòu)型，其中將調(diào)控序列置于相對 于多核苷酸的編碼序列的適當(dāng)位置，使得調(diào)控序列指導(dǎo)編碼序列的表達(dá)。
[0030] 表達(dá):術(shù)語"表達(dá)〃包括涉及多肽產(chǎn)生的任何步驟，其包括但不限于轉(zhuǎn)錄、轉(zhuǎn)錄后修 飾、翩譯、翻譯后修飾和分泌。
[0031] 表達(dá)載體:術(shù)語"表達(dá)載體"意指線性的或環(huán)狀的DNA分子，其包含編碼多肽的多核 苷酸，并且所述多核苷酸與提供用于其表達(dá)的額外核苷酸可操作地連接。
[0032] 宿主細(xì)胞:術(shù)語"宿主細(xì)胞〃意指任何細(xì)胞類型，所述細(xì)胞類型對于使用包含本發(fā) 明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等是易感的（susceptible) '術(shù)語 "宿主細(xì)胞〃涵蓋任何親本細(xì)胞的后代，其由于在復(fù)制過程中發(fā)生的突變而不同于親本細(xì) 胞。
[0033] 變體:術(shù)語"變體"意指具有3-差向異構(gòu)酶活性的蛋白質(zhì)或多肽，其在一個或多個 (幾個)位置包含改變，即一個或多個(幾個)氨基酸殘基的取代、插入和(或)缺失。取代意指 用不同的氨基酸替代占據(jù)某位置的氨基酸:缺失意指移出占據(jù)某位置的氨基酸;和插入意 指緊鄰占據(jù)某位置的氨基酸添加1-3個氨基酸。
[0034] 發(fā)明詳述 本發(fā)明人研究了源自Thermogemmatispora carboxidivorans菌的差向異構(gòu)酶多肽的 特性，在對其進(jìn)行將果糖轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖及將山梨糖轉(zhuǎn)化為D-塔格糖的實(shí)驗(yàn)時發(fā)現(xiàn)，上 述多肽具有使果糖及山梨糖第3個碳位發(fā)生差向異構(gòu)化反應(yīng)、使其轉(zhuǎn)化為D-阿洛酮糖或D-塔格糖的功能，這是通過以下步驟進(jìn)行的：合成源自Thermogemmatispora carboxidivorans菌的差向異構(gòu)酶基因，培養(yǎng)包含所述基因表達(dá)載體的微生物，并過表達(dá)該 多肽。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該多肽具有良好的阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶及塔格糖-3-差向異構(gòu)酶 活性和優(yōu)秀的熱穩(wěn)定性。因此，本發(fā)明提供了一種具有阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶及塔格糖-3_差向異構(gòu)酶活性的多肽，并利用所述具有阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶及塔格糖-3-差向異構(gòu) 酶活性的多肽生產(chǎn)D-阿洛酮糖或D-塔格糖的方法。
[0035] 為了確定該差向異構(gòu)酶的多肽的特性，在本發(fā)明中，通過基因合成從 Thermogemmatispora carboxidivorans菌株中獲得該標(biāo)注為差向異構(gòu)酶的多肽的基因，所 標(biāo)注的差向異構(gòu)酶基因是僅根據(jù)DNA堿基序列，而不是根據(jù)其功能方面的表征結(jié)果所定義 的。然后，將所獲得的差向異構(gòu)酶基因插入到適合的表達(dá)載體中，從而產(chǎn)生含有差向異構(gòu)酶 基因的重組載體，并且將所述重組載體轉(zhuǎn)化到適合的微生物中。將該轉(zhuǎn)化的微生物培養(yǎng)在 發(fā)酵培養(yǎng)基中，并在該微生物中過表達(dá)所述差向異構(gòu)酶基因的多肽產(chǎn)物，然后分離和純化 所述差向異構(gòu)酶基因的多肽產(chǎn)物，以備用。經(jīng)過實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該多肽具有阿洛酮糖-3-差向異 構(gòu)酶及塔格糖-3-差向異構(gòu)酶活性，能夠轉(zhuǎn)化果糖生成D-阿洛酮糖，也能轉(zhuǎn)化山梨糖生成D-塔格糖。
[0036] 由本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的新型3-差向異構(gòu)酶活性的多肽可具有這樣的氨基酸序 列，該序列不僅限于SEQ ID N〇:2的氨基酸序列，而且包括由SEQ ID N〇:2的氨基酸序列中 一些氨基酸殘基的替換、插入或缺失所形成的氨基酸序列，只要這些氨基酸修飾過的蛋白 質(zhì)或多肽具有阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶及塔格糖-3-差向異構(gòu)酶活性，能夠轉(zhuǎn)化果糖或山梨 糖生成D-阿洛酮糖或D-塔格糖。
