一種角蛋白酶的分離純化方法及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種角蛋白酶的分離純化方法及應(yīng)用，步驟為：將粗酶液用硫酸銨梯度沉淀后，用緩沖液重懸沉淀、透析；用緩沖液平衡離子交換柱，上樣，酶活峰在穿過峰中；收集有酶活的組分，用緩沖液透析；用緩沖液平衡離子交換柱，上樣，用NaCl梯度洗脫，得純化后的角蛋白酶。本發(fā)明中1L發(fā)酵液可收獲角蛋白酶Ker FJ純酶16.59mg，總酶活2989U。且獲得的角蛋白酶Ker FJ在畜禽廢棄物降解、脫毛及作為洗滌劑添加劑方面均有非常好的效果。CGMCC NO.1208620160120
【專利說明】
一種角蛋白酶的分離純化方法及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及一種角蛋白酶的分離純化方法及應(yīng)用，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 家禽羽毛、羊毛、動(dòng)物皮毛、蹄角的主要成分是角蛋白。角蛋白是硬性蛋白，結(jié)構(gòu)致 密復(fù)雜，很難被普通的蛋白酶如胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶等水解，只能被稱作"角 蛋白酶"的蛋白酶所水解。由于角蛋白酶能降解普通蛋白酶難以降解的富含角蛋白的羽毛、 羊毛、蹄甲、毛發(fā)，因此被廣泛應(yīng)用于制革業(yè)、紡織業(yè)和角蛋白廢棄物的處理?，F(xiàn)有市售的角 蛋白酶酶制劑例如Versazyme?、Valkerase?等都是由角蛋白酶KerA改造而來(Gupta R et al.，Appl Microbiol Biotechnol.2013,97:9931_9940)〇
[0003] 全球范圍內(nèi)禽畜養(yǎng)殖業(yè)、屠宰業(yè)、制革業(yè)、毛皮加工業(yè)帶來大量的家禽羽毛和豬、 牛、羊等的皮毛蹄角這些蛋白質(zhì)廢棄物，這些廢棄物富含角蛋白，在厭氧條件下釋放氯硫化 物和氨氣，帶來嚴(yán)重的環(huán)境問題，同時(shí)又難以降解，給廢物處理帶來困難。微生物及分泌的 胞外酶(主要是角蛋白酶)能降解這些角蛋白廢棄物。微生物和角蛋白酶在溫和的反應(yīng)條件 下將難降解的角蛋白轉(zhuǎn)化為多肽和氨基酸，富含氮元素的水解產(chǎn)物可用作飼料飼喂禽畜， 提高飼料的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和動(dòng)物的消化吸收效率;能用作土壤的營(yíng)養(yǎng)肥料;用于葉面施肥;還可 生產(chǎn)甲烷和生物氫等生物能源。如何解決畜禽廢棄物的無害化處理、資源化利用成為我國(guó) 養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的重要課題。
[0004] 傳統(tǒng)制革業(yè)中皮毛浸泡、脫毛、軟化和鞣革過程需用到大量堿、硫化物、鹽、有機(jī)溶 劑、石灰等難處理的化學(xué)物質(zhì)，不僅產(chǎn)生S21虧染，而且使廢水中的C0D、B0D值升高，廢水呈強(qiáng) 堿性且?guī)в袗撼粑叮饑?yán)重的環(huán)境污染。利用酶法脫毛來代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)試劑脫毛，可避 免使用硫化鈉及其他有毒物質(zhì)，從而減少?gòu)U棄物的產(chǎn)生，降低工業(yè)排污，保護(hù)環(huán)境，是實(shí)現(xiàn) 制革清潔化生產(chǎn)的有效途徑之一。商品化蛋白酶制劑Aqimderm?:、NUB?、Pyrase? 和Clarizyme已被廣泛應(yīng)用于制革業(yè)中毛皮的清洗、脫毛等程序（Gupta et al.，Appl Microbiol Biotechnol. 2013，97:9931-9940)。但完全使用蛋白酶代替化學(xué)試劑成本高，亟 需開發(fā)更高效的酶制劑。角蛋白酶能高效降解普通蛋白酶難以降解的角蛋白，包括富含角 蛋白的羽毛、羊毛、蹄甲、毛發(fā)，因此在制革行業(yè)中，角蛋白酶就成為了比普通蛋白酶更有優(yōu) 勢(shì)的替代品。沒有膠原酶活性、有微弱彈性蛋白酶活性的角蛋白酶可用于制革業(yè)的脫毛，這 些酶松弛角蛋白組織，不破壞皮革的彈性而拔出完整毛皮，角蛋白水解物還能用作復(fù)鞣劑 充盈皮革質(zhì)地，提高毛皮品質(zhì)（Gupta et al.，Appl Microbiol Biotechnol.2013,97: 9931-9940)。