玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆性中的應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明涉及玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆性中的應(yīng)用，將含有玉米ZmPPase4基因的表達載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選出轉(zhuǎn)基因植株，并進行了耐鹽性鑒定。本發(fā)明的ZmPPase4基因能顯著提高植株的耐鹽堿性，對于培育高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物具有重要意義。
【專利說明】
玉米焦磷酸酶基因 ZmPPaSe4在提高植物抗逆性中的應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植 物抗逆性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹽堿脅迫是影響農(nóng)作物生產(chǎn)的重要因素。植物在含有高濃度鹽離子的土壤中，通 過水分運輸，會導(dǎo)致植物組織中離子積累。過多的可溶性離子包括鈉離子，鉀離子等會影響 植物正常發(fā)育。另外，高濃度的鹽導(dǎo)致的離子脅迫還會引起滲透脅迫，進而嚴重影響植物產(chǎn) 量。植物可以通過多種方式平衡鹽離子吸收，包括限制攝入、增加鈉離子的排泄、將鹽離子 區(qū)室化到液泡，以及控制的鈉離子的長途運輸從根到地上部分，從而減弱地上部分細胞質(zhì) 中鈉含量。
[0003] 焦磷酸酶(pyrophosphatase，PPase，EC3 ? 6 ? 1 ? 1)是一種廣泛存在于自然界的能夠 參與合成糖和蛋白的多種代謝反應(yīng)的水解酶。焦磷酸酶以焦磷酸為底物將焦磷酸基團水解 為磷酸鹽。通常，焦磷酸酶可以分為兩大類:一類是存在于細胞質(zhì)和細胞基質(zhì)中的可溶性無 機焦磷酸酶；另外一種是與膜結(jié)合的不可溶酶類。在細胞質(zhì)內(nèi)PPase活性較高，通過不斷水 解PPi使得細胞質(zhì)內(nèi)PPi保持較低水平。植物液泡膜上PPase和液泡ATPase共同作用，構(gòu)成植 物完整的質(zhì)子栗跨膜運輸體系，在植物生理活動中起重要作用。此外，PPase還可能參與將 無機鹽離子運進液泡，從而調(diào)節(jié)細胞膨壓。
[0004] 對于無機焦磷酸酶的生理機制研究較早，1975年Kawlsson從甜菜(Beta Vugaris) 根中首次分離到激活鉀離子的PPase，它在水解PPi的同時，還能將H+從細胞質(zhì)運送如液泡 膜內(nèi)。1990年，Kieber從擬南芥中克隆了一個0RF為789bp的焦磷酸酶，其蛋白分子量約為 30kDa。1995年，Jorge從馬鈴薯中克隆了一個無機焦磷酸酶，發(fā)現(xiàn)該蛋白序列的催化結(jié)構(gòu)域 與擬南芥同源域相似度非常高，從進化樹及保守結(jié)構(gòu)分析表明馬鈴薯、擬南芥和大腸桿菌 的無機焦磷酸化酶蛋白結(jié)構(gòu)中都含有一個極端保守的疏水蛋白域。2008年，張寧、司懷軍等 人克隆了一個馬鈴薯PPase基因，通過生物學(xué)軟件對PPase基因及其編碼的蛋白質(zhì)的分析表 明，該基因與茄科屬植物的同源性高達89 %~97 %，與其他物種基因的同源性在77 %~ 80%之間。其編碼的蛋白質(zhì)具有多個磷酸化位點，沒有跨膜區(qū)。通過亞細胞定位可知，它主 要定位于細胞質(zhì)和線粒體基質(zhì)，可能在糖代謝中發(fā)揮重要的調(diào)控作用。2009年張春鳳，司懷 軍等對轉(zhuǎn)正義和反義PPase基因的馬鈴薯植株進行了功能研究，分析了焦磷酸酶的活性測 定條件，結(jié)果表明PPase在pH值為8.0時具有較高的活性，酶促反應(yīng)的最適溫度是42°C，不同 陽離子活性檢測中Mg 2+與PPase親和力最高。
