專利名稱：：重組人甲胎蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及克隆人甲胎蛋白的表達和純化；用于治療自身免疫病的方法；癌癥治療及診斷方法；以及細(xì)胞生長和細(xì)胞培養(yǎng)。甲胎蛋白(AFP)是一種血清蛋白，一般僅在胎血中有較高含量。成體血液中較高的甲胎蛋白含量與肝的再生和某些癌有關(guān)。概括地說，本發(fā)明的特征是大體上純的有生物活性的重組人甲胎蛋白，它包括一段序列，該序列大體上相同于圖1(序列9)的氨基酸1-389或其片段；圖1(序列10)的氨基酸198-590或其片段；圖1(序列7)的氨基酸198-389或其片段；圖1(序列8)的氨基酸390-590；圖1(序列11)的氨基酸266-590或其片段。在另一個相關(guān)方面，本發(fā)明的特征是一種用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)具有生物學(xué)活性的重組人甲胎蛋白或其片段或其類似物的方法，該方法包括a)提供一種轉(zhuǎn)化的昆蟲細(xì)胞(例如，草地食夜蛾(Spodopterafrugiperda))，其含有一個編碼人甲胎蛋白或其片段或其類似物的重組DNA分子，該分子與一個表達控制因子可操作地連接，由該控制因子指導(dǎo)人甲胎蛋白或其片段或類似物的表達；b)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞；和c)回收有生物學(xué)活性的人甲胎蛋白或其片段或類似物。在有關(guān)方面，本發(fā)明的特征還在于用本文披露的任何方法生產(chǎn)的大體上純的人甲胎蛋白或其片段或其類似物，和含有用本文披露的任何表達系統(tǒng)生產(chǎn)的大體上純的人甲胎蛋白(或其片段或類似物)的治療組合物。另一方面，本發(fā)明的特征是一種抑制哺乳動物(如，人類患者)自身反應(yīng)免疫細(xì)胞增殖的方法，包括給哺乳動物給藥治療有效量重組人甲胎蛋白或其免疫細(xì)胞抗增殖片段或類似物。這種方法是基于本人的發(fā)現(xiàn)在原核生物(如大腸桿菌)中生產(chǎn)的非糖基化重組人甲胎蛋白可用于抑制源于哺乳動物的自身反應(yīng)免疫細(xì)胞。這種免疫細(xì)胞優(yōu)選包括T細(xì)胞或B細(xì)胞；而用于這種方法的重組人甲胎蛋白(或其免疫細(xì)胞抗增殖片段或類似物)優(yōu)選是在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。再一方面，本發(fā)明的特征是一種治療哺乳動物(如人類患者)的自身免疫病的方法，包括向哺乳動物給藥治療有效劑量的重組人甲胎蛋白或其免疫細(xì)胞抗增殖片段或其類似物。所述自身免疫病是多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、重癥肌無力、胰島素依賴性糖尿病、或系統(tǒng)性紅斑狼瘡。在其它的優(yōu)選實施方案中，所述自身免疫病是獲得性免疫缺陷綜合癥或涉及移植器官、組織或細(xì)胞的排斥。用于所述方法的重組人甲胎蛋白優(yōu)選是在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。在其它優(yōu)選實施方案中，所述方法還包括向哺乳動物給藥有效劑量的免疫抑制劑，這一劑量低于僅使用這種免疫抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)劑量。所述免疫抑制劑優(yōu)選是環(huán)孢菌素、類固醇、硫唑嘌呤、FK-506或15-脫氧精胍菌素。在另一種優(yōu)選實施方案中，所述方法包括給哺乳動物給藥一種耐受劑(to1erizingagent)。用于所述方法的重組人甲胎蛋白優(yōu)選是在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的。根據(jù)本發(fā)明，給藥重組人甲胎蛋白(“rHuAFP”)(或其片段或類似物)，可能是一種有效的預(yù)防、治療或改善哺乳動物的自身免疫病的方法。為了說明這一點，發(fā)明人已證實在原核表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的重組HuAFP能有效抑制T細(xì)胞效應(yīng)于自身抗原的增殖，盡管實際情況是這種rHuAFP是以不同于天然存在的HuAFP的方式修飾的。到目前為止，天然HuAFP的應(yīng)用一直受到其不可獲得性的局限，天然HuAFP是通過繁瑣的純化過程從有限的臍帶及臍帶血清來源中獲取的。由于現(xiàn)在可以用重組DNA技術(shù)大量制備有生物學(xué)活性的rHuAFP，所以，目前用rHuAFP治療自身免疫病是可行的。rHuAFP的應(yīng)用尤其有利，因為還未知有與人甲胎蛋白相關(guān)的有害副作用，而且據(jù)認(rèn)為可以安全地給藥較大劑量。在另一方面，本發(fā)明的特征是用于預(yù)防、治療和診斷腫瘤，特別是癌癥的組合物和方法。本發(fā)明的這一方面是基于發(fā)明人的如下發(fā)現(xiàn)在原核生物(如大腸桿菌)中產(chǎn)生的非糖基化重組人甲胎蛋白可用于治療和診斷患有腫瘤的哺乳動物，特別是患惡性腫瘤，如乳腺癌或前列腺癌，以及由惡性細(xì)胞增生所致的其它癌的哺乳動物，所述細(xì)胞能表達被重組人甲胎蛋白識別的受體。一方面，本發(fā)明的特征是抑制哺乳動物(如人類患者)腫瘤的方法，包括向哺乳動物給藥治療有效劑量的重組人甲胎蛋白或其抗腫瘤片段或類似物。所述腫瘤優(yōu)選是惡性腫瘤(如乳腺瘤和前列腺瘤)；而所述重組人甲胎蛋白是在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的。在優(yōu)選實施方案中，所述腫瘤細(xì)胞能表達一種由重組人甲胎蛋白識別的受體。所述腫瘤通常是諸如腺癌或肉瘤的癌。在優(yōu)選實施方案中，腫瘤效應(yīng)于諸如雌激素或雄激素的激素增生。給藥重組人甲胎蛋白優(yōu)選能抑制哺乳動物腫瘤細(xì)胞的增生或殺死這些腫瘤細(xì)胞。該方法還包括向哺乳動物給藥化療劑。另一方面，本發(fā)明的特征是一種預(yù)防哺乳動物發(fā)生腫瘤的方法，包括向哺乳動物給藥一種治療有效劑量的重組人甲胎蛋白。重組人甲胎蛋白優(yōu)選是在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的。又一方面，本發(fā)明的特征是一種雜合的細(xì)胞毒素，包括和一種細(xì)胞毒性劑連接的重組人甲胎蛋白(或其片段或類似物)。