多篇文獻(xiàn)報(bào)道了產(chǎn)角蛋白酶的芽孢桿菌屬細(xì)菌Bacillus subtilis S14 (Macedo AJ et al.,Appl Environ Microbiol?2005,71:594-596)、B.pumilus(Kumar AG et al.,J Appl Microbiol.2008,104:411-420)nB.1icheniformis ER-15(Tiwary E, Gupta R et al.,Bioresour Technol.2010,101:6103-6110)nB.halodurans PPKS-2 (Prakash P et al.，Appl Biochem Biotechnol.2011，160:1909_1920)、B.halodurans JB99(Shrinivas D，Naik GR et al.，Int Biodeter Biodeger.2011,65:29-35)胞外粗酶 液對(duì)不同毛皮的脫毛作用；國(guó)內(nèi)主要圍繞有脫毛能力的菌株資源的篩選及粗酶液脫毛效果 粗評(píng)價(jià)等方面來研究菌株的脫毛效果(謝菲等，微生物學(xué)報(bào)，2010，50(4): 537-541;劉彥等， 中國(guó)皮革，2013,42 (23):15-18)。有報(bào)道稱來自短短芽孢桿菌Brevibaci llus brevis US575的角蛋白酶KERUS單獨(dú)作用即可完成兔皮、山羊皮、綿羊皮、牛皮的脫毛(Jaouadi NZ et al.,Plos One,2013,8(10):e76722)〇
[0005] 與普通蛋白酶相比，角蛋白酶能更容易洗掉衣物表面沾有的角質(zhì)化廢物，可用作 洗滌劑的添加劑。該應(yīng)用要求蛋白酶的耐堿性好、在較寬的溫度范圍內(nèi)仍能保持高活性，此 外還要對(duì)蛋白污漬的有良好的洗滌效果、能耐受洗滌劑中的離子型/非離子型表面活性劑、 氧化劑、漂白劑、酶類等其他成分并保持自身活性的穩(wěn)定（Vojcic L et al.，New Biotechnol，2015,32(6): 342-348)。盡管蛋白酶可應(yīng)用于洗滌劑添加劑的報(bào)道有多篇，但 對(duì)角蛋白酶在此方面的應(yīng)用研究較少。來自短短芽孢桿菌Brevibaci llus sp.AS-S10-II的 角蛋白酶在EDTA、SDS、Triton X-100、Tween 20、H2〇2中仍保持較高酶活，但與不同種類洗滌 劑共同保溫后酶活均有不同程度降低（Rai KR，Mukherjee AK.Biochem Eng J.2011，54: 47-56);來自B.pumilus KS12的角蛋白酶最適pH是10,最適酶活溫度60°C，在去垢劑皂苷、 膽酸鈉、SDS、Tri ton X、Tween-80，氧化劑H2〇2、次氯酸鈉及各品牌洗滌劑中酶活均有不同程 度提高，但未見對(duì)污漬洗滌效果的報(bào)道(Rajput R et al.，Enzyme Research,2010,2010: 7)。
[0006] 直至目前，篩選、發(fā)掘、研究有角蛋白酶生產(chǎn)能力的微生物菌株，以及繼續(xù)開發(fā)這 些菌株產(chǎn)的有潛在工業(yè)、商業(yè)應(yīng)用潛力的角蛋白酶資源，仍是角蛋白酶研究中的重要的、待 解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種角蛋白酶的分離純化方法及應(yīng)用，通過本發(fā)明純化方 法，1L B.subtilis FJ-3-16發(fā)酵液可收獲角蛋白酶Ker FJ純酶16.59mg，總酶活2989U。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0009] -種角蛋白酶的分離純化方法，具體步驟如下：
[0010] 將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16發(fā)酵培養(yǎng)，獲得粗酶液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為40~70%的硫酸銨梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0，50mM Tris-HCl緩沖液重懸沉淀、透 析；用pH 10.0,50mM Tris-HCl緩沖液平衡Q Sepharose fast-flow離子交換柱，上樣，酶活 峰在穿過峰中；收集有酶活的組分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl緩沖液透析；用pH 7.0,50mM Tris-HCl緩沖液平衡SP Sepharose fast-flow離子交換柱，上樣，用0~1M NaCl梯度洗脫， 在0.25M NaCl處洗脫出有酶活的組分，即得純化后的角蛋白酶Ker FJ。