[0005] 對液泡焦磷酸酶(V-PPase)的研究要晚于無機焦磷酸酶，1992年，Sarafian K等首 次篩選克隆出擬南芥V-PPase基因，研究結(jié)果表明，擬南芥V-PPase編碼區(qū)為2310bp，編碼 769個氨基酸。2000年，在擬南芥中克隆到了第2種類型的液泡焦磷酸酶，命名為AVP2。在上 述研究的基礎(chǔ)上，研究者根據(jù)V-PPase的保守序列設(shè)計引物成功地從多種植物中克隆到焦 磷酸酶基因序列，經(jīng)過多物種間的cDNA序列比對可知，其核酸序列非常保守，在其酶活性的 保守序列結(jié)構(gòu)域中相似性可達到近90%。礦轉(zhuǎn)運焦磷酸化酶(H+-PPase)屬于液泡焦磷酸酶 的一種，在參與植物逆境脅迫響應(yīng)中起重要作用。擬南芥A VP1編碼一個H+-PPase焦磷酸酶， 主要在液泡膜上起H+轉(zhuǎn)運作用，通過轉(zhuǎn)運H+使液泡膜產(chǎn)生H+梯度，從而驅(qū)動Na+/H+離子栗等 反向轉(zhuǎn)運。在擬南芥中過表達AVP1基因能夠顯著提高植株耐旱和耐鹽堿能力。由此說明H+-PPase在植物逆境脅迫下通過調(diào)控H+梯度，從而調(diào)整細胞內(nèi)外壓差，對植物抗逆具有重要意 義。
[0006] 可見，目前對于植物抗逆基因的研究是近年來的熱點領(lǐng)域，目前，這方面的研究工 作基本上是在模式植物擬南芥上進行的。對于重要作物(如水稻、玉米、小麥等）中此類基因 的研究較少，特別是有關(guān)玉米焦磷酸酶基因的功能研究尚未見報道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆性中的應(yīng)用。 [0008]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供的玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆 性中的應(yīng)用，其中基因ZmPPase4編碼蛋白的氨基酸序列如SEQ ID No.l所示或該序列經(jīng)替 換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0009] 本發(fā)明所述抗逆性包括耐鹽堿性，即對鹽堿脅迫的抗性。
[0010] 本發(fā)明所述植物包括但不限于擬南芥。
[0011] 前述的應(yīng)用，通過在植物中過表達基因ZmPPase4的CDS序列，從而提高轉(zhuǎn)基因植株 抗逆性。具體方法如下：
[0012] 提取玉米總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，依據(jù)目的基因ZmPPase4的序列，設(shè)計PCR擴增引 物，從玉米cDNA擴增出如SEQ ID No.2所示的基因ZmPPase4的⑶S序列，并將所述⑶S序列構(gòu) 建到植物表達載體上，轉(zhuǎn)化植物，篩選轉(zhuǎn)基因植株。
[0013]優(yōu)選地，通過Gateway技術(shù)將所述⑶S序列構(gòu)建到植物表達載體上，具體方法如下： 將所述CDS序列連接至入門載體pGWC上，得到的重組載體pGWC-ZmPPase4與載體 pEarleyGate202進行LR反應(yīng)，即得重組表達載體pEar 1 eyGate202_ZmPPase4，并用 pEarleyGate202_ZmPPase4轉(zhuǎn)化植物（圖 1)。
[0014] ?0財廣增所用引物為(3￡〇10如.3和4):
[0015] 正向引物F 5，-ATGGCGCCCGCTGTAGAAG-3'
[0016] 反向引物R 5'-CTACCTCCTCAGGCCCTCAAC-3'
[0017]攜帶有目的基因的表達載體可通過使用Ti質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、微 注射、電穿孔等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物細胞中（Weissbach，1998，Method for Plant Molecular Biology VIII，Academy Press，New York，第411-463頁；Geiserson和Corey， 1998,Plant Molecular Biology,2nd Edition)〇
[0018] 本發(fā)明優(yōu)選采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植物。
[0019] 優(yōu)選地，利用草銨膦(口1108口11；[1101：111'；[0；[11，？?1')篩選轉(zhuǎn)基因植株。
[0020] 本發(fā)明進一步提供玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4,基因ZmPPase4的⑶S序列為：
[0021] i)SEQ ID No .2所示的核苷酸序列；或
[0022] ii)SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且 表達相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或
