甲胎蛋白異質(zhì)體afp-l3定量檢測試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體設(shè)及甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3定量檢測試劑盒及 其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 在世界范圍內(nèi)，肝細(xì)胞癌是第最常見的癌癥，第=種最常見的癌癥相關(guān)死亡原因。 危險(xiǎn)因素包括由己型肝炎病毒和丙型肝炎病毒導(dǎo)致的慢性肝炎和肝硬化。要得到有效治 療，篩查和普查的臨床效率依賴于早期診斷。
[000引甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3是糖基化異常的甲胎蛋白，AFP-L3是肝癌細(xì)胞所特有，該 指標(biāo)比常見的甲胎蛋白具有更高的特異性，特異性高達(dá)95%W上；更重要的是，該指標(biāo)對 于亞臨床肝癌的診斷具有重要臨床意義；國內(nèi)臨床研究認(rèn)為該指標(biāo)至少可W比影象學(xué)提前 9-12個(gè)月檢測出腫瘤，美國臨床研究認(rèn)為比影象學(xué)提前21個(gè)月預(yù)警肝腫瘤；甲胎蛋白異質(zhì) 體（AFP-L3)是美國FDA批準(zhǔn)的第一個(gè)明確用于腫瘤預(yù)警的生物學(xué)指標(biāo)，在臨床肝癌早期診 斷中發(fā)揮了重要作用；甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3是由惡化癌細(xì)胞特異生成并含有特異糖鏈 的一種甲胎蛋白組分，甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3含量達(dá)到10%W上，發(fā)生肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)幾 率就會極端增加，而良性肝病基本不含有此糖鏈異常的甲胎蛋白組分，該指標(biāo)可在影像學(xué) 發(fā)現(xiàn)肝癌之前9~12個(gè)月被檢測出來，有效起到預(yù)警作用，對于肝癌診治具有重要臨床價(jià) 值，被稱為新一代肝癌生物學(xué)診斷指標(biāo)。但長期W來，臨床卻無法開展甲胎蛋白異質(zhì)體常規(guī) 檢測，原因是快速分離含異常糖鏈的甲胎蛋白異質(zhì)體是個(gè)世界難題。
[0004]AFP-L3是唯一的由得病患者肝臟中癌細(xì)胞生成的蛋白。在美國的一項(xiàng)多中屯、、前 瞻性、雙盲、長期臨床試驗(yàn)中，對該檢測方法進(jìn)行了研究。結(jié)果顯示AFP-L3升高15%W上的 患者，在接下來的21個(gè)月中，發(fā)生肝細(xì)胞癌的危險(xiǎn)增加7倍之多。根據(jù)已有的肝細(xì)胞癌腫 瘤學(xué)實(shí)踐指南，該些患者肝細(xì)胞癌發(fā)生率極端增高。
[0005]但是長期W來，國內(nèi)只有少數(shù)臨床實(shí)驗(yàn)室能夠測定AFP異質(zhì)體，只有少數(shù)城市能 滿足臨床測定AFP異質(zhì)體的要求。迄今為止的異質(zhì)體測定方法，特異性不好，敏感性差，對 于技術(shù)的要求較高、操作繁瑣、試劑昂貴。
[0006]專利CN200510108154公開了一種凝集素競爭法測定AFP-L3的定量試劑盒，該試 劑盒在準(zhǔn)確性、精密度、靈敏度W及特異性方面取得較好效果，但該試劑盒在靈敏度和穩(wěn)定 性上還需改進(jìn)。專利CN200610112962也公開了一種凝集素競爭法測定AFP-L3的定量試劑 盒，但其仍然解決試劑盒的穩(wěn)定問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種甲胎蛋白異質(zhì)體AFP-L3定量檢測試劑盒，其由甲 胎蛋白（AFP)標(biāo)準(zhǔn)品、凝集素溶液、對照液、包被酶標(biāo)板、辣根過氧化物酶（HRP)標(biāo)記的AFP 單克隆抗體溶液和輔助試劑組成。
[0008]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述包被酶標(biāo)板是由普通甲胎蛋白單克隆抗體包被 酶標(biāo)板而制作的，所述普通甲胎蛋白單克隆抗體可通過商業(yè)渠道獲得。具體過程為；將上述 單克隆抗體用0. 05M碳酸緩沖液稀釋后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100y1，吸附過夜，用吐溫磯 酸鹽緩沖液洗板，再用含牛血清白蛋白的吐溫磯酸鹽緩沖液封閉過夜，甩干后驚干，即獲得 單克隆抗體包被酶標(biāo)板。
[0009] 所述凝集素溶液為；含6yg/ml的扁豆凝集素和0.Img/ml的氨基S己酸的 30mmol/L的PBS緩沖液，抑值為6. 5。
[0010] 所述辣根過氧化物酶（HR巧標(biāo)記的AFP單克隆抗體溶液為含Img/L的HRP標(biāo)記的 AFP單克隆抗體和3 %酪蛋白的PBS緩沖液，抑值為6. 5。
