用于核酸純化的一步程序的制作方法
【專利說明】用于核酸純化的一步程序
[0001]背景
核酸純化通常由下述組成:從樣品中釋放核酸的裂解步驟，核酸與固體基質(zhì)的結(jié)合，洗滌基質(zhì)以去除污染物質(zhì)，和在緩沖液中從基質(zhì)洗脫核酸。該過程是復(fù)雜的，特別是在污染物去除的基質(zhì)洗滌中。溶液必須加入基質(zhì)中，其將去除污染物而不是核酸，并且隨后這些溶液必須在從基質(zhì)中洗脫核酸之前去除。如果磁性顆粒用作固體基質(zhì)，則它們通常必須在結(jié)合步驟后進(jìn)行捕獲，通過從溶液中捕獲和去除顆粒或通過固定顆粒和去除裂解結(jié)合溶液而與裂解結(jié)合溶液分開，并且隨后釋放到洗滌溶液內(nèi)。在洗滌后，顆粒必須再次被捕獲且與洗滌溶液分開。參見例如，Alderton，R.P.等人，Anal.B1chem.(1992) 201:166-169 和 WO91/00212。一些方案需要使用幾種不同洗滌溶液的幾個(gè)洗滌步驟。在顆粒已洗滌后，它們必須重懸浮于洗脫緩沖液中，以從顆粒中釋放核酸。進(jìn)一步地，這些程序通常對(duì)于核酸不是選擇性的。相反，各種固體和溶解的物質(zhì)同樣凝集。
[0002]其他方案需要用例如乙醇使核酸沉淀。沉淀的核酸隨后必須進(jìn)行洗滌和重新溶解。也存在用于分離核酸的層析程序(參見例如EP O 658 164)，但這些程序也需要多個(gè)步驟和洗滌。
[0003]通過Boreal Genomics，Inc.(Los Altos, CA)的現(xiàn)有技術(shù) SCODA (SynchronousCoefficient of Drag Alterat1n)系統(tǒng)使用脈沖電場(chǎng)將核酸集中到一個(gè)點(diǎn)，但這通常是可能非常稀釋的預(yù)純化材料。由在Northwestern University的Kelso(Sur等人，ImmisciblePhase Nucleic Acid Purificat1n Eliminates PCR Inhibitors with a Single Passof Paramagnetic Particle through a Hydrophobic Liquid， J.Mol.Diag.2012 12
(5):620-628)開發(fā)的油-門系統(tǒng)(oil-gate system)拉動(dòng)顆粒通過油，以嘗試消除洗滌，但該方法導(dǎo)致大量的鹽遺留，因?yàn)橛驮陬w粒周圍留下大滴裂解溶液，這導(dǎo)致很多鹽遺留。因此，當(dāng)使用該系統(tǒng)時(shí)，需要另外的處理。
[0004]可見現(xiàn)有技術(shù)考慮的用于核酸分離/純化的方法具有某些缺點(diǎn)。此類缺點(diǎn)涉及例如純度、選擇性、回收率、實(shí)驗(yàn)室安全和便利性、以及分離/純化過程的速度。換言之，已知的現(xiàn)有技術(shù)程序需要多個(gè)步驟，且通常導(dǎo)致由于眾多步驟的靶核酸喪失和/或靶核酸改變(例如由于重復(fù)的苛刻處理?xiàng)l件的修飾基團(tuán)喪失)。
[0005]因此，待解決的問題是提供用于從樣品中分離核酸的更簡(jiǎn)單程序，其節(jié)省時(shí)間和試劑，并且?guī)椭柚乖谔幚砥陂g的靶的喪失和/或靶的修飾。
[0006]發(fā)明概述
本發(fā)明涉及使用凝膠從洗脫緩沖液中分離裂解-結(jié)合溶液。顆粒用于捕獲裂解-結(jié)合溶液中的核酸。顆粒是磁性的，并且使用磁場(chǎng)進(jìn)行集中。具體地，顆粒通過磁場(chǎng)拉動(dòng)穿過去除污染物的凝膠，并且將集中的顆粒重懸浮于洗脫緩沖液中。該過程非常簡(jiǎn)單。凝膠使裂解-結(jié)合溶液與洗脫緩沖液分開，并且限制或消除兩者之間的混合。顆粒通過凝膠的移動(dòng)去除污染物和鹽。污染物通過經(jīng)過凝膠而被去除(即它們被“刷(squeegeed)”掉)。鹽通過經(jīng)過凝膠被稀釋。顆粒隨后直接傳遞到在其中釋放核酸的洗脫緩沖液中。磁性顆?？梢噪S后拉回到凝膠內(nèi)，或者通過離心或沉降(重力)與洗脫緩沖液分開。這個(gè)過程已顯示成功純化來(lái)自血漿樣品的HCV病毒RNA，使用實(shí)時(shí)PCR測(cè)定以檢測(cè)丙型肝炎病毒(HCV病毒)RNA。
[0007]本發(fā)明考慮了從核酸樣品中去除裂解緩沖液組分的方法，該方法包括:提供包含或懷疑包含核酸的樣本，使樣本與一種或多種裂解試劑接觸，在適合于樣本中的核酸與固體基材結(jié)合的條件下，使樣本與固體基材接觸一段時(shí)間，并且如果核酸存在于樣本中，則使結(jié)合有核酸的所述固體基材經(jīng)過水基分離凝膠(aqueous-based separat1n gel)。當(dāng)裂解緩沖液含有濃度大于約I摩爾的鹽時(shí)，本方法是有用的。固體基材可以是微粒，并且微?？梢詾橹睆郊s0.1 nm至約5 nm或直徑約0.8 nm至約5 nm。進(jìn)一步地，微?？梢允谴判缘?。
