一種便捷式c反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體地說涉及一種便捷式C反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑 盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前定量免疫檢測(cè)技術(shù)中，主要有以下幾種定量檢測(cè)方法：
[0003] -是配套大型、高度集成的自動(dòng)化儀器的免疫比濁檢測(cè)技術(shù)；
[0004] 二是酶聯(lián)免疫層析檢測(cè)技術(shù)；
[0005] 三是免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)；
[0006] 其中免疫比濁檢測(cè)技術(shù)和酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)存在樣本需要預(yù)處理、操作復(fù)雜、檢 測(cè)時(shí)間長、需配套復(fù)雜的大型儀器、機(jī)動(dòng)性差、出報(bào)告時(shí)間長等缺點(diǎn)，更適合大批量樣本的 集中檢測(cè)，不適合急診及各科室門診、社區(qū)醫(yī)院、小型診所、急救現(xiàn)場(chǎng)等的快速檢測(cè)。
[0007] 而免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)是近年發(fā)達(dá)國家發(fā)展起來的一種快速免疫分析技術(shù)。其 原理是樣本液在毛細(xì)迀移作用下在硝酸纖維素膜上迀移，其中的待測(cè)物與膜上一定區(qū)域的 抗體（抗原）結(jié)合，通過有色標(biāo)記物，十幾分鐘甚至幾分鐘內(nèi)即可得到肉眼可見的直觀結(jié) 果。免疫層析快速檢測(cè)技術(shù)不需將游離的抗體（抗原）和形成復(fù)合物的抗體（抗原）進(jìn)行 分離，省去了繁瑣洗滌步驟，因而操作便捷，出報(bào)告時(shí)間短，在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)、急診、現(xiàn)場(chǎng)、家 庭自檢等場(chǎng)所得到了廣泛的應(yīng)用。
[0008] 以膠體金為標(biāo)記物的第一代免疫層析技術(shù)已發(fā)展了將近30多年，目前仍廣泛應(yīng) 用，但由于其只能用于定性或半定量的檢測(cè)，難以滿足臨床對(duì)微量、超微量分析物定量檢測(cè) 的要求。急需一種能定量快速檢測(cè)的新技術(shù)產(chǎn)品替代膠體金免疫分析產(chǎn)品，滿足臨床診斷 需求。一些診斷試劑企業(yè)開發(fā)了能定量檢測(cè)的熒光免疫檢測(cè)試劑，但存在抗干擾能力差，使 用不方便等缺點(diǎn)。
[0009] 其中中國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站上公開了一種全量程C反應(yīng)蛋白的免疫層析試紙 條，其檢測(cè)方法易受類風(fēng)濕因子和嗜異性抗體的干擾，造成假陽性，而且使用過程需要對(duì)試 紙條進(jìn)行定標(biāo)，增加了操作復(fù)雜性。
[0010] 中國國家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局網(wǎng)站上還公開了一種超敏C反應(yīng)蛋白熒光免疫層析法檢測(cè) 試劑盒，包括HS-CRP反應(yīng)板，HS-CRP檢測(cè)緩沖液，HS-CRPID芯片，其使用過程為使用者將 HS-CRPID芯片插入熒光檢測(cè)儀讀取ID芯片數(shù)據(jù)，然后將樣品加入HS-CRP檢測(cè)緩沖液中反 應(yīng)1分鐘，然后立刻將反應(yīng)后的HS-CRP檢測(cè)緩沖液加入HS-CRP反應(yīng)板加樣孔中進(jìn)行反應(yīng)， 反應(yīng)結(jié)束后插入熒光檢測(cè)儀讀取熒光信號(hào)。其檢測(cè)過程需讀取ID芯片數(shù)據(jù)和計(jì)時(shí)反應(yīng)兩 次，操作過程復(fù)雜，而且ID芯片無加密功能，容易被復(fù)制篡改；而且該方法同樣易受類風(fēng)濕 因子和嗜異性抗體的干擾，造成假陽性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明所要解決的問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種操作簡單、不易復(fù)制篡 改、且不易受到類風(fēng)濕因子和嗜異性抗體的干擾的便捷式C反應(yīng)蛋白檢測(cè)試劑盒，
[0012] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種便捷式C反應(yīng)蛋白檢 測(cè)試劑盒，包括試紙條、用于固定試紙條的上卡槽（上殼體）和下卡槽（下殼體）、射頻識(shí)別 芯片；所述試紙條包括塑料膠板、和塑料膠板上依次設(shè)置的樣品墊、熒光示蹤物標(biāo)記的C反 應(yīng)蛋白第一抗體承載墊、纖維素膜和吸水墊；所述的第一抗體承載墊和吸水墊分別搭接于 纖維素膜的兩端；所述樣品墊的一端搭接于第一抗體承載墊上；所述的樣品墊為經(jīng)過抗人 紅細(xì)胞抗體溶液處理、具有吸附紅細(xì)胞作用的樣品墊；所述纖維素膜上具有固定C反應(yīng)蛋 白第二抗體的檢測(cè)帶T和固定羊抗鼠抗體的質(zhì)控帶C;所述的試紙條置于上卡槽和下卡槽 相互拼合構(gòu)成的腔體內(nèi)；所述的上卡槽上對(duì)應(yīng)于樣品墊的位置設(shè)置有用于添加用樣品稀釋 液稀釋后的目標(biāo)分析物校準(zhǔn)品或待測(cè)樣本的加樣孔（即該加樣孔用于添加用樣品稀釋液 稀釋后的目標(biāo)分析物校準(zhǔn)品或待測(cè)樣本），對(duì)應(yīng)于纖維素膜位置設(shè)置有檢測(cè)窗口；所述樣 品稀釋液為含有類風(fēng)濕因子和嗜異性抗體阻斷劑的緩沖液；所述的下卡槽靠近左端設(shè)置有 射頻識(shí)別芯片。