[0037] 在本發(fā)明的方法中，能用于產(chǎn)生重組表達(dá)載體的表達(dá)載體可以是任何常規(guī)用于遺 傳重組技術(shù)的表達(dá)載體，并且可以是，例如，pET-22b( + )。能夠通過重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微 生物可以是大腸桿菌(E. coli)BL21(DE3)。然而，所述微生物是不受限制的，只要它是任何 這樣的微生物，即該微生物能夠在經(jīng)過包含所需要基因的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化后過表達(dá)該基 因，并且作為過表達(dá)的結(jié)果能夠產(chǎn)生活性蛋白質(zhì)或多肽。
[0038] 更詳細(xì)地，以下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的微生物和誘導(dǎo)本發(fā)明的蛋白質(zhì)或多肽過表達(dá)的過程可 以根據(jù)本發(fā)明的示范的實(shí)驗(yàn)方案如以下描述進(jìn)行。將低溫保存的重組大腸桿菌接種到裝有 50mL LB培養(yǎng)基的250mL的燒瓶中，并將該菌株在維持在37 °C的搖床中培養(yǎng)，直到600nm處 的吸光度達(dá)到2.0。將該培養(yǎng)溶液加入到裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L的發(fā)酵罐中，所述發(fā)酵培養(yǎng) 基由15g/L蛋白胨，25g/L酵母提取物，10g/L氯化鈉，2 g/L葡萄糖，3 g/L乳糖組成，并將該 混合物在所述發(fā)酵罐中培養(yǎng)，以誘導(dǎo)本發(fā)明的蛋白質(zhì)的過表達(dá)。在發(fā)酵過程中，攪拌速率為 500rpm，通氣量為1.0 vvm，及培養(yǎng)溫度為37 °C，而且上述培養(yǎng)條件有利于大規(guī)模生產(chǎn)3-差 向異構(gòu)酶。
[0039] 為了純化由過表達(dá)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)，將所述重組大腸桿菌培養(yǎng)溶液在6，000 X g，4°C離心30分鐘，然后用0.85%的NaCl洗滌兩次。隨后，將該細(xì)胞重新懸浮于50 mM pH8.0 的磷酸鈉緩沖溶液(含有300mM NaCl)中，并將含有所述細(xì)胞的緩沖溶液置于冰浴中30分 鐘。利用高壓均質(zhì)機(jī)破碎該緩沖溶液中的細(xì)胞，將破碎的細(xì)胞在13，000 X g，4°C離心20分 鐘，并將其除去，而使上清液通過孔徑〇. 45um的濾膜進(jìn)行過濾，并通過低溫條件下的快速蛋 白質(zhì)色譜法對其進(jìn)行純化。將含有本發(fā)明的蛋白質(zhì)的濾出液加入HisTrap HP柱，所述 HisTrap HP柱是經(jīng)過50 mM pH8.0的磷酸鈉緩沖溶液平衡的，其中所述磷酸鈉緩沖溶液含 有300mM NaCl和10 mM咪唑。隨后，用相同的磷酸鈉緩沖溶液洗滌該HisTrap HP柱，并且再 用含有濃度梯度為從10 mM到200mM的咪唑的相同磷酸鈉緩沖溶液洗脫附著于該柱的蛋白 質(zhì)，其流速為lmL /min。將含有本發(fā)明蛋白質(zhì)的洗脫液加入到HiPrep 16/60樹脂柱中去除 咪唑，所述HiPrep 16/60樹脂柱是經(jīng)過pH7. 5的50 mM的磷酸鈉緩沖溶液平衡的，并且再以 6mL/min的速率洗脫該蛋白質(zhì)。將由此所收集的蛋白質(zhì)溶液加入到Sephacryl S-100 HR柱 中以洗脫該蛋白質(zhì)，所述Sephacryl S-100HR柱是經(jīng)過pH7.5的含有0.15M NaCl的50 mM的 磷酸鈉緩沖溶液平衡的，其流速為6mL/min，最后將洗脫的白質(zhì)在50 mM的磷酸鈉緩沖溶液 中進(jìn)行透析。
[0040] 如上述所獲得的本發(fā)明的蛋白質(zhì)是3-差向異構(gòu)酶，所述3-差向異構(gòu)酶的單體分子 量為31770 Da。該3-差向異構(gòu)酶是金屬酶，金屬離子對其活性有明顯促進(jìn)。
[0041] 根據(jù)本發(fā)明的另一個實(shí)施方案，3-差向異構(gòu)酶在金屬離子的存在下反應(yīng)，可實(shí)現(xiàn)提高 由果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖產(chǎn)量的目的，也可實(shí)現(xiàn)提高由山梨糖生產(chǎn)D-塔格糖產(chǎn)量的目的。所 述金屬離子選自下列各項(xiàng)組成的組:錳、鎂和鈷，其濃度范圍為0.5 - 5mM，例如，1 mM。當(dāng)所 述金屬離子的濃度低于0.5 mM時.提高轉(zhuǎn)化率的作用并不明顯，而當(dāng)所述金屬離子的濃度 高于5 mM時，轉(zhuǎn)化率并沒有顯著的差異。