[0011] 利用SDS-PAGE檢測(cè)各純化步驟獲得的角蛋白酶Ker FJ的純度（圖1)。經(jīng)過硫酸銨 梯度沉淀和兩步離子交換層析，我們獲得了電泳純的角蛋白酶Ker FJ。
[0012] 本發(fā)明中，枯草芽抱桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16于2016年01月20日保藏于 中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)CGMCC N0.12086,保藏地址 為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類命名為Bacillus subtilis。
[0013] 本發(fā)明中，所述粗酶液的發(fā)酵培養(yǎng)基為：
[0014] FM3培養(yǎng)基（g ? L-玉米粉20,大豆粉20,麩皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇43，CaCl2 l，pH 7.5。
[0015]發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為200rpm，培養(yǎng)72h，接種量為6 % (體積比）。 [0016]發(fā)酵培養(yǎng)后，獲得粗酶液的方法：
[0017]用紗布過濾發(fā)酵培養(yǎng)后的渣滓，llOOOrpm離心15min，收集發(fā)酵液上清即為粗酶 液。
[0018]本發(fā)明中角蛋白酶Ker FJ分離純化的具體步驟為：
[0019] (1)將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16單菌落用接種針接種至LB液體 培養(yǎng)基中，30°C，200rpm培養(yǎng)18h;
[0020] LB液體培養(yǎng)基(g ? L-1蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 10，pH 7.5;
[0021] (2)將LB液體培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期種子液按6% (體積比）接種量接種于FM3培養(yǎng)基 中，30°C，200rpm 培養(yǎng) 72h;
[0022] FM3培養(yǎng)基（g ? L-玉米粉20,大豆粉20,麩皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇43，CaCl2 l，pH 7.5；
[0023] (3)用紗布過濾掉步驟(2)培養(yǎng)后的培養(yǎng)基渣滓，llOOOrpm離心15min收集發(fā)酵液 上清即為粗酶液；
[0024] (4)將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16發(fā)酵培養(yǎng)，獲得粗酶液，用質(zhì)量 分?jǐn)?shù)為40~70 %的硫酸銨梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0，50mM Tris-HCl緩沖液重懸沉淀、 透析；用pH 10.0,50mM Tris-HCl緩沖液平衡Q Sepharose fast-flow離子交換柱，上樣，酶 活峰在穿過峰中；收集有酶活的組分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl緩沖液透析；用pH 7.0， 50mM Tris-HCl緩沖液平衡SP Sepharose fast-flow離子交換柱，上樣，用0~1M NaCl梯度 洗脫，在0.25M NaCl處洗脫出有酶活的組分，即得純化后的角蛋白酶Ker FJ。
[0025] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)：
[0026] 現(xiàn)有技術(shù)中，多種細(xì)菌分泌的蛋白酶多是通過離子交換層析與分子篩層析相結(jié)合 達(dá)到純化目的。與分子篩層析相比，離子交換層析具有上樣量大、流速快、耗時(shí)短、操作簡(jiǎn) 便、收集的樣品濃度高等優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明首先利用Q陰離子柱除去粗酶液的色素組分，再利用 SP柱分離其他雜質(zhì)組分而獲得純酶，純化步驟操作簡(jiǎn)單、回收率高、純化效果好。通過本發(fā) 明純化方法，1L B.subtilis FJ-3-16發(fā)酵液可收獲角蛋白酶Ker FJ純酶16.59mg，總酶活 2989U。且獲得的角蛋白酶Ker FJ在畜禽廢棄物降解、脫毛及作為洗滌劑添加劑方面均有非 常好的效果。
