一種髓核細(xì)胞分離純化方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種髓核細(xì)胞分離純化方法，包括：沖洗步驟，將獲取的椎間盤髓核組織用PBS沖洗干凈；剪碎步驟，將所述組織剪碎；消化步驟，加入2倍體積的消化液，消化液是體積比為1：1的0.5％II型膠原酶和0.25％胰蛋白酶混合液，在恒溫水浴箱震蕩消化設(shè)定時(shí)長(zhǎng)，靜置后吸取上清液，加入含體積分?jǐn)?shù)10％FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，剩余組織加所述消化液繼續(xù)消化，如此重復(fù)多次；收集步驟，將終止消化后的液體離心，離心轉(zhuǎn)速為1000～1500rpm，離心時(shí)間為5～10min，去上清，用含體積分?jǐn)?shù)10％FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸髓核細(xì)胞沉淀。本方法分離純化過程簡(jiǎn)單快捷，消化過程溫和，消化時(shí)間短，所需儀器設(shè)備簡(jiǎn)單；所獲得的髓核細(xì)胞量大，存活率高，更易于在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)貼壁、附著、延伸，細(xì)胞活性比較強(qiáng)。
【專利說明】
-種髓核細(xì)胞分離純化方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種分離純化方法，具體來說是指一種椎間盤髓核細(xì)胞的分離純化方 法。
【背景技術(shù)】
[0002] 腰痛構(gòu)成了一個(gè)可觀的流行病學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)問題，盡管腰痛的原因有許多，但是一 個(gè)很明顯的原因是與椎間盤的退變極大相關(guān)。椎間盤隨年齡增長(zhǎng)由于各種原因而導(dǎo)致退 變，而髓核組織中存在最明顯的改變。椎間盤的退變速度遠(yuǎn)比其他組織要快，從而改變了脊 柱的力學(xué)，而運(yùn)種損傷極難自我修復(fù)。目前的治療包括非手術(shù)治療(例如鍛煉、物理治療如 熱/冷刺激、電刺激、針灸、牽引W及止痛藥物)和手術(shù)治療(融合術(shù)和微創(chuàng)），但是手術(shù)常常 達(dá)不到緩解疼痛的目的，還可能加速鄰近間盤的退變性改變。組織工程技術(shù)提供了修復(fù)退 變椎間盤功能的一條有效方法。大多數(shù)研究直接指向了髓核組織工程，因?yàn)樽甸g盤退變被 認(rèn)為起源于髓核組織區(qū)域，而臨床微創(chuàng)手術(shù)可獲取大量退變髓核組織，研究者試圖通過從 髓核組織內(nèi)分離得到髓核細(xì)胞，從而在體外通過髓核細(xì)胞來研究椎間盤退變的機(jī)制。目前， 關(guān)于人髓核細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法不一，所用消化酶及消化時(shí)間（2-4h，4-化，6-她、過夜）差 異較大，而且所獲取的細(xì)胞量較少，存活率也較低。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的目的在于提供了一種新的髓核細(xì)胞分離純化方法。
[0004] 本發(fā)明的一種髓核細(xì)胞分離純化方法，包括如下步驟：
[0005] 沖洗步驟，將椎間盤髓核組織沖洗干凈；
[0006] 剪碎步驟，將所述組織剪碎；
[0007] 消化步驟，利用消化液消化所述組織；
[000引收集步驟，收集消化下來的髓核細(xì)胞。
[0009] 所述消化步驟可W重復(fù)多次。
[0010] 所述消化液包含II型膠原酶和膜蛋白酶中的至少一種。
[00川所述消化液是體積比為1:1的0.5 % II型膠原酶和0.25 %膜蛋白酶混合液。
[0012] 所述消化步驟中，終止液是含體積分?jǐn)?shù)10%FBS的高糖DMEM。
[0013] 所述收集步驟中，通過離屯、作用收集消化下來的髓核細(xì)胞。
[0014] 所述剪碎步驟中，剪碎后的所述組織的直徑不大于1mm。
[0015] -種髓核細(xì)胞分離純化方法，包括如下步驟：
[0016] a)將獲取的髓核組織置于含雙抗的PBS中，分離髓核組織周圍的纖維環(huán)組織，然后 用PBS沖洗干凈；
[0017] b)將沖洗干凈后的髓核組織剪碎，加入消化液，在恒溫水浴箱中震蕩消化過夜，并 用終止液終止消化；
[001引 C)離屯、，棄上清及用DMEM重懸細(xì)胞。
[0019] 所述步驟b)中，所述消化液是2倍體積的0.5% II型膠原酶和0.25 %膜蛋白酶混合 液，且所述II型膠原酶和0.25%膜蛋白酶的體積比是1:1。所述步驟b)中，所述終止液是含 體積分?jǐn)?shù)10 % FBS的DMEM。
[0020] -種髓核細(xì)胞分離純化方法，包括如下步驟：
[0021] 沖洗步驟，將獲取的椎間盤髓核組織用PBS沖洗干凈；
[0022] 剪碎步驟，將所述組織剪碎；
[0023] 消化步驟，加入2倍體積的消化液，消化液是體積比為1:1的0.5% II型膠原酶和 0.25%膜蛋白酶混合液，在恒溫水浴箱震蕩消化設(shè)定時(shí)長(zhǎng)，靜置后吸取上清液，加入含體積 分?jǐn)?shù)10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，剩余組織加所述消化液繼續(xù)消化，如此重復(fù)多次；
