一種用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，包含GP73捕獲抗體溶液、生物素標(biāo)記的AAL、用于形成GP73抗體-抗原-生物素標(biāo)記AAL復(fù)合物并進(jìn)行ELISA檢測(cè)的AAL-ELISA檢測(cè)板和用于形成GP73抗體-抗原-生物素標(biāo)抗體復(fù)合物并進(jìn)行ELISA檢測(cè)的Protein-ELISA檢測(cè)板。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高通量性，較高特異性，檢測(cè)快速準(zhǔn)確等突出優(yōu)點(diǎn)，對(duì)肝癌的診斷具有重要的臨床價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑
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【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，與應(yīng)用性基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研宄和臨床研宄相聯(lián)系；涵蓋腫瘤學(xué)、診斷學(xué)，糖生物學(xué)。

【背景技術(shù)】
[0002]肝細(xì)胞性肝癌(--是一種多基因、多因素、病理機(jī)制復(fù)雜的常見惡性腫瘤。在我國(guó)，乙肝病毒攜帶者占人口的7.18 %，是全世界乙肝攜帶者的2/3，肝病發(fā)病率仍居全球之首，全球50%以上的年新增肝癌病例發(fā)生在我國(guó)。絕大多數(shù)患者發(fā)病隱匿，出現(xiàn)臨床癥狀后就醫(yī)時(shí)已屬晚期，喪失了治療的良機(jī)，因此早期診斷對(duì)于提高患者的生存率至關(guān)重要。理想的肝癌標(biāo)志物需要有較高的特異性，能夠?qū)⒏伟┡c肝硬化、肝炎、肝臟再生結(jié)節(jié)等疾病區(qū)分開來(lái)；同時(shí)還需較高的敏感性，能夠在肝癌早期即提示診斷，同時(shí)應(yīng)具有易檢測(cè)、可重復(fù)、可經(jīng)非侵入性操作測(cè)定等特點(diǎn)。
[0003]在蛋白質(zhì)不同的翻譯后修飾中，糖基化最為常見，幾乎50%的蛋白質(zhì)都被認(rèn)為具有糖基化修飾。糖蛋白聚糖存在著宏觀和微觀的不均一性，其結(jié)構(gòu)功能變化和與疾病發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系。聚糖在很多關(guān)鍵的生物學(xué)過(guò)程中起到重要作用，比如細(xì)胞黏附、分子運(yùn)輸和清除、受體激活、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及內(nèi)吞作用等。在生物體發(fā)育過(guò)程中，聚糖結(jié)構(gòu)也在變化，在不同的分化階段，聚糖有不同的表達(dá)。在癌癥的發(fā)生過(guò)程中，糖基化的改變是普遍存在的，如能關(guān)注糖基化的變化，可以提升診斷的特異性和敏感性。因此，利用檢測(cè)糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)的異常來(lái)診斷惡性腫瘤已引起相當(dāng)重視，如八---13的變化已成為檢測(cè)肝癌的重要聚糖標(biāo)志等。目前檢測(cè)糖蛋白聚糖結(jié)構(gòu)變化的技術(shù)方法有生物質(zhì)譜、液相色譜和植物凝集素親和印跡等，其中植物凝集素是一類存在于多數(shù)植物中的糖蛋白，其最大特點(diǎn)是能夠識(shí)別糖蛋白和糖脂中的聚糖，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜結(jié)構(gòu)的聚糖即細(xì)胞膜表面決定簇，它們與聚糖的結(jié)合是非共價(jià)且可逆的。…楊樹茹凝集素)是一種親和0連接巖藻糖(161-11111181 3 ？110和土…-匕51)的植物凝集素，巖藻糖修飾能賦予聚糖很多獨(dú)特的功能特性，其在輸血反應(yīng)、凝集素介導(dǎo)的白細(xì)胞和內(nèi)皮的粘附、宿主和微生物相互作用和個(gè)體發(fā)育等方面發(fā)揮重要作用。此外，巖藻糖還參與構(gòu)成某些重要粘附分子的聚糖結(jié)構(gòu)，與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切。在癌癥中發(fā)現(xiàn)81071[冊(cè)18 3含量增多，許多腫瘤中4和8型血型抗原丟失伴隨著0血型抗原和16*187表達(dá)升高。