【附圖說明】
[0027]圖1為分離純化角蛋白酶Ker FJ的SDS-PAGE檢測(cè)圖；
[0028]圖2為為進(jìn)化樹分析菌株B.subtilis FJ-3-16的進(jìn)化位置圖；
[0029]圖3為角蛋白酶Ker FJ對(duì)天然角蛋白底物羽毛和羊毛的膨脹和降解圖；
[0030]圖4為角蛋白酶Ker FJ對(duì)羊皮和驢皮的脫毛作用圖；
[0031]圖5為角蛋白酶Ker FJ在各品牌洗滌劑中保溫lh、6h、12h后測(cè)殘余酶活；
[0032]圖6為角蛋白酶Ker FJ作為洗滌劑添加劑，對(duì)不同污漬（番茄醬、姜粉、甜面醬、辣 醬。血漬)的去污效果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而 更為清楚。但實(shí)施例僅是范例性的，并不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng) 該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修 改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
[0034] 實(shí)施例1角蛋白酶的分離純化方法，具體步驟如下：
[0035] (1)將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16單菌落用接種針接種至LB液體 培養(yǎng)基中，30°C，200rpm培養(yǎng)18h;
[0036] LB液體培養(yǎng)基(g ? L-1蛋白胨10,酵母粉5，NaCl 10，pH 7.5;
[0037] (2)將LB液體培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期種子液按6% (體積比）接種量接種于FM3培養(yǎng)基 中，30°C，200rpm 培養(yǎng) 72h;
[0038] FM3培養(yǎng)基（g ? L-玉米粉20,大豆粉20,麩皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇4 3，CaCl2 l，pH 7.5；
[0039] (3)用紗布過濾掉步驟(2)培養(yǎng)后的培養(yǎng)基渣滓，11 OOOrpm離心15min收集粗酶液；
[0040] (4)用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40~70%的硫酸銨梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0,50mM Tris- HC1緩沖液重懸沉淀、透析；用pH 10.0,50mM Tris-HCl緩沖液平衡Q Sepharose fast-flow 離子交換柱，上樣，酶活峰在穿過峰中；收集有酶活的組分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl緩沖 液透析；用pH 7.0,50mM Tris-HCl緩沖液平衡SP Sepharose fast-flow離子交換柱，上樣， 用0~1M NaCl梯度洗脫，在0.25M NaCl處洗脫出有酶活的組分，即得純化后的角蛋白酶Ker FJ。
[00411利用SDS-PAGE檢測(cè)角蛋白酶Ker FJ的純度，如圖1所示，獲得電泳純的角蛋白酶 Ker FJ。
[0042]枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16從家禽屠宰場(chǎng)長(zhǎng)期堆放羽毛廢棄物的 土壤中篩選獲得，于2016年01月20日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心，菌種保藏號(hào)CGMCC N0.12086,保藏地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類命名為 Bacillus subtilis。
[0043]實(shí)施例2B. subtil is FJ-3-16 菌種鑒定
[0044] 1^液體培養(yǎng)基(8/1):蛋白胨10.0、酵母粉5.0、似(：110.〇4117.5。如用于轉(zhuǎn)化子 篩選，培養(yǎng)基中加入終濃度50yg/mL氨芐青霉素(Amp)。
[0045] 1^固體培養(yǎng)基(8/1):蛋白胨10.0、酵母粉5.0、恥(：110.0，瓊脂15.0 4117.5。
