一種卡那霉素的化學(xué)發(fā)光試劑盒及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測(cè)卡那霉素的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒，用于檢測(cè)牛奶、奶粉 中的卡那霉素含量或殘留量。屬于免疫學(xué)檢測(cè)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 卡那霉素是一種高效、廣譜的氨基糖苷類抗生素，在治療由革蘭氏菌引起的感染 方面具有許多優(yōu)點(diǎn)，其在動(dòng)物中廣泛應(yīng)用的一個(gè)主要后果就是在動(dòng)物性食品中抗生素的非 法殘留。如果長(zhǎng)期攝入含有藥物殘留的動(dòng)物性食品，這些藥物就可在體內(nèi)蓄積，產(chǎn)生慢性毒 害作用，氨基糖苷類抗生素均有潛在的耳毒性，可引起前庭功能障礙和聽力永久喪失。
[0003] 目前，測(cè)定卡那霉素的主要方法是微生物法、高效液相色譜、酶聯(lián)免疫吸附法等。 色譜技術(shù)是非常有效、準(zhǔn)確、敏感的方法，但是待檢樣品需經(jīng)一系列的預(yù)處理，繁瑣費(fèi)時(shí)，從 樣品預(yù)處理到得出檢驗(yàn)結(jié)果需要較長(zhǎng)時(shí)間，檢測(cè)費(fèi)用很高；另一方面這種檢測(cè)方法還必須 有昂貴的儀器設(shè)備，只有特定的專業(yè)人員才能應(yīng)用，而且每次檢測(cè)的樣品有限，不適應(yīng)大批 樣品的篩查，嚴(yán)重阻礙了該檢測(cè)方法的推廣應(yīng)用，更不適合于現(xiàn)場(chǎng)檢驗(yàn)。與之相比，化學(xué)發(fā) 光免疫法具有快速、靈敏、方便、檢測(cè)成本較低等特點(diǎn)，能最大限度地減少操作誤差和工作 強(qiáng)度，是一種非常適合基層檢測(cè)牛奶、奶粉中卡那霉素的篩選方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種卡那霉素的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒。該試劑盒具有檢測(cè)靈 敏度高、應(yīng)用靈活、方便的特點(diǎn)，可用于牛奶、奶粉等樣品中卡那霉素的殘留量檢測(cè)。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明主要是利用抗原與抗體的特異性免疫反應(yīng)的基本原理來(lái) 實(shí)現(xiàn)的。化學(xué)發(fā)光免疫分析法是化學(xué)發(fā)光法和免疫分析法結(jié)合的產(chǎn)物，因此同時(shí)具有化學(xué) 發(fā)光法的高靈敏性和免疫分析法的高特異性。在整個(gè)反應(yīng)過(guò)程中，樣品中卡那霉素含量越 高，反應(yīng)體系中發(fā)光強(qiáng)度越弱；反之，樣品中卡那霉素含量越少，發(fā)光強(qiáng)度越高。
[0006] 本發(fā)明的檢測(cè)卡那霉素的化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)試劑盒含有盒體，設(shè)在盒體內(nèi)的化學(xué) 發(fā)光板和設(shè)在盒體內(nèi)的試劑。具體含有以下成分：
[0007] 包被有抗卡那霉素抗體的白色不透明96孔可拆卸或不可拆卸的聚苯乙烯化學(xué)發(fā) 光板。
[0008] 應(yīng)用pH= 7. 4 0. 05mol/L的PBS溶液稀釋卡那霉素純品得到的卡那霉素系列標(biāo) 準(zhǔn)品溶液，濃度范圍至少包含了 〇. 05~4. 05ng/mL的濃度區(qū)間。
[0009] 酶標(biāo)抗原濃縮液：由卡那霉素與卵清蛋白偶合制成的人工抗原與辣根過(guò)氧化物酶 偶聯(lián)制備得到。
[0010] 酶標(biāo)抗原稀釋液：pH7. 6的0. 01M的磷酸鈉、0. 25M的NaCl溶液。
[0011] 發(fā)光底物液：發(fā)光底物液分為A、B液。A液為化學(xué)發(fā)光底物-魯米諾和發(fā)光增強(qiáng) 劑-對(duì)甲苯酚溶液，B液為過(guò)氧化氫脲溶液。
[0012] 濃縮復(fù)溶液：濃縮復(fù)溶液具體為2倍濃縮磷酸鹽緩沖液，使用前用雙蒸水稀釋至 工作濃度后使用，用于樣品前處理。
[0013] 濃縮洗滌液：濃縮洗滌溶液具體為含有吐溫-20 (Tween-20)緩沖液的20倍濃縮磷 酸鹽緩沖液，使用前用雙蒸水稀釋至工作濃度后使用，用于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中洗滌化學(xué)發(fā)光板。 [0014] 本發(fā)明溶液的配制：
[0015] 本發(fā)明試劑盒中涉及的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液、酶標(biāo)卡那霉素抗原溶液、化學(xué)發(fā)光 溶液及洗滌溶液及其配方對(duì)本發(fā)明試劑盒檢測(cè)的靈敏度影響很大；其中各溶液的主要成分 及其配制方法是：