[0004]高爾基體蛋白73((^73)是一種高爾基體II型膜蛋白，表達(dá)于上皮細(xì)胞，是一種糖蛋白，包含3個(gè)潛在.糖基化位點(diǎn):八811109，八811144和八811398。隨著糖生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，已有研宄證實(shí)將⑶73的巖藻糖基化異質(zhì)體在某些肝癌患者中作為標(biāo)志物進(jìn)行檢測(cè)會(huì)優(yōu)于⑶73。在前期工作中，發(fā)現(xiàn)相比于肝硬化患者，肝癌患者血清單位⑶73親和歐能力顯著降低，說(shuō)明肝癌患者的單位⑶73巖藻糖基化聚糖含量降低。本發(fā)明應(yīng)用對(duì)巖藻糖化聚糖的高親和性，通過(guò)…和？1~0仏111-此的制備與檢測(cè)，分別形成⑶73抗體-抗原-生物素標(biāo)復(fù)合物和⑶73抗體-抗原-生物素標(biāo)抗體復(fù)合物，獲得⑶73結(jié)合八八I的吸光度與⑶73蛋白的吸光度比值？11(3-⑶73，通過(guò)對(duì)臨床資料進(jìn)行回顧性研宄，建立腫瘤判別診斷函數(shù)，獲得80(:曲線和0打值，同時(shí)比較八---13和[110-(^73對(duì)肝癌診斷的準(zhǔn)確率差異。本發(fā)明適用于肝癌高發(fā)現(xiàn)場(chǎng)或者肝病人群大規(guī)模篩查，對(duì)于提高肝癌的診斷率，實(shí)現(xiàn)早期干預(yù)治療，降低肝癌病死率具有非常重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種具有較高準(zhǔn)確率的用于診斷肝細(xì)胞性肝癌(--的試劑盒。
[0006]為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供了一種用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，包含⑶73捕獲抗體溶液、生物素標(biāo)記的?VI用于形成⑶73抗體-抗原-生物素標(biāo)記歐復(fù)合物并進(jìn)行此13八檢測(cè)的…檢測(cè)板和用于形成⑶73抗體-抗原-生物素標(biāo)抗體復(fù)合物并進(jìn)行￡[13八檢測(cè)的？1~0丨6111-211“檢測(cè)板。
[0007]優(yōu)選地，所述的八從-此檢測(cè)板的預(yù)處理方法為:在八從-此檢測(cè)板中加入6？73捕獲抗體，—1-211“中即73捕獲抗體濃度為1 V 用量為100 V 1?611，室溫孵育過(guò)夜；采用？831緩沖液洗板；采用含有3 % 8“(質(zhì)量-體積濃度)的？83溶液進(jìn)行封閉，用量為200 V 1/^611采用？831緩沖液洗板；采用邱4.0的含有100禮版1104和50禮檸檬酸的溶液進(jìn)行氧化，用量為200 V 1/^611，41:避光反應(yīng)111 ；采用？831緩沖液洗板，得到預(yù)處理后的…此1“檢測(cè)板。
[0008]優(yōu)選地，所述的八檢測(cè)板的預(yù)處理方法為:在？1*01:6111-1^13八檢測(cè)板中加入即73捕獲抗體，^1-0^6111-2118^中即73捕獲抗體濃度為2 V 匕用量為100 V 1/%11，室溫孵育過(guò)夜；采用？831緩沖液洗板；采用含有(質(zhì)量-體積濃度)和0.05%版為(質(zhì)量-體積濃度)的？83溶液進(jìn)行封閉，用量為200 V 1/^611 ；采用？831緩沖液洗板；采用含有1 % 8“(質(zhì)量-體積濃度)和0.05 %似吧(質(zhì)量-體積濃度)的？83溶液進(jìn)行氧化，用量為200 ^17冊(cè)11，41:避光反應(yīng)1卜；采用？831緩沖液洗板，得到預(yù)處理后的？1~01:6111-2118^ 檢測(cè)板。
[0009]優(yōu)選地，所述的6？73捕獲抗體溶液共有兩種，濃度分別為1 V 和2 V 。
[0010]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括生物素標(biāo)記的⑶73抗體。
[0011]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包含含有3 % 83八的？88溶液，含有1 % 83八和0.05 %版為的？88溶液，邱4.0的含有100應(yīng)&10 4和50禮檸檬酸的溶液。
[0012]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括？881緩沖液。
[0013]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素(冊(cè)?。
[0014]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括底物溶液和終止液。
[0015]優(yōu)選地，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包含采集血樣裝置及操作說(shuō)明書。
[0016]本發(fā)明中提及的(^73蛋白由前期糖蛋白質(zhì)組學(xué)工作確定單位(^73親和…^能力顯著降低，說(shuō)明肝癌患者的單位⑶73巖藻糖基化聚糖含量減少。
[0017]本發(fā)明主要是建立并優(yōu)化八從-此和方法，確定最優(yōu)的捕獲抗體濃度、血清樣品的上樣量、凝集素濃度和檢測(cè)抗體濃度；并選擇合適的…封閉劑和氧化劑。排除⑶73抗體與其它抗原的交叉反應(yīng)，確立八從-此和？1~0丨6111-此13八對(duì)6？73的檢測(cè)范圍和重復(fù)性，構(gòu)建可用于臨床血清樣品篩查的半定量檢測(cè)系統(tǒng)。
