專利名稱：：甲胎蛋白磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明提供了一種寬范圍、高靈敏測定甲胎蛋白(a-fetoprotein,AFP)的磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析試劑盒及其制備方法。本發(fā)明試劑盒結合了生物素一親和素免疫放大技術、免疫磁微粒分離技術和化學發(fā)光免疫分析技術。
背景技術：
：癌癥自從誕生之日起就對人類的生存健康構成了嚴重威脅。目前腫瘤治療的關鍵在于早期發(fā)現、早期治療。但是目前醫(yī)院診斷早期腫瘤，主要是靠影像學和細胞病理學診斷技術，一般都是在具有明顯的占位性病變和臨床癥狀后才得以確診，但這已不是癌變的最早期。隨著腫瘤早期診斷進入蛋白質時代，以血液為代表的體液蛋白質成為腫瘤標志研究領域中的熱點。越來越多腫瘤標志物的發(fā)現對建立發(fā)展快速、高靈敏、高特異肺瘤標志物新型檢測技術提出了更高的要求。原發(fā)性肝癌(Hepatocellularcarcinoma,HCC，又稱為Primarylivercellcarcinoma),是世界范圍內第五大常見癌癥，致命率居于第三位。在中國，肝癌發(fā)病率是世界其它地區(qū)的三到四倍，占世界肝癌發(fā)病總數的40%多。目前報道的關于HCC的腫瘤標志物有多種，其中以曱胎蛋白(AFP)最受關注。AFP是由一個天冬酰胺連接到糖鏈上的一種糖蛋白，分子量大約為70000Dalton，在胚胎發(fā)育階段由嬰兒的卵黃囊和肝臟大量分泌，嬰兒出生后12~18個月內迅速減少，血清含量低于10|ug/L。血清學檢測AFP作為HCC參照物已經被世界多家權威機構認可，包括歐洲肝臟研究協會(EASL)、英國胃腸病學研究協會(BrSocGE)、歐洲肺瘤標志物組織(EGTM)和美國國立綜合癌癥網(NCCN)。并且AFP做為HCC診斷參考標準也受到美國NACB(NationalAcademyofClinicalBiochemistry)的支持，該機構強調曱胎蛋白檢測并連續(xù)觀察AFP在體內的變化情況對于早期診斷HCC具有重要的臨床價值。由于AFP在非腫瘤人群(如肝炎)或孕婦體內均有可能大幅升高，所以寬范圍的檢測是必需的。例如AFP在100-300jug/L之間者必須進行隨訪，密切觀察AFP的動態(tài)變化，注意可能的小肝癌；AFP在350-500pg/L,或含量明顯增高者，必須參考其他;險查，高度警惕原發(fā)性肝癌的可能；AFP為500~1000pg/L，且含量在短期內不斷升高，原發(fā)性肝癌可能性很大，但必須建議做活檢；AFP大于IOOOjag/L者，甚至在近期內AFP含量迅速升高，則原發(fā)性肝癌診斷基本可確定。所以高靈敏的檢測是疾病早期預警的要求，而寬范圍又是動態(tài)監(jiān)測所必需的。免疫學測定是以抗體-抗原的特異性識別、抗體標記技術和示蹤技術為基礎的定量技術，在腫瘤標志物的體液檢測中具有廣泛應用。目前檢測AFP的免疫學方法主要有石英晶體微天平法、元素示蹤ICP-MS法、空間分辨熒光法、乳液光度免疫分析法、電化學免疫分析、毛細管電泳-化學發(fā)光檢測。這些方法均具有不可避免的不足之處如石英晶體微天平、ICP-MS價格昂貴，空間分辨熒光法易受到環(huán)境的干擾，光度分析法檢測靈敏度較低、毛細管電泳的重現性較差，而電化學免疫分析又需要特殊的裝置。同時這些方法的工作范圍大多在0-600)jg/L之間，對高濃度樣品必須進行稀釋方可測定，根本無法滿足含量大于600pg/L后的連續(xù)監(jiān)測?；瘜W發(fā)光免疫分析法結合了免疫反應的高特異性和化學發(fā)光反應的高靈敏性，儀器簡單，成本低廉，可達到10-'8摩爾檢測水平，且檢測范圍可達6個數量級，因而得到了越來越多的關注。在實際的免疫檢測中，由于待測樣品中所含的雜質成分較多，一定程度上影響了檢測靈敏度和準確性，所以從復雜的樣品基質中快速分離、純化出目的待測物，是臨床檢驗工作者面臨的難題之一。