[0008]本發(fā)明進(jìn)一步考慮了在經(jīng)過含水凝膠后，使與所述固體基材結(jié)合的核酸與洗脫緩沖液接觸，所述洗脫緩沖液從所述固體基材中洗脫核酸。再進(jìn)一步地，核酸不在有機(jī)溶劑中沉淀，或核酸可以在有機(jī)溶劑中沉淀，并且有機(jī)溶劑可以是乙醇或任何其他合適的有機(jī)溶劑。
[0009]本發(fā)明進(jìn)一步考慮了在經(jīng)過含水凝膠后，在從固體基材洗脫前或后，使與固體基材結(jié)合的核酸與酶接觸。酶可以是DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶。再進(jìn)一步地，核酸可以在固體基材上進(jìn)行測(cè)序，而無(wú)需稀釋。
[0010]本發(fā)明進(jìn)一步考慮了可以在經(jīng)過含水凝膠后使與固體基材結(jié)合的核酸與重亞硫酸鹽接觸，使得將未甲基化的胞嘧啶脫氨基。本發(fā)明進(jìn)一步考慮了核酸中的至少一個(gè)核堿基可以具有表觀遺傳修飾。
[0011]本發(fā)明再進(jìn)一步考慮了核酸可以經(jīng)由選自下述的實(shí)體與固體基材結(jié)合:核酸雜交、適體、抗體、抗體片段、生物素、抗生物素蛋白和鏈霉抗生物素蛋白。
[0012]本發(fā)明考慮了用于從樣品中富集核酸的方法，該方法包括:提供懷疑包含核酸的樣品、適合于結(jié)合核酸的微粒和水基分離凝膠，在適合于樣品中的任何核酸與磁性微粒結(jié)合的條件下，使樣品與微粒接觸一段時(shí)間，以產(chǎn)生裝載的磁性微粒；用磁場(chǎng)將裝載的微粒拉動(dòng)通過水基分離凝膠。凝膠可以是瓊脂糖凝膠。瓊脂糖凝膠可以為約0.10%至約1.0%的濃度。分離凝膠還可以包含乙醇和甘油中的一種或多種。顆粒還可以包含適合于結(jié)合核酸的官能團(tuán)。
[0013]進(jìn)一步考慮微粒可以是磁性的，并且磁性微粒任選至少部分涂布有二氧化硅和玻璃中的一種或多種。磁性微?？梢允乔驙铙w，盡管任何形狀均被考慮為在本發(fā)明中是合適的。
[0014]進(jìn)一步考慮樣品可以包含裂解緩沖液。
[0015]附圖描述
圖1 (A - F)顯示了如實(shí)施例中所述的本發(fā)明方法的例示。
[0016]圖2顯示了(A)如實(shí)施例2中詳述的通過本發(fā)明的方法純化的靶核苷酸序列的DNA擴(kuò)增曲線和(B )內(nèi)部對(duì)照。
[0017]圖3顯示了(A)如實(shí)施例2中詳述的通過本發(fā)明的方法純化的靶核苷酸序列的DNA擴(kuò)增曲線和(B )內(nèi)部對(duì)照。
[0018]發(fā)明詳述
本方法涉及核酸的一步分離和純化方法。該方法是簡(jiǎn)單的且容易由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員執(zhí)行。該方法涉及加入裂解溶液(裂解溶液是本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的)和結(jié)合核酸的固體基材(例如氧化鐵顆粒，磁性顆粒，至少部分地涂布有玻璃、二氧化硅等的磁性顆粒等)。存在的核酸將結(jié)合顆粒。在磁性顆粒的情況下，顆粒隨后用置于測(cè)定容器外的磁源(即磁體)拉動(dòng)通過含水凝膠(例如瓊脂糖凝膠，盡管與核酸相容的任何凝膠例如SDS丙烯酰胺凝膠也將是合適的)。拉動(dòng)顆粒通過凝膠的動(dòng)作去除(即“刷去”)不溶性污染物，且稀釋可溶性污染物(例如鹽)。顆粒在離開凝膠后進(jìn)入洗脫緩沖液。核酸在洗脫緩沖液中被釋放。磁性顆粒隨后可以被拉回到凝膠內(nèi)，或允許沉降出來(lái)(或在從凝膠表面去除洗脫緩沖液中后離心出來(lái))。該方法通常在管中執(zhí)行，其中凝膠在裂解緩沖液上分層，并且洗脫緩沖液在凝膠上分層。任選地，非洗脫緩沖液可以在凝膠上分層，并且需要時(shí)，在以后的時(shí)間，從顆粒中洗脫核酸。洗脫緩沖液可以包含或不包含有機(jī)溶劑(例如乙醇)。
[0019]通常的裂解緩沖液包含鹽。在裂解緩沖液中通常發(fā)現(xiàn)的鹽包括但不限于硫氰酸胍(GITC)(通常范圍為0.5 M至4.0 M)、NaCl (通常范圍高達(dá)0.1 M至10.5 M)。裂解緩沖液還通常含有緩沖劑(例如Tris-HCl ;通常濃度為約25 mM，約pH 7至約pH 8，或本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的其他合適緩沖劑)和去污