這種細(xì)胞毒性劑的例子包括，但不限于白喉毒素、假單胞桿菌屬(Pseudomonas)外毒素A；蓖麻毒蛋白及其它植物毒素，如相思豆毒蛋白、modeccin、Volkensin、桷寄生毒素；霍亂毒素(由霍亂弧菌(Vibriocholerae)產(chǎn)生)；所謂志賀樣毒素(由大腸桿菌及其它腸桿菌產(chǎn)生)；沙門氏菌屬(Salmonella)不耐熱的腸毒素；和大腸桿菌不耐熱的熱毒素。在其它優(yōu)選實施方案中，所述細(xì)胞素性劑是非蛋白類的。這種非蛋白類細(xì)胞毒性劑的例子包括，但不限于抗癌劑，如阿霉素，以及α-發(fā)射放射性核素，如砹，和β-發(fā)射核素，如釔。所述雜合細(xì)胞毒素的細(xì)胞毒性劑是通過肽鍵和重組人甲胎蛋白連接，而且該雜合毒素是通過表達遺傳工程的雜合DNA分子產(chǎn)生的。在其它優(yōu)選實施方案中，所述雜合細(xì)胞毒素的細(xì)胞毒性劑是蛋白；這種細(xì)胞毒性劑是和重組人甲胎蛋白化學(xué)綴合的。在其它方面，本發(fā)明的特征是一種能夠與人體腫瘤細(xì)胞結(jié)合的可檢測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白或其可檢測地標(biāo)記的片段或類似物。所述分子優(yōu)選是用放射核素標(biāo)記過的，如锝-99m、I-125、I-131或銦。其它可檢測的標(biāo)記包括，但不限于酶，熒光團，或其它能發(fā)出可檢測到的信號(如放射性、熒光、顏色)成分或化合物，或在該標(biāo)記暴露給其底物后發(fā)出一種可檢測到的信號，或者所述可檢測到的信號可以是一種能由一種抗體識別的表位(例如，甲胎蛋白表位或通過工程手段特意引入重組甲胎蛋白的表位，如HA或myc表位)。所述分子優(yōu)選能針對惡性腫瘤(如乳腺瘤、前列腺瘤或癌)，該惡性腫瘤能表達一種可由重組人甲胎蛋白(或其片段或類似物)識別的受體。通常，這種重組甲胎蛋白是在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的?？蓹z測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白(或其片段或類似物)可用于對人類患者的具腫瘤細(xì)胞的部位進行體內(nèi)顯像。一般，該方法包括(a)提供一種可檢測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白分子(或其片段或類似物)；(b)向患者給藥這種分子；(c)讓所述標(biāo)記分子和所述部位結(jié)合，并將未結(jié)合的分子從所述部位清除；和(d)獲得具腫瘤細(xì)胞的部位的圖像。所述部位優(yōu)選是乳腺或前列腺。在其它優(yōu)選實施方案中，所述部位包括但不限于肝組織、肺組織、脾組織、胰腺組織、腦組織、淋巴組織或骨髓。所述圖像優(yōu)選是利用動態(tài)γ閃爍照像法得到的?？蓹z測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白(或其片段或類似物)也可用于診斷哺乳動物(如人類患者)內(nèi)的腫瘤的方法。這種方法包括(a)讓生物樣品和可檢測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白接觸；和(b)檢測和樣品結(jié)合的標(biāo)記，當(dāng)檢測到的標(biāo)記高于背景含量時，表明患者有腫瘤。該方法優(yōu)選在所述接觸步驟之前包括含有固定的和切片的細(xì)胞的生物樣品，而與樣品結(jié)合的標(biāo)記是結(jié)合在相當(dāng)于細(xì)胞的細(xì)胞膜部分。在優(yōu)選實施方案中，生物樣品來自人類患者的乳腺或前列腺?？蓹z測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白(或其片段或類似物)也可用于體內(nèi)檢測哺乳動物活體內(nèi)腫瘤的方法。這種方法包括(a)給藥診斷有效劑量的可檢測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白；和(b)檢測與哺乳動物組織結(jié)合的可檢測標(biāo)記的存在，標(biāo)記量高于背景含量處表明在該哺乳動物體內(nèi)存在腫瘤。在優(yōu)選實施方案中，該方法涉及被懷疑患有乳腺癌的患者，而所述組織是乳腺組織。在其它優(yōu)選實施方案中，該方法涉及被懷疑患有前列腺癌的患者，而所述組織是前列腺組織?？蓹z測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白優(yōu)選是和放射核素(如锝-90)連接，而檢測步驟是通過放射成像(如動態(tài)γ閃爍照相法)完成的。另一方面，本發(fā)明的特征是用于在體內(nèi)、原位或體外檢測腫瘤或任何表達可由重組人甲胎蛋白(或其片段或類似物)識別的受體的細(xì)胞的試劑盒。一般，該試劑盒含有一種可由腫瘤識別的重組人甲胎蛋白，而且這種蛋白可以是可被檢測地標(biāo)記過的。如果所述重組人甲胎蛋白是未標(biāo)記的，則所述試劑盒中最好含有具有可檢測標(biāo)記(如放射性核素，如锝90、I-125，I-131或銦)的第二種試劑。當(dāng)所述可檢測標(biāo)記是酶時，所述試劑盒還包括一種用于這種酶的底物。該試劑盒還包括一種用于將可檢測標(biāo)記和重組甲胎蛋白連接的試劑。在另一種實施方案中，所述用于檢測腫瘤或任何有害的能表達一種可由重組人甲胎蛋白(或其片段或類似物)識別的受體的細(xì)胞的試劑盒，包括一種含有可以特異結(jié)合重組人甲胎蛋白的試劑和一種含有可由抗人甲胎蛋白抗體特異結(jié)合的可檢測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白的試劑。所述試劑盒的重組人甲胎蛋白優(yōu)選是在原核細(xì)胞(大腸桿菌)中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。將重組人甲胎蛋白用于治療和診斷癌癥具有很多優(yōu)點。例如，可將rHuAFP直接給藥于腫瘤位點。重組HuAFP也可以是化學(xué)定義和合成的，以及用重組DNA技術(shù)大量制備的，例如，用本文所披露的方法。另外，與常規(guī)的癌癥化療和放療不同，重組人甲胎蛋白引起的副作用很小，這些副作用如惡心、嘔吐和神經(jīng)毒性。因此，可以安全地給藥較大劑量的rHuAFP。本發(fā)明的診斷方法是有利的，因為該方法可以快速便捷地診斷出腫瘤。例如，將rHuAFP用作診斷劑(例如，通過閃爍照相法進行放射顯像)特別有利于癌癥的實時成像，以便進行癌(如，乳腺癌)手術(shù)前或內(nèi)部的操作定位和分期，在手術(shù)后的檢查中也是有利的。