專利名稱：從人血漿中分離純化巨核細胞刺激因子的方法及應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生化分離純化技術(shù)領(lǐng)域。
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)人腎細胞條件化培養(yǎng)液，人尿中都含有一種可促進動物血小板生成的蛋白質(zhì)，但分子量、等電點和免疫學性質(zhì)和血小板生成素(TPO)完全不同，經(jīng)深入研究發(fā)現(xiàn)，這是一種新的生長因子，故命名為巨核細胞刺激因子簡稱MES，以與TPO區(qū)別。鑒于胎腎來源有限，人尿雖無限制，但體積大，必須從大量尿液中富集，給生產(chǎn)帶來不便，而且人尿MES主要是低分子量形式，活性比高分子量形式低得多。本發(fā)明從人血漿沉淀物中分離MES，得到比較理想的結(jié)果。
本發(fā)明技術(shù)將人血漿分離白蛋白和(或)球蛋白后的沉淀物，溶于磷酸緩沖液(PBS)中，上陰離子纖維素層析柱，用含有不同濃度NaCl的PBS洗脫，收集活性峰，加(NH4)2SO4沉淀，放置過夜，離心，沉淀溶解后對水透析，離心，上清上Sephacryl柱分離，收集洗脫活性峰，凍干、溶解、透析，上DEAE-Sephadex柱，進行NaCl直線梯度洗脫，收集活性峰，透析平衡，透析液離心，上清除熱原，除菌，測蛋白濃度，加蛋白保護劑60℃ 10h滅活病毒，測活性，除菌，去熱原，得原料液，稀釋至所需濃度后加入凍干輔料，除菌，分裝，凍干，包裝，藥品常規(guī)檢查，得最終的合格藥品。該藥品可用于治療腫瘤放、化療引起的血小板低下，以及血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合癥等血液病或環(huán)境、藥物、化學物質(zhì)、放射性物質(zhì)、電磁波等引起的血小板減少癥。
活性測定(體內(nèi)法)小鼠肌肉注射樣品含MES 5ug/ml，0.1ml/10g體重每日一次(在肌注樣品之前，先每只小鼠眼眶或尾部采血，計數(shù)血小板)連續(xù)8天，于第三次注射樣品后再腹腔注射環(huán)磷酰胺(CTX)100mg/kg/d，連續(xù)三天，鹽水對照組注射生理鹽水代替樣品，代替樣品，在最后一次注射后次日小鼠眼眶或尾部取血20ul，加入0.38ml血小板稀釋液中混合，室溫放置10-30分鐘以溶解紅細胞和白細胞，取此稀釋好的血小板懸液一滴加入計數(shù)池內(nèi)靜置10-15分鐘，用高倍鏡計數(shù)血小板數(shù)，凡試驗組的血小板數(shù)與對照組比較，經(jīng)統(tǒng)計學處理，有明顯差異視為合格產(chǎn)品。
本發(fā)明所述MES無論在體內(nèi)還是體外促進血小板生成的效果都十分明顯1、巨核細胞刺激因子對環(huán)磷酰胺所致的小鼠血小板減少的影響取健康小鼠40只，♀♂各半，體重18-22g，隨機分四組，生理鹽水(NS)組，巨核細胞刺激因子低、中、高劑量組(劑量分別為0.5ug/Kg、5ug/Kg、25ug/Kg)小鼠肌肉注射樣品0.1ml/10g體重，每日一次(在肌注樣品之前，先每只小鼠眼眶或尾部采血，計數(shù)血小板)連續(xù)8天，于第三次注射樣品后再腹腔注射環(huán)磷酰胺100mg/kg/d，連續(xù)三天，鹽水對照組注射生理鹽水代替樣品，在最后一次注射后次日小鼠眼眶或尾部取血20ul，加入0.38ml血小板稀釋液中混合，室溫放置10-30分鐘以溶解紅細胞和白細胞，取此稀釋好的血小板懸液一滴加入計數(shù)池內(nèi)靜置10-15分鐘，用高倍鏡計數(shù)血小板數(shù)，經(jīng)統(tǒng)計學處理試驗組的血小板數(shù)比對照組有顯著性差異，結(jié)果見表1。
