專利名稱：甲胎蛋白受體、其多克隆抗體及其試劑盒和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體的說，是甲胎蛋白受體多克隆抗體，及其試劑盒和用途。
背景技術(shù)：
甲胎蛋白，簡稱AFP，是由胎兒肝細胞合成，在胎兒血清中正常存在的一種特殊蛋白，一般在妊娠后開始上升，至胎齡16-20周時達到最高峰，然后逐漸下降，至胎兒娩出后1-5周完全消失。而在原發(fā)性肝癌患者中，血清中AFP陽性率常常明顯升高，超過400微克/升，甚至達到1000微克/升以上或呈進行性升高。AFP的檢測不僅有助于原發(fā)性肝癌的診斷，而且可以作為原發(fā)性肝癌的療效考核標準，并可判斷預(yù)后。此外，還可以作為原發(fā)性肝癌的普查方法，通過普查，早期治療，可以改善預(yù)后，甚至獲得治愈。在其它癌癥患者中也出現(xiàn)了異常的AFP陽性。
某些腫瘤細胞表面存在有甲胎蛋白的受體，因此，用針對該受體的檢測手段可以確定腫瘤或腫瘤細胞的存在，對于診斷有重要意義。CN1169778描述了通過檢測樣品中與AFP受體的標記抗體反應(yīng)來確定癌的存在。但并沒有詳細描述該受體的性狀、結(jié)合特性等。因此，本領(lǐng)域仍然存在對于利用甲胎蛋白受體的抗體診斷盒進行診斷的需要。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種制備甲胎蛋白受體的方法。
本發(fā)明的另一個目的是提供一種甲胎蛋白受體。
本發(fā)明的還有一個目的是提供一種甲胎蛋白受體的多克隆抗體的制備方法。
本發(fā)明的還有一個目的是提供一種甲胎蛋白受體的多克隆抗體。
本發(fā)明的還有一個目的是提供甲胎蛋白受體的多克隆抗體的試劑盒。
本發(fā)明的還有一個目的是提供該試劑盒在診斷癌癥中的用途。
在本發(fā)明的一個方面，提供了一種產(chǎn)生甲胎蛋白受體的方法，該方法包括步驟(a)將純化的甲胎蛋白與凝膠偶聯(lián)，制備甲胎蛋白凝膠柱；(b)從乳腺癌細胞制備總蛋白；(c)將步驟(b)中得到的總蛋白加到(a)制得的凝膠柱上；(d)洗滌柱，去除雜質(zhì)；(e)用0.1-1.0M的鉀鹽溶液洗脫，收集蛋白峰組分，得到甲胎蛋白受體。
在該方面的一個優(yōu)選例中，鉀鹽溶液是氯化鉀溶液，優(yōu)選濃度為0.4M。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種用上述方法制備的甲胎蛋白受體，其特征在于，該蛋白大小為45kD，含有YGATDSIELATVIAA和EVDPNIQAVRTQE的序列。
在本發(fā)明的另一個方面，提供了一種多克隆抗體，它特異性地抗上述甲胎蛋白受體。
在一個優(yōu)選例中，該多克隆抗體與標記偶聯(lián)，所述標記選自HRP，堿性磷酸酶，生物素。
在本發(fā)明的還有一個方面提供了一種診斷試劑盒，該試劑盒含有上述多克隆抗體和顯色劑，顯色劑優(yōu)選為二氨基聯(lián)苯胺。
在本發(fā)明的還有一個方面，提供了上述多克隆抗體的用途，其特征在于，該抗體用于檢測體外標本中甲胎蛋白受體的存在。


圖1顯示了280nm下的蛋白洗脫峰。
圖2是用考馬斯亮藍染色的SDS凝膠電泳照片。
圖3a顯示了受體與過氧化物酶標記的甲胎蛋白結(jié)合的競爭性抑制實驗結(jié)果。
圖3b顯示了與受體無特異性結(jié)合的卵蛋白競爭性實驗結(jié)果。
圖4a顯示了多克隆抗體的Western Blot(蛋白印跡實驗)結(jié)果。
