專利名稱:一種檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑及制備方法
技術領域:
本發(fā)明屬生物技術診斷試劑,具體涉及一種檢測甲胎蛋白的診斷試劑及制備方法。
甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)測定是肝細胞性肝癌的主要實驗室診斷方法。正常人血清也含有低濃度的AFP。臨床檢測AFP時,常以20-50μg/L作為正常參考值上限。
在臨床檢測中測定AFP的常用方法有酶免疫法,放射免疫法,化學發(fā)光免疫法等。但這些定量測定法需用特殊的儀器和試劑,不適合廣泛推廣使用,而且結果報告時間較長。
現(xiàn)有的AFP快速診斷試劑條為定性試劑,當標本中AFP含量超過正常參考值上限時,只報告陽性結果。
由于在臨床上除肝癌外,其它肝病如肝炎等血清AFP亦會顯著升高,但升高程度不及肝癌,因我國為肝炎高發(fā)區(qū),如僅以超過正常為陽性來報告AFP的含量范圍,臨床上缺乏鑒別診斷的參考。
本發(fā)明的目的在于克服上述缺點,研制一種不需要測試儀器,簡便、快速的半定量診斷方法。
本發(fā)明提供了一種檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑,其特征在于該試劑是由樣品墊1,固定有有色顆粒標記的抗AFP抗體I的吸水材料2,微孔膜3,吸水墊4,底板5,抗AFP抗體II A,抗抗體B組成的試劑。如
圖1、圖2所示。
圖1為檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑側視2為檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑俯視圖本發(fā)明的檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑在使用時采用免疫層析法(immunochromatographic assay,ICA),這是一種以微孔薄膜為載體的快速免疫結合方法。ICA中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細管作用向另一端移動。移動過程中被分析物與固定于膜上某一區(qū)域的受體(抗原或抗體)結合而被固定,無關物則越過該區(qū)域而被分離,然后通過標記物的顯色來判斷實驗結果。
本發(fā)明的檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑的半定量是應用下列原理來達到的。
在制備普通免疫層析法試劑時,人們通常在微孔膜上設檢測區(qū)和質控區(qū),但這里的質控區(qū)只用來指示該試劑是否失效,與被測物的含量沒有明確關系。在實驗中我們發(fā)現(xiàn),隨著被測物含量的增加,檢測區(qū)的顏色逐漸加深,而質控區(qū)的顏色卻逐漸減淡。我們以有色顆粒為標記物,通過調節(jié)檢測區(qū)和質控區(qū)的抗體包被濃度,使檢測區(qū)和質控區(qū)的顏色變化及兩區(qū)的顏色對比與被測物的含量范圍呈明確對應關系,從而達到半定量的目的。
檢測時,將試劑樣品墊一端浸入待測標本或將待測標本滴加在樣品墊上,等液體前移至前沿達到微孔膜時,取出試劑平放,15分鐘觀察結果。
若僅有質控區(qū)顯色,表明待測物中AFP含量小于正常參考值(例如30ug/L);若測試區(qū)與質控區(qū)均顯色,但質控區(qū)顏色深于測試區(qū)。表明待測物中AFP含量在正常參考值與陽性診斷值(例如200μg/L)之間;若測試區(qū)與質控區(qū)均顯色,但測試區(qū)顏色與質控區(qū)顏色相同或略深。表明待測物中AFP含量大于陽性診斷值;若測試區(qū)與質控區(qū)均不顯色,說明試劑已經失效。
本發(fā)明的另一目的是公開了上述檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑的制備方法,該方法包括下列步驟