表1.肌肉注射不同劑量的MES對CTX所致小鼠的血小板減少的影響劑量 動物數(shù) 血小板(×109)組別 ug/Kg只 CTX處理前 CTX處理和治療后NS 10 888.00±337.30 477.00±289.00+++MES 0.5 10 1014.00±123.10*1015.00±154.00+***MES 5.0 10 1074.00±139.75*1025.00±107.50+***MES 25.0 10 944.15±89.60* 1220.00±200.75++***注*與相應NS相比，*p＞0.05，***p＜0.01。+與處理前相比，+p＞0.05，+++p＜0.01。
由表1可見，CTX可使小鼠血小板明顯減少，與CTX處理前相比有明顯差異。肌肉注射不同劑量的巨核細胞刺激因子可不同程度地提高血小板值，并有劑量依賴關(guān)系。2、巨核細胞刺激因子對60Co照射所致的大鼠血小板減少的影響取28只SD大鼠，♀♂各半，體重250±30g，隨機分四組，生理鹽水(NS)組，巨核細胞刺激因子低、中、高劑量組(劑量分別為2.5ug/Kg、5ug/Kg、10ug/Kg)，尾部取血，測正常血小板數(shù)，送江蘇省農(nóng)科院輻射中心經(jīng)60Co照射(總量為4.0Gy，劑量率為800倫/min)后，肌肉注射NS或巨核細胞刺激因子，每天一次(注射容積為0.1ml/100g體重)，分別于7，11，14日測血小板值，觀察它們的變化。
表2.不同劑量的MES對60Co照射所致的大鼠血小板減少的影響劑量動物數(shù) 血小板(×109/L)組別(ug/Kg) (只) 0d 7d 11d 14dNS 7 919.14±78.55 143.57±14.84+++30.71±14.38+++ 276.36±158.35+++MES 2.5 7 950.00±195.0*121.00±30.00*+++ 57.90±37.11*+++382.12±190.25*+++MES 5.0 7 959.43±85.32*132.71±39.99*+++ 101.29±38.07***+++ 513.57±194.83**+++MES 107 934.86±76.47*127.57±28.72*+++ 130.00±31.27***+++ 615.50±121.87***+++注*與相應NS相比，*P＞0.05，**P＜0.05，***P＜0.01.+與0d相比，+P＞0.05，++P＜0.05，+++P＜0.01。
由表2結(jié)果可見，60Co照射后7d，11d，14d，大鼠血小板明顯減少，但不同劑量的巨核細胞刺激因子可不同程度地阻止血小板值的進一步減少，照射后第14d，巨核細胞刺激因子組血小板值恢復較NS組明顯增快，且呈劑量相關(guān)性。3、巨核細胞刺激因子對60Co照射所致的犬血小板減少的影響犬12只，隨機分為3組，每組4只，生理鹽水(NS)組，巨核細胞刺激因子低、高劑量組(劑量分別為15、30ug/Kg)，測正常血小板值后送江蘇省農(nóng)科院輻射中心經(jīng)60Co雙側(cè)骨盆屏蔽照射，共6.0Gy，劑量率為100倫/min，照射后第二天開始每天肌肉注射NS或巨核細胞刺激因子(注射容積為0.1ml/Kg體重)，于照射后隔日測血小板值，觀察它們的變化。結(jié)果見表3。
表3不同劑量的MES對60Co照射所致的犬血小板值減少的影響劑量動物數(shù) 血小板值(×109/L)組別(ug/Kg) (只)0d 2d 4d 6dNS4 249.50±72.57 246.00±85.45 229.50±100.87 154.00±65.49*MES 15 4 236.50±48.52 234.75±18.21 254.67±29.37201.25±35.68MES 30 4 247.00±31.43 277.25±25.41 283.25±66.60222.25±82.96PLT續(xù)表1.8d 10d 12d 14d 