[0042] 該3-差向異構(gòu)酶和果糖或山梨糖間的反應(yīng)可利用濃度為10-75%(w/w)，pH6_8和 溫度為50-90°C的底物（即果糖或山梨糖溶液)進(jìn)行。當(dāng)該底物，即果糖或山梨糖的濃度在 10-75%(w/w)的范圍內(nèi)時，D-阿洛酮糖或D-塔格糖的產(chǎn)量好，轉(zhuǎn)化率高，且上述范圍的pH和 溫度條件是對3-差向異構(gòu)酶活性最佳的pH和溫度范圍。
[0043]該3-差向異構(gòu)酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，在60°C保溫12小時后活性仍沒有檢測到活 性下降，在80°C保溫12小時后，活性仍然保持在80%以上，在90 °C保溫8小時后仍然有50%的 殘余活性。該3-差相異構(gòu)酶優(yōu)良的熱穩(wěn)定性對較高溫度條件下生產(chǎn)D-阿洛酮糖和D-塔格糖 而言是優(yōu)良的性能。
[0044]根據(jù)本發(fā)明另一個實(shí)施方案，該3-差向異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖和轉(zhuǎn)化山 梨糖生產(chǎn)D-塔格糖的反應(yīng)可通過在反應(yīng)過程中將3-差向異構(gòu)酶固定在載體上進(jìn)行，這是因 為固定在載體上的3-差向異構(gòu)酶能夠長期地保持酶活性且便于重復(fù)使用。用于本發(fā)明目前 的實(shí)施方案中的載體可以是任意己知其在酶固定化中用途的載體，并且可以是例如，海藻 酸鈉。海藻酸鈉是天然膠體多糖，它在藻類細(xì)胞壁中很豐富，且含了0-D-甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸殘基，所述0-D-甘露糖醛酸和a-L-古洛糖醛酸殘基通過0-1，4鍵隨機(jī)連接。因 此，海藻酸鈉容許3-差向異構(gòu)酶穩(wěn)定的固定，且有利于獲得較高的D-阿洛酮糖或D-塔格糖 產(chǎn)量。為了獲得D-阿洛酮糖或D-塔格糖的最大產(chǎn)量，海藻酸鈉可用于進(jìn)行3-差向異構(gòu)酶的 固定，其濃度為1.5-4%(w/v)，例如濃度為2.5%(w/v)。當(dāng)海藻酸鈉用作固定3-差向異構(gòu)酶的 載體時，將所述3-差向異構(gòu)酶的溶液加入到海藻酸鈉水性溶液中，所述海藻酸鈉水性溶液 的體積是3-差向異構(gòu)酶溶液體積的一倍或兩倍，然后利用注射器栗和真空栗將該混合物逐 滴地加入到0.2M鈣離子溶液中，從而形成3-差向異構(gòu)酶-海藻酸鈉復(fù)合體球。這些3-差向異 構(gòu)酶-海藻酸復(fù)合體球可接用于轉(zhuǎn)化果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖以及轉(zhuǎn)化山梨糖生產(chǎn)D-塔格糖的 反應(yīng)中。
[0045] 本發(fā)明的3-差向異構(gòu)酶對果糖和山梨糖均具有良好的活性和優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，這 兩點(diǎn)對較高溫度條件下生產(chǎn)D-阿洛酮糖和D-塔格糖而言是優(yōu)良的性能。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方 案的生產(chǎn)D-阿洛酮糖和D-塔格糖的方法是對環(huán)境友好的，這是因?yàn)槭褂昧嗽醋晕⑸锏?酶，并且該方法要求簡單的酶固定化過程，以及顯著地增加了 D-阿洛酮糖和D-塔格糖的生 產(chǎn)產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，因此降低了生產(chǎn)成本，而最大化了生產(chǎn)的效果。
[0046] 由此生產(chǎn)的D-阿洛酮糖和D-塔格糖能夠有效地用作食品或藥物的添加劑。
[0047] 有利作用 本發(fā)明的3-差向異構(gòu)酶對果糖和山梨糖均具有良好的活性和優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，這兩點(diǎn) 對高溫度條件下生產(chǎn)D-阿洛酮糖和D-塔格糖而言是優(yōu)良的性能。根據(jù)本發(fā)明實(shí)施方案的生 產(chǎn)D-阿洛酮糖和D-塔格糖的方法是對環(huán)境友好的，這是因?yàn)槭褂昧嗽醋晕⑸锏拿?，并?該方法要求簡單的酶固定化過程，以及顯著地增加了 D-阿洛酮糖和D-塔格糖的生產(chǎn)產(chǎn)量和 生產(chǎn)效率，因此降低了生產(chǎn)成本，而最大化了生產(chǎn)的效果。
[0048] 由此生產(chǎn)的D-阿洛酮糖和D-塔格糖能夠有效地用作食品或藥物的添加劑。
【附圖說明】
[0049] 圖1是本發(fā)明實(shí)施例1中3-差向異構(gòu)酶的生產(chǎn)流程圖； 圖2-1是本發(fā)明實(shí)施例5中pH對于3-差向異構(gòu)酶活性影響的曲線圖； 圖2-2是本發(fā)明實(shí)施例5中溫度對于3-差向異構(gòu)酶活性影響的曲線圖； 圖3是本發(fā)明實(shí)施例6中溫度活性關(guān)系圖； 圖4是本發(fā)明實(shí)施例7中利用3-差向異構(gòu)酶所轉(zhuǎn)化果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率示意 圖； 圖5是本發(fā)明實(shí)施例11中利用3-差向異構(gòu)酶所轉(zhuǎn)化山梨糖生產(chǎn)D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率示意 圖。