這種診斷方法的應(yīng)用可以對腫瘤的存在、位置或缺乏進行非侵害性的測定，這有利于監(jiān)控患者的疾病。在另一方面，本發(fā)明的特征是一種含有重組人甲胎蛋白或其細(xì)胞刺激性片段或類似物的的細(xì)胞培養(yǎng)基。本發(fā)明的這一方面是基于發(fā)明人的以下發(fā)現(xiàn)在原核生物(如大腸桿菌)中產(chǎn)生的非糖基化重組人甲胎蛋白是一種細(xì)胞增殖劑，例如，在體外促進骨髓生長。這種重組人甲胎蛋白優(yōu)選是在原核細(xì)胞(大腸桿菌)中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的。因此，本發(fā)明這一方面的特征是一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法包括(a)提供一種含有重組人甲胎蛋白的細(xì)胞培養(yǎng)基；(b)提供一種細(xì)胞；(c)在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)所述細(xì)胞，使細(xì)胞增殖和維持。所述細(xì)胞優(yōu)選是哺乳動物細(xì)胞。這種哺乳動物細(xì)胞的例子包括骨髓細(xì)胞(例如，T細(xì)胞、天然殺傷細(xì)胞、淋巴細(xì)胞)、雜交瘤、或遺傳工程細(xì)胞系。其它細(xì)胞的例子包括造血細(xì)胞，如干細(xì)胞、母細(xì)胞、祖細(xì)胞(例如，諸如成爆發(fā)集落形成單位和集落形成單位的紅細(xì)胞祖細(xì)胞)、成髓細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、T-淋巴細(xì)胞、B-淋巴細(xì)胞、嗜伊紅性粒細(xì)胞、嗜堿性細(xì)胞、組織肥大細(xì)胞、巨核細(xì)胞[例如，參見“醫(yī)療實踐的最好的Taylor′s生理學(xué)基礎(chǔ)”(BestandTaylor′sPhysiologicalBasisofMedicalPratice)，JohnB.West著，Willians&Wilkins，Baltimore]。在其它優(yōu)選實施方案中，該方法涉及來自體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)。在另一方面，本發(fā)明的特征是抑制哺乳動物(如人類患者)的骨髓中毒性的方法，包括向動物給藥一種治療有效劑量的重組人甲胎蛋白或其骨髓毒性抑制類似物或片段。所述重組人甲胎蛋白優(yōu)選是在原核細(xì)胞(大腸桿菌)中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的。在另一方面，本發(fā)明的特征是一種抑制哺乳動物骨髓細(xì)胞增殖抑制的方法，該方法包括向哺乳動物給藥有效劑量的重組甲胎蛋白或其抗抑制片段或類似物。重組人甲胎蛋白優(yōu)選是在原核細(xì)胞(如，大腸桿菌)中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的。在另一方面，本發(fā)明的特征是一種促進哺乳動物骨髓細(xì)胞增殖的方法，包括向哺乳動物給藥有效劑量的重組人甲胎蛋白或其細(xì)胞刺激片段或類似物。重組人甲胎蛋白優(yōu)選是在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的。再一方面，本發(fā)明的特征是一種預(yù)防哺乳動物骨髓細(xì)胞移植排斥的方法，包括向哺乳動物給藥有效劑量的重組人甲胎蛋白或其抗排斥片段或類似物。重組人甲胎蛋白優(yōu)選是在原核細(xì)胞(如大腸桿菌)中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的。按照本發(fā)明的方法，給藥rHuAFP(或其片段或類似物)可能是促進和加強體外、來自體內(nèi)或體內(nèi)細(xì)胞生長的有效方法。另外，給藥本發(fā)明的化合物可能還是預(yù)防、治療或改善哺乳動物的骨髓毒血癥的有效方法。將rHuAFP(或其片段或類似物用作組織培養(yǎng)基的主要成分是有利的，因為其優(yōu)點是感染病原體的可能性幾乎沒有)?！叭思滋サ鞍住笔侵敢环N大體上與由Morinaga等描述的[“美國國家科學(xué)院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.，USA)804604(1983)]人甲胎蛋白基因編碼的蛋白的氨基酸序列的多肽。在原核細(xì)胞中產(chǎn)生人甲胎蛋白的方法披露于美國專利5,384,250中，而且與本文所披露的方法一致?！氨磉_控制因子”是指一個核苷酸序列，它包括關(guān)于控制蛋白編碼序列表達并與該序列可操作地連接的因子的識別序列。因此，表達控制因子通常包括控制轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，例如，啟動子、核糖體結(jié)合位置、阻遏物結(jié)合位點和激活物結(jié)合位點。“大體上相同的氨基酸序列”是指一種多肽，且它與天然存在的人甲胎蛋白的氨基酸序列的同源性至少為80％，典型地至少約為85％、更典型地至少約為90％，經(jīng)常至少約為95％，更加經(jīng)常的是至少約為97％。比較序列的長度通常至少約為16個氨基酸，通常至少約為20個氨基酸，更通常的是至少約為25個氨基酸，典型地至少約為30個氨基酸，優(yōu)選多于35個氨基酸。多肽的同源性一般是用序列分序軟件(例如，威斯康星大學(xué)生物技術(shù)中心的序列分析軟件包，1710，UniversityAvenue，Madison，WI53705)測定的。蛋白分析軟件通過評價與各種置換、缺失、置換和其它修飾的同源程度對相似序列進行配對。保守置換一般包括以下各組范圍內(nèi)的置換甘氨酸，丙氨基；纈氨酸，異亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；賴氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。在本文中，“大體上純的”是指一種已與其天然相伴的成分分離的蛋白或多肽的蛋白。一般，當(dāng)一種樣品中至少60-75％的總蛋白都是感興趣的蛋白時，這種感興趣的蛋白是大體上純的。小的變型或化學(xué)修飾一般具有相同的多肽序列。大體上純的蛋白一般在樣品中含有超過約85-90％的這種蛋白，而且優(yōu)選純度在99％以上一般，純度是在層析柱上、聚丙烯酰胺凝膠上測定的，或通過HPLC分析測定。