基于核酸適體熒光探針afp4的甲胎蛋白試劑盒及其檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)測(cè)定技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及基于核酸適體熒光探針AFP4的甲 胎蛋白試劑盒及其檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 甲胎蛋白（AFP)是一種糖蛋白，正常情況下，這種蛋白主要來(lái)自胚胎的肝細(xì)胞，胎 兒出生后約兩周甲胎蛋白從血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微 克/升。甲胎蛋白在產(chǎn)婦羊水或母體血漿中AFP可用于胎兒產(chǎn)前監(jiān)測(cè)。如在神經(jīng)管缺損、脊柱 裂、無(wú)腦兒等時(shí)，AFP可由開(kāi)放的神經(jīng)管進(jìn)入羊水而導(dǎo)致其在羊水中含量顯著升高。胎兒在 宮腔內(nèi)死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可經(jīng)羊水部分進(jìn)入母體血循環(huán)。 在85%脊柱裂及無(wú)腦兒的母體，血漿AFP在妊娠16-18周可見(jiàn)升高而有診斷價(jià)值，但必須與臨 床經(jīng)驗(yàn)結(jié)合，以免出現(xiàn)假陽(yáng)性的錯(cuò)誤。
[0003] 檢測(cè)甲胎蛋白的方法有好幾種，放射免疫法測(cè)得的甲胎蛋白大于甲胎蛋白500 微克/升、且持續(xù)4周者，或甲胎蛋白在200~500微克/升、持續(xù)8周者，在排除其它引起甲胎 蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌癥后，需再結(jié)合定位檢 查，如B超、CT、磁共振(MRI)和肝血管造影等即可作出診斷。不過(guò)，正常懷孕的婦女、少數(shù)肝 炎和肝硬化、生殖腺惡性腫瘤等情況下甲胎蛋白也會(huì)升高，但升高的幅度不如肝癌那樣高。 肝硬化病人血清甲胎蛋白濃度多在25~200微克/升之間，一般在2個(gè)月內(nèi)隨病情的好轉(zhuǎn)而 下降，多數(shù)不會(huì)超過(guò)2個(gè)月；同時(shí)伴有轉(zhuǎn)氨酶升高，當(dāng)轉(zhuǎn)氨酶下降后甲胎蛋白也隨之下降，血 清甲胎蛋白濃度常與轉(zhuǎn)氨酶呈平行關(guān)系。如果甲胎蛋白濃度在500微克/升以上，雖有轉(zhuǎn) 氨酶升高，但肝癌的可能性大，轉(zhuǎn)氨酶下降或穩(wěn)定，而甲胎蛋白上升，也應(yīng)高度懷疑肝癌。
[0004] 甲胎蛋白在肝癌出現(xiàn)癥狀之前的8個(gè)月就已經(jīng)升高，此時(shí)大多數(shù)肝癌病人仍無(wú)明 顯癥狀，腫瘤也較小，這部分患者經(jīng)過(guò)手術(shù)治療后，預(yù)后可得到明顯改善，故肝硬化、慢性肝 炎病人、家族中有肝癌患者的人應(yīng)半年檢測(cè)一次。
[0005] 目前沒(méi)有能夠直接識(shí)別甲胎蛋白的抗體和其它分子探針。因此設(shè)計(jì)一種高度設(shè)別 甲胎蛋白的分子探針，并基于此建立簡(jiǎn)單快速和廉價(jià)的檢測(cè)方法將提高對(duì)肝癌和胎兒先天 病等于甲胎蛋白相關(guān)的疾病的的監(jiān)控。