【具體實(shí)施方式】
[0050] 下文中，將參考具體實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)地描述。這些實(shí)施例僅僅是為了 例證的目的，而非意欲限制本發(fā)明的范圍。
[0051] 在目前的試驗(yàn)實(shí)施例中，利用果糖和山梨糖作為底物測量了其酶活性。為了測量 其酶活性，將3-差向異構(gòu)酶與含有10%果糖或山梨糖的50mM pH7.5磷酸鈉緩沖溶液混合，在 60 °C條件下反應(yīng)20分鐘，再在100°C加熱該反應(yīng)溶液15分鐘，以終止該反應(yīng)。所述含有果糖 或山梨糖的磷酸鈉緩沖溶液是通過將果糖或山梨糖溶解于PH7-8的磷酸鈉緩沖溶液中，以 達(dá)到濃度60-70%(w/v)配制而成的，并且將該含有果糖或山梨糖的磷酸鈉緩沖溶液持續(xù)地 加入到維持在60°C的生物反應(yīng)器中。為了實(shí)現(xiàn)方便比較其酶活性的目的，將一單位的阿洛 酮糖-3-差向異構(gòu)酶定義為在pH7.5和60 °C條件下每分鐘生產(chǎn)1摩爾D-阿洛酮糖所需要的 阿洛酮糖-3-差向異構(gòu)酶的量;將一單位的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶定義為在pH7.5和60 °C條 件下每分鐘生產(chǎn)1摩爾D-塔格糖所需要的塔格糖-3-差向異構(gòu)酶的量。果糖、D-阿洛酮糖、山 梨糖、D-塔格糖的濃度是利用高效液相色譜法測量的，該高效液相色譜法使用BP-100鈣離 子碳?xì)浠衔镏蚏I檢測器，柱溫80°C，流動相為超純水，流速0.5 mL/min。
[0052] 實(shí)施例1:3-差向異構(gòu)酶的生產(chǎn) 差向異構(gòu)酶基因是通過合成Thermogemmatispora carboxidivorans中標(biāo)注為差向 異構(gòu)酶的多肽的基因獲得的，所述差向異構(gòu)酶基因是僅根據(jù)序列，而不是根據(jù)其功能方面 的表征結(jié)果所定義的。通過利用限制性內(nèi)切酶Ndel和Xhol，將獲得的差向異構(gòu)酶基因插入 到表達(dá)載體pET-22b( + )中，從而產(chǎn)生重組表達(dá)載體pET-22b( + )/差向異構(gòu)酶(見圖1)。通過 常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，將該重組達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中。將轉(zhuǎn)化得到的重組大腸桿菌 BL21 (DE3)保藏在-80°C的超低溫冰箱中。
[0053]此后，將該重組大腸桿菌接種在裝有50mL液體LB培養(yǎng)基的250mL三角燒瓶中，并在 37 °C的搖床中培養(yǎng)活化，直到培養(yǎng)液在波長600nm處的吸光度達(dá)到2.0。將該培養(yǎng)液加入 到裝有5L發(fā)酵培養(yǎng)基的7L的發(fā)酵罐中，進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)以大規(guī)模生產(chǎn)3-差向異構(gòu)酶。在發(fā)酵 過程中，維持?jǐn)嚢杷俾蕿?00rpm，通風(fēng)率為1.0 vvm，培養(yǎng)溫度為37°C。
[0054] 實(shí)施例2:3-差向異構(gòu)酶的純化 為了對3-差向異構(gòu)酶的性質(zhì)進(jìn)行表征，利用親合色譜法(HisTrap HP柱），HiPrep 16/ 60柱和S印hacryl S-100 HR柱純化3-差向異構(gòu)酶。
[0055] 測量了該純化的3-差向異構(gòu)酶的分子量，發(fā)現(xiàn)該3-差向異構(gòu)酶單體分子量為 31770Da的。證實(shí)了該3-差向異構(gòu)酶的氨基酸序列與NCBI登記號WP_052889376的氨基酸序 列相同。
[0056] 實(shí)施例3:3-差向異構(gòu)酶的金屬依賴性 在實(shí)施例3中，為了研究金屬離子的對該3-差向異構(gòu)酶的影響，在不同金屬離子存在條 件下將果糖作為底物測定對其活性的影響，測量是在用EDTA處理該3-差向異構(gòu)酶后，向3-差向異構(gòu)酶溶液中加入1 mM下表1中所示的各種金屬離子后進(jìn)行的。該3-差向異構(gòu)酶反應(yīng) 在50 mMpH7.5的Tri s緩沖溶液中，60 °C條件下進(jìn)行20分鐘，其中所述Tr i s緩沖溶液含有 0.04 U/mL的3-差向異構(gòu)酶和10%(w/v)的果糖，再將該反應(yīng)溶液在100 °C加熱15分鐘，以終 止該反應(yīng)，然后測量該3-差向異構(gòu)酶的活性。