[0018]如圖1所示，本發(fā)明通過(guò)八從-此13八和的制備，聯(lián)合并行分析血清中⑶73的巖藻糖和蛋白的表達(dá)水平，用于肝癌和肝硬化病人血清中單位⑶73蛋白中結(jié)合巖藻糖的含量$110-(^73)的定量檢測(cè)。并根據(jù)？1^4？73的檢測(cè)數(shù)據(jù)和臨床資料的回顧性研宄，建立腫瘤判別診斷函數(shù)可用于原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌的早期診斷。
[0019]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是:
[0020]本發(fā)明通過(guò)八從(楊樹茹凝集素)-此和的制備與檢測(cè)，分別形成抗體-抗原-生物素標(biāo)復(fù)合物和抗體-抗原-生物素標(biāo)抗體復(fù)合物，以6？73結(jié)合八八I的吸光度(00值)與即73蛋白的吸光度比值作為衡量單位即73蛋白中結(jié)合巖藻糖的含量$11(3-(^73),通過(guò)對(duì)臨床資料進(jìn)行回顧性研宄，建立腫瘤判別診斷函數(shù)，獲得受試者工作曲線￠00以及判別⑴此0打)值，該函數(shù)對(duì)于!1(1:的診斷靈敏度和特異度分別為73.9%和65.4%，^0為0.801，優(yōu)于甲胎蛋白.聚糖核心巖藻糖(他?-!^)。本發(fā)明所述的方法及試劑盒具有高通量性，較高特異性，檢測(cè)快速準(zhǔn)確等突出優(yōu)點(diǎn)，對(duì)肝癌的診斷具有重要的臨床價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0021]圖1為高通量[110-(^73檢測(cè)系統(tǒng)原理示意圖；
[0022]圖2為線性檢測(cè)范圍圖；
[0023]圖3為1^-(^73和他?-13檢測(cè)系統(tǒng)分別構(gòu)建80(:曲線圖；

【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0025]實(shí)施例
[0026]一種用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其組成為:
[0027]1、？110~6？73半定量檢測(cè)此板，所述的1^-(^73半定量檢測(cè)此板由用于形成即73抗體-抗原-生物素標(biāo)記復(fù)合物并進(jìn)行此13八檢測(cè)的…檢測(cè)板和用于形成6？73抗體-抗原-生物素標(biāo)抗體復(fù)合物并進(jìn)行此13八檢測(cè)的？1~0丨6111-此13八檢測(cè)板組成。
[0028]2、6？73捕獲抗體溶液，其濃度分別為1 V 和2 V ^1(由汕腦代公司制備，？88溶液稀釋)。
[0029]4、含有 3% 83八的？88 溶液(3% 83八 111 ？83，邱7.2-7.4)。
[0030]5、含有 1 % 83八和 0.05 % 版^3的？83 溶液(1 % 88^,0.05 % 3111 ？83，邱7.2-7.4)。
[0031]6、含有 100禮似104和 50禮檸檬酸的溶液(100^ ^10 50111101^10 ￡^1(1，邱4.0)。
[0032]7、生物素標(biāo)記的八從溶液，濃度為1 V ^60^01-公司，9^0(111(3^18-1395, ？881緩沖液稀釋)。
[0033]8、生物素標(biāo)記的即73抗體溶液，濃度為2 V ^1(由廣州生物醫(yī)藥與健康研宄院提供
[0034]9、冊(cè)？-81^61)1:8^1(1111 (1116:0110 8016111:1^10, ^1-0(11101:^ 100)0
[0035]10、采集血樣裝置及操作說(shuō)明書。
[0036]11、？881 緩沖液(0.05 % 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)。
[0037]12、底物溶液:3，3 7 ,5,5 ；-四甲基聯(lián)苯胺(118)溶液，雙氧水溶液￠0嫩
0101:6011 1110.^1^0(11101:^1(0331002) 0
[0038]13、終止液；觀??！2804
[0039]上述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒的使用方法為:
[0040]( 一板和？1~0忱111-此1 “ 板的預(yù)處理:
[0041]1、取兩塊乩板，分別用作八從-此板和？1~0仏111-211“板；
[0042]2、捕獲抗體:在八從-此板和板中分別加入⑶73捕獲抗體，
中 6？73 捕獲抗體濃度為 1 V 8/此，100 V 1/^611 ；？1~0^6111~2118^ 中 6？73 捕獲抗體濃度為2 V 100 V 1/^6110室溫孵育過(guò)夜。
[0043]3、洗板:采用？83丁緩沖液(0.05% 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡2分鐘，300 V 17*611，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0044]4、封閉:魈[-此1 “板采用含有 3% 88^ 的？83 溶液(3% 88^ 111 ？83，邱7.2-7.4)進(jìn)行封閉，室溫封閉1卜，用量為200 ^17冊(cè)11 ；？1~0仏111-此采用含有1 % 8“和0.05%關(guān)3的？88溶液(1% 88^,0.05%關(guān)“11 ？83，邱7.2-7.4)進(jìn)行封閉，室溫封閉1卜，用量為