[0046]將FJ-3-16菌株單菌落接種于5mL液體LB培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)過夜。取lmL培養(yǎng)好的 菌液，按照"百泰克細(xì)菌基因組提取試劑盒"說明書提取細(xì)菌總DNA。
[0047]設(shè)計(jì)16S通用引物2 7F(5 ' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R(5 ' -ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3 '）。以細(xì)菌基因組為模板，按照Taq DNA聚合酶說明書中的PCR體 系及程序，PCR獲得DNA片段。
[0048] PCR體系如表1所示，PCR程序如表2所示：
[0049]表 1
[0053]利用DNA膠回收試劑盒(Omega)回收DNA片段，操作按試劑盒說明書進(jìn)行?；厥盏?PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，利用Solution I連接酶（大連寶生物）連接至載體 pMD19_T easy(大連寶生物)載體上。連接體系lOyl :DNA片段4yl，pMD19_T easy載體lyl， Solution I 5yl。連接條件：16°C，8h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)化方法按 照《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第三版）（薩姆布魯克，拉塞爾著，2002)說明進(jìn)行。按照pMD19-T easy載體序列設(shè)計(jì)引物 Ml 3F: CAGGAAACAGCTATGAC，Ml 3R: GTTTTCCCAGTCACGA，利用菌落 PCR 方法篩選轉(zhuǎn)化子，PCR體系及程序同上述。轉(zhuǎn)化子測(cè)序在鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完 成。
[0054] 測(cè)序共測(cè)得16S rRNA序列全長(zhǎng)1514bp。將序列在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST比對(duì)分析 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi ?PR0GRAM = blastn&PAGE_TYPE = BlastSearch&LINK_LOC = blasthome)，序列一致性較高的均為枯草芽抱桿菌Baci 1 lus subtilis，identity為99 %。利用Clustalx XI ? 83軟件對(duì)序列一致性較高的菌株的16S rRNA進(jìn)行多重比對(duì)，利用MEGA 6.0軟件的鄰接法(Neighbor-Joining Method)繪制序列進(jìn) 化樹，如圖2所示。
[0055]實(shí)施例3角蛋白酶Ker FJ的酶活測(cè)定
[0056] 取lml稀釋好的粗酶液加入lml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的keratin底物(TCI公司，K0044)， 在55°C反應(yīng)lh后加入2ml 0.4M TCA終止反應(yīng)，llOOOrpm離心2min后取上清lml，加入5ml 0.4M Na2C〇3和lml Fol in試劑，在40°C顯色20min后，在660nm比色，在660nm每分鐘吸光值升 高0.1定義為1個(gè)酶活單位(U)。
[0057]蛋白濃度測(cè)定
[0058]根據(jù)"BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒"說明書操作(碧云天生物技術(shù)），本發(fā)明中獲得的 B.subtilis FJ-3-16發(fā)酵液，1L中角蛋白酶總酶活73820.16U。利用本發(fā)明純化方法，1L B.subtilis FJ-3-16發(fā)酵液可收獲角蛋白酶Ker FJ純酶16.59mg，總酶活2989U。
[0059]實(shí)施例3本發(fā)明獲得的角蛋白酶Ker FJ的應(yīng)用 [0060] 1、畜禽廢棄物降解
[0061]角蛋白酶Ker FJ底物廣泛，能降解酪蛋白（casein )、可溶性角蛋白（參考 Wawrzkiewi方法自制，Wawrzkiewicz K et al.，J Med Vet Mycol, 1987,25:261-268)、羽 毛粉、羊毛粉、天青角蛋白（Keratin azure,Sigma,K8500)、keratin(TCI公司，K0044)等。 [0062]角蛋白酶Ker FJ對(duì)天然羽毛、羊毛的降解：