[0023] iii)在嚴格條件下與SEQ ID No.2所示序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸 序列，所述嚴格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65°C 下雜交，并用該溶液洗膜;或
[0024] iv)與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達相同功能蛋白質(zhì)的 核苷酸序列。
[0025]本發(fā)明涉及玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4在提高植物抗逆性中的應(yīng)用，將含有玉米 ZmPPase4基因的表達載體轉(zhuǎn)入植物中，篩選出轉(zhuǎn)基因植株，并進行了耐鹽性鑒定。本發(fā)明的 ZmPPase4基因通過調(diào)控下游相關(guān)基因參與植物耐鹽堿過程，對于培育高產(chǎn)的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物 具有重要意義。
【附圖說明】
[0026] 圖1為本發(fā)明實施例1中構(gòu)建重組表達載體PEarleyGate202-ZmPPase4的流程圖。
[0027]圖2為本發(fā)明實施例3中轉(zhuǎn)基因株系目的基因的PCR檢測結(jié)果；其中，M:Marker;l: 正對照（以載體pEarleyGate202-ZmPPase4為PCR模板）；2:負對照（以野生型擬南芥DNA為 PCR 模板）；13、19、21、27、42、43、44、45、48、50、60和61:211^?3864不同轉(zhuǎn)基因株系目的基因 擴增結(jié)果。
[0028]圖3為本發(fā)明實施例4中轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型植株在含有不同濃度NaCl的培養(yǎng) 基上生長情況比較結(jié)果。轉(zhuǎn)35S: :ZmPPaSe4基因擬南芥種子點播在含有150mM NaCl的MS培 養(yǎng)基上，4°C春化3d后，置于22°C培養(yǎng)，10d后觀察生長狀況轉(zhuǎn)基因株系在150mM NaCl的平板 上生長明顯受到抑制，轉(zhuǎn)基因株系(^-21、(^-37、(^-42長勢明顯優(yōu)于訂，他(：1對幼苗根長也 有明顯抑制作用。
[0029] 圖4為本發(fā)明實施例5中高鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株的表型比較結(jié)果;其 中，A為根長比較結(jié)果，B為鮮重比較結(jié)果。
【具體實施方式】
[0030] 以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例 均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊（Sambrook J&Russell DW, Molecular cloning:a laboratory manual ,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。 [0031]實施例1玉米焦磷酸酶基因ZmPPase4的克隆及植物表達載體的構(gòu)建
[0032] 1、提取玉米總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，依據(jù)目的基因ZmPPase4的序列，設(shè)計PCR擴增引 物（3￡0 10如.3和4)，從玉米〇0嫩擴增出基因211^3864的〇)5序列（5￡0 10如.2)，并用瓊 脂糖凝膠試劑盒回收目的片段。
[0033] 2、將回收的片段與pGWC載體連接，然后后轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細胞，獲得陽性單克隆， 經(jīng)測序鑒定得到與目的基因序列完全相同的單克隆，搖菌并提取該單克隆質(zhì)粒，命名為 pGWC-ZmPPase4〇
[0034] 3、以pGWC_ZmPPase4為入門載體，pEar 1 eyGate202為表達載體，經(jīng)過LR反應(yīng)，獲得 重組表達載體pEarleyGate202_ZmPPase4(圖 1，即超表達載體35S: : ZmPPase4)。
[0035] 實施例2轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的獲得