當(dāng)把一種蛋白與在天然狀態(tài)下和其相伴生的雜質(zhì)分離時，這種蛋白就是大體上無天然伴生成分的蛋白。因此，化學(xué)合成的蛋白或在不同于天然產(chǎn)生這種蛋白的細(xì)胞的細(xì)胞系統(tǒng)中產(chǎn)生的蛋白將是大體上沒有其天然伴生成分的。因此，這一術(shù)語可用于描述在大腸桿菌或其它原核生物中合成的源于真核生物的多肽和核酸。本發(fā)明提供了大體上純的人甲胎蛋白?？梢圆糠值馗鶕?jù)人甲胎蛋白的結(jié)構(gòu)和功能特性設(shè)計出各種從生物材料中分離人甲胎蛋白(AFP)的方法。另外，可以將抗AFP抗體固定在固體基質(zhì)上，以得到一種用于純化人AFP的高度專一的親和性。除了大體上全長的多肽外，本發(fā)明還提供了人甲胎蛋白的有生物活性的重組片段或類似物。例如，有配體結(jié)合或免疫抑制活性的片段。編碼人甲胎蛋白或其理想片段的天然或合成DNA片段將被結(jié)合到DNA結(jié)構(gòu)上，該DNA結(jié)構(gòu)可以導(dǎo)入細(xì)胞培養(yǎng)物中并在其中表達。為導(dǎo)入這種宿主而制備的DNA結(jié)構(gòu)通常包括一個可被宿主細(xì)胞利用的復(fù)制起點，一個編碼人甲胎蛋白的所需部分的DNA片段，可操作地和該甲胎蛋白編碼片段連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始調(diào)節(jié)序列，以及可操作地和甲胎蛋白編碼片段連接的轉(zhuǎn)錄和翻譯終止調(diào)節(jié)序列。該轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)序列通常包括一個可由宿主識別的異源啟動子。合適啟動子的選擇取決于宿主，但在合適條件下可以使用諸如trp、tac和噬菌體啟動子、tRNA啟動子和糖酵解酶啟動子(Sambrook等著，“分子克隆實驗指南”(MolecularCloningLaboratoryManual)，ColdSpringHarborPress，ColdSpringHarbor，NY1989)。在某些場合可能希望包括關(guān)于能夠在宿主細(xì)胞中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的因子的適當(dāng)定位的識別序列(例如，大腸桿菌的lac阻遏物)。可以使用包括復(fù)制系統(tǒng)與轉(zhuǎn)錄和翻譯調(diào)節(jié)序列以及常用于插入編碼待表達基因的DNA片段的市售表達載體。上述各種啟動子、轉(zhuǎn)錄和翻譯序列一般是指“表達控制因子”。也可以將一個編碼全部或部分人AFP的DNA片段整合到宿主細(xì)胞染色體中?？梢杂帽娝苤姆椒▽⒑懈信d趣的DNA片段的載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞中，這些方法因細(xì)胞宿主的類型而異(Sambrook等，同上)?！稗D(zhuǎn)化的細(xì)胞”這一說法的含義也包括轉(zhuǎn)化細(xì)胞的子代?？捎糜诟咚奖磉_重組蛋白的原核宿主包括大腸桿菌、枯草芽孢桿菌(BacillusSubtilis)和假單胞屬的各種菌株。本發(fā)明的方法提供了一種產(chǎn)生大量具有生物活性的人甲胎蛋白的手段。用本發(fā)明方法生產(chǎn)的AFP具有生物活性，盡管事實上這種AFP未被以與天然存在的人AFP相同的方式修飾?！懊庖呒?xì)胞抗增殖”這一說法是指能夠抑制不需要的免疫細(xì)胞(例如，使用本文所披露的分析方法測得的自身反應(yīng)T細(xì)胞)的生長?！澳[瘤”是指任何無生理功能的細(xì)胞的有害生長。一般，腫瘤細(xì)胞是從其正常的細(xì)胞分裂控制中釋出的，即這樣的一種細(xì)胞，其生長不是由細(xì)胞環(huán)境中普通的生化和物理影響調(diào)節(jié)的。在多數(shù)情況下，腫瘤細(xì)胞的增殖會形成細(xì)胞的克隆，這種克隆是良性的或惡性的。腫瘤的例子包括，但不限于轉(zhuǎn)化的和無限增殖化細(xì)胞、腫瘤、和癌，如乳腺細(xì)胞癌和前列腺癌。“治療有效量”這一說法是指能夠抑制腫瘤增殖或能夠抑制自身反應(yīng)免疫細(xì)胞增殖或刺激細(xì)胞(如骨髓細(xì)胞)增殖的非糖基化重組人甲胎蛋白或其抗腫瘤片段或類似物的劑量。“診斷有效量”這一說法是指可以在哺乳動物(如人類患者)的靶部位中可以檢測到的經(jīng)可檢測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白或其經(jīng)可檢測地標(biāo)記的片段或類似物的劑量?！凹?xì)胞刺激”這一說法是指增加細(xì)胞增殖、增加細(xì)胞分裂、促進細(xì)胞分化和/或發(fā)育、或延長細(xì)胞壽命?！肮撬瓒拘砸种啤笔侵敢种乒撬鑴冸x。從以下對本發(fā)明優(yōu)選實施方案的說明和權(quán)利要求書可以了解本發(fā)明的其它特征和優(yōu)點。先說明附圖。附1是編碼人甲胎蛋白的cDVA的核苷酸序列(序列4)和推斷氨基酸序列(序列5)。圖2是rHuAFP片段I(序列11)的10％SDS-PAGE分析(泳道A，分子量標(biāo)記；泳道B，天然人甲胎蛋白(AFP)；泳道C，未純化的rHuAFP；泳道D，rHuAFP片段I；和泳道E，rHuAFP(圖1的氨基酸1-590，序列5))。圖3是表示由大腸桿菌產(chǎn)生的rHuAFP和結(jié)構(gòu)域片段對人“自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(AMLR)的抑制作用的直方圖。圖4表示用聚丙烯酰胺凝膠電泳和柱層析制備的由桿狀病毒和大腸桿菌產(chǎn)生的rHuAFP的純度和生化特征的一系列示圖。圖4A是10％非變性堿性聚丙烯酰胺凝膠，示rHuAFP的純度。小鼠羊水蛋白(運鐵蛋白、AFP和白蛋白)如泳道1所示，天然HuAFP(泳道2)，由桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP(泳道3)，和大腸桿菌產(chǎn)生的rHuAFP(泳道4)。圖4B是10％十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，示用桿狀病毒和大腸桿菌表達系統(tǒng)生產(chǎn)的rHuAFP的純度。分子量標(biāo)記示于泳道1中，天然HuAFP、由桿狀病毒和大腸桿菌產(chǎn)生的rHuAFP分別示于泳道2、3和4中。圖4C是在MonoQ陰離子交換柱上洗脫的天然HuAFP、由桿狀病毒和大腸桿菌產(chǎn)生的rHuAFP的一系列FPLC層析譜。