16d105.67±24.11**80.50±17.77**86.66±19.42**77.25±21.14**74.75±12.48**97.75±16.38**84.50±12.01**75.00±23.40**87.50±15.28**84.50±10.85**106.00±16.02**85.50±11.09*77.25±22.87**92.75±19.88**90 25±23.82**PLT續(xù)表2.18d 20d 22d 24d 26d97.00±14.10**109.50±34.23**99.25±18.20**104.00±6.21**90.00±10.23**97.50±24.72**105.25±22.87**129.00±45.88**125.25±29.83**98.00±28.32**114.50±35.15**135.00±32.30*141.50±30.13*# 168.50±36.19# 158.75±37.56#PLT續(xù)表3.28d 30d 32d 34d108.00±40.65**113.25±22.54*111.34±28.34**110.25±31.94**148.75±52.36**139.00±23.90**177.10±32.12215.00±48.91##201.00±42.23# 212.50±84.63# 232.57±52.11# 251.67±30.86##注*P＜0.05，**P＜0.01，與0d相比；#P＜0.05，##p＜0.01，與相應NS相比。
由表3結(jié)果可見，MES對60Co照射后的血小板減少具有明顯的刺激作用，高劑量組在34天治療后，血小板完全恢復到照射前的水平，而對照組僅恢復到照射前的44％。
本發(fā)明與已有技術(shù)相比，有以下特點1.國內(nèi)外均無同類產(chǎn)品，為治療血小板低下癥的專一藥物。
2.純天然制品，在制造過程中未使用過任何有害化學物質(zhì)，十分安全。
3.本品為與人同源的細胞生長因子，使用量為微克水平，不存在異源蛋白的問題。
4.原料來源豐富，甚至是廢物利用，成本低，制造過程無污染。
5.MES除了可刺激巨核細胞的增殖分化外，對造血干細胞也有很好的促增殖分化作用。分離臍血中的單個核細胞(MNC)與MES或MES+rSCF(重組干細胞生長因子)培養(yǎng)7天后，MNC擴增25倍和29倍，對照組為10.8倍。CD34+細胞擴增32倍和60倍，對照組僅9倍，CD34+CD38-細胞擴增23倍和60倍，而對照組只擴增6倍，說明MES對臍血干細胞或骨髓干細胞(CD34+、CD38-)體外有擴增作用，MES可單獨使用，也可與干細胞生長因子(rSCF)合并使用?？芍苽涑芍苿┗蛟噭┖校糜诟杉毎w外擴增和干細胞移植。
實施例收集制備過白蛋白后的血漿沉淀物300g濕重(相當于100L血漿)，溶于6L 10mmol/L pH6.5的PBS中，4℃，9000r/m，離心10分鐘，取上清(蛋白濃度2.46mg/ml)，共得蛋白質(zhì)14.76g，將離心上清上DEAE纖維素柱層析，以10mmol/L PBS和含0.1mol/L NaCl的10mmol/L PBS洗去雜蛋白，再以0.5mol/LNaCl/10mmol/L PBS洗下目的蛋白共10.5g，回收率71.1％。加入(NH4)2SO4至80％飽和度，收集沉淀，對水透析；透析液經(jīng)過Sephacryl凝膠柱分離，共得4個蛋白峰，收集峰I和峰II，得蛋白質(zhì)4.29g，回收率40％，冷凍濃縮后，透析平衡，再經(jīng)DEAE-Sephadex柱分離，上樣后先以含0.1mol/LNaCl的10mmol/L PBS洗去雜質(zhì)，再以0.1mol/L-0.5mol/LNaCl的直線梯度洗脫，其中峰III為活性峰，得到800mg蛋白質(zhì)，通過SDS-PAGE檢查呈現(xiàn)二條帶，分子量分別為40-42kd與18-20kd二者比例為2∶1。