免疫磁微粒技術是利用高分子材料合成6一定粒度大小的磁性固相微粒作載體，以物理吸附、化學偶聯等方法包被上具有特異性親合力的各種免疫活性物質(抗原或抗體)，使其致敏為免疫磁微粒，具有分離速度快、效率高、可重復性好；操作簡單；不影響被分離細胞或其它生物材料的生物學性狀和功能等特點，在外加磁場作用下定向運動，使得某些特殊成分得以分離、濃集或純化。免疫磁微粒技術與化學發(fā)光免疫分析技術結合檢測待測物，可大大提高檢測的靈敏度和準確性，它以微米級磁微粒為載體，利用表面有機物提供的羧基活性基團與蛋白質氨基共價結合，采用抗體進行"搭橋"成免疫磁微粒，可進行抗原、抗體反應。該技術的新穎之處有(l)采用微小的磁微粒作為固相可增加包被表面積，從而增加了抗體的有效包被量，不僅節(jié)省了抗體，而且有助于建立寬范圍的免疫檢測方法，尤其適合于高濃度臨床樣本的測定，避免彎鉤效應的發(fā)生；(2)利用順磁鐵微粒為固相載體，外包被單克隆抗體，增加抗原、抗體的接觸面積及底物發(fā)光面積，提高反應的靈敏度，并采用旋轉磁場使磁微粒起攪拌作用及分離結合抗原-抗體與游離抗體的作用；(3)在液相反應中，使用發(fā)光增強劑，將水分子從發(fā)光底物的發(fā)光位點排開，同時還可縮短發(fā)光的達峰時間；(4)使用單克隆抗體，提高了反應的特異性。生物素-親和素系統(biotin-avidinsystem,BAS)具有多級的信號放大作用，并且不增加非特異性干擾，且具有靈敏度高、特異性好、穩(wěn)定性高、適用性強和實驗成本低等特點。生物素-親和素免疫放大技術可以直接用標記親和素連接生物素化大分子反應體系進行檢測，這種方法稱為標記親和素-生物素法。待測反應體系可以利用生物素化抗體，使得親和素-生物素系統與免疫分析檢測體系偶聯，放大終反應先將針對不同抗原決定簇的固相抗體和生物素化抗體與抗原(標準抗原和待測抗原)同時反應，在固相載體表面形成雙抗體夾心免疫復合物，再7加入親和素與復合物中的生物素結合，最終使反應信號放大，從而提高了免疫分析的靈敏度?；瘜W發(fā)光免疫分析結合生物素-親和素系統和免疫磁微粒固相分離體系是一種檢測AFP的先進而有效的方法，有助于促進化學發(fā)光免疫分析技術在臨床檢驗、檢測中的應用與發(fā)展。曾經有文獻報道利用生物素-親和素系統的信號放大原理實現對AFP的熒光免疫檢測，但與化學發(fā)光檢測及磁微粒系統結合建立高靈敏、寬范圍的方法則未見報道。并且現有技術中的化學發(fā)光免疫分析試劑盒為封閉式全自動化學發(fā)光測量系統，需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，從而限制了推廣使用，無法廣泛地應用于臨床診斷和科研工作。本發(fā)明是在酶免疫分析的基礎上應用酶催化發(fā)光底物，通過;f企測發(fā)光底物產生的光信號代替酶免疫分析中的顯色底物，因而其靈敏度大大提高，并且操作簡便適用性廣，既可應用于開放式的半自動化學發(fā)光測量儀，也可用于全自動的測量系統，可實現大批量、快檢測，使用成本低，更易推廣應用。
發(fā)明內容本發(fā)明同時解決了上述問題，即將生物素-親和素免疫放大技術和免疫磁微粒技術結合化學發(fā)光免疫分析技術，檢測AFP，提供了一種高靈敏、寬范圍、簡便快速、穩(wěn)定地定量檢測AFP的測定試劑盒，該試劑盒適于產業(yè)化，具有良好的市場應用前景。本發(fā)明的目的是提供一種生物素一親和素免疫放大技術和免疫磁微粒技術結合化學發(fā)光免疫分析定量測定AFP的磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒。本發(fā)明的再一目的是提供一種制備上述試劑盒的方法。根據本發(fā)明的試劑盒包括1)AFP校準品；2)抗異疏氰酸酯熒光素(FITC)單克隆抗體包被的磁孩i粒溶液；3)生物素標記的AFP單克隆抗體與FITC標記的AFP單8克隆抗體的混合液；4)辣才艮過氧化物酶標記的鏈親和素液；5)上述酶所作用的化學發(fā)光底物液；以及6)反應管。進一步，根據本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以AFP純品配制校準品；2)制備抗FITC單克隆抗體包被的磁微粒溶液；3)制備生物素標記的AFP單克隆抗體與FITC標記的AFP單克隆抗體的混合液；4)以辣根過氧化物酶標記鏈親和素；5)配制辣根過氧化物酶所作用的化學發(fā)光底物液；6)分裝上述校準品、抗體包被的磁微粒、生物素標記物與FITC標記物的混合液、酶標記物和化學發(fā)光底物液和反應管；以及7)組裝為成品。