[0006] 核酸適配體是近年發(fā)展起來(lái)的一類(lèi)新型識(shí)別分，是指能夠高特異性和高親和力地 域靶分子結(jié)的單鏈核苷酸分子。核酸適體可以通過(guò)配體指數(shù)富集系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) (Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX)篩選獲得。 SELEX技術(shù)是指應(yīng)用化學(xué)法合成大容量的隨機(jī)寡核苷酸（由兩端的固定序列和中間的隨機(jī) 序列組成）文庫(kù)，通過(guò)施加選擇壓力（結(jié)合靶目標(biāo)，淘選與靶目標(biāo)高度特異結(jié)合片段的過(guò) 程），并結(jié)合體外擴(kuò)增技術(shù)，經(jīng)過(guò)多輪的循環(huán)選擇富集，獲得與靶物質(zhì)高度特異結(jié)合的寡 核苷酸分子，可以是RNA也可以是DNA，長(zhǎng)度一般為25~60個(gè)核苷酸。核酸適體主要通過(guò) 發(fā)生適應(yīng)性折疊，通過(guò)氫鍵、疏水堆積作用、范德華力與靶分子相互作用，與插入或包被的 革巴分子形成穩(wěn)定的三維空間結(jié)構(gòu)。核酸適體不與祀分子結(jié)合時(shí)，核酸適體處于比較松散的 結(jié)構(gòu)，5'和3'兩端相互游離。與靶分子結(jié)合時(shí)，靶分子誘導(dǎo)核酸適體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，核酸 適體的5'端和3'端都將參與與靶分子特定區(qū)域(類(lèi)似于與抗體結(jié)合的抗原位點(diǎn)）的相互 作用，導(dǎo)致5'和3'兩端相互靠近。這一特點(diǎn)使核酸適體適于分子信標(biāo)探針設(shè)計(jì)。其中一種 分子信標(biāo)設(shè)計(jì)利用了熒光染料芘分子。當(dāng)一個(gè)激發(fā)態(tài)芘分子和另一個(gè)基態(tài)芘分子近距離遭 遇的時(shí)候能形成激發(fā)態(tài)二聚體，能在比芘單體波長(zhǎng)更長(zhǎng)的位置釋放一個(gè)光子。芘激發(fā)態(tài)二 聚體發(fā)射峰在480到500nm，而芘單體的發(fā)射峰在370到400nm之間。另外，芘分子熒 光壽命比生物樣品中的非特異激發(fā)熒光的壽命長(zhǎng)，檢測(cè)時(shí)可以在非特異激發(fā)熒光消失后， 再來(lái)收集激發(fā)態(tài)二聚體的熒光信號(hào)，大大提高檢測(cè)的特異性和靈敏度。識(shí)別甲胎蛋白的核 酸適體可以應(yīng)用于甲胎蛋白的臨床檢測(cè)，提高檢測(cè)效率，降低檢測(cè)成本。
[0007] 核酸適體與靶物質(zhì)結(jié)合所呈現(xiàn)的高敏感性和高特異性，使其在疾病診斷中具有 良好的應(yīng)用前景，盡管目前成熟的臨床應(yīng)用報(bào)道較少，但應(yīng)用適體檢測(cè)靶蛋白的研究卻 不斷增多，基于適體的檢測(cè)新技術(shù)也不斷出現(xiàn)。核酸適體由于其獨(dú)特的化學(xué)抗體特性成為 新一代針對(duì)特定蛋白的分子藥物或靶向載體，以及用于檢測(cè)其特異性識(shí)別的靶分子物質(zhì)。 但是目前基于核酸適體的針對(duì)于甲胎蛋白AFP診斷試劑還很缺乏，且針對(duì)于甲胎蛋白AFP的 核酸適體熒光探針檢測(cè)試劑盒的開(kāi)發(fā)尚未見(jiàn)有報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是針對(duì)現(xiàn)有的易產(chǎn)生操作技術(shù)誤差、重復(fù)性欠佳、干擾因素很多、操 作繁瑣、測(cè)試成本高等不足，提供一種基于核酸適體熒光探針的甲胎蛋白AFP試劑盒及其檢 測(cè)方法。
[0009] 本發(fā)明的方案是通過(guò)這樣實(shí)現(xiàn)的： 一種基于核酸適體熒光探針的甲胎蛋白試劑盒，其特征在于，主要成分包括:含NH4C1、 Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液;含MgCl2的0.2M磷酸緩沖液；甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)品；甲胎蛋白核 酸適體熒光探針;所述甲胎蛋白核酸適體熒光探針為5'和3'兩端分別標(biāo)記熒光芘分子單體 的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：ggatgcggta acggtacgta cctgtatagt gtgacatcct gtctccaacc acctgctgac gtgc。該序列命名為AFP4〇