圖4b顯示了多克隆抗體的組織切片染色結(jié)果。
具體實施例方式
甲胎蛋白受體的純化甲胎蛋白可從臍帶血中通過親和層析(抗甲胎蛋白單克隆抗體的親和層析)獲得。凝膠柱可采用(Sigma公司提供的溴化氰活化的瓊脂糖凝膠)，根據(jù)廠商說明書或本領(lǐng)域常規(guī)使用的方法偶聯(lián)。
癌細胞株可選自乳腺癌、肺癌、卵巢癌、胃癌和前列腺癌的細胞株。例如本領(lǐng)域已知的，且公眾可得的乳腺癌MCF-7，肺癌A549等。這些細胞都具有甲胎蛋白受體。
細胞的培養(yǎng)可用常規(guī)方法，根據(jù)不同種類的細胞選擇其生長條件?？墒褂贸Ｒ?guī)的培養(yǎng)液，例如DMEM、RPMI、等。細胞長至密集后可以使用常規(guī)方法從培養(yǎng)基上分離，然后進行離心，裂解并超聲振碎，離心取得上清液。由于甲胎蛋白受體位于細胞表面，因此不需要進一步的酶消化等步驟。
上清液上柱后，洗滌至OD280穩(wěn)定。此時甲胎蛋白受體完全和偶聯(lián)的甲胎蛋白結(jié)合，而其余蛋白質(zhì)或其它雜質(zhì)被洗去。
改變鹽濃度，可改變蛋白質(zhì)之間的離子相互作用，從而能洗脫蛋白質(zhì)，優(yōu)選是0.4M KCL。然后收集OD280nm的洗脫峰。
獲得的AFP受體溶液可進一步濃縮，也可直接使用。
甲胎蛋白受體的定性分析可用常規(guī)的10％SDS PAGE，蛋白質(zhì)印跡等方法對甲胎蛋白受體進行檢測。同時，通過競爭性抑制法等可驗證其與甲胎蛋白的結(jié)合性質(zhì)。
甲胎蛋白受體多克隆抗體的獲得用常規(guī)方法，將甲胎蛋白受體免疫入動物。免疫方法可使用家兔皮下注射，用常規(guī)的弗氏佐劑。本領(lǐng)域技術(shù)人員可參考文獻獲得免疫方法，例如Ed Harlow，David LaneUsing AntibodiesA Laboratory Manual等。免疫3-4個月后，可從家兔靜脈血中收獲抗血清并純化。
甲胎蛋白受體抗體的鑒定和分析可使用甲胎蛋白受體進行免疫實驗，并用蛋白質(zhì)印跡分析和組織切片染色分析。
甲胎蛋白受體檢測試劑盒的制備1.甲胎蛋白受體多克隆抗體的標記使用過氧化物酶標記抗體。該標記方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員在ELISA技術(shù)中已知的。過氧化物酶可采用辣根過氧化物酶等。
2.質(zhì)控切片為了對照起見，在試劑盒中加入了用本發(fā)明的多克隆抗體標記的腫瘤細胞切片。腫瘤細胞的培養(yǎng)和制片可使用常規(guī)技術(shù)。這些腫瘤細胞可視要檢測的腫瘤類型而定，可采用乳腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌以及前列腺癌等的細胞或組織切片作為質(zhì)控切片。
3.甲胎蛋白受體檢測試劑盒的組成包括甲胎蛋白受體的過氧化物酶標記的多克隆抗體、過氧化氫溶液和酶底物二氨基聯(lián)苯胺(DAB)。
4.效果本發(fā)明的試劑盒重復(fù)性好，敏感性高，與常規(guī)的伊紅染色相比，在所有的肺癌、胃癌、乳腺癌、卵巢癌以及前列腺癌的病例中，甲胎蛋白受體腫瘤診斷試劑盒都能夠及其明顯的區(qū)分出惡性腫瘤區(qū)域，而伊紅染色需要經(jīng)過細心的形態(tài)學(xué)分析才能予以判別。
本發(fā)明的試劑盒在非極端條件下，不受時間、溫度和試劑濃度變化的影響。
本發(fā)明的試劑盒穩(wěn)定性好，至少能夠在4℃下保存6個月，室溫下至少兩個月，37℃至少兩周。