(1)單抗的純化含單抗的腹水1份,經12000r/min離心10min后取上清液加入2份0.06mol/L pH 4.0醋酸緩沖液,按33.3μl/ml腹水比例加入正辛酸,4℃攪拌30min,離心12000r/min,30min,取上清液過濾,用0.002mol/L pH7.4的NaCl透析48h;在紫外分光光度計上測定A280和A260根據(jù)公式(1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數(shù),計算蛋白濃度;加入0.2%NaN3,分裝,-20℃凍存;(2)多抗的純化抗AFP的抗血清1份加上4份0.06M pH4.0醋酸緩沖液,再加入0.125份的正辛酸,4℃攪拌30min,10000r/min離心30min,取上清過濾,加入1/10體積的PBS,調pH至7.0;冷卻至4℃,按每ml體積加0.277g比例加入硫酸銨,4℃攪拌1h,4000r/min離心15min,沉淀用1份生理鹽水溶解,混勻,再加1份生理鹽水,透析,計算蛋白濃度,保存方法同單抗純化;(3)膠體金的制備用檸檬酸還原法制備,配制1%的檸檬酸鈉溶液,按1.5%的比例加入到雙蒸水中,煮沸后再按1%的比例加入1%氯金酸溶液,繼續(xù)煮沸15min,冷卻備用;(4)金標抗體的制備如上制備的膠體金溶液用0.1mol/LK2CO3調節(jié)pH至中性,加入1/10(V/V)的適當濃度的抗AFP抗體I溶液,室溫反應15min后,加入1%聚乙二醇(PEG);12000r/min離心30min,吸去上清;用含1%BSA的磷酸鹽緩沖液洗滌2-4次;最后沉淀復懸于相當于原體積1/5的1%BSA溶液中;4℃保存;(5)金標抗體的固定取金標抗體液與1%BSA溶液1∶1混勻,按比例加至吸水材料上,干燥;在微孔膜上平行包被兩種抗體,一種為抗AFP抗體II,包被濃度為2mg/ml;另一種為兔抗鼠IgG,包被濃度為1.5mg/ml;干燥;(6)組合成試劑條將上述固定著有色顆粒標記抗AFP抗體I的吸水材料2(5mm*6mm)、包被著抗AFP抗體II和兔抗鼠IgG的微孔膜3(5mm*20mm)、樣品墊1(5mm*23mm)和吸水墊4(5mm*31mm)按附圖粘貼在底板5(5mm*77mm)上組合成試劑條(見圖1、圖2);首先,將微孔膜3粘貼在底板5上,距底板5的近B末端30mm,然后將吸水墊4粘貼在底板5的近B端,吸水墊4與微孔膜3重疊處為1mm,再將吸水材料2粘貼在底板5的近A端,吸水材料2與微孔膜3重疊處為1mm;最后將樣品墊1也粘貼在底板5的近A端,樣品墊1與吸水材料2重疊處為1mm。
本發(fā)明所述的微孔膜為尼龍膜、PVDF膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜或硝酸纖維素與醋酸纖維素的混合膜;所述的有色顆粒為膠體金、膠體硒或彩色膠乳;所述的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
本發(fā)明的試劑不需要用測試儀器,具有簡便、快速、半定量的優(yōu)點,能判斷被測體中AFP的含量范圍,為臨床上肝炎和肝癌的鑒別診斷提供了更好的檢測方法。
實施例1單抗的純化含單抗的腹水1ml經12000r/min,10min離心后將上清液移入小燒杯中,加2ml 0.06mol/L pH 4.0醋酸緩沖液,再緩慢滴加33.3μl正辛酸,4℃攪拌30min,離心12000r/min,30min,上清液經脫脂棉濾入透析袋,對0.002mol/L pH 7.4的NaCl透析48h。取出純化的單抗液經1∶20稀釋后測A280,A260。根據(jù)公式(1.45×A280-0.74×A260)×稀釋倍數(shù),計算蛋白濃度。加入0.2%NaN3,分裝,-20℃凍存。
膠體金的制備;用檸檬酸還原法。在100ml雙蒸水中加入1%檸檬酸鈉溶液1.5ml,煮沸后再加入1%氯金酸溶液1ml,繼續(xù)煮沸15min,冷卻備用。
金標抗體的制備如上制備的膠體金溶液用0.1mol/L K2CO3調節(jié)pH至中性,加入1/10(V/V)的適當濃度的抗AFP單抗I溶液,室溫反應15min后,加入1%PEG。12000r/min離心30min,吸去上清。用入1%BSA的磷酸鹽緩沖液洗滌2-4次。最后沉淀復懸于20ml的1%BSA溶液中。4℃保存。
金標抗體的固定取金標抗體液400μl,加1%BSA溶液400μl,混勻,加至0.6×20cm的玻璃纖維膜上,干燥。
在硝酸纖維素膜上平行包被兩種抗體,一種為抗AFP單抗II,包被濃度為2mg/ml;另一種為兔抗鼠IgG,包被濃度為1.5mg/ml。干燥。
將上述玻璃纖維膜、硝酸纖維素膜、樣品墊和吸水墊按附圖在PVC底板上組裝成試劑條。
實施例2多抗的純化馬抗AFP的抗血清1ml加上4ml 0.06M pH 4.0醋酸緩沖液,再加入125μl的正辛酸,4℃攪拌30min,10000r/min離心30min,取上清過濾,體積為4.5ml,加450μl PBS,調pH至7.0。冷卻至4℃,加入1.37克硫酸銨,4℃攪拌1h,4000r/min離心15min,沉淀用1ml生理鹽水溶解,混勻,再加1ml生理鹽水,透析,計算蛋白濃度,保存方法同單抗純化。