[0016] 1、卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液：以常規(guī)方法將卡那霉素純品用0. 05mol/L，pH= 7. 4的PBS 配制成濃度分別為〇、〇. 05、0. 15、0. 45、1. 35、4. 05ng/mL的卡那霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液。
[0017] 2、酶標(biāo)卡那霉素抗原溶液：用卡那霉素與偶聯(lián)蛋白偶聯(lián)制備的人工抗原與辣根過(guò) 氧化物酶偶聯(lián)制備得到，將所得酶標(biāo)卡那霉素抗原用酶標(biāo)卡那霉素稀釋液稀釋成1:4000 的工作濃度。
[0018] 3、酶標(biāo)抗原稀釋液：為pH7. 6的磷酸鈉為0? 01M、NaCl為0? 25M的緩沖溶液。
[0019] 4、化學(xué)發(fā)光溶液:A液為魯米諾含量為0. 01M、對(duì)甲苯酚含量為0. 001MpH= 8. 8 的三（羥甲基）氨基甲烷溶液，B液為每100mL溶液含檸檬酸2.lg，無(wú)水Na2HP042. 82g， 0. 75%的過(guò)氧化氫脲0. 64mL的水溶液。
[0020] 5、濃縮復(fù)溶工作液：NaH2P04 ? 2H20 5. 74g、Na2HP04 ? 12H20 32. 6g溶于 1L的去離子 水中。
[0021] 6、濃縮洗滌溶液：按體積分?jǐn)?shù)0. 05 %將吐溫-20添加至pH= 7. 4,0.lmol/L磷酸 鹽緩沖液中。
[0022] 7、包被溶液：1. 59g碳酸鈉和2. 53g碳酸氫鈉溶于1L水中，調(diào)節(jié)pH= 9. 5。
[0023] 8、封閉溶液配制：10gBSA溶于1L洗滌溶液中，再加入重量比為5%。的NaN3。
[0024] 本發(fā)明化學(xué)發(fā)光板的包被：
[0025] 本發(fā)明中包被化學(xué)發(fā)光板采用將抗卡那霉素抗體置于設(shè)定的包被溶液中，以設(shè)定 的濃度，在37 °C恒溫箱中反應(yīng)包被。
[0026] 本發(fā)明采用的是pH= 9. 5的碳酸鈉-碳酸氫鈉緩沖溶液。本發(fā)明中微孔板中所 包被的抗卡那霉素抗體在堿性環(huán)境下可以很好的結(jié)合在微孔板塑料表面上，可以經(jīng)受多次 洗板，采用的抗體包被濃度為5. 0yg/mL。
[0027] 包被好的微孔板可以用封閉溶液封閉，封閉液中惰性蛋白優(yōu)選BSA，需加入似％防 止變質(zhì)。
[0028] 酶標(biāo)卡那霉素抗原溶液的制備：
[0029] 本發(fā)明中酶標(biāo)卡那霉素抗原溶液濃度是決定本發(fā)明中卡那霉素化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試 劑盒測(cè)定范圍及靈敏度的重要因素。
[0030] 本發(fā)明中涉及的酶標(biāo)卡那霉素抗原溶液可以用酶標(biāo)卡那霉素稀釋液稀釋成 1:4000的工作濃度。
[0031] 按照上述酶標(biāo)卡那霉素抗原溶液濃度制備的試劑盒可以達(dá)到很好的線性范圍 (標(biāo)準(zhǔn)線范圍可以達(dá)到0. 05~4. 05ng/mL)和很好的靈敏度（IC5Q為0. 065ng/mL)。
[0032] 化學(xué)發(fā)光溶液的配制：
[0033] 所述化學(xué)發(fā)光液A液為魯米諾含量為0. 01M、對(duì)甲苯酚含量為0. 001MpH= 8. 8的 三（羥甲基）氨基甲烷溶液，B液為lOOmL溶液含檸檬酸2.lg，無(wú)水Na2HP042. 82g，0. 75% 的過(guò)氧化氫脲0. 64mL的水溶液。所述魯米諾為化學(xué)發(fā)光底物，對(duì)甲苯酚為發(fā)光增強(qiáng)劑。 [0034] 本發(fā)明的原理是將抗體-抗原反應(yīng)的高度特異性與酶催化的高度靈敏性結(jié)合起 來(lái)，利用酶催化底物的化學(xué)發(fā)光反應(yīng)檢測(cè)產(chǎn)物濃度。
[0035] 本發(fā)明的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒具有靈敏度高、簡(jiǎn)便快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，與傳統(tǒng)的比 色ELISA法比較，靈敏度可以提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。有望在牛奶、奶粉中的卡那霉素殘留檢測(cè)中 發(fā)揮重要作用。
【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1為卡那霉素半抗原合成反應(yīng)式。
[0037] 圖2為卡那霉素半抗原核磁共振氫譜圖。