[0057] 結(jié)果顯示該3-差向異構(gòu)酶具有金屬依賴性，如下表1所示，鎂、錳和鈷離子增強(qiáng)其 酶活性，而銅和鋅離子抑制其酶活性。

實(shí)施例4:3-差向異構(gòu)酶的底物特異性 該3-差向異構(gòu)酶反應(yīng)在50 mM的磷酸鈉緩沖溶液中，pH7.5和60 °C條件下進(jìn)行20分 鐘，其中所述磷酸鈉緩沖溶液含有〇.〇4U/ml的該3-差向異構(gòu)酶和10 mM下表2中所示的各種 單獨(dú)的單糖，再將每個反應(yīng)溶液在100 °C加熱15分鐘，以終止該反應(yīng)，然后，測量了每種反 應(yīng)溶液中該3-差向異構(gòu)酶的酶活性。
[0059]結(jié)果顯示該3-差向異構(gòu)酶對D-果糖、D-阿洛酮糖、D-山梨糖、D-塔格糖均具有活 性，該3-差向異構(gòu)酶除可用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖，也可用于生產(chǎn)D-塔格糖。
實(shí)施例5: pH和溫度和對3-差向異構(gòu)酶活性的影響 在實(shí)施例5中，為了研究不同pH和溫度對該3-差向異構(gòu)酶活性的影響，在不同的溫度和 pH條件下將果糖作為底物測定對其活性的影響，且比較了在不同溫度和pH下的酶活性。為 了研究pH的作用，該3-差向異構(gòu)酶的反應(yīng)在pH范圍6.0-8.5 50 mM的磷酸鈉緩沖溶液中進(jìn) 行，其中所述磷酸鈉緩沖溶液含有〇. 〇4U/mL的該3-差向異構(gòu)酶和10%(w/v)的果糖。在此，各 自的反應(yīng)在60°C、無金屬離子加入的條件下進(jìn)行20分鐘，然后在100 °C加熱15分鐘來終止 該反應(yīng)，并測量了其酶活性。其結(jié)果在圖2-1中所說明。
[0061 ]為了研究溫度的作用，該反應(yīng)在50 mM的磷酸鈉緩沖溶液中，溫度范圍40-90°C中 進(jìn)行了20分鐘，其中所述磷酸鈉緩沖溶液含有0.04 U/mL的該3-差向異構(gòu)酶和10%(w/v)的 果糖，在PH7.5條件下進(jìn)行反應(yīng)。通過在100 °C加熱15分鐘來終止該反應(yīng)，并測量了其酶活 性。其結(jié)果在圖2-2中所說明。
[0062] 結(jié)果顯示該3-差向異構(gòu)酶的最佳pH和溫度分別為7.5和90°C。
[0063]圖2-1是顯示在本發(fā)明實(shí)施方案條件下pH對于3-差向異構(gòu)酶活性影響的曲線圖。 [0064]圖2-2是顯示在本發(fā)明實(shí)施方案條件下溫度對于3-差向異構(gòu)酶活性影響的曲線 圖。
[0065] 實(shí)施例6:3-差向異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性 在實(shí)施例6中，為了研究該3-差向異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性，將該3-差向異構(gòu)酶分別置于不同 溫度條件下保溫，在不同時間取樣將果糖作為底物測定其殘余活性。測量是在將該3-差向 異構(gòu)酶分別置于50°(：、60°(：、70°(：、80°(：和90°(：水浴條件下保溫后，每隔1小時取樣進(jìn)行的。 該3-差向異構(gòu)酶反應(yīng)在50 mMpH7.5的磷酸鈉緩沖溶液中，60 °C條件下進(jìn)行20分鐘，其中所 述磷酸鈉緩沖溶液含有0.04 U/mL的3-差向異構(gòu)酶和10%(w/v)的果糖，再將該反應(yīng)溶液在 100°C加熱15分鐘，以終止該反應(yīng)，然后測量該3-差向異構(gòu)酶的活性。其結(jié)果在圖3中所說 明。
[0066]結(jié)果顯示該3-差向異構(gòu)酶具有優(yōu)良的熱穩(wěn)定性，在60°C保溫12小時后活性仍沒有 檢測到活性下降，在80°C保溫12小時后，活性仍然保持在80%以上，在90°C保溫8小時后仍然 有50%的殘余活性。
[0067] 實(shí)施例7:利用3-差向異構(gòu)酶所轉(zhuǎn)化果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率 在實(shí)施例7中，該3-差向異構(gòu)酶的反應(yīng)在pH7.5 50 mM的磷酸鈉緩沖溶液中，溫度范圍 40-90°C條件下進(jìn)行12小時，從而容許該反應(yīng)充分地進(jìn)行，其中所述磷酸鈉緩沖溶液含有該 3_差向異構(gòu)酶0.04 U/mL，1 mM的鈷離子，和10%(w/v)的果糖。然后，通過在100°C加熱15分 鐘來終止該反應(yīng)，并測量樣品中果糖和D-阿洛酮糖的含量。其結(jié)果在圖4中所說明。
[0068]結(jié)果顯示在12小時后該3-差向異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化果糖生產(chǎn)D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率在90°C 時轉(zhuǎn)化率最高，為39%，50 °C時轉(zhuǎn)化率最低，為22%，而在60 °C時轉(zhuǎn)化率為37%。