重疊的層析譜表示天然HuAFP(層析譜1)、由桿狀病毒和大腸桿菌產(chǎn)生的rHuAFP(分別為層析譜2和3)。圖4D是通過讓50μg天然HuAFP和rHuAFP從反向DeltaPakC18柱(Waters)中通過，并用在0.1％“三氟乙酸”(TFA)中配制的0-100％乙腈梯度洗脫而獲得的一系列HPLC層析譜。重疊的層析譜表示天然HuAFP(層析譜1)和由桿狀病毒與大腸桿菌產(chǎn)生的rHuAFP(分別為層析譜2和3)。圖5是一直方圖，其表示由用桿狀病毒和大腸桿菌表達系統(tǒng)產(chǎn)生的rHuAFP產(chǎn)生的抗天然HuAFP抗體阻止AMLR的免疫抑制。由用桿狀病毒和大腸桿菌表達系統(tǒng)產(chǎn)生的rHuAFP產(chǎn)生的免疫抑制是顯著的(P＞0.002)，而由單克隆抗天然HuAFP(aAFP)抗體產(chǎn)生的、由rHuAFP介導(dǎo)的AMLR的免疫抑制也是顯著的(P＜0.03)。AMLR培養(yǎng)是在有或沒有蛋白的條件下建立的，其含有2×105個效應(yīng)T細(xì)胞，2.5×105個輻射過的自身非T細(xì)胞，在144小時時收獲，并根據(jù)摻入自身反應(yīng)T細(xì)胞中的3H-胸苷是測定其自身增殖。rHuAFP的自身增殖抑制作用是這樣進行的以1/8(125μg/ml)的稀釋倍數(shù)將鼠抗人AFP單克隆抗體加入AMLR培養(yǎng)物中，AMLR能被100mg/ml由桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP(影線條)和100μg/ml由大腸桿菌產(chǎn)生的rHuAFP(空白條)抑制。對照培養(yǎng)物由有1/8倍抗人AFP(aAFP)單克隆抗體存在的AMLR組成。圖6是一系列直方圖(圖6A和6B)，表示用人AMLR(圖6A)和“外周血淋巴細(xì)胞”(PBL)(圖6B)進行試驗時由rHuAFP介導(dǎo)的免疫抑制效果。圖6A表示通過對250,000個T細(xì)胞和等量自身輻射(autologousirradiated)的非T淋巴細(xì)胞進行其培養(yǎng)制備的自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(AMLR)結(jié)果。源于大腸桿菌和桿狀病毒表達的系統(tǒng)的重組HuAFP制劑和白蛋白在培養(yǎng)開始時均以100μg/ml的濃度加入。在144小時時通過3H-胸苷摻入量測定增殖效應(yīng)。圖6B表示用1μg/ml伴刀豆凝集素A(ConA)刺激的PBLs(2×105)的結(jié)果，將其在僅補充有2mg/ml白蛋白的RPMI培養(yǎng)基中培養(yǎng)48小時。以100μg/ml的濃度加入白蛋白和源于大腸桿菌和桿狀病毒的rHuAFP，開始培養(yǎng)。根據(jù)DNA合成過程中3H-胸苷的摻入量測定增殖效果。測得SEM低于平均值的5％。圖7是pVT-PlacZ的質(zhì)粒圖。圖8是系列圖，表示rHuAFP對T細(xì)胞活化的動力學(xué)的抑制效果(圖8A)，和rHuAFP對自身增殖的T細(xì)胞的劑量-效應(yīng)關(guān)系。圖8A是表示在沒有rHuAFP()和有100μg/ml()rHuAFP存在的條件下將細(xì)胞培養(yǎng)4天以上時間的增殖效應(yīng)的圖。(°)表示單獨培養(yǎng)的效應(yīng)細(xì)胞群的背景增殖。在上述時間內(nèi)，由重組HuAFP-介導(dǎo)的對AMLR的抑制作用是顯著的(P＜0.01)。圖8B是表示在144小時時用量為6-100μg/ml()的rHuAFP對自身增殖的T細(xì)胞的抑制作用。()表示在無蛋白的條件下反應(yīng)的對照效應(yīng)。用量在12.5-100μg/ml范圍內(nèi)的rHuAFP對自身反應(yīng)T細(xì)胞的抑制作用是顯著的(P＜0.005)。圖9是表示rHuAFP對雌激素刺激的MCF-7乳腺癌細(xì)胞鋪滿后生長的影響的直方圖。圖10是表示在有或沒有400μg/mlrHuAFP和5μg/ml運鐵蛋白的存在條件下鼠骨髓在無血清RPMI培養(yǎng)基中的增殖。重組人甲胎蛋白的表達CDNA文庫的構(gòu)建用由自4.5月齡人類流產(chǎn)胎兒的肝細(xì)胞(～3g濕重)中分離的poly(A)+RNA制備的大小分級cDNA(0.5-3kg)構(gòu)建cDNA文庫。(另外，可以從ClontechLaboratory，Inc.獲得胎兒cDNA文庫，PaloAlto，CA.)。用硫氰酸胍法(Chirgwin等，“生物化學(xué)”(Biochemistry)185294，1979)制備總RNA，并通過oligo(dT)-纖維素層析(CollaborativeResearch，Bedford，MA)[“現(xiàn)代分子生物學(xué)方案”(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，Ausubel等，著，WileyInterscience，NewYork1989]篩選mRNA。利用LibrarianIIcDNA合成試劑盒(Invitrogen，SanDiego，(A)合成cDNA并在1％瓊脂糖凝膠上進行分級分離。提取0.5-3kb的片段，并將其和載體pTZ18-RB(Invitrogen)連接，然后用其轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DHlαF(Invitrogen))。用Colony/PlaqueScreen濾膜(DuPont，Wilmington，DE)進行菌落起模(colonylifts)，在含有0.5MNaOH、1.5MNaCl的溶液中培養(yǎng)10分鐘對轉(zhuǎn)移的細(xì)菌菌落進行裂解和變性。在含有1.5MNaCl、0.50MTris-HCl(pH7.6)的溶液中洗滌濾膜5分鐘，然后風(fēng)干。然后在氯仿中將濾膜洗滌5次，在0.3MNaCl中浸泡以除去細(xì)胞屑，然后風(fēng)干。通過在80°下在真空條件下焙烤2小時將DNA固定在硝酸纖維素膜上。將焙烤過的濾膜放在含有6×SSC(1×SSC＝150mMNaCl、15mM檸檬酸鈉[pH7.0])、1×Denhardt′s溶液(0.2g/l聚乙烯吡咯烷酮、0.2g/l“牛血清白蛋白”(BSA)、0.2g/lFicoll400)、0.05％焦磷酸鈉、0.5％SDS、和100μg/ml大腸桿菌DNA的溶液中，在37℃下預(yù)雜交3小時。