MES經(jīng)巰基乙醇加熱變性后40-42kd的成分減少，18-20kd成分大量增加，沒有新的條帶產(chǎn)生，二條帶洗脫后測活均有促進小鼠骨髓細胞中巨核細胞增殖的生物學功能，40-42kd的活性比18-20kd的活性高約10％-20％，將SDS-PAGE的條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，以考馬斯亮藍染色，切下藍色條帶，經(jīng)序列測定，二種分子形式蛋白的N-端10個氨基酸的序列相同，經(jīng)國外蛋白質(zhì)序列庫檢索至2002年2月，未能與目前已知的人源蛋白序列獲得明顯的相容性結(jié)果。MES的等電點測定為4.6±0.1，故稱本品為一種全新結(jié)構(gòu)的蛋白質(zhì)。
活性峰800mg，經(jīng)過凍干、透析、離心去熱原，除菌等步驟后，得到合格產(chǎn)品330mg，相當于1噸血漿可得3300mgMES，可制成針劑10000-15000瓶。
權(quán)利要求
1.一種巨核細胞刺激因子(MES)，其特征是從人血漿中分離到一種新的生長因子-巨核細胞刺激因子(MES)，它有兩種分子形式，分子量分別為40-42Kda和18-20Kda，pI為4.2±0.1。但大分子形式MES的生物活性明顯高于低分子量形式，經(jīng)測定二種分子形式的N-末端序列完全相同，MES的N-端1-10氨基酸序列為(Val-thr-glu-asp-ser-asp-gln-leu-gly-tyr-)。
2.一種巨核細胞刺激因子的生產(chǎn)方法，其特征是將人血漿分離白蛋白和(或)球蛋白后的沉淀物，溶于磷酸緩沖液(PBS)中，上陰離子纖維素層析柱，用含有不同濃度NaCl的PBS洗脫，收集活性峰，加(NH4)2SO4沉淀，放置過夜，離心，沉淀溶解后對水透析，離心，上清上Sephacryl柱分離，收集洗脫活性峰，凍干、溶解、透析，上DEAE-Sephadex柱，進行NaCl直線梯度洗脫，收集活性峰，透析平衡，透析液離心，上清除熱原，除菌，加蛋白保護劑60℃ 10h滅活病毒，測蛋白濃度，測活性，除菌，去熱原，得原料液，稀釋至所需濃度后加入凍干制劑用輔料，除菌，分裝，凍干，包裝，藥品常規(guī)檢查，得最終產(chǎn)品。
3.一種巨核細胞刺激因子的應用，其特征是MES具有明顯的促進巨核細胞祖細胞分化、成熟為有功能的巨核細胞?？芍苽涑伤幬?，用于治療腫瘤放、化療引起的血小板低下，以及血小板減少性紫癜、再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合癥等血液病或環(huán)境、藥物、化學物質(zhì)、放射性物質(zhì)、電磁波等引起的血小板減少癥。
4.一種巨核細胞刺激因子的應用，其特征是MES對臍血干細胞或骨髓干細胞(CD34+、CD38-)體外有擴增作用，MES可單獨使用，也可與干細胞生長因子(rSCF)合并使用?？芍苽涑芍苿┗蛟噭┖校糜诟杉毎w外擴增和干細胞移植。
全文摘要
本發(fā)明屬于生化分離純化技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明從人血漿經(jīng)生產(chǎn)白蛋白和球蛋白后的沉淀物中,通過溶解、離心、超濾、離子交換纖維素層析,凝膠過濾,DEAE凝膠層析等方法,分離純化了巨核細胞刺激因子(Megakarylcyte Stimulator,簡稱MES),MES具有分子量40－42Kda和18－20Kda兩種形式,等電點4.6±0.1,均具有促進巨核細胞的祖細胞分化成熟,表現(xiàn)出巨核細胞的功能,從而可以在體內(nèi)促進血小板生成,對血小板低下癥具有專一的治療效果。此外MES還具有促進臍帶血干細胞增殖的功能。在干細胞移植中有著重大的潛在價值。
文檔編號A61K38/18GK1369507SQ0211272
公開日2002年9月18日 申請日期2002年3月6日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月6日
發(fā)明者張鶴云, 金以豐, 張?zhí)? 湯國枝, 袁達文 申請人:南京大學