200V1/^6110
[0045]5、洗板:采用？831 緩沖液(0.05% 1^661120111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡2分鐘，300 V 17*611，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0046]6、氧化:八從-此板采用邱4.0的含有100禮似104和50禮檸檬酸的溶液(1001111 他 104，501111 011:1-10 801(1, 1)? 4.0)進(jìn)行氧化，用量為 200 V 1/^611，4。〇避光反應(yīng)111 ；？1~0七6111-此13八采用含有1% 83八和0.05%版^3的？88溶液(1% 88^,0.05%關(guān)辦？83，邱7.2-7.4)進(jìn)行氧化，4X:避光反應(yīng)比，200 V 17冊(cè)11。
[0047]7、洗板:采用？881 (0.05% 1^661120111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300 V 17冊(cè)11，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干，分別得到處理后的…^4113八板和？1~01:6111-2113八板，用于下述步驟。
[0048]( 二)1^-(^73半定量檢測(cè)此檢測(cè)方法:
[0049]1、采樣:通過(guò)采集血樣裝置采集血樣，抽取靜脈血5“，每份標(biāo)本均無(wú)溶血、月旨血。371:靜置一小時(shí)，3000印111離心300111后上清即為所需血清，-701:分裝凍存(10(^1/1:11)36)。
[0050]2、加樣:八從-此板加入血清樣品100 V 1/^11 ；？1~0^6111-2118^板加入稀釋后血清樣品100上1/^611 (采用？83，邱7.2-7.41.4倍稀釋至100^1)，室溫2匕。
[0051]3、洗板:采用？881 (0.05% 1^661120111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300 V 17*611，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0052]4、檢測(cè)試劑規(guī)-乩13八板中加入1 V邑/此生物素標(biāo)記的撒(^881稀釋)；^1-0^6111-2118^板中加入生物素標(biāo)記的抗體2 V ^/1111(^88稀釋)，100 V 17冊(cè)11，室溫2匕。
[0053]5、洗板:采用？881 (0.05% 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300 V 17*611，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0054]6、酶結(jié)合物工作液:八從-2113八板中加入冊(cè)?(米用3 % 83八111？88^ ^7.2-7.4,1: 12500 稀釋)；？1~0忱111-此1“ 板中加入冊(cè)？-8釷6的(采用 1 %83八 111 ？88^ ^7.2-7.4,1: 12500 ^^),100 1^/^611,^^301111110
[0055]7、洗板:采用？881 (0.05% 1^66=20111 ？83，邱7.2-7.4)洗板 4 次，每次浸泡 2 分鐘，300 V 17*611，甩干，并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干。
[0056]8、加底物溶液，所述的底物溶液由3，37，5，57 -四甲基聯(lián)苯胺(118)溶液和的雙氧水溶液按照體積比為1: 2混合而成，100 V 17^611，室溫20111111。
[0057]9、加終止液:100 V 18^0？ 3011^1011/^611，終止液的加入順序與底物溶液的加入順序相同。
[0058]10、檢測(cè):立即用版11100皿社1200 (邛“⑷酶標(biāo)儀在450咖波長(zhǎng)測(cè)量各孔的00值。應(yīng)提前打開酶標(biāo)儀電源，預(yù)熱儀器，設(shè)置好檢測(cè)程序。
[0059](三)？110~6？73半定量檢測(cè)此分析方法:
[0060]1、數(shù)據(jù):每個(gè)血清樣品的00值應(yīng)減去空白孔的00值為實(shí)際00值。每個(gè)血清樣品即73結(jié)合八從的實(shí)際00值與此相同血清樣品即73蛋白的實(shí)際00值(^1-0^6111-2118^)比值即為值。
[0061]采用軟件回歸分析建立的上述預(yù)測(cè)模型進(jìn)行檢測(cè)區(qū)分肝癌和肝硬化的0打值為3.9433。按照上述預(yù)測(cè)模型計(jì)算？值，將？值與0打值比較，? 3.9433為肝硬化，? 3.9433為肝癌。