在37℃下在同一溶液中雜交18-24小時，雜交溶液中無SDS，含有1-2×106cpm/ml通過5′-端磷酸化“[現(xiàn)代分子生物學(xué)方案”(CurrentProtocolsinMolecularBiology)，同上]用32P標(biāo)記的兩種寡核苷酸。用于檢測所述文庫的寡核苷酸的序列為5′-TGTCTGCAGGATGGGGAAAAA-3′(序列1)和5′-CATGAAATGACTCCAGTA-3′(序列2)，分別相應(yīng)于人AFP編碼序列的772-792位和1405-1422位。在37℃下用6×SSC、0.05％焦磷酸鈉將濾膜洗兩次，30分鐘，然后在48℃下在同一溶液中洗一次，30分鐘。在有DuPontCronexLightningPlus增感屏存在的條件下用干燥的濾膜對KodakXAR膠片進行曝光24-48小時，以鑒定陽性克隆。分離、擴增陽性克隆，并進行Southern印跡分析[“現(xiàn)代分子生物學(xué)方案”(CurrentProtocolsinMolecuarBiology)，同上]。簡單地講，用合適的限制酶水解純化的DNA，并在1％瓊脂糖凝膠上分離所得到的片段。然后將DNA轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。雜交條件如上所述，所不同的是，除上述兩種探針外，還使用第三種32P標(biāo)記的寡核苷酸(5′-CATAGAAATGAATATGGA-3′(序列3)，表示人AFP編碼片段的7-24位)。在所篩選的3,000個菌落中鑒定出5個陽性克隆。其中的一個克隆pLHuAFP被用于以下所述的構(gòu)建。構(gòu)建全長人AFPcDNA用以下5個DNA片段制備一種含有翻譯起始密碼子、其后為人AFP編碼序列和翻譯終止密碼子的結(jié)構(gòu)。片段1將兩種非磷酸化寡核苷酸退火，以形成一種雙鏈DNA分子，其組成為一個5′-端粘性EcoRI識別位點，隨后是一個ATG起始密碼子，和人AFPcDNA的前60個堿基對(bp)。而且包括位于該編碼序列的第60位上的PstI限制位點(在這種方案中，核苷酸1是成熟蛋白的第一個密碼子(Thr)的第一個核苷酸，相當(dāng)于Morinaga等的核苷酸102，同上)。將該片段同用EcoRI和PstI線性化的pUC119(具有M13的從5465位的HgiAI至5941位的AhaII的基因間區(qū)的pUC19，該基因間區(qū)被插在pUC19的NdeI位點)連接。所得到的DNA在大腸桿菌NM522(Pharmacia，Piscataway，NJ)中擴增。以如下方法回收EcoRI-PstI插入片段酶促消化重組質(zhì)粒，然后在5％聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳分離，再自凝膠中提取。片段2通過用PstI和NsiI消化pLHuAFP和上述凝膠純化獲得一個97bp的人AFPcDNA片段(57-153)。該克隆含有人AFP的完整的編碼片段及5′和3′非翻譯序列。片段3通過用NsiI和AlwNl消化pLHuAFP和上述純化獲得一個224bp的人AFPcDNA片段(150-373位)。片段4通過用AlwNI和StyI消化pLHuAFP和上述純化獲得一個1322bp的人AFPcDNA片段(371-1692位)。片段5將兩個非磷酸化的寡核苷酸退火，形成86bp的雙鏈DNA，其含有從StyI位點的1693位至1773位終止AFP編碼片段的TAA終止密碼子的人AFP序列，其后面為一個粘性BamHI位點。無需任何進一步的操作即可使用這種合成的DNA。用EcoRI和BamHI徹底水解pBlueScript(StrataGene，LaJolla，CA)，并將其加入含有上述5種純化片段的連接混合物中。對照連接混合物中僅含有線性化的pBluescript。將上述兩種連接混合物的一部分用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH52(GIBCO/BRL，GrandIsland，NY)。從幾種轉(zhuǎn)化體中分離重組質(zhì)粒，通過深入的限制性酶分析和DNA測序進行篩選。篩選出一種重組質(zhì)粒并命名為pHuAFP。隨后將其用來將人AFP基因插入幾種表達載體中。pHuAFP包括一個獨特的EcoRI-BamHI片段，該片段不僅包括5′-末端的ATG起始密碼子和3′-末端的TAA終止密碼子，而且還含有人AFP的完整的編碼序列。AFP表達載體在3種不同的表達系統(tǒng)中成功實現(xiàn)了在大腸桿菌里的高水平合成人AFP。TRP系統(tǒng)能進行直接表達。R×1系統(tǒng)能產(chǎn)生一種融合蛋白，其含有20個由trpE和載體序列編碼的氨基酸。MAL系統(tǒng)表達與malE基因產(chǎn)物-一種42kd的芽糖結(jié)合蛋白融合的AFP。TRP表達系統(tǒng)將pHuAFP的1186bpEcoRI-BamHIAFP編碼片段克隆到表達載體pTrP4(Olsen等，“生物技術(shù)雜志”(J.Biotechnol.)g179，1989)上，克隆位于trp啟動子和一個修飾過的核糖體結(jié)合位點的下游。簡單地講，用EcoRI和BamHI消化pHuAFP，并用Klenow聚合酶將末端補平。然后對1186bp的AFP片段進行凝膠純化。用ClaI消化pTrp4，用Klenow聚合酶將其末端補平，并對線性化的載體進行凝膠純化。連接1186bp的AFP片段和pTrp4主鏈，并將其用于轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，即以下菌株DH5α，BL21(F.W.Studier，BrookhavercNationalLaboratory，Upton，NY)、SG927(美國模式培養(yǎng)物保藏所，Rockville，MD保藏號39627)、SG928(ATCC，保藏號39628)和SG935(ATCC，保藏號39623)。R×1表達系統(tǒng)將人AFPcDNA克隆到表達載體pR×1[Rimm等，“基因”(Gene)，75323，1989]上接近trp啟動子的位置，其位于TrpE翻譯框中。通過用EcoRI和BamHI消化將人AFPcDNA從pHuAFP上切除，并克隆到經(jīng)適當(dāng)處理的pR×I(BioRadLaboratories，Hercules，CA)上。然后用最終得到的被稱為pR×1/HuAFP的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化上述大腸桿菌菌株和CAG456(D.W.Cleveland，JohnsHepkinsUniversity，Baltimore，MD)。MAL表達系統(tǒng)將AFPcDNA插入表達載體pMAL(NewEnglandBiolabs，Inc.