以下實施例是對本發(fā)明優(yōu)選例的詳述，不是為了限制本發(fā)明。
實施例1甲胎蛋白受體的純化1.用親和層析法從臍帶血中純化甲胎蛋白，經(jīng)濃縮透析后再定量。
2.取20毫克純化的甲胎蛋白，耦聯(lián)于4克溴化氫活化的瓊脂糖凝膠(SIGMA C-9210)，制成10毫升甲胎蛋白凝膠柱。耦聯(lián)步驟完全根據(jù)Sigma公司提供的產(chǎn)品使用方法。
3.乳腺癌細胞株MCF-7培養(yǎng)于DMEM+10％胎牛血清，37℃，5％CO2。待細胞長至豐滿后收獲。3000轉(zhuǎn)/分離心沉淀細胞，用PBS清洗3次，加0.1％SDS/PBS裂解細胞30分鐘(1×100,000細胞/毫升裂解液)，經(jīng)超聲振碎。離心10000轉(zhuǎn)/分30分鐘后，取上清蛋白定量。
4.取1毫升細胞裂解液與10毫升甲胎蛋白凝膠混合2小時后，裝柱，用PBS清洗至OD280值穩(wěn)定。
5.加0.4M氯化鉀洗脫，收集洗脫峰。再濃縮，透析。蛋白定量，經(jīng)SDS凝膠電泳后，考馬斯藍染色。
圖1顯示了OD280nm下的蛋白洗脫峰。
圖2是用考馬斯亮藍染色的SDS凝膠電泳照片。左側(cè)為純化的AFP，右側(cè)是分子量標記。可見在45kD處有一清晰條帶。
實施例2甲胎蛋白受體的定性分析用常規(guī)ELISA方法證實此蛋白與過氧化物酶標記甲胎球蛋白相結(jié)合，并且可以被未經(jīng)標記的甲胎蛋白競爭性抑制。圖3a顯示了受體與過氧化物酶標記的甲胎蛋白結(jié)合的競爭性抑制實驗結(jié)果。用未標記的甲胎蛋白與標記的甲胎蛋白競爭與受體的結(jié)合?？梢娫谑荏w完全結(jié)合后，隨著未標記甲胎蛋白的加入，標記量下降。用與受體無特異性結(jié)合的卵蛋白做競爭性實驗，對其無抑制(見圖3b)。
高碘酸鈉(反應(yīng)條件包被的甲胎蛋白受體于酶標板1微克/孔，加100微升0.1mol高碘酸鈉，4℃孵育2小時)處理45KD的甲胎蛋白受體以破壞糖基，會明顯的削弱它與甲胎蛋白的結(jié)合能力，但是如果以胃蛋白酶破壞其蛋白結(jié)構(gòu)，它與甲胎蛋白的結(jié)合不受影響?？梢?，甲胎蛋白受體與甲胎蛋白的結(jié)合是通過糖基而結(jié)合的(數(shù)據(jù)未顯示)。
用Western Blot和ELISA檢測顯示45KD的甲胎蛋白受體高表達于某些惡性腫瘤細胞，如人乳腺癌細胞，肺癌細胞，前列腺癌細胞，宮頸癌細胞，白血病細胞。(數(shù)據(jù)未顯示)。
對該分離蛋白進行了蛋白質(zhì)測序，得到N端和C端的部分氨基酸序列(YGATDSIELATVIAA和EVDPNIQAVRTQE)。其中YGATDSIELATVIAA不和已知的任何序列具有相關(guān)性。EVDPNIQAVRTQE與細胞角蛋白8相似。
實施例3酶標記的甲胎蛋白受體多克隆抗體的制備，生產(chǎn)和鑒定1.甲胎蛋白受體多克隆抗體的制備用實施例2所純化的甲胎蛋白受體按照本領(lǐng)域常規(guī)的方法(見Ed Harlow，David LaneUsing AntibodiesA Laboratory Manual參考文獻)免疫家兔，收集抗血清，利用蛋白A親和層析純化抗體。
2.甲胎蛋白受體多克隆抗體的酶標將5毫克過氧化物酶(HRP)溶于1.2ml去離子水中。加0.3ml新鮮配制的0.1M高碘酸鈉(10mM磷酸鈉pH7.0).
室溫下孵育20分鐘。
對1mM醋酸鈉pH4.0透析，4℃下過夜。
抗體10毫克/毫升溶于20mM碳酸鈉緩沖液pH9.5中.