[0069] 實(shí)施例8:利用3-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)D-阿洛酮糖 為了生產(chǎn)高濃度的D-阿洛酮糖，該反應(yīng)在pH7.5 50 mM的磷酸鈉緩沖溶液中，60 °C條 件下進(jìn)行反應(yīng)，其中所述磷酸鈉緩沖溶液含有10 U/mL的該3-差向異構(gòu)酶，1 mM的鈷離子和 700g/L的果糖。然后在不同反應(yīng)時間點(diǎn)取樣，通過在100 °C加熱15分鐘終止該反應(yīng)，并測量 樣品中D-阿洛酮糖的濃度。不同反應(yīng)時間的D-阿洛酮糖產(chǎn)量顯示在下表3中。
結(jié)果顯示，反應(yīng)6小時，產(chǎn)生了259 g/L的D-阿洛酮糖，轉(zhuǎn)化率約為37%。
[0071] 實(shí)施例9:通過固定化酶生產(chǎn)D-阿洛酮糖 為了研究該生產(chǎn)D-阿洛酮糖方法的效率，對該3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行了固定化。測量了固 定化的3-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)產(chǎn)量，將其與未固定的(游離的）3_差向異構(gòu)酶的生產(chǎn)產(chǎn)量進(jìn)行比 較。
[0072]對于固定在載體上的3-差向異構(gòu)酶，使用了 3-差向異構(gòu)酶-海藻酸鈉復(fù)合體球，該 小球是通過如下方法制備的：將3-差向異構(gòu)酶溶液加入到2.5% (w/v)的海藻酸鈉溶液中， 所述海藻酸鈉溶液的體積是所述3-差向異構(gòu)酶溶液體積的1.5倍，再利用注射器栗和真空 栗將該混合物加入到0.2M|丐離子溶液中。
[0073]除了使用了固定的3-差向異構(gòu)酶之外，該反應(yīng)以與實(shí)施例7中相同的方式進(jìn)行。該 反應(yīng)中所用的3-差向異構(gòu)酶的量為10 U/mL，并測量了D-阿洛酮糖生產(chǎn)率。其結(jié)果顯示在下 表4中。
結(jié)果顯示，固定化的3-差向異構(gòu)酶在反應(yīng)8小時后達(dá)到最大產(chǎn)量258 g/ L，轉(zhuǎn)化率約為 37%，比游離的3-差向異構(gòu)酶反應(yīng)速度稍慢，但是固定化的3-差向異構(gòu)酶更利于連續(xù)化生 產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)D-阿洛酮糖的高效生產(chǎn)。
[0075] 實(shí)施例10:D-阿洛酮糖在生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)產(chǎn)量 以下反應(yīng)在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，從而檢驗(yàn)實(shí)施例9的固定化的3-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)產(chǎn)量。
[0076] 首先，該固定化的3-差向異構(gòu)酶和果糖以與實(shí)施例9中相同的方式制備，將果糖加 入到該固定化的3 -差向異構(gòu)酶中，并將該混合物調(diào)節(jié)為體積100mL隨后，將高100cm和直徑 2.6cm的生物反應(yīng)器中充滿所述固定化的3-差向異構(gòu)酶和果糖的混合物，且該反應(yīng)在流速 10 mL/h和60 °C條件下進(jìn)行。所用的3-差向異構(gòu)酶的量為500U，且所用果糖的濃度限制為 600g/L，這歸因于長時間操作過程中過量果糖的沉淀問題。其結(jié)果顯示在下表5中。
結(jié)果顯示，3-差向異構(gòu)酶和果糖間的反應(yīng)在整個30天的試驗(yàn)周期中是穩(wěn)定的，從果糖 向D-阿洛酮糖的轉(zhuǎn)化率為37%，產(chǎn)物D-阿洛酮糖濃度為220 g/L。其產(chǎn)量能夠滿足糖類大規(guī) 模生產(chǎn)的需要。
[0078] 因此，本發(fā)明能夠提供利用生物反應(yīng)器的D-阿洛酮糖生產(chǎn)系統(tǒng)，所述生物反應(yīng)器 能夠進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的大規(guī)模生產(chǎn)。
[0079] 實(shí)施例11:利用3-差向異構(gòu)酶所轉(zhuǎn)化山梨糖生產(chǎn)D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率 在實(shí)施例11中，該3-差向異構(gòu)酶的反應(yīng)在pH7.5 50 mM的磷酸鈉緩沖溶液中，溫度范圍 40-90°C條件下進(jìn)行12小時，從而容許該反應(yīng)充分地進(jìn)行，其中所述磷酸鈉緩沖溶液含有該 3_差向異構(gòu)酶0.04 U/mL，1 mM的鈷離子，和10%的山梨糖。然后，通過在100 °C加熱15分鐘來 終止該反應(yīng)，并測量樣品中山梨糖和D-塔格糖的含量。其結(jié)果在圖5中所說明。