根據本發(fā)明的方法，在所述制備抗FITC單克隆抗體包被的磁微粒步驟2)中所述磁孩吏粒為23miti粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有活性基團的聚合物，其使用濃度為3~8mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過戊二酪兩步法以抗FITC單克隆抗體包被磁微粒；以封閉液封閉包被的磁微粒，所述封閉液為含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、0.5%~1.0%酪蛋白、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液。9所述制備生物素標記的AFP單克隆抗體與FITC標記的AFP單克隆抗體的混合液步驟3)中所述生物素標記物和FITC標記物的混合液是將掉生物素標記的AFP單克隆抗體和FITC標記的AFP單克隆抗體以體積比為1:2混合，以20~40%小牛血清配制而成；所述生物素標記的AFP單克隆抗體是通過生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗體游離賴氨酸發(fā)生偶聯反應而實現的。根據本發(fā)明的方法，在所述以辣根過氧化物酶標記鏈親和素的步驟4)中，采用改良過碘酸鈉法以辣根過氧化物酶標記鏈親和素。根據本發(fā)明的方法，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液是在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HC1緩沖液，包含4.Omg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對珙苯酚；B液是在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成0.1MPH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。在根據本發(fā)明制備上述試劑盒的方法中，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作為反應管材料。具體的上述試劑盒可以包括校準品、磁孩i粒溶液、生物素標記物和FITC標記物的混合液、酶標記物、化學發(fā)光底物液與洗滌緩沖液等。其中，所述校準品的原料為標準級，純度不低于90°/。；抗FITC抗體包被于磁微粒上；FITC標記抗體與生物素標記的抗體形成混合液；標記鏈親和素的酶為辣#>過氧化物酶；化學發(fā)光底物液為魯米諾或異魯米諾；洗滌緩沖液為磷酸鹽緩沖液。10本發(fā)明"曱胎蛋白磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒"可以"寬范圍、高靈敏"檢測出原發(fā)性肝癌患者體內的AFP含量，可以根據AFP含量的多少判斷病情的變化及治療效果。本發(fā)明的試劑盒(化學發(fā)光法、生物素-親和素免疫放大技術與免疫磁微粒結合)具有簡便快速、高靈敏、寬范圍、穩(wěn)定等優(yōu)點，且各項指標均達到同類進口試劑盒的分析法水平。并且，根據本發(fā)明的檢測系統為開放式操作，簡便快速，不需要昂貴的全自動化學發(fā)光測量儀，特別適合廣大的中小醫(yī)院推廣使用，為臨床診斷和科研工作提供一種非常有價值的檢測手段。根據本發(fā)明的試劑盒，抗FITC單克隆抗體包被的磁」微粒、FITC標記的單克隆抗體、生物素標記的單克隆抗體和待測樣品中的AFP，形成"雙夾心免疫復合物"，之后酶標記的鏈親和素再與該復合結構結合，形成"磁微粒-抗體-待測抗原-抗體-生物素-親和素-酶"復合物，最后與化學發(fā)光底物作用而產生并放大光信號，在管式發(fā)光儀中對AFP進行高靈敏、寬范圍、高特異檢測。