金體抗體的制備金標記抗體為馬抗AFP,制備方法同實施例1。
單抗純化、膠體金的制備、金標抗體的固定等其余步驟均同實施例1。
實施例3在硝酸纖維素膜上平行包被兩種抗體,一種為馬抗AFP,包被濃度為2mg/ml;另一種為兔抗鼠IgG,包被濃度為1.5mg/ml,干燥。
其余步驟均同實施例1。
本發(fā)明不限于上述實施方式,還可把制成的試劑放入塑料盒中組成試劑盒或試劑板,因此凡是利用本發(fā)明原理制成的試劑盒或試劑板均應認為落在本發(fā)明的保護范圍之內。
權利要求
1.一種檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑,其特征在于該試劑是由樣品墊(1),固定有有色顆粒標記的抗AFP抗體I的吸水材料(2),微孔膜(3),吸水墊(4),底板(5),抗AFP抗體IIA,抗抗體B組成的試劑。
2.一種如權利要求1所述的檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑的制備方法,其特征在于該方法包括下列步驟①單抗的純化含單抗的腹水1份,經12000r/min離心10min后取上清液加入2份0.06mol/L pH 4.0醋酸緩沖液,按33.3μl/ml腹水比例加入正辛酸,4℃攪拌30min,離心12000r/min,30min,取上清液過濾,用0.002mol/L pH7.4的NaCl透析48h;在紫外分光光度計上測定A280和A260;根據(jù)公式1.45×A280-0.74×A260×稀釋倍數(shù),計算蛋白濃度;加入0.2%NaN3,分裝,-20℃凍存;②多抗的純化抗AFP的抗血清1份加上4份0.06M pH4.0醋酸緩沖液,再加入0.125份的正辛酸,4℃攪拌30min,10000r/min離心30min,取上清過濾,加入1/10體積的PBS,調pH至7.0;冷卻至4℃,按每ml體積加0.277g比例加入硫酸銨,4℃攪拌1h,4000r/min離心15min,沉淀用1份生理鹽水溶解,混勻,再加1份生理鹽水,透析,計算蛋白濃度,保存方法同單抗純化;③膠體金的制備用檸檬酸還原法制備,配制1%的檸檬酸鈉溶液,按1.5%的比例加入到雙蒸水中,煮沸后再按1%的比例加入1%氯金酸溶液,繼續(xù)煮沸15min,冷卻備用;④金標抗體的制備如上制備的膠體金溶液用0.1mol/L K2CO3調節(jié)pH至中性,加入1/10(V/V)的適當濃度的抗AFP抗體I溶液,室溫反應15min后,加入1%聚乙二醇;12000r/min離心30min,吸去上清;用含1%BSA的磷酸鹽緩沖液洗滌2-4次;最后沉淀復懸于相當于原體積1/5的1%BSA溶液中;4℃保存;⑤金標抗體的固定取金標抗體液與1%BSA溶液1∶1混勻,按比例加至吸水材料上,干燥;在微孔膜上平行包被兩種抗體,一種為抗AFP抗體II,包被濃度為2mg/ml;另一種為兔抗鼠IgG,包被濃度為1.5mg/ml;干燥;⑥組合成試劑條將上述固定著有色顆粒標記抗AFP抗體I的吸水材料(2)、包被著抗AFP抗體II和兔抗鼠IgG的微孔膜(3)、樣品墊(1)和吸水墊(4)粘貼在底板(5)上組合成試劑條;首先,將微孔膜(3)粘貼在底板(5)上,距底板(5)的近B末端30mm,然后將吸水墊(4)粘貼在底板(5)的近B端,吸水墊(4)與微孔膜(3)重疊處為1mm,再將吸水材料(2)粘貼在底板(5)的近A端,吸水材料(2)與微孔膜(3)重疊處為1mm;最后將樣品墊(1)也粘貼在底板(5)的近A端,樣品墊(1)與吸水材料(2)重疊處為1mm。
3.根據(jù)權利要求1所述的一種檢測甲胎蛋白半定量快速診斷試劑,其特征在于其中所述的微孔膜為尼龍膜、PVDF膜、聚酯膜、硝酸纖維素膜、醋酸纖維素膜或硝酸纖維素與醋酸纖維素的混合膜;所述的有色顆粒為膠體金、膠體硒或彩色膠乳;所述的抗體為單克隆抗體或多克隆抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用以檢測甲胎蛋白的新型半定量快速診斷試劑及制備方法。本發(fā)明的試劑是以微孔膜為固相載體,以有色顆粒為標記物,在膜上包被有特定濃度的兩種抗體,構成檢測區(qū)和質控區(qū)的試劑條。檢測結果顯示的兩區(qū)顏色變化及顏色對比與被測物的含量范圍呈明確對應關系。本發(fā)明檢測方法操作簡便、快速、不需測試儀器,可適應于多種物質的檢測。
文檔編號G01N33/53GK1262440SQ0011143
公開日2000年8月9日 申請日期2000年1月12日 優(yōu)先權日2000年1月12日
發(fā)明者俞海燕, 陶義訓 申請人:上海本草生物醫(yī)學工程研究所, 宗英