[0063] 酶解條件：45°C，150rpm酶解48h。未滅菌的羊毛、羽毛2.5mg/ml，酶濃度25U。添加 0-ME質(zhì)量濃度為0.1%。
[0064]酶解結(jié)果：角蛋白酶Ker FJ對(duì)天然狀態(tài)下的羽毛和羊毛有很強(qiáng)的降解作用，酶解 時(shí)羽毛的羽枝部分從羽軸上解離、堅(jiān)硬的羽軸斷裂，羊毛團(tuán)變松散。在還原劑P-ME(0.1%) 存在時(shí)降解更徹底，降解率由30%提高到80%，如圖3所示。
[0065] 2、脫毛作用
[0066] 實(shí)驗(yàn)條件:45°C，150rpm酶解24h。驢皮、羊皮購(gòu)自屠宰場(chǎng)，切成5cm X 5cm小塊;酶濃 度 45U。
[0067]實(shí)驗(yàn)結(jié)果：角蛋白酶Ker FJ對(duì)黑驢皮和白羊皮的脫毛效果顯著，且該酶沒有膠原 酶活性、有微弱彈性蛋白酶活性；目視觀察脫毛后的皮張紋路完整、毛孔清晰，皮張的膠原 層未受破壞，如圖4所不。
[0068] 3、作為洗滌劑添加劑
[0069] 角蛋白酶Ker FJ催化角蛋白水解的最適pH 9.0~9.5;pH穩(wěn)定性良好，在pH 6.0~ 11.5范圍內(nèi)酶活穩(wěn)定，pH12.0時(shí)仍保持90 %酶活。該酶最適酶活溫度55 °C ;熱穩(wěn)定性良好， 40°(：時(shí)酶活半衰期約10.611。該酶屬于中溫堿性角蛋白酶。金屬離子此2+、1( +、似+、512+、1^2+、 Mg2+、Ca 2+、Ba2+對(duì)酶活無影響;5mM還原劑DTT、DTNB、P-ME使酶活提高10% ;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的 去垢劑皂苷、作1切11乂-100、1'冊(cè)611-80不僅不能使酶活降低，還能使酶活提高104~32.56% 不等;質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1~3 %的氧化劑H2O2對(duì)酶活無降低作用。上述數(shù)據(jù)表明角蛋白酶Ker FJ的 抗逆性能優(yōu)異。
[0070] (1)實(shí)驗(yàn)條件:角蛋白酶Ker FJ稀釋到合適濃度，與質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的洗滌劑1:1混 合，混合后酶濃度40U/ml，在室溫下保溫lh、6h、12h后，利用Fol in-酸法測(cè)殘余酶活。以不與 洗滌劑混合的角蛋白酶Ker FJ保溫lh時(shí)的酶活作為100%。
[0071]實(shí)驗(yàn)結(jié)果：角蛋白酶Ker FJ在市售液體洗滌劑奧妙、立白、開米、碧浪、藍(lán)月亮、安 利中，室溫保溫1~12h酶活不僅不降低，反而有所升高；在超能、白貓中保溫lh仍能殘留 95 %以上酶活;在雕牌、汰漬中酶活降低，如圖5所示。
[0072] (2)實(shí)驗(yàn)條件：碧浪洗滌劑濃度1%，酶濃度9.6U/ml，洗滌條件：30°C，150rpm洗滌 lh〇
[0073]實(shí)驗(yàn)結(jié)果:與不添加角蛋白酶Ker FJ質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的碧浪相比，添加了酶的洗滌 劑在洗滌番茄醬、姜粉、甜面醬、辣醬、血漬等污漬時(shí)，洗滌效果更好，如圖6所示。
[0074]上述結(jié)果表明角蛋白酶Ker FJ具備開發(fā)成洗滌劑添加劑的應(yīng)用潛力。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種角蛋白酶的分離純化方法，步驟如下： 將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16發(fā)酵培養(yǎng)，獲得粗酶液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40 ~70 %的硫酸銨梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0，50mM Tris-HCl緩沖液重懸沉淀、透析；用 pH 10.0,50mM Tris-HCl緩沖液平衡Q Sepharose fast-flow離子交換柱，上樣，酶活峰在 穿過峰中；收集有酶活的組分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl緩沖液透析；用pH 7.0,50mM Tris-HCl緩沖液平衡SP Sepharose fast-flow離子交換柱，上樣，用0~1M NaCl梯度洗脫， 在0.25M NaCl處洗脫出有酶活的組分，即得純化后的角蛋白酶Ker FJ; 所述枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16于2016年01月20日保藏于中國(guó)微生物 菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌種保藏號(hào)CGMCC NO. 12086,保藏地址為北京市朝 陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，分類命名為Bacillus subtilis。