本發(fā)明采用"雙抗體直接夾心兩步法，，反應模式，有效地利用了化學發(fā)光技術結合磁微粒和生物素-親和素免疫放大技術原理，定量檢測人體血清、血漿樣品中AFP含量，確保了檢測的靈敏度。使用的磁微粒具有超順磁、高分散、表面積大的特點。對樣品的前處理要求低，樣品前處理過程簡單可靠，可快速、高通量檢測大批樣品，便于操作和生產。本發(fā)明的試劑盒結構簡單，使用方便，價格便宜，攜帶便利，與市場上的酶免疫試劑盒、板式化學發(fā)光試劑盒相比，線性范圍寬，有效避免彎鉤效應，不需樣品稀釋，適用于大批量檢測樣品。圖1為實施例1所制備的試劑盒中的校準品線性圖(雙對數標準曲線)。圖2為本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒(Monobind公司微板式化學發(fā)光試劑盒)臨床血樣測值比對的相關曲線。具體實施例方式實施例1制備本發(fā)明的AFP磁微粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒一、AFP校準品的制備用馬血清將AFP純品稀釋成校準品，分裝0ug/L、15pg/L、50ng/L、150lug/L、500!Ug/L、1000lug/L共6瓶。二、抗FITC單克隆抗體包被磁微粒溶液的制備將粒徑為2-3jum的石茲」微粒用戊二醛進行活化，室溫攪4半，混勻2小時后，加磁場，靜置2025min，倒出上清，用pH值為7.4的0.Olmol/L磷酸鹽緩沖液清洗三次，并用該溶液進行懸浮，濃度為50~100mg/mL;每毫升懸浮液中加入抗FITC單克隆抗體60~100Mg,在4。C下攪拌過夜后，加磁場，靜置1015min,倒出上清，用含有0.2%~1.0%牛血清白蛋白、0.5%~1.0%酪蛋白、O.02mol/L的磷酸緩沖液(pH為7.2)于室溫封閉3~4小時；最后用pH值為7.4、含吐溫-20和疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽洗滌緩沖液清洗3~5次，并用該溶液配制成5~10mg/mL的工作液。磁微粒溶液在4'C保存，不應凍存，用時輕輕搖勻。三、生物素標記物和FITC標記物的混合液的制備1、生物素標記的AFP單克隆抗體的制備生物素標記AFP單克隆抗體以生物素琥珀酰亞胺酯在樣"威性條件下與單抗發(fā)生偶聯反應，對PBS充分透析，生物素標記物以小牛血清稀釋，加入proclin300,-20。C以下保存。2、FITC標記的AFP單克隆抗體的制備FITC可以與抗體的伯氨基直接反應。將適量抗AFP單克隆抗體置于透析袋在50mmol.L—'NaHC03緩沖液(pH9.3)中過夜透析后，置入溶有適量FITC的50mmol.L—'碳酸鹽緩沖液(pH9.5)中，在4。C下攪拌反應16~20小時。更換透析液，以0.01mol'L—屮BS液(pH7.4)為透析液，每隔4~6小時更換一次，共更換4~5次。之后提耳又反應液于離心管中，3000rpm離心30min,棄去沉淀。標記物中加入等體積甘油后，置-20°C下保存待用。3、混合液的制備將生物素標記的AFP單克隆抗體與FTIC標記的AFP單克隆抗體以體積比為1:2混合，以20~40%小牛血清配制而成。四、辣根過氧化物酶標記的鏈親和素的制備以辣根過氧化物酶標記鏈親和素采用改良過碘酸鈉法，具體標記過程如下稱取3~6mg辣根過氧化物酶溶解于1.5mL雙蒸水，加入新鮮配制的0.05mol/LNaI040.3~0.5mL,室溫攪拌10min;經lmmol/L、pH4.5-5.0的醋酸鹽緩沖液于4'C透析4~10h后，加入鏈親和素(4~8mg/mL)1.5mL,攪拌2~5h;用4~8mg/mL的NaBH40.15mL進行還原；經0.01mol/L、pH7.2PBS緩沖液透析過夜后，離心去除沉淀；加等體積甘油，分裝后，-2(TC以下保存。四、酶標記物的濃/變選定采用方陣法選擇酶標記物的工作濃度范圍為1:30005000。五、酶才示i己物稀釋-液Tris12.12gBSA5g13Proclin1mL雙蒸水1000mL六、化學發(fā)光底物液本發(fā)明所使用的辣根過氧化物酶(HRP)的化學發(fā)光底物液的配制方法A液在雙蒸水中加入Tris和濃HC1配成0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液。