[0080] 結(jié)果顯示在12小時后該3-差向異構(gòu)酶轉(zhuǎn)化山梨糖生產(chǎn)D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率在90 °C 時轉(zhuǎn)化率最高，為36%，50 °C時轉(zhuǎn)化率最低，為29%，而在60 °C時轉(zhuǎn)化率為34%。
[0081 ]實(shí)施例12:利用3-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)D-塔格糖 為了生產(chǎn)高濃度的D-塔格糖，該反應(yīng)在pH7.5 50 mM的磷酸鈉緩沖溶液中，60 °C條件 下進(jìn)行反應(yīng)，其中所述磷酸鈉緩沖溶液含有20 U/mL的該3-差向異構(gòu)酶，1 mM的鈷離子和 500g/L的山梨糖。然后在不同反應(yīng)時間點(diǎn)取樣，通過在100 °C加熱15分鐘終止該反應(yīng)，并測 量樣品中D-塔格糖的濃度。不同反應(yīng)時間的D-塔格糖產(chǎn)量顯示在下表6中。
結(jié)果顯示，反應(yīng)8小時，產(chǎn)生了 171 g/L的D-塔格糖，轉(zhuǎn)化率約為34%。
[0083] 實(shí)施例13:通過固定化酶生產(chǎn)D-塔格糖 為了研究該生產(chǎn)D-塔格糖方法的效率，對該3-差向異構(gòu)酶進(jìn)行了固定化。測量了固3定 化的3-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)產(chǎn)量，將其與未固定的（游離的）3_差向異構(gòu)酶的生產(chǎn)產(chǎn)量進(jìn)行比 較。
[0084]對于固定在載體上的3-差向異構(gòu)酶，使用了 3-差向異構(gòu)酶-海藻酸鈉復(fù)合體球，該 小球是通過如下方法制備的：將3-差向異構(gòu)酶溶液加入到2.5% (w/v)的海藻酸鈉溶液中， 所述海藻酸鈉溶液的體積是所述3-差向異構(gòu)酶溶液體積的1.5倍，再利用注射器栗和真空 栗將該混合物加入到0.2M鈣離子溶液中。
[0085]除了使用了固定的3-差向異構(gòu)酶之外，該反應(yīng)以與實(shí)施例12中相同的方式進(jìn)行。 該反應(yīng)中所用的3-差向異構(gòu)酶的量為20 U/mL，并測量了D-塔格糖生產(chǎn)率。其結(jié)果顯示在下 表7中。
結(jié)果顯示，固定化的3-差向異構(gòu)酶在反應(yīng)10小時后達(dá)到最大產(chǎn)量170g/ L，轉(zhuǎn)化率約為 34%，與游離的3-差向異構(gòu)酶相比反應(yīng)速度稍慢，但是固定化的3-差向異構(gòu)酶更利于連續(xù)化 生產(chǎn)，實(shí)現(xiàn)D-塔格糖的高效生產(chǎn)。
[0087] 實(shí)施例14:D_塔格糖在生物反應(yīng)器中的生產(chǎn)產(chǎn)量 以下反應(yīng)在生物反應(yīng)器中進(jìn)行，從而檢驗(yàn)實(shí)施例13的固定化的3-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)產(chǎn) 量。
[0088] 首先，該固定化的3-差向異構(gòu)酶和山梨糖以與實(shí)施例13中相同的方式制備，將山 梨糖加入到該固定化的3 -差向異構(gòu)酶中，并將該混合物調(diào)節(jié)為體積10 0 m L隨后，將高10 0 cm和直徑2.6 cm的生物反應(yīng)器中充滿所述固定化的3-差向異構(gòu)酶和山梨糖的混合物，且該 反應(yīng)在流速10 mL/h和60 °C條件下進(jìn)行。所用的3-差向異構(gòu)酶的量為400 U，且所用山梨糖 的濃度為400 g/L。其結(jié)果顯示在下表8中。
結(jié)果顯示，3-差向異構(gòu)酶和山梨糖間的反應(yīng)在整個30天的試驗(yàn)周期中是穩(wěn)定的，從山 梨糖向D-塔格糖的轉(zhuǎn)化率為34%，產(chǎn)物D-塔格糖濃度為170 g/L。其產(chǎn)量能夠滿足糖類大規(guī) 模生產(chǎn)的需要。
[0090]因此，本發(fā)明能夠提供利用生物反應(yīng)器的D-塔格糖生產(chǎn)系統(tǒng)，所述生物反應(yīng)器能 夠進(jìn)行工業(yè)規(guī)模的大規(guī)模生產(chǎn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種新型3-差向異構(gòu)酶，其選自下組： (a) 多肽或蛋白質(zhì)，其氨基酸序列與SEQ ID No: 2具有至少70%，例如至少75%，至少80%， 至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少 98%，至少99%，或甚至100%序列同一性； (b) 多肽或蛋白質(zhì)，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸在中等-高嚴(yán)格條件下與以下雜 