，Beverly，MA)中，將其置于tac啟動子的控制之下，并位于MalE翻譯框中。簡單地講，用BamHI水解pHuAFP，并用Klenow聚合酶將末端補平。通過EcoRI消化將人AFPcDNA質(zhì)粒DNA的其余部分釋出，然后進行凝膠純化。將純化的法段連接到適當(dāng)消化過的pMAL-C上。將正確取向的重組質(zhì)粒-其名稱為pMAL/HuAFP用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH52、TBI(NewEnglandBiolabs)和SG935。對用于構(gòu)建上述3種表達系統(tǒng)中的AFP編碼片段進行測序，發(fā)現(xiàn)其編碼完整長度的AFP。在大腸桿菌中表達AFP在30℃或37℃、通氣條件下對細(xì)菌培養(yǎng)物進行培養(yǎng)。使過夜的大腸桿菌培養(yǎng)物在補充了適當(dāng)?shù)乃杩股?四環(huán)素-HCl50μg/ml，氨芐青霉素-Na100μg/ml)和LB培養(yǎng)基中生長。TRP和R×1表達系統(tǒng)在色氨酸饑餓條件下誘導(dǎo)trp啟動子。誘導(dǎo)是在按如下方法制備的MgCA培養(yǎng)基中執(zhí)行將1g酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratory，Detroit，MI)，6gNa2HPO4，3gKH2PO4，0.5gNaCl，1gNH4Cl加入1升Milli-Q水(Millipore公司，Bedford，MA)中，將pH調(diào)至7.4，并對該溶液進行高壓滅菌。使冷卻的培養(yǎng)基中含有2mMMgSO4、0.1mMCaCl2、和0.2％葡萄糖。將在補充了抗生素的MgCA中培養(yǎng)過夜的培養(yǎng)物稀釋100倍，然后在30℃下使細(xì)胞生長至A550為0.4，離心收獲，并在-20℃下以沉淀形式保存。MAL表達系統(tǒng)用義務(wù)誘導(dǎo)物異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)tac啟動子。用補充了抗生素的LB培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)物稀釋100倍，并使細(xì)胞在37℃下生長至A550為0.4。然后將IPTG加至終濃度為0.3mM，并將細(xì)菌再培養(yǎng)2小時。通過離心收獲細(xì)胞，并于-20℃下保存沉淀。檢測AFP在大腸桿菌中的表達進行分析研究以測定重組AFP的表達和行為。或者將細(xì)胞沉淀懸浮于SDS-裂解溶液(0.16MTris-HCl[pH6.8])、4％W/VSDS、0.2m二硫蘇糖醇(DTT)、20％甘油、0.02溴酚藍(lán))中，煮沸5分鐘，并用于SDS-PAGE分析；或者將細(xì)胞沉淀懸浮于由10mMNa2HPO4、30mMNaCl，0.25％Tween20、10mMEDTA、10mM乙二醇雙(乙-氨基乙醚)四乙酸(EGTA)組成的裂解緩沖液中，在4℃下與1mg/ml溶菌酶一起培養(yǎng)30分鐘，然后以50％的功率用脈沖方式進行聲處理3×1分鐘(“聲能學(xué)及器材”(SonicsandMaterials)，Danbury，CTmodelVC300Sonifier)。在10,000g下將裂解液離心20分鐘，將含有可溶性蛋白的上清液傾入另一支試管中，并在-20℃下冰凍待用。將含有不溶性蛋白的沉淀重新懸浮于SDS-裂解緩沖液中，煮沸5分鐘，并在-20℃下保存等用。對釋放在SDS-裂解緩沖液中的總蛋白以及可溶性和沉淀級分進行SDS-PAGE分析和Western吸印轉(zhuǎn)移后的免疫檢測。在以上研究中，用圖像測密計(BioRad，Mode1620)對考馬斯藍(lán)染色的凝膠進行常規(guī)掃描。由此可以對所產(chǎn)生的重組AFP量進行定量測定，以占細(xì)胞總蛋白的百分比形式表示。在TRP系統(tǒng)中表達的AFP的純化除非另有說明，所有操作均在4℃下進行。將每份自1升培養(yǎng)物獲得冰凍細(xì)胞沉淀重新懸浮于25ml裂解緩沖液A[50mMTris-HCl[pH7.5]]、20％蔗糖、100μg/ml“苯甲基磺酰氟”(PMSF)]中，并溫育10分鐘。加入EDTA至終濃度為35mM，并將提取物再放置10分鐘。加入25ml(裂解緩沖液B(50mMTris-HCl[pH7.5])，2.5mMEDTA，0.2％TritonX-100)后將裂解緩沖液再溫育30分鐘。于12,000g離心細(xì)胞裂解液20分鐘，并用50ml洗滌緩沖液(50mMTris-HCl[pH8.0]、10mMEDTA、0.2％TritonX-100)將含有重組AFP的沉淀洗滌2次，每次洗滌后都進行上述離心。將沉淀溶解在50ml變性緩沖液(0.1MK2HPO4[pH8.5])、6M鹽酸胍、0.1M2-巰基乙醇)中，聲處理，然后在一臺Nutator(ClayAdams)上混合4小時。用含有50mMTris-HCl、100mMNaCl、1mMEDTA的溶液將溶解的提取物稀釋50倍，并使重組AFP蛋白復(fù)性24小時。這一50倍稀釋步驟是很重要的，因為在稀釋之前AFP似乎有微聚積。經(jīng)過稀釋和再濃縮后，AFP不再聚積。用Amicon過濾裝置在YM10膜上將上述溶液濃縮100倍，并通過Millex0.22μm膜濾器(Millipore)澄清。在室溫下用在20mMTris-HCl(pH8.0)中平衡的MonoQ柱(Pharmacia)上進一步純化AFP，用線性梯度0-100％1MNaCl，20mMTris-HCl(pH8.0)洗脫結(jié)合的蛋白。通過SDS-PAGE、堿性PAGE(APAGE)和Westem印跡分析洗脫級分。上述多肽表達和純化的一般方法也可用于產(chǎn)生和分離有用的人甲胎蛋白或類似物(如下文所述)。聚丙烯酰胺凝膠電泳和Western免疫檢測方法按照Hames等的方法(“蛋白質(zhì)凝膠電泳一種實用方法”(GelElectrophoresisofProteinsAPracticalApproach)，IRLPress，London，1981)，使用mini-Protean電泳裝置(BioRad)在不連續(xù)的緩沖系統(tǒng)中進行SDS-PAGE和堿性PAGE。在SDS-PAGE或APAGE之后通過將凝膠浸泡在轉(zhuǎn)移緩沖液(12.5mMTris-HCl，96mM甘氨酸、20％甲醇[pH8.2])中15分鐘，對重組人AFP進行免疫檢測。然后在每塊凝膠上覆蓋一張Immobilon聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)，并將其夾在mini-Protean轉(zhuǎn)移裝置(BioRad)的兩個電極載網(wǎng)之間，使凝膠接近陰極。