在此緩沖液中加入4.0mg/mL的Luminol和0.3mg/mL的對碘苯酚等發(fā)光增強劑。B液在雙蒸水中加入檸檬酸三鈉和檸檬酸，配制成0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，在此溶液中加入200mg/mL的過氧化氫溶液。使用方法A、B液雙組分試劑，在使用前根據使用量等體積混合。七、洗滌緩沖液洗滌緩沖液是含有0.10.5%吐溫-20、0.1%疊氮化鈉防腐劑的磷酸鹽緩沖液，pH值為7.4。使用時用蒸餾水稀釋20倍。八、半成品及成品組成上述步驟所得產品分裝即為半成品。抽出三份經過特異性、精密性、靈敏度及穩(wěn)定性檢定合格才能組裝成AFP磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒，組裝成試劑盒后還需抽檢合格后才能出廠。實施例2本發(fā)明的試劑盒的使用方法一、樣品前處理取人的空腹晨血清樣品，3000rpm離心5min，取上層血清進行分析。二、檢測方法使用本試劑盒進行實驗前，需先取出磁微粒溶液、生物素標記物與FITC標記物混合液、校準品/待測樣品、酶標記親和素在室溫放置15-30分鐘，使它們平衡到室溫；之后，將恒溫溫箱或者水浴鍋調至37°C;再后，準備好合適的微量加樣器及對應吸頭并且檢查化學發(fā)光儀是否正常工作。使用本試劑盒按照實施例2的方法進行實驗的具體操作步驟如下將圓底聚苯乙烯試管編號后，向試管中加入25ut血清樣品或系列校準品溶液，校準品每管加0|ag/L、15jjg/L、50|jg/L、150|ag/L、500)jg/L、1000ug/L各25ijL,再先后加入標記物混合液和》茲孩i粒溶液各50、100|uL,37。C振蕩反應15min。再加入辣根過氧化物酶標記的親和素50)nL,37。C振蕩反應15min。之后，將試管架置于^f茲分離器上分離lmin,然后倒轉分離器倒出上清液，將倒轉的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體。每管加入洗滌液500|jL,充分混勻，置于^f茲分離器上分離lmin，倒出上清液，將倒轉的試管放在濾紙上吸干，拍擊分離器以除去掛壁液體，重復4次。各管加入化學發(fā)光底物液200一00)aL，充分混勻，置于磁分離器內，待磁微粒富集于底部后，暗處放置5min，而后在管式化學發(fā)光測量儀上依序測量各管的發(fā)光強度(RLU)。以校準品濃度的Log值為橫坐標，RLU的Log值為縱坐標繪出標準曲線(雙對數曲線)，以各待測血清RLU值在標準曲線上查出該血清AFP的濃度，見附圖1，其中，I為發(fā)光強度，C為AFP濃度(單位為yg/L)，相關系數r-O.9963,Y=0.9913+0.0491X。實施例3本發(fā)明的試劑盒的方法學檢定按照本領域中常規(guī)的制造及檢定規(guī)程對實施例1中制備的試劑盒進行檢定，結果如下1、試劑盒精密度測定(1)標準品精密度實驗將實施例l中制備的試劑盒分別取三批進行精密度實驗，每批抽取10個試劑盒。以實施例1中所抽取的試劑盒測定50jiig/L的AFP標準品5次。計算測定濃度的變異系數。實施例l中的三批試劑盒的測定結果如表l所示，結果表明變異系數在之3.8%~7.3%之間。表lAFP標準可重復性實驗試劑編號12345678910cv%Ol批4.34.13.86.03.94.34.26.04.86.004批4.05.94.86.55.34.96.67.06.56.207批4.06.97.04.96.46.25.77.37.06.6(2)樣本精密度實驗將實施例l中制備的試劑盒分別取三批進行精密度實驗，每批抽取10個試劑盒。以實施例l中所抽取的試劑盒測定110ug/L和220pg/L的AFP樣品5次。計算測定濃度的變異系數。實施例1中的三批試劑盒的測定結果如表2、表3所示，結果表明變異系數小于8.4%。