[0036] 1、構(gòu)建好的超表達載體35S: :ZmPPase4轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101。
[0037] 2、用沾花浸染(floral dipping)的方法轉(zhuǎn)化野生型擬南芥。
[0038] 3、將轉(zhuǎn)化后得到的T0代種子春化3天，然后直接播種到營養(yǎng)土中生長，正常生長約 兩周后，用0.5%。的草銨膦噴灑T0代擬南芥篩選轉(zhuǎn)化植株。
[0039] 4、由于所用的轉(zhuǎn)化超表達載體中帶有抗草銨膦的Bar基因，轉(zhuǎn)化時可隨目的基因 一起轉(zhuǎn)入植物體，因此噴施PPT后大部分未轉(zhuǎn)化植株死亡，而轉(zhuǎn)化植株仍然能夠正常生長。 轉(zhuǎn)化植株按照不同株系分別收獲n代種子。
[0040] 5、收獲各轉(zhuǎn)基因株系T2代種子后，用0.5%的NaCIO對種子進行消毒處理。然后點 種于含有〇. 5%〇PPT的MS培養(yǎng)基平板中（每個轉(zhuǎn)基因株系需要約45粒種子），以野生型為負對 照。
[0041] 6、春化三天后置于22°C光照培養(yǎng)箱中生長，一周后觀察幼苗生長情況。野生型在 含0.5%qPPT的MS培養(yǎng)基中無法存活;T2代雜合體轉(zhuǎn)基因株系由于在產(chǎn)生子代的過程中會發(fā) 生基因分離與自由組合，因此會有一部分無草銨膦抗性的種子出現(xiàn)；只有T2代為純合體轉(zhuǎn) 基因株系的種子能全部在含PPT的MS培養(yǎng)基中存活。
[0042]實施例3轉(zhuǎn)基因陽性株系的鑒定
[0043] 1、以提取的陽性植株的總DNA為模板，用如SEQ ID No.4和5所示的引物進行PCR擴 增，陽性植株能夠擴增出645bp的條帶，而假陽性植株則無PCR擴增產(chǎn)物。野生型植株不能擴 增出目的條帶。（圖2)
[0044] 2、收獲各轉(zhuǎn)基因株系T2代種子后，用0.5%的NaCIO對種子進行消毒處理。然后點 種于含有〇. 5%〇PPT的MS培養(yǎng)基平板中（每個轉(zhuǎn)基因株系需要約45粒種子），以野生型為負對 照。
[0045] 3、春化三天后置于22°C光照培養(yǎng)箱中生長，一周后觀察幼苗生長情況。野生型在 含0.5%〇PPT的MS培養(yǎng)基中無法存活。
[0046] 4、T2代雜合體轉(zhuǎn)基因株系由于在產(chǎn)生子代的過程中會發(fā)生基因分離與自由組合， 因此會有一部分無卡那霉素抗性的種子出現(xiàn)；只有T2代為純合體轉(zhuǎn)基因株系的種子能全部 在含卡那霉素的MS培養(yǎng)基中存活。
[0047] 實施例4轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株的抗逆性比較
[0048] 將轉(zhuǎn)35S: :ZmPPase4基因擬南芥株系點播在含有0mM、125mM、150mM的NaCl的MS平 板上，4°C春化3天后，置于22°C，16小時光照/8小時黑暗的培養(yǎng)箱中，5天后觀察表型并進行 分析。結(jié)果見圖3,從結(jié)果可以看出，野生型擬南芥在高鹽脅迫下葉子萎蔫發(fā)黃程度嚴重，而 轉(zhuǎn)基因株系0E-21、0E-37、0E-42長勢較好。轉(zhuǎn)基因株系及野生型在正常MS培養(yǎng)基中表型無 明顯差別。
[0049] 實施例5高鹽脅迫下轉(zhuǎn)基因植株及野生型植株的表型比較
[0050] 將轉(zhuǎn)35S: :ZmPPase4基因擬南芥T3純合株系（(^-21、(^-37、(^-42)及野生型（訂） 擬南芥種子，滅菌后分別點播于含有125mM、150mM NaCl的MS固體培養(yǎng)基上，4°C春化3天，將 培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)室，16h光/8h暗條件下垂直培養(yǎng)，過表達基因ZmPPase4植株在含有125mM、 150mM NaCl的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)14天后。分別測量不同植株的根長及鮮重，每個轉(zhuǎn)基因株系 測量10株，3次重復(fù)。結(jié)果見圖4,從結(jié)果可以看出，轉(zhuǎn)35S: :ZmPPase4基因擬南芥在125mM的 NaCl培養(yǎng)基上，WT根長只有3-4cm，過表達基因ZmPPase4的轉(zhuǎn)基因株系根長為6cm，在更高濃 度（150mM)的NaCl條件下，WT根長只有2.5〇11，野生型訂在15〇1111的他(：1的1^培養(yǎng)基上出現(xiàn)白 化及萎蔫表型。正常的MS培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因株系與野生型植株無明顯差異。同樣，經(jīng)過125mM、 150mM NaCl脅迫處理后轉(zhuǎn)基因株系鮮重與WT相比具有顯著差異，說明高濃度NaCl脅迫可以 嚴重抑制植株生長，而轉(zhuǎn)基因株系具有明顯的耐鹽性。