加0.5ml抗體于HRP中。
室溫下孵育2小時。
加入100微升4mg/ml的硼氫化鈉，4℃下2小時。
透析于PBS，4℃過夜。
3.乳腺癌MCF-7細胞制備質(zhì)控切片將乳腺癌MCF-7細胞培養(yǎng)于8孔方形細胞培養(yǎng)板上(Falcon#354108)，培養(yǎng)液為DMEM+10％胎牛血清，培養(yǎng)12-24小時。
換培養(yǎng)液為無血清DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)1小時。
用95％酒精在室溫下固定細胞5分鐘。
PBS清洗細胞1次。
再用20％甘油/PBS清洗1次。
棄去甘油，勿使細胞干燥，立即將制成的玻片置于-20℃。
制成的細胞玻片編號。需要時取出染色。
注MCF-7細胞是人的乳腺腺癌細胞株，ATCC#HTB-22。
4.酶標甲胎蛋白受體多抗活性檢測用MCF7細胞，K562細胞的SDS裂解液和純化的甲胎蛋白受體包被酶標板，來對酶標的甲胎蛋白受體多抗進行滴度測定。在同一酶標板上，以一質(zhì)控酶標作比較。
以乳腺癌組織切片和固定于玻片上的MCF-7細胞為對象，稀釋酶標多抗1/400，1/200，1/100，1/50進行染色以確定最佳的工作濃度。
經(jīng)檢測，原始純化的多克隆抗體濃度約為200微克/毫升，1/200為最佳工作濃度。
經(jīng)45Kd蛋白免疫動物制備的多克隆抗體在組織切片染色中，此抗體特異性地和乳腺癌細胞相結(jié)合。(見圖4a)。在Western Blot中，與乳腺癌細胞MCF7及淋巴瘤細胞K562中45KD蛋白特異性結(jié)合。(圖4b)。
5.乳腺癌MCF-7細胞制備質(zhì)控切片染色實驗用新培養(yǎng)的MCF-7細胞制作玻片，和質(zhì)控玻片一起，用質(zhì)控酶標多抗染色后比較結(jié)果。染色步驟與產(chǎn)品說明書中一致，所用溶液取自于試劑盒。
記錄實驗結(jié)果。可見所得的染色結(jié)果和質(zhì)控玻片的染色結(jié)果相同。
6.酶標甲胎蛋白受體多抗的穩(wěn)定性酶標甲胎蛋白受體多抗溶液為PBS緩沖液pH 7.4，含2％BSA和0.02％硫柳汞，在45℃，37℃，室溫和4℃下分別包存4天和45天，檢測其活性。
結(jié)果如果酶標抗體僅僅儲存于PBS中，在45℃，37℃下4天后，大部分酶活性都喪失。在室溫下35天，大部分酶活性也都喪失。4℃下45天，酶的活性顯著降低。
如果酶標抗體僅僅儲存于PBS+2％BSA中，45℃下45天，大部分酶活性都喪失，但是，如在PBS、BSA和0.02％硫柳汞中保存37℃，室溫和4℃下45天，酶的活性保持不變。
實施例4甲胎蛋白受體多克隆抗體試劑盒的實驗1.試劑盒的組成甲胎蛋白受體腫瘤診斷試劑盒60人份包括以下部份試劑A，10X濃度的過氧化物酶標記甲胎蛋白受體多抗(基礎(chǔ)濃度為200微克/毫升) 1.5ml酶標稀釋液(PBS+1％明膠)30ml10倍的洗液(PBS+0.05％吐溫-20) 100ml
底物DAB(0.05％w/v) 0.6ml過氧化氫溶液(0.66％v/v) 15ml陽性對照切片說明書2.試劑盒的確認實驗用試劑盒內(nèi)的2張已染色的乳腺癌切片作為陽性對照。
操作步驟根據(jù)標準方法制備病人需檢測的組織的切片。
根據(jù)標準方法，將組織切片浸入二甲苯，用酒精和水處理來再水化病理組織。在每一步驟中，避免組織干燥。
為了減少內(nèi)源性過氧化物酶的活性，用3％的過氧化氫/甲醇(24毫升30％過氧化氫溶于200毫升甲醇中)孵育切片15分鐘。
加0.5毫升洗液清洗切片2分鐘，重復(fù)洗片2次，拭去過剩液體。
加0.2毫升稀釋液，放置20分鐘。
加甲胎蛋白受體多抗酶標0.2毫升，孵育45分鐘。
加0.5毫升洗液清洗切片5分鐘，重復(fù)清洗2次。拭去切片過剩液體。