[0011] 所述對照液由陰性對照和陽性對照組成，陽性對照通過收集肝癌病人腹水過濾除 菌、分裝獲得，陰性對照通過收集健康正常人血清，過濾除菌、分裝獲得。
[0012] 所述輔助試劑包括對照緩沖液、底物溶液、顯色液、反應(yīng)終止液和清洗緩沖液，各 試劑具體為：
[0013] 對照緩沖液為30mmol/L的PBS(P冊.5)緩沖液；
[0014] 底物溶液為磯酸-巧樣酸緩沖液（P冊.5)配制的3%過氧化氨溶液；
[00巧]顯色液為四甲基聯(lián)苯胺（TMB)的甲醇溶液，濃度為0.Img/ml;
[0016] 反應(yīng)終止液為3mol/L硫酸；
[0017] 清洗緩沖液為30mmol/L的PBS(P冊.5)配制的0. 05%吐溫20溶液。
[0018] 另一方面，本發(fā)明還提供了檢測甲胎異質(zhì)體的含量的方法，其中包括使上述試劑 盒與血清或血漿樣品相接觸的步驟。
[0019] 更具體地，本發(fā)明的檢測方法包括下述步驟：
[0020]a)抗原-抗體反應(yīng)：在試劑盒提供的抗體包被板的微孔中分別雙孔加入50y1陽 性、陰性對照血清，或待測血清樣品，使用記號筆標(biāo)記成1、2系列。37°C水浴保溫50分鐘。 洗板操作5次。
[0021] b)l系列加樣孔中加入含有凝集素的溶液，2系列加樣孔中加入不含有凝聚素的 對照緩沖液。37°C水浴保溫50分鐘。取出扳，甩掉孔中液體。
[0022]C)將HRP標(biāo)記的AFP單克隆抗體溶液加入各孔，每孔100y1，37°C水浴保溫50分 鐘。重復(fù)洗板操作5次。
[0023]d)顯色反應(yīng)：每孔依次加入底物溶液A，顯色液B各50y1，37°C水浴保溫20分鐘， 每孔再加入50y1反應(yīng)終止液結(jié)束反應(yīng)。
[0024] e)比色；W空白對照孔的吸光值調(diào)零，用酶標(biāo)儀在450nm測定0D值并記錄。
[002引f)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線；W標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品測定的0D值為縱坐標(biāo)，作出標(biāo) 準(zhǔn)曲線；計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸系數(shù)R2,當(dāng)R2> 0. 95時(shí)本次測定有效；
[0026] g)計(jì)算待測血清樣品濃度：根據(jù)待測樣品的0D值從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出待測血清樣 品的AFP和AFP-L3濃度。
[0027] 陽性質(zhì)控血清；（孔2-孔1)-孔2 > 10%時(shí)，本次測定有效。
[002引陰性對照血清；（孔2-孔1)-孔2《10%時(shí)，本次測定有效。
[0029] 待檢測血清；（孔2-孔1)-孔2 > 10%時(shí)，說明其中甲胎蛋白異質(zhì)體含量較高， 為肝癌陽性。
[0030] 本發(fā)明試劑盒通過對試劑組分配比優(yōu)化組合，極大提高了試劑盒的穩(wěn)定性，并且 具有更加的靈敏度。試劑盒配套用的標(biāo)準(zhǔn)品，能夠直接定量計(jì)算出血樣標(biāo)本中所含的甲胎 蛋白和甲胎蛋白異質(zhì)體的含量，方法應(yīng)用簡便，并且試劑盒穩(wěn)定性強(qiáng)。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面將進(jìn)一步的詳細(xì)說明來舉例說明本發(fā)明。需要指出的是，W下說明僅僅是對 本發(fā)明要求保護(hù)的技術(shù)方案的舉例說明，并非對該些技術(shù)方案的任何限制。本發(fā)明的保護(hù) 范圍W所附權(quán)利要求書記載的內(nèi)容為準(zhǔn)。
[0032] 實(shí)施例1試劑盒的制備
[0033] 本發(fā)明試劑盒組成；AFP-L3陰性、陽性對照各1瓶;AFP單克隆抗體包被板巧6 孔）；辣根過氧化物酶（HR巧標(biāo)記的AFP單克隆抗體溶液1瓶，6ml/瓶；扁豆凝集素（LCA) 溶液1瓶；對照緩沖液1瓶;AFP標(biāo)準(zhǔn)品1瓶，底物溶液、顯色液各1瓶，各5ml/瓶；反應(yīng)終 止液1瓶，5ml/瓶；清洗緩沖液（20X濃縮）1瓶，30ml/瓶。
[0034] 酶標(biāo)板采用進(jìn)口或國產(chǎn)生產(chǎn)的12X8可拆條板。將AFP單克隆抗體用0. 05mol/L 碳酸鹽緩沖液稀釋為20yg/ml后加入酶標(biāo)板各孔，每孔100y1，吸附過夜，用清洗緩沖液 洗板，再用該封閉液緩沖液封閉過夜，甩干后驚干，即獲得單克隆抗體包被酶標(biāo)板。按96孔 /塊用侶巧袋包裝、真空封閉。
[00巧]凝集素溶液為：含6yg/ml的扁豆凝集素和0.Img/ml的氨基S己酸的30mmol/L的PBS緩沖液，抑值為6. 5,按量分裝。
[0036] 辣根過氧化物酶（HR巧標(biāo)記的AFP單克隆抗體溶液為含Img/L的AFP單克隆抗體 和3%酪蛋白的PBS緩沖液，抑值為6. 5,按量分裝。具體過程為；W化I〇4-己二醇法進(jìn)行 HRP的氧化，達(dá)到終濃度15mg/ml。單克隆抗體和HRP在