表2110嗎/L血清樣品精密度測定試劑編號1234567891001批5.25.27.48.15.46.25.27.77.28.1cv%04批5.05.26.67.56.66.17.17.26.36.207批3,46.97.27.06.05.26.17.27.16.1表3220mg/L血清樣品精密度測定試劑編號1234567891016<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>3、試劑盒穩(wěn)定性實驗對實施例1的試劑盒進行37°C7天加速實驗后，測定試劑盒的最大、最低發(fā)光強度、待測物的加標回收率等結果表明實施例1的試劑盒指標均在正常范圍之內。對實施例1的試劑盒主要組分進行2~8'C8個月跟蹤實驗，結果表明各項指標完全符合要求。考慮到試劑盒冷凍情況的發(fā)生，將實施例1的試劑盒放入-2(TC冷凍7天，測定結果也表明試劑盒的各項指標完全正常。從以上結果可以看出試劑盒可以在28。C至少可以保存6個月以上。經過大量的實驗證明，本發(fā)明的試劑盒方法學指標如下檢測范圍0-1000ug/L;靈敏度最小檢出限為l.Oyg/L;精密度小于9%(n=5);準確性平均回收率在93.0%~102.0%之間；特異性與CA19-9、CEA、CA125、CA50、CA15-3等常見的腫瘤標志物的交叉反應率小于0,1%;穩(wěn)定性各試劑組分置37。C,考察7天后，各組分仍穩(wěn)定。說明"曱胎蛋白磁微?；瘜W發(fā)光免疫分析測定試劑盒"的臨床檢測范圍、靈敏度、精密度、準確性、特異性和穩(wěn)定性是完全合格的。綜上，在本發(fā)明的研究過程中，本發(fā)明的發(fā)明人首先對所用的原材料進行了篩選實驗和質量檢定，包括包被抗體的活性、磁微粒的吸附性能和變異大小、HRP的活性、化學發(fā)光底物的發(fā)光強度及發(fā)光持續(xù)時間等。然后對包被方法進行了研究，用不同的包被緩沖液和封閉液進行實驗，選擇出最適合的包被液和封閉液，18通過抗體不同包被濃度實驗找到最佳的濃度條件。對于HRP的標記可以有不同的方法，通過反復探索和對比實驗最終找到了簡便、產率高、成本低、質量可靠的標記方法，并對不同的酶稀釋液進行了長期的考察實驗，配制出了能夠使酶標記物長期保持活性穩(wěn)定的稀釋液。本發(fā)明的發(fā)明人還對試劑盒的反應模式和反應條件進行了實驗研究，最終確定了雙抗體夾心兩步法反應模式，并就不同的反應時間對實驗結果的影響進行了實驗，確定最適合的反應時間。利用本發(fā)明方法進行檢測，靈敏度高，特異性強，檢測范圍寬，操作簡單，無放射性污染，試劑盒成本低，臨床適用性強，更適用于我國臨床檢測篩查實驗室。因此本發(fā)明為臨床檢測AFP,診斷原發(fā)性肝癌，以及對肝癌的早期預警和動態(tài)監(jiān)測，提供了一種靈敏、準確、快捷、特異的方法。實施例4本發(fā)明的試劑盒同國外試劑盒臨床血樣測值比對用本發(fā)明的試劑盒和Monobind公司的AFP微板式化學發(fā)光試劑盒對80份腫瘤病人的臨床血清樣品同時進行檢測，所采用的92份臨床血樣來自首都醫(yī)科大學附屬天壇醫(yī)院和首都醫(yī)科大學附屬友誼醫(yī)院。其檢測結果見附圖2,以本發(fā)明方法測定的血樣AFP結果為橫坐標，以Monobind測定的結果為縱坐標作回歸分析，相關方程為Y=l.0330X-1.9684,相關系數r=0.9895。經統計學處理結果表明，本發(fā)明方法同國外試劑盒臨床血樣測值相關性良好。19權利要求1、一種甲胎蛋白磁微粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)AFP校準品；2)抗異硫氰酸熒光素(fluoresceinisothiocyanate，FITC)單克隆抗體包被的磁微粒溶液；3)生物素標記的AFP單克隆抗體與FITC標記的AFP單克隆抗體的混合液；4)辣根過氧化物酶標記的鏈親和素；5)上述辣根過氧化物酶所作用的化學發(fā)光底物液；以及6)反應管。2、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述生物素標記的AFP單克隆抗體與FITC標記的AFP單克隆抗體的混合比例為1:2。