[0010] 以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的甲胎蛋白試劑盒，所述含NH4Cl、Tris、 EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液為含有 1~280 mmol/L NH4CI，1~34 mmol/L Tris，l~2mmol/ LEDTA-Na2, pH 7.0~7.2;所述含MgCh的0.2M磷酸緩沖液為含有1~10mmol/L MgCh。
[0011] 以上任一所述的一種基于核酸適體熒光探針的甲胎蛋白試劑盒，其特征在于，所 述含NH4CI、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液、含MgCl 2的0.2M磷酸緩沖液、甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、 甲胎蛋白核酸適體熒光探針為配制好直接使用的液體試劑或是使用前需加水溶解的干粉 狀態(tài)。
[0012] 以上所述的一種基于核酸適體熒光探針的甲胎蛋白試劑盒，其特征在于，該試劑 盒用于檢測(cè)肝素抗凝全血或末梢血中的甲胎蛋白濃度。
[0013] -種用以上任一所述基于核酸適體熒光探針的甲胎蛋白試劑盒來(lái)檢測(cè)甲胎蛋白 濃度的方法，其特征在于，方法步驟包括： (1)血樣裂解:將血樣和含NH4CI、Tris、EDTA-Na2的紅細(xì)胞裂解液按1:0.5~5體積比混 勾，靜置5~30min，再中速離心5~lOmin，收集上清液； (2) 混合卵育：混合卵育：取20~100μΙ步驟1)得到的上清液和30~50ul的用含MgCl2的 〇. 2M磷酸緩沖液，溶解甲胎蛋白核酸適體熒光探針得到的甲胎蛋白核酸適體熒光探針試劑 混合，室溫下卵育5~15min，使甲胎蛋白核酸適體熒光探針與血樣充分結(jié)合，得到測(cè)試液； (3) 熒光檢測(cè)：熒光檢測(cè)儀檢測(cè)步驟2)得到的測(cè)試液50ul，在熒光檢測(cè)儀熒光激發(fā)后， 讀取熒光激發(fā)后20至100ns時(shí)間段內(nèi)波長(zhǎng)在480~500nm的熒光值； (4) 結(jié)果計(jì)算:使用生物醫(yī)學(xué)作圖軟件，參照甲胎蛋白標(biāo)準(zhǔn)樣品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)合 步驟3)中檢測(cè)到的熒光值計(jì)算出血樣中甲胎蛋白的濃度。
[0014] 以上所述的生物醫(yī)學(xué)軟件為Sigma plot軟件，于市面上可以購(gòu)買(mǎi)到。
[0015] 以上所述的一種用基于核酸適體熒光探針的甲胎蛋白試劑盒來(lái)檢測(cè)甲胎蛋白濃 度的方法，其特征在于，所述甲胎蛋白核酸適體熒光探針試劑中甲胎蛋白核酸適體熒光探 針濃度為200~400 nmol/L，其特性還在于，所述甲胎蛋白核酸適體熒光探針為5'和3'兩端 分別標(biāo)記焚光花分子單體的核苷酸單鏈，該核苷酸單鏈序列為：ggatgcggta acggtacgta cctgtatagt gtgacatcct gtctccaacc acctgctgac gtgc〇
[0016] 甲胎蛋白核酸適體熒光探針不與甲胎蛋白結(jié)合時(shí)，核酸適體處于比較松散的結(jié) 構(gòu)，5'和3'兩端的芘分子單體相互游離，熒光激發(fā)后發(fā)射波長(zhǎng)在370~400nm之間；甲胎 蛋白核酸適體熒光探針與甲胎蛋白結(jié)合時(shí)，甲胎蛋白誘導(dǎo)其發(fā)生結(jié)構(gòu)改變，核