[0062]采用實(shí)施例中的試劑盒和檢測(cè)方法，分析49例肝病血清樣品(肝硬化26例和肝癌患者23例，均經(jīng)臨床確診)中即73的巖藻糖和蛋白的表達(dá)水平，計(jì)算得到含量。同時(shí)使用他?-13檢測(cè)試劑盒(他?-13檢測(cè)試劑盒購(gòu)自汕110妨公司(01^110^1^1187)和其操作說(shuō)明中的檢測(cè)方法，檢測(cè)上述49例肝病血清樣品中八---13含量，采用軟件獲得80(:曲線。比較本發(fā)明試劑盒和八---13對(duì)肝癌診斷的靈敏性和特異性，結(jié)果如圖3所示，本發(fā)明試劑盒的靈敏度為73.9%，特異度65.4%，如?0為0.801，而他?-13對(duì)的診斷靈敏度為69.6 %，特異度為69.2 %，皿為0.701。因此，本發(fā)明具有較高敏感性，對(duì)肝癌的預(yù)測(cè)具有重要臨床價(jià)值。
[0063]采用1*6(30111131的111: 6？73標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行倍比稀釋，確定？1~01:6111-2113八線性檢測(cè)范圍。結(jié)果如圖2所示，？1~01:6111-2118^的定量線性檢測(cè)范圍為0?500000呢加1。
【權(quán)利要求】
1.一種用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，包含GP73捕獲抗體溶液、生物素標(biāo)記的AAL、用于形成GP73抗體-抗原-生物素標(biāo)記AAL復(fù)合物并進(jìn)行ELISA檢測(cè)的AAL-ELISA檢測(cè)板和用于形成GP73抗體-抗原-生物素標(biāo)抗體復(fù)合物并進(jìn)行ELISA檢測(cè)的Protein-ELISA檢測(cè)板。
2.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，所述的AAL-ELISA檢測(cè)板的預(yù)處理方法為:在AAL-ELISA檢測(cè)板中加入GP73捕獲抗體，AAL-ELISA中GP73捕獲抗體濃度為lyg/mL，用量為100 μ L/well，室溫孵育過(guò)夜；采用PBST緩沖液洗板；采用含有3% BSA的PBS溶液進(jìn)行封閉，用量為200 μ L/well ;采用PBST緩沖液洗板；采用pH 4.0的含有10mM似104和50mM檸檬酸的溶液進(jìn)行氧化，用量為200 μ L/well，4°C避光反應(yīng)Ih ;采用PBST緩沖液洗板，得到預(yù)處理后的AAL-ELISA檢測(cè)板。
3.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，所述的Protein-ELISA檢測(cè)板的預(yù)處理方法為:在Protein-ELISA檢測(cè)板中加入GP73捕獲抗體，Protein-ELISA中GP73捕獲抗體濃度為2 μ g/mL，用量為100 μ L/well，室溫孵育過(guò)夜；采用PBST緩沖液洗板；采用含有1% BSA和0.05%似乂的PBS溶液進(jìn)行封閉，用量為200 μ L/well ;采用PBST緩沖液洗板；采用含有I % BSA和0.05%似乂的PBS溶液進(jìn)行氧化，用量為200 μ L/well，4°C避光反應(yīng)Ih ;采用PBST緩沖液洗板，得到預(yù)處理后的Protein-ELISA 檢測(cè)板。
4.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，所述的GP73捕獲抗體溶液共有兩種，濃度分別為I μ g/mL和2 μ g/mL。
5.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括生物素標(biāo)記的GP73抗體。
6.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包含含有3% BSA的PBS溶液，含有I % BSA和0.05 % NaN3的PBS溶液，pH 4.0的含有10mMNa1 4和50mM檸檬酸的溶液。
7.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括PBST緩沖液。
8.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記鏈霉親和素。
9.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包括底物溶液和終止液。
10.如權(quán)利要求1所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒，其特征在于，所述的用于肝癌血清學(xué)預(yù)測(cè)的高爾基體蛋白73異質(zhì)體試劑盒還包含采集血樣裝置及操作說(shuō)明書。
【文檔編號(hào)】G01N21/31GK104483484SQ201410816433
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年12月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月19日
【發(fā)明者】張舒, 郭坤, 劉銀坤 申請(qǐng)人:復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院