交：（i)SEQ ID N〇:l的多肽編碼序列，（ii)包含SEQ ID N〇:l的多肽編碼序列的基因組DNA 序列，或（iii) (i)或（ii)的全長互補(bǔ)鏈； (c) 多肽或蛋白質(zhì)，其由多核苷酸編碼，所述多核苷酸與SEQ ID NO: 1的多肽編碼序列 具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%序列同一性； (d) SEQ ID N0:2的多肽或蛋白質(zhì)包含一個或多個(幾個)氨基酸的取代、缺失和/或插 入的變體； (e) 任何(a)、（b)或（c)的多肽或蛋白質(zhì)，其氨基酸序列包含SEQ ID N〇:2或由SEQ ID No :2組成，和 (〇(&)，（13)，（〇)，（(1)，或(6)的多肽或蛋白質(zhì)的片段，其具有3-差向異構(gòu)酶活性。2. 權(quán)利要求1的分離的多肽或蛋白質(zhì)，其與SEQ ID No:2的多肽或蛋白質(zhì)的氨基酸序列 具有至少70%，例如至少75%，至少80%，至少85%，至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少 94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%，或甚至100%序列同一性。3. 權(quán)利要求1或2任一項(xiàng)的分離的多肽或蛋白質(zhì)，其包含SEQ ID N〇:2或由SEQID N〇:2 組成。4. 一種分離的多核苷酸，其編碼權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的多肽或蛋白質(zhì)。5. -種核酸構(gòu)建體或表達(dá)載體，其包含權(quán)利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地 連接于一個或多個(幾個)調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)所述多肽或蛋白質(zhì)在表達(dá)載體中的 產(chǎn)生。6. -種重組宿主細(xì)胞，其包含權(quán)利要求4的多核苷酸，所述多核苷酸可操作地連接于一 個或多個調(diào)控序列，所述調(diào)控序列指導(dǎo)所述多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。7. -種產(chǎn)生權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的多肽或蛋白質(zhì)的方法，其包括： (a) 在有助于所述多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)細(xì)胞，其以其野生型形式產(chǎn)生所 述多肽或蛋白質(zhì)； 和 (b) 回收所述多肽或蛋白質(zhì)。8. -種產(chǎn)生權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的多肽或蛋白質(zhì)的方法，其包括： (a) 在有助于所述多肽或蛋白質(zhì)的產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)權(quán)利要求6的宿主細(xì)胞;和 (b) 回收所述多肽或蛋白質(zhì)。9. 一種組合物，其包含權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的多肽或蛋白質(zhì)和其它酶。10. 權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的多肽或蛋白質(zhì)或權(quán)利要求9的組合物在用于生產(chǎn)D-阿洛酮 糖的工藝中的用途。11. 權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)的多肽或蛋白質(zhì)或權(quán)利要求9的組合物在用于生產(chǎn)D-塔格糖 的工藝中的用途。12. -種用于生產(chǎn)D-阿洛酮糖的方法，其包括將果糖、葡萄糖及淀粉糖等混合糖與權(quán)利 要求1至3任一項(xiàng)的多肽或蛋白質(zhì)的水性溶液相接觸生產(chǎn)D-阿洛酮糖。13. -種用于生產(chǎn)D-塔格糖的方法，其包括將山梨糖及淀粉糖等混合糖與權(quán)利要求1 至3任一項(xiàng)的多肽或蛋白質(zhì)的水性溶液相接觸生產(chǎn)D-塔格糖。14. 權(quán)利要求12至13任一項(xiàng)的方法，其中所述多肽或蛋白質(zhì)是權(quán)利要求1至3任一項(xiàng)所 述的多肽或蛋白質(zhì)。
【文檔編號】C12P19/24GK105821027SQ201610047300
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年4月1日
【發(fā)明人】魏淼, 嚴(yán)明, 章志林, 陳圣
【申請人】南京朗奈生物技術(shù)有限公司