[0051]雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。
【主權(quán)項】
1. 玉米焦磷酸酶基因 ZmPPase4在提高植物抗逆性中的應(yīng)用，其中基因 ZmPPase4編碼蛋 白的氨基酸序列如SEQ ID No. 1所示或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個或幾個氨基酸形成 的具有同等功能的氨基酸序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抗逆性包括耐鹽堿性。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述植物包括擬南芥。4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，通過在植物中過表達基因 ZmPPase4的⑶S序列，從而提高轉(zhuǎn)基因植株抗逆性。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，提取玉米總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，依據(jù)目的 基因 ZmPPase4的序列，設(shè)計PCR擴增引物，從玉米cDNA擴增出如SEQ ID No . 2所示的基因 ZmPPase4的CDS序列，并將所述CDS序列構(gòu)建到植物表達載體上，轉(zhuǎn)化植物，篩選轉(zhuǎn)基因植 株。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，通過Gateway技術(shù)將所述CDS序列構(gòu)建到植 物表達載體上，具體方法如下：將所述CDS序列連接至入門載體pGWC上，得到的重組載體 pGWC_ZmPPase4與載體pEarleyGate202進行LR反應(yīng)，即得重組表達載體pEarleyGate202_ ZmPPase4，并用pEar leyGate202_ZmPPase4 轉(zhuǎn)化植物。7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的應(yīng)用，其特征在于，PCR擴增所用引物為： 正向引物F 5 ' -ATGGCGCCCGCTGTAGAAG-3 ' 反向引物R 5 ' -CTACCTCCTCAGGCCCTCAAC-3 '。8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化植 物。9. 根據(jù)權(quán)利要求5-8任一項所述的應(yīng)用，其特征在于，利用草銨膦篩選轉(zhuǎn)基因植株。10. 玉米焦磷酸酶基因 ZmPPase4，其特征在于，基因 ZmPPase4的⑶S序列為： i) SEQ ID No.2所示的核苷酸序列；或 ii) SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列經(jīng)取代、缺失和/或增加一個或多個核苷酸且表達 相同功能蛋白質(zhì)的核昔酸序列;或 iii) 在嚴格條件下與SEQ ID No.2所示序列雜交且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷酸序 列，所述嚴格條件為在含〇. 1 % SDS的0.1 X SSPE或含0.1 % SDS的0.1 X SSC溶液中，在65 °C下 雜交，并用該溶液洗膜;或 iv) 與i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90%以上同源性且表達相同功能蛋白質(zhì)的核苷 酸序列。
【文檔編號】C12N15/82GK105821017SQ201610200926
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月31日
【發(fā)明人】鄭軍, 陳勛基, 焦珍珍, 王國英
【申請人】中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所