3、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液是0.1MpH值為8.5的Tris-HCl緩沖液，包含4.Omg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對硤苯酚；B液是0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。4、如權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒使用的反應管材料為透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃。5、一種制備權利要求l所述試劑盒的方法，其特征在于包括以下步驟1)以AFP純品配制^f交準品；2)制備抗FITC單克隆抗體包被的磁微粒；3)制備生物素標記的AFP單克隆抗體與FITC標記的AFP單克隆抗體的混合液；4)以辣#>過氧化物酶標記鏈親和素；5)配制辣根過氧化物酶所作用的化學發(fā)光底物魯米諾或異魯米諾；6)分裝上述校準品、磁顆粒溶液、混合液、酶標記物、化學發(fā)光底物液和反應管；以及7)組裝為成品。6、如權利要求5所述的方法，其特征在于，在所述制備抗FITC單克隆抗體包被的磁微粒步驟2)中所述磁微粒為23)jm粒徑、四氧化三鐵內核、表面包裹帶有活性基團的聚合物，其使用濃度為3~8mg/mL;所述抗體包被磁微粒是通過戊二醛兩步法以抗FITC單克隆抗體包被磁微粒;以封閉液封閉包被的磁微粒，所述封閉液為含有o.2%~i.oy。牛血清白蛋白、0.5°/。~l.0%酪蛋白、pH值為7.2的0.02mol/L磷酸緩沖液。7、如權利要求5所述的方法，其特征在于，在所述制備生物素標記的AFP單克隆抗體與FITC標記的AFP單克隆抗體的混合液步驟3)中所述生物素標記物和FITC標記物的混合液是將抗生物素標記的AFP單克隆抗體和FITC標記的AFP單克隆抗體以體積比為1:2混合，以20~40%小牛血清配制而成；所述生物素標記的AFP單克隆抗體是通過生物素琥珀酰亞胺酯在微堿性條件下與抗體游離賴氨酸發(fā)生偶聯反應而實現的。8、如權利要求6所述的方法，其特征在于，所述活性基團為氨基或羧基。9、如權利要求5所述的方法，其特征在于，在所述以辣根過氧化物酶標記鏈親和素的步驟4)中，采用改良過碘酸鈉法以辣根過氧化物酶標記鏈親和素。10、如權利要求5所述的方法，其特征在于，所述化學發(fā)光底物液包含A液和B液，其中，A液是0.1MpH值為8.5的Tris-HC1緩沖液，包含4.Omg/mL的魯米諾或異魯米諾和0.3mg/mL的對硤苯酚；B液是0.1MpH值為4.6的檸檬酸緩沖液，包含200mg/mL的過氧化氫溶液。11、如權利要求5所述的方法，其特征在于，使用透明聚苯乙烯、聚乙烯、聚丙烯或者玻璃作為反應管材料。全文摘要本發(fā)明涉及免疫分析醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明提供了一種AFP磁微粒化學發(fā)光免疫分析測定試劑盒及其制備方法。根據本發(fā)明的試劑盒包括1)AFP校準品；2)抗異硫氰酸酯熒光素(FITC)單克隆抗體包被的磁微粒溶液；3)生物素標記的AFP單克隆抗體與FITC標記的AFP單克隆抗體的混合液；4)辣根過氧化物酶標記的鏈親和素；5)化學發(fā)光底物液；以及6)反應管。進一步，根據本發(fā)明制備上述試劑盒的方法包括以下步驟1)以AFP純品配制校準品；2)制備FITC抗體包被的磁微粒溶液；3)制備生物素標記的AFP單克隆抗體與FITC標記的AFP單克隆抗體的混合液；4)用辣根過氧化物酶標記鏈親和素；5)配制化學發(fā)光底物液；6)分裝上述校準品、磁顆粒溶液、混合液、酶標記物、化學發(fā)光底物液和反應管；以及7)組裝為成品。本發(fā)明的試劑盒具有簡便、快速、靈敏、穩(wěn)定等優(yōu)點。文檔編號G01N33/574GK101514991SQ200810057840公開日2009年8月26日申請日期2008年2月19日優(yōu)先權日2008年2月19日發(fā)明者應希堂,張倩云,李振甲,林金明,栩王,胡國茂申請人:北京科美東雅生物技術有限公司