[0013] 本發(fā)明所述射頻識(shí)別芯片用于存儲(chǔ)試紙條分析物濃度與熒光信號(hào)之間的對(duì)應(yīng)關(guān) 系計(jì)算方程、測(cè)試板生產(chǎn)日期、批號(hào)、有效期、參考范圍等信息。
[0014] 本發(fā)明所述C反應(yīng)蛋白第一抗體為能特異性結(jié)合C反應(yīng)蛋白第一表位的鼠單克隆 抗體（為通過C反應(yīng)蛋白免疫小鼠取得的脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞融合，篩選取得能永久產(chǎn)生C 反應(yīng)蛋白第一表位抗體的雜交瘤細(xì)胞，并將此雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)分離純化獲得目標(biāo)鼠單克隆 抗體（上述"能特異性結(jié)合C反應(yīng)蛋白第一表位的鼠單克隆抗體"的獲得過程是行業(yè)常規(guī) 技術(shù)）。
[0015] 本發(fā)明所述C反應(yīng)蛋白第二抗體為能特異性結(jié)合C反應(yīng)蛋白第二表位的鼠單克隆 抗體（為通過C反應(yīng)蛋白免疫小鼠取得的脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞融合，篩選取得能永久產(chǎn)生C 反應(yīng)蛋白第二表位抗體的雜交瘤細(xì)胞，并將此雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)分離純化獲得目標(biāo)鼠單克隆 抗體；均為行業(yè)常規(guī)技術(shù)）。
[0016] 本發(fā)明所述熒光示蹤物為能在一定波長激發(fā)光源的激發(fā)下產(chǎn)生熒光的帶有功能 團(tuán)的有機(jī)納米微球，進(jìn)一步地，優(yōu)選帶有羧基功能基團(tuán)的有機(jī)熒光微球。
[0017] 所述樣本墊為濾紙、玻璃纖維、聚酯纖維、無紡布中的一種。
[0018] 所述纖維素膜為硝酸纖維素膜。
[0019] 所述熒光示蹤物標(biāo)記的C反應(yīng)蛋白第一抗體承載墊為濾紙、玻璃纖維、聚酯纖維、 無紡布中的一種。
[0020] 所述吸水墊為濾紙。
[0021] 本發(fā)明所述的阻斷劑為鼠熱處理IgG(將鼠IgG(小鼠IgG)置于60-75Γ水浴中 加熱10分鐘即可得到熱處理IgG)或商業(yè)化阻斷劑復(fù)合物（如羅氏的MAB33、SCABTIB0D的 HBR等）。
[0022] 本發(fā)明試劑盒的制備方法為：
[0023] 1)熒光示蹤物標(biāo)記抗體（熒光示蹤物標(biāo)記的C反應(yīng)蛋白第一抗體或熒光抗體）的 制備
[0024] 用10mm〇l/L、pH=6.5的磷酸鹽緩沖液將羧基熒光微球（如東莞市漢諾生 物技術(shù)有限公司銷售的議S你憤?Φ YG Carboxylate Microspheres和Ru§f絲blit#) MultifluorescentMicrospheres中的一種）稀釋到濃度為5mg/ml，配制成微球懸液，每 10ml上述微球懸液中加入EDAC(乙基二甲基胺丙基碳化二亞胺，CAS:25952-53-8) 1~ l〇mg，溶解混勻，室溫靜置1小時(shí)，lOOOOrpm離心20min，去上清液，然后將沉淀懸浮于等體 積的10mm〇l/LpH= 7. 2的磷酸鹽緩沖液中，超聲分散；然后向羧基微球懸液中加入C反 應(yīng)蛋白第一表位單克隆抗體，每l〇ml上述微球懸液中加入抗體1~5mg，混合，室溫反應(yīng) 2小時(shí)，再向上述微球懸液中加入牛血清白蛋白，使得微球懸液中牛血清白蛋白的濃度為 2~20mg/ml，混勻，室溫反應(yīng)1小時(shí)；lOOOOrpm離心20min，去上清，沉淀懸浮于等體積的 10mm〇l/LpH= 7. 2的磷酸鹽緩沖液中，超聲分散，4°C保存?zhèn)溆茫?br>[0025] 2)第一抗體承載墊的制備
[0026] 用步驟（1)制備的熒光抗體噴涂稀釋液稀釋熒光抗體到0. 5~2mg/ml，在三維噴 點(diǎn)平臺(tái)上將熒光抗體涂于玻璃纖維墊上，37°C干燥1小時(shí)，備用；
[0027] 3)纖維素膜包被抗體
[0028] 將硝酸纖維素膜黏貼在塑料膠板中間位置，用抗體包被稀釋液分別稀釋C反應(yīng)蛋 白第二表位單克隆抗體和羊抗鼠抗體到濃度為0. 5~2. 0mg/ml制備成噴膜液，其中，在三 維噴點(diǎn)平臺(tái)上噴膜液以條帶狀噴點(diǎn)在硝酸纖維素膜上適當(dāng)位置（分別構(gòu)成固定有C反應(yīng)蛋 白第二表位單克隆抗體的檢測(cè)帶T和固定羊抗鼠抗體的質(zhì)控帶C)，37°C干燥1小時(shí)，備用。
[0029] 4)樣品墊的預(yù)處理
[0030]