加0.2毫升DAB和過氧化氫混合物(1體積的DAB試劑加49體積的過氧化氫)。當染色切片的背景在鏡下可見時，用去離子水清洗切片，通常情況下，顯色過程為3-5分鐘，不超過10分鐘。當細胞的染色度與鄰近的正常腺體和導(dǎo)管相當或更弱時，那么其結(jié)果即為陰性。建議用蘇木精復(fù)染后再加蓋玻片。
可接受指標所檢測的試劑盒染色的腫瘤組織必須達到與陽性對照相同深度的染色。正常細胞染色不可以超過1個+。
3.非臨床實驗室檢測的結(jié)果和討論(1)敏感性和特異性在20例乳腺癌病理切片檢測中，敏感性和特異性均達到100％，在20例良性病例和20例正常切片中，沒有發(fā)現(xiàn)假陽性。本公司的檢測中，18/18乳腺癌，6/6例胃癌，4/4例前列腺癌，5/5例肺癌和1/1例結(jié)腸癌為陽性。綜合第三方結(jié)果總共38/38乳腺癌陽性。表明本試劑盒具有高度敏感性和特異性。
表1顯示了切片檢測的結(jié)果。
表1石蠟包埋切片檢測結(jié)果

+輕微染色。
++一般染色。
+++深棕色染色。
該標準可以由病理科經(jīng)驗醫(yī)師根據(jù)實踐經(jīng)驗輕易判定。
結(jié)論結(jié)果顯示甲胎蛋白腫瘤診斷試劑盒批號#001檢測出18/18乳腺癌，6/6胃癌，4/4前列腺癌，5/5肺癌和1/1結(jié)腸癌。大部分正常組織被輕度染色為(+)，可是，痰中的巨噬細胞呈(+++)，腎小管呈(++)，也就是說巨噬細胞和腎小管在甲胎蛋白腫瘤診斷試劑盒檢測中呈假陽性結(jié)果。但是，由于本試劑盒檢測的是組織切片，因此不存在被痰液或腎小管的假陽性結(jié)果混淆的可能性。
(2)可重復(fù)性和耐受性由于甲胎蛋白受體腫瘤診斷試劑盒的可重復(fù)性較好。當試劑盒內(nèi)的酶標試劑在2倍(體積濃度)范圍內(nèi)變化，37℃孵育5-15分鐘，或室溫下45-60分鐘，結(jié)果顯示僅僅在染色強度上有少許不同。37℃孵育比室溫下的染色強度要略強。
(3)穩(wěn)定性含有上述成分的甲胎蛋白腫瘤診斷試劑盒，儲存于4℃、室溫和37℃，在2周到8個月中，根據(jù)試劑盒內(nèi)的說明書的步驟對乳腺癌石蠟切片進行染色。其結(jié)果總結(jié)如下表2保存的溫度對試劑盒染色乳腺癌組織的影響 結(jié)論結(jié)果顯示甲胎蛋白受體腫瘤診斷腫瘤診斷試劑盒批號在37℃下2周保持穩(wěn)定，室溫下2個月穩(wěn)定，4℃下6個月穩(wěn)定。
實施例5試劑盒臨床實驗的結(jié)果
1.甲胎蛋白受體腫瘤診斷試劑盒染色乳腺組織的評估將乳腺組織樣本分為三組(1)侵潤性和原位癌20例，(2)良性纖維腺瘤20例，(3)乳腺增生20例。所有樣本均經(jīng)蘇木精和伊紅染色而確診。每一樣本均從(安徽醫(yī)科附屬大學(xué)醫(yī)院)保存的病理石蠟塊中隨機抽取。石蠟塊的時間為2個月至年不等。
所有組織樣本均按標準方法經(jīng)10％的福爾馬林固定和石蠟包埋。用切片機切成3毫米的切片。經(jīng)實施例4制備的甲胎蛋白受體腫瘤診斷試劑盒染色，同時以Mayer蘇木精染色以顯示細胞核。對照組的切片經(jīng)蘇木精和伊紅染色。切片在常規(guī)脫蠟后用水清洗，加30倍體積的過氧化氫孵育45分鐘以抑制內(nèi)源性的過氧化物酶活性，根據(jù)試劑盒說明書中的步驟進行染色。
結(jié)果用實施例4制備的甲胎蛋白受體腫瘤診斷試劑盒染色，在侵潤性癌和原位癌切片中，癌細胞膜和胞漿均被染色呈棕色顆粒狀。用陰性對照試劑染色細胞，細胞不被染色。管狀細胞癌的染色要比小葉癌深，所有癌癥病例中的癌細胞大部分染色呈陽性。很重要的是，在這些腫瘤病例中，從腫瘤細胞群到非增生性的組織結(jié)構(gòu)，存在著由強到弱的染色，組織結(jié)構(gòu)呈陰性。這表面了甲胎蛋白受體的表達與細胞分化之間的關(guān)系。未分化程度越高，甲胎蛋白受體染色就越深。良性和正常的肌上皮細胞膜顯示微弱的染色。在纖維瘤中，某些腺管的局部細胞也有弱染色，而周圍的大面積上皮細胞完全呈陰性。以上的弱陽性結(jié)果不會對最終鑒別癌細胞和良性細胞產(chǎn)生任何影響。