[0038] 圖3為本發(fā)明化學(xué)發(fā)光試劑盒工作曲線。
【具體實(shí)施方式】
[0039] 實(shí)施例1 :半抗原、抗原及單克隆抗體的制備
[0040] (1)卡那霉素半抗原合成
[0041] 1. 0g卡那霉素、0. 3g鄰苯二甲酸酐和2ml吡啶在10mlDMF中的混合液，室溫下攪 拌反應(yīng)12小時(shí)，減壓蒸除溶劑，乙醇中重結(jié)晶得到鄰苯二甲酸單卡那霉素酰胺，得率53%。
[0042] 取上述產(chǎn)物經(jīng)核磁共振氫譜測(cè)定，如圖2所示，8.Oppm左右的芳香烴信號(hào)和 11.Oppm羧基峰信號(hào)的出現(xiàn)說(shuō)明半抗原合成成功。
[0043] (2)免疫原（卡那霉素-BSA)的合成
[0044] 取20mg半抗原，溶解于lmLDMF中，取30mgEDC和NHS用0. 2ml水充分溶解后 于加入⑴中，室溫下攪拌24h，即可得到反應(yīng)液A。稱取BSA50mg，使之充分溶解在3. 8mL PBS(PH7. 2)中，將反應(yīng)液A逐滴緩慢滴加到蛋白溶液中，并于室溫下攪拌24h，用0.Olmol/ 1PBS4度透析3d每天換3次透析液，以除去未反應(yīng)的小分子物質(zhì)。分裝，于-20°C保存?zhèn)?用。
[0045] 稱取半抗原20mg和OVA50mg，按上述步驟反應(yīng)制備包被抗原，供酶標(biāo)用。
[0046] (3)卡那霉素單克隆抗體的制備
[0047] A，動(dòng)物免疫：用上述制備出的免疫原（卡那霉素-BSA)按100yg/只，以生理鹽水 溶解免疫原與弗氏完全佐劑等體積混勻，頸背部皮下注射免疫6~8周齡Balb/c雌鼠，初 次免疫后第7、14、28天以免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混勻，各追加免疫一次，融合前3 天以免疫復(fù)合物100Ug/只，不加弗氏佐劑再追加免疫一次。
[0048] B，細(xì)胞融合：按常規(guī)方法進(jìn)行，取免疫小鼠的脾細(xì)胞與處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨 髓瘤細(xì)胞（SP2/0)混合，然后在45秒內(nèi)緩慢加入預(yù)熱的融合劑（PEG4000)進(jìn)行融合，用HAT 培養(yǎng)基懸浮均勻，再加入適量的飼養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，于37°C，5 %C02培養(yǎng)箱中培 養(yǎng)，5天后用HT培養(yǎng)基半換液，9天時(shí)候進(jìn)行全換液。
[0049] C，雜交瘤細(xì)胞的篩選：細(xì)胞融合后，待細(xì)胞長(zhǎng)到培養(yǎng)孔面積的1/4時(shí)，采用分步篩 選法篩選雜交瘤細(xì)胞。初選采用間接ELISA方法，以包被抗原（預(yù)先用方陣法常規(guī)滴定其 最佳包被濃度和陽(yáng)性血清稀釋度）包被化學(xué)發(fā)光板，加入被測(cè)孔培養(yǎng)上清，孵育，清洗后加 入羊抗鼠IgG-HRP和IgM-HRP，OPD進(jìn)行顯色反應(yīng)。篩選出的陽(yáng)性孔再用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA方 法篩選，先將細(xì)胞上清與l〇〇yg/mL的卡那霉素等體積混合，37°C水浴作用30min，再加入 到包被好的化學(xué)發(fā)光板中。同時(shí)用PBS取代卡那霉素作對(duì)照，其余步驟同上。若經(jīng)卡那霉 素阻斷后的〇D45(lnm值下降到對(duì)照孔的50%以下，則判為陽(yáng)性，經(jīng)2~3次檢測(cè)都為陽(yáng)性的 孔，立即用有限稀釋法進(jìn)行亞克隆化。
[0050] D，單克隆抗體制備：將2~3次亞克隆建株后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，收集上清液 用間接ELISA測(cè)定效價(jià)，凍存；并取8~10周齡Balb/c小鼠腹腔注射液體石蠟0. 5mL/只， 7~10日后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞1~2X106/只，7~10日后抽取小鼠腹水，離心取上清， 測(cè)定效價(jià)，并凍存?zhèn)溆谩?br>[0051] 實(shí)施例2 :酶標(biāo)抗原的制備
[0052] A，稱取2mgHRP溶解于0. 5mL雙蒸水中；加入0. 5mL新配制的0. 06mol/L恥104溶 液，4°C避光作用30min;
[0053] B，加入 160mmol/L的乙二醇 0? 5mL，室溫作用 30min;
[0054] C，加入卡那霉素-OVA2mg，混勾后裝入處理過(guò)的透析袋中，置1000mL的0. 05m mol/L碳酸鈉緩沖液中透析，4°C過(guò)夜；
[0055] D，透析液吸至10mL的離心管中，加0. 25