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，粗酶液的發(fā)酵培養(yǎng)基為： FM3培養(yǎng)基（g.L-玉米粉20,大豆粉20,麩皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇4 3，CaCl2 1，ρΗ 7.5。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，粗酶液發(fā)酵培養(yǎng)的條件為:溫度為30°C，轉(zhuǎn) 速為200rpm，培養(yǎng)72h。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，粗酶液發(fā)酵培養(yǎng)時(shí)接種量為6 % (體積比）。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于，所述粗酶液的制備方法： 用紗布過濾發(fā)酵培養(yǎng)后的渣滓，llOOOrpm離心15min，收集發(fā)酵液上清即為粗酶液。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述角蛋白酶的分離純化的具體步驟為： (1) 將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16單菌落用接種針接種至LB液體培養(yǎng) 基中，30°C，200rpm培養(yǎng) 18h; LB液體培養(yǎng)基(g · L-1):蛋白胨10，酵母粉5，NaCl 10，pH 7 · 5; (2) 將LB液體培養(yǎng)基中的對(duì)數(shù)期種子液按6 % (體積比）接種量接種于FM3培養(yǎng)基中，30 °C，200rpm 培養(yǎng) 72h; FM3培養(yǎng)基（g.L-玉米粉20,大豆粉20,麩皮 10，KH2P〇4 l，K2HP〇4 3，CaCl2 1，ρΗ 7.5; (3) 用紗布過濾掉步驟(2)培養(yǎng)后的培養(yǎng)基渣滓，llOOOrpm離心15min收集發(fā)酵液上清 即為粗酶液； (4) 將枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis FJ-3-16發(fā)酵培養(yǎng)，獲得粗酶液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù) 為40~70%的硫酸銨梯度沉淀粗酶液后，用pH 10.0，50mM Tris-HCl緩沖液重懸沉淀、透 析；用pH 10.0，50mM Tris-HCl緩沖液平衡Q Sepharose fast-flow離子交換柱，上樣，酶活 峰在穿過峰中；收集有酶活的組分，用pH 7.0,50mM Tris-HCl緩沖液透析；用pH 7.0,50mM Tris-HCl緩沖液平衡SP Sepharose fast-flow離子交換柱，上樣，用0~1M NaCl梯度洗脫， 在0.25M NaCl處洗脫出有酶活的組分，即得純化后的角蛋白酶Ker FJ。7. 如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述方法制備的角蛋白酶在畜禽廢棄物降解方面的應(yīng)用。8. 如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述方法制備的角蛋白酶在脫毛方面的應(yīng)用。9. 如權(quán)利要求1-6任一項(xiàng)所述方法制備的角蛋白酶在作為洗滌劑添加劑方面的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12R1/125GK105821023SQ201610289190
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月4日
【發(fā)明人】邊斐, 岳壽松, 張曉瑋, 朱耀霞, 馬德源, 彭振英, 陳高, 畢玉平, 宣寧
【申請(qǐng)人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心