標本中的基質(zhì)膠原呈均一分布的淺棕色背景，若用對照染液代替試劑A，這種背景就消失了。有趣的是，在纖維腺瘤和非增生性病例中，膠原產(chǎn)生的背景顯得較強。這種背景最終不會影響對鑒別癌細胞和良性細胞。
任何良性病例(增生和纖維腺瘤)的染色都不會與惡性腫瘤相混淆。
結(jié)論經(jīng)測試使用甲胎蛋白受體腫瘤診斷試劑盒，所有的癌癥病例均顯示陽性染色。沒有任何良性病例顯示出與惡性腫瘤相同的染色。我們認為，用本試劑盒染色甲胎蛋白受體可以區(qū)別癌性病灶，非癌性病灶和正常組織。因此，我們認為甲胎蛋白受體腫瘤診斷試劑盒在臨床病理診斷上具有價值。
如上描述了本發(fā)明所公開的甲胎蛋白受體、其多克隆抗體、試劑盒的制備方法和制得的產(chǎn)品及其用途。但需理解其中包含了本領(lǐng)域技術(shù)人員所理解的變化和改變。這些變化和改變也包含在權(quán)利要求所限定的本發(fā)明的范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生甲胎蛋白受體的方法，其特征在于，該方法包括步驟(a)將甲胎蛋白與凝膠偶聯(lián)，制備甲胎蛋白凝膠柱；(b)從乳腺癌細胞制備總蛋白；(c)將步驟(b)中得到的總蛋白加到(a)制得的凝膠柱上；(d)洗滌柱，去除雜質(zhì)；(e)用0.1-1.0M的鉀鹽溶液洗脫，收集蛋白峰組分，得到甲胎蛋白受體。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該鉀鹽溶液是氯化鉀溶液。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述氯化鉀溶液為0.4M。
4.一種甲胎蛋白受體，其特征在于，所述的甲胎蛋白受體是用權(quán)利要求1所述的方法制備的，大小為45kD，含有YGATDSIELATVIAA和EVDPNIQAVRTQE的序列。
5.一種多克隆抗體，其特征在于，它特異性地抗權(quán)利要求4所述的甲胎蛋白受體。
6.如權(quán)利要求5所述的多克隆抗體，其特征在于，該多克隆抗體與標記偶聯(lián)，所述標記選自辣根過氧化物酶，堿性磷酸酶，或生物素。
7.一種診斷試劑盒，其特征在于，該試劑盒含有權(quán)利要求5所述的多克隆抗體。
8.如權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒，其特征在于，還含有顯色劑，所述所述顯色劑是二氨基聯(lián)苯胺。
9.如權(quán)利要求5所述的多克隆抗體的用途，其特征在于，該抗體用于制備檢測體外標本中甲胎蛋白受體的存在的診斷試劑盒。
10.如權(quán)利要求7所述的診斷試劑盒的用途，其特征在于，該試劑盒用于檢測體外標本中甲胎蛋白受體的存在。
全文摘要
公開了一種產(chǎn)生甲胎蛋白受體的方法，該方法包括步驟(a)將純化的甲胎蛋白與凝膠偶聯(lián)，制備甲胎蛋白凝膠柱；(b)從乳腺癌細胞制備總蛋白；(c)將步驟(b)中得到的總蛋白加到(a)制得的凝膠柱上；(d)洗滌柱，去除雜質(zhì)；(e)用0.1－1.0M的鉀鹽溶液洗脫，收集蛋白峰組分，得到甲胎蛋白受體。還公開了用該方法獲得的甲胎蛋白受體，針對該受體的多克隆抗體和用其制備的診斷試劑盒及其用途。
文檔編號G01N33/68GK1624000SQ20031010902
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月3日
發(fā)明者胡小龍 申請人:上海澤桂生物科技有限公司