[0024] 收集步驟，將終止消化后的液體離屯、，離屯、轉(zhuǎn)速為1000~1500巧m，離屯、時(shí)間為5~ lOmin，去上清，用含體積分?jǐn)?shù)10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸髓核細(xì)胞沉淀。
[00巧]較佳的是，離屯、轉(zhuǎn)速為1500巧m，離屯、時(shí)間為1 Omin。
[0026] 本發(fā)明的有益效果是:分離純化過程簡(jiǎn)單快捷，消化過程溫和，消化時(shí)間短，所需 儀器設(shè)備簡(jiǎn)單，成本較低；所獲得的髓核細(xì)胞量大，存活率高，更易于在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)貼壁、附 著、延伸，細(xì)胞活性比較強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面通過【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0028] 本實(shí)施方式髓核細(xì)胞分離純化方法包括如下步驟:獲取手術(shù)椎間盤髓核組織后， 將組織用PBS沖洗S遍，盡量將組織上殘留的血液沖洗干凈;洗凈后盡量吸去殘留的PBS溶 液，無菌條件下用眼科剪將組織盡可能的剪碎;加入2倍體積的膠原酶-膜酶混合液(0.5% 濃度的II型膠原酶和0.25%濃度的膜蛋白酶的體積比是1:1)，37°C消化15min，靜置后吸取 上清液，加入含體積分?jǐn)?shù)10 %FBS(FBS，胎牛血清）的DMEM培養(yǎng)基終止消化，剩余組織加膠原 酶-膜酶混合液繼續(xù)消化，如此重復(fù)S次。將終止消化后的液體離屯、，離屯、轉(zhuǎn)速1500rpm，離 屯、時(shí)間lOmin，去上清，用含體積分?jǐn)?shù)10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸髓核細(xì)胞沉淀。
[0029] 本實(shí)施方式中，獲取的髓核組織需用PBS洗多次，盡量去除血液殘留，髓核組織用 眼科剪剪碎，要盡可能剪到直徑1mm W下。
[0030] 本實(shí)施方式中，所用消化液為0.5%11型膠原酶和0.25%膜蛋白酶等體積混合液。 當(dāng)然，II型膠原酶和膜蛋白酶的體積比也可W是2:1或1:2。較佳的是，體積比是1:1，此時(shí)， 消化時(shí)間和細(xì)胞存活率較佳。
[0031] 本實(shí)施方式中，消化時(shí)間15min是指每次加入消化液后、37°C恒溫水浴震蕩消化 15min，剩余未被消化的組織繼續(xù)加消化液消化，反復(fù)重復(fù)多次;每次消化可W使用同樣的 消化液。重復(fù)次數(shù)如3次。
[0032] 本實(shí)施方式中，消化反應(yīng)的終止液可W選用含10%FBS的高糖DMEM。當(dāng)然，終止液 可 W 選用含 10%FBS 的 RPMI1640。
[0033] 本實(shí)施方式中，離屯、轉(zhuǎn)速為1500巧m，離屯、時(shí)間為lOmin。
[0034] 本實(shí)施方式的關(guān)鍵是手術(shù)所取髓核組織消化前要盡可能將血液洗凈，W免殘留血 細(xì)胞影響髓核細(xì)胞的沉降貼壁;眼科剪要盡可能將組織剪碎，W減少消化時(shí)間，從而減少酶 對(duì)細(xì)胞的損傷;消化液為膠原酶和膜蛋白酶的混合液，一方面避免單獨(dú)用膠原酶消化時(shí)間 過長(zhǎng)，另一方面避免膜蛋白酶作用太強(qiáng)對(duì)細(xì)胞造成損傷；消化過程重復(fù)=次，每次作用 15min，可避免酶對(duì)已消化下來的髓核細(xì)胞造成損傷;離屯、1500rpm、10min可W最大程度收 集消化下來的髓核細(xì)胞。
[0035] 實(shí)施例1:
[0036] 手術(shù)摘取的髓核組織置于含雙抗(青-鏈霉素）的PBS中，小屯、分離周圍少量的纖維 環(huán)組織，然后用PBS沖洗S次，直至無明顯血跡為止。用眼科剪將髓核組織剪成直徑約1mm大 小，加入2倍體積0.5% n型膠原酶，37°C恒溫水浴箱中震蕩消化過夜。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，100化/min離屯、5min;棄上清(主要作用為去除殘存的消化 酶），用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的重懸細(xì)胞。使用臺(tái)吩藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率、血球 計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X lOVml后，接種于T25培養(yǎng)瓶，置于37 °C、5 % C〇2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h換液1次，W后每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
[0037] 實(shí)施例2:
[0038] 手術(shù)摘取的髓核組織置于含雙抗(青-鏈霉素）的PBS中，小屯、分離周圍少量的纖維 環(huán)組織，然后用PBS沖洗S次，直至無明顯血跡為止。用眼科剪將髓核組織剪成直徑小于1mm 大小，加入2倍體積0.5 % n型膠原酶，37°C恒溫水浴箱中震蕩消化過夜。用含體積分?jǐn)?shù)10 % 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，15(K)r/min離屯、lOmin;棄上清(主要作用為去除殘存的消 化酶），用含體積分?jǐn)?shù)10 %胎牛血清的重懸細(xì)胞。使用臺(tái)吩藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率、血 球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 105/ml后，接種于T25培養(yǎng)瓶，置于37 °C、5 % C〇2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h換液1次，W后每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
[0039] 實(shí)施例3:
[0040] 手術(shù)摘取的髓核組織置于含雙抗(青-鏈霉素）的PBS中，小屯、分離周圍少量的纖維 環(huán)組織，然后用PBS沖洗S次，直至無明顯血跡為止。用眼科剪將髓核組織剪成直徑小于1mm 大小，加入2倍體積0.25%膜蛋白酶，37°C恒溫水浴箱中震蕩消化化。用含體積分?jǐn)?shù)10%胎 牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，150化/min離屯、lOmin;棄上清(主要作用為去除殘存的消化 酶），用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的重懸細(xì)胞。使用臺(tái)吩藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率、血球 計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 105/ml后，接種于T25培養(yǎng)瓶，置于37 °C、5 % C〇2培 養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h換液1次，W后每3天換液1次。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
[0041 ] 實(shí)施例4:
[0042] 手術(shù)摘取的髓核組織置于含雙抗(青-鏈霉素）的PBS中，小屯、分離周圍少量的纖維 環(huán)組織，然后用PBS沖洗S次，直至無明顯血跡為止。用眼科剪將髓核組織剪成直徑小于1mm 大小，加入2倍體積0.5% n型膠原酶和0.25%膜蛋白酶混合液(體積比1:1 )，37°C恒溫水浴 箱中震蕩消化4h。用含體積分?jǐn)?shù)10 %胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，1500r/min離屯、 lOmin;棄上清(主要作用為去除殘存的消化酶），用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì) 胞。使用臺(tái)吩藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率、血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X 105/ ml后，接種于T25培養(yǎng)瓶，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h換液1次，W后每3天換液1 次。倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
[0043] 實(shí)施例5:
[0044] 手術(shù)摘取的髓核組織置于含雙抗(青-鏈霉素）的PBS中，小屯、分離周圍少量的纖維 環(huán)組織，然后用PBS沖洗S次，直至無明顯血跡為止。用眼科剪將髓核組織剪成直徑小于1mm 大小，加入2倍體積0.5% n型膠原酶和0.25%膜蛋白酶混合液（1:1)，37°C恒溫水浴箱中震 蕩消化15min。靜置后取上清，用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基終止消化，剩余組 織加酶繼續(xù)消15min，如此重復(fù)S次直至組織完全消化，終止消化后1500r/min離屯、lOmin; 棄上清(主要作用為去除殘存的消化酶），用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的DMEM重懸細(xì)胞。使 用臺(tái)吩藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率、血球計(jì)數(shù)板計(jì)算細(xì)胞濃度，調(diào)整細(xì)胞濃度為2 X lOVml后， 接種于T25培養(yǎng)瓶，置于37°C、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24h換液1次，W后每3天換液1次。倒置 相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。
[0045] 現(xiàn)有文獻(xiàn)顯示常用消化酶組分為n型膠原酶、膜蛋白酶、DNA酶、鏈霉蛋白酶等單 獨(dú)或混合使用，而文獻(xiàn)報(bào)道的消化時(shí)間為20min，45min，化，2-地，4-化，6-8h、過夜等，差異 較大，國(guó)內(nèi)外說法各異，而有研究者認(rèn)為0.2 % n型膠原酶消化髓核組織塊4h為獲取髓核細(xì) 胞的最佳條件。本
【申請(qǐng)人】用0.5% n型膠原酶進(jìn)行了嘗試，即使把組織剪碎成糜爛狀，4h仍 不能完全消化組織，因而不能獲得全部細(xì)胞。同時(shí)本
【申請(qǐng)人】也用0.25%膜蛋白酶進(jìn)行消化， 消化過程很快（化左右），但死細(xì)胞很多，細(xì)胞存活率很低，說明膜蛋白酶對(duì)細(xì)胞損傷很大。 而最后本
【申請(qǐng)人】混合膠原酶和膜蛋白酶，加快了消化過程(分=次消化，每次15min，如果組 織小于500mg，兩次即可完全消化），減少了獲取髓核細(xì)胞操作過程所需要的時(shí)間。而且混合 膠原酶可使作用溫和，避免膜蛋白酶強(qiáng)的作用對(duì)細(xì)胞造成的損傷。
[0046] 各種消化液的消化結(jié)果如表1所示。
[0047] 表1各種消化液的消化結(jié)果對(duì)比 [004引
[0049] 本消化時(shí)間和所獲細(xì)胞量W500mg組織計(jì)算，如果組織大于500mg，則需消化S次。 當(dāng)0.5% n型膠原酶/0.25%膜蛋白酶體積比是1:1時(shí)，如果組織小于500mg，可W只消化兩 次;如果大于500mg，則需消化S次。表1中，當(dāng)體積比是1:1時(shí)，消化總時(shí)間較短、所獲總細(xì)胞 較多且細(xì)胞存活率較高。
[0050] W上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說明，不能認(rèn)定本發(fā) 明的具體實(shí)施只局限于運(yùn)些說明。對(duì)于本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫 離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可W做出若干簡(jiǎn)單推演或替換。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，包括如下步驟： 沖洗步驟，將椎間盤髓核組織沖洗干凈； 剪碎步驟，將所述組織剪碎； 消化步驟，利用消化液消化所述組織； 收集步驟，收集消化下來的髓核細(xì)胞。2. 如權(quán)利要求1所述的髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，所述消化步驟重復(fù)多次。3. 如權(quán)利要求1或2所述的髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，所述消化液包含II型 膠原酶和胰蛋白酶中的至少一種。4. 如權(quán)利要求3所述的髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，所述消化液是體積比為1: 1的0.5 % II型膠原酶和0.25 %胰蛋白酶混合液。5. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，所述消化步 驟中，終止液是含體積分?jǐn)?shù)10 % FBS的高糖DMEM。6. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，所述收集步 驟中，通過離心作用收集消化下來的髓核細(xì)胞。7. 如權(quán)利要求1-3中任意一項(xiàng)所述的髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，所述剪碎步 驟中，剪碎后的所述組織的直徑不大于1mm。8. -種髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，包括如下步驟： a) 將獲取的髓核組織置于含雙抗的PBS中，分離髓核組織周圍的纖維環(huán)組織，然后用 PBS沖洗干凈； b) 將沖洗干凈后的髓核組織剪碎，加入消化液，在恒溫水浴箱中震蕩消化過夜，并用終 止液終止消化； c) 離心，棄上清及用DMEM重懸細(xì)胞。9. 如權(quán)利要求8所述的髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，所述步驟b)中，所述消化 液是2倍體積的0.5% II型膠原酶和0.25 %胰蛋白酶混合液，且所述0.5% II型膠原酶和 0.25 %胰蛋白酶的體積比是1:1。10. -種髓核細(xì)胞分離純化方法，其特征在于，包括如下步驟： 沖洗步驟，將獲取的椎間盤髓核組織用PBS沖洗干凈； 剪碎步驟，將所述組織剪碎； 消化步驟，加入2倍體積的消化液，消化液是體積比為1:1的0.5% II型膠原酶和0.25% 胰蛋白酶混合液，在恒溫水浴箱震蕩消化設(shè)定時(shí)長(zhǎng)，靜置后吸取上清液，加入含體積分?jǐn)?shù) 10 % FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，剩余組織加所述消化液繼續(xù)消化，如此重復(fù)多次； 收集步驟，將終止消化后的液體離心，離心轉(zhuǎn)速為1 〇 〇 〇~15 0 0 r p m，離心時(shí)間為5~ lOmin，去上清，用含體積分?jǐn)?shù)10 %FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸髓核細(xì)胞沉淀。
【文檔編號(hào)】C12N5/077GK106047801SQ201610371318
【公開日】2016年10月26日
【申請(qǐng)日】2016年5月30日
【發(fā)明人】朱艷霞, 周光前
【申請(qǐng)人】深圳大學(xué)