將該系統(tǒng)浸入轉(zhuǎn)移緩沖液中，施加150mA的電流，作用2小時。在含有20mMTris-HCl(pH7.5)、500mMNaCl、3％明膠的溶液中封閉ImmobilonPVDF膜上未反應(yīng)的位點1小時。分別將同堿性磷酸酶(BioRad)綴合的兔抗人AFP抗血清和羊抗兔抗體用作一級和二級抗體。用5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽和P-氮藍(lán)四唑(BioRad)檢測堿性磷酸酶活性。AFP表達的定量用人AFP“酶聯(lián)免疫吸附測定”(ELISA)試劑盒(AbbortLaboratories，Chicago，IL)，對重組人AFP進行定量。通過掃描銀染凝膠測定AFP產(chǎn)量。當(dāng)用采用了“色氨酸”(Trp)表達系統(tǒng)的編碼AFP的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化SG935細(xì)胞時，AFP占大腸桿菌細(xì)胞總蛋白的2-5％(每升培養(yǎng)物中約含3-7mgAFP)。如上所述，初級提取物中的大部分AFP是不可溶的。上述再溶解過程可以回收50-60％穩(wěn)定、半純化、單體形式的AFP(每201大腸桿菌大約可得50mg)。可對上述產(chǎn)物進行進一步純化，以得到25mg的純化單體AFP。N-末端分析用一臺Porton蛋白/肽氣相微量測序儀進行自動Edman降解，用一臺定做的一體化的微孔HPLC優(yōu)化序列。用PC/Gene軟件包(Intelligenetics)里的選擇程序輔助蛋白質(zhì)序列分析。用一種桿狀病毒表達系統(tǒng)進行HuAFP的克隆、表達和純化按照本領(lǐng)域公知的標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，參見美國專利No.4,745,051)構(gòu)建表達HuAFP(或其片段或類似物)的重組桿狀病毒。這種方法一般包括兩個步驟。首先將待表達的基因，例如rHuAFP或其片段或類似物(見下文)克隆到一個質(zhì)粒轉(zhuǎn)移載體上，使其位于桿狀病毒啟動子的下游，桿狀病毒啟動子的側(cè)翼為源于非必須位點的桿狀病毒DNA，例如多角體蛋白基因。然后將該質(zhì)粒隨環(huán)狀野生型基因組DNA一起導(dǎo)入昆蟲細(xì)胞，使發(fā)生同源重組。隨后篩選重組的子代，例如，用順序噬斑分析從非重組型親代菌株中純化重組病毒。為了獲得足夠的用于蛋白表達的病毒，通常必須進行病毒擴增。對重組病毒進行噬斑純化，并用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法證實其DNA結(jié)構(gòu)。用EcoRI/BamHI從質(zhì)粒PIl8中分離rHuAFP的cDNA片段，并利用下文所述的Geneclean進行純化。HuAFPcDNA在桿狀病毒中的克隆和表達是用質(zhì)粒pVT-PlacZ進行的。將人AFPcDNA克隆到質(zhì)粒pVT-PlacZ(圖7)上，位于其3′-端為昆蟲產(chǎn)生的蜂毒肽信號肽序列的讀框中。對桿狀病毒載體pVT-PlacZ的修飾是通過用寡核苷酸5′-GATCTAGAATTCGGATCCGGT-3′(序列21)及其互補片段替代其多克隆位點，包括沿5′和3′方向的EcoRI和BamHI限制位點，所述修飾還包括減少位于蜂毒肽信號肽裂解位點和在EcoRI內(nèi)切核酸酶序列上插入AFPcDNA位點之間的非AFP編碼核苷酸的數(shù)目。然后將所述插入片段連接到修飾過的pVT-PlacZ載體的EcoRI和BamHIDNA序列上。按照標(biāo)準(zhǔn)方法制備含有rHuAFP編碼序列的重組桿狀病毒。通過用pVT-PlacZ轉(zhuǎn)移載體和野生型桿狀病毒進行共轉(zhuǎn)染，并接著進行兩輪噬斑純化制備含有HuAFP編碼序列的純化重組桿狀病毒。將Sf9昆蟲細(xì)胞以1×106細(xì)胞/ml的密度接種在盛于500ml體積的轉(zhuǎn)動燒瓶中的無血清Grace培養(yǎng)基中，用重組桿狀病毒進行感染，感染復(fù)數(shù)為5。通過在200×g下離心收獲含有所分泌的rHuAFP的上清液，并除去細(xì)胞。通過用YM30Amicon膜超濾將含有rHuAFP的培養(yǎng)基濃縮10-20倍，用PBS透析過夜，然后加注到ConA凝集素柱(Pharmacia)上。用0.4M的甲基α-D吡喃甘露糖苷洗脫結(jié)合的rHuAFP，并通過在用20mM磷酸緩沖液，pH8.0配制的1MNaCl的0-100％線性梯度期間從MonoQ柱上洗脫來純化。用本領(lǐng)域公知的方法鑒定重組HuAFP。本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，由桿狀病毒所產(chǎn)生的rHuAFP約占由Sf9昆蟲細(xì)胞分泌到無血清培養(yǎng)基中的總蛋白量的20％。通過非還原性堿性PAGE發(fā)現(xiàn)，這種AFP也是單體。大部分由桿狀病毒產(chǎn)生的HuAFP結(jié)合于固定化ConA上。這樣一來，可以有效除去90％以上的混雜蛋白，這些蛋白不能結(jié)合在凝集素粒上。用270-310mMNaCl從MonoQ珠上洗脫蛋白，對由桿狀病毒產(chǎn)生的rAFP制劑進行最終的純化，得到一種單一的肽，其表現(xiàn)分子量約為68KD。我們從每升生長培養(yǎng)物中至少可獲得1mg純化蛋白。由桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP的分子量類似于天然人體分子的分子量(圖4B)。上述發(fā)現(xiàn)，以及桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP的結(jié)合到ConA柱上和所觀察到的由大腸桿菌產(chǎn)生的rHuAFP不結(jié)合到ConA柱上表明，由桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP是糖基化的。不過，預(yù)計由桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP(BrAFP)的糖基化程度低于天然分子的糖基化程度，因為已有文獻記載被重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞缺乏進行復(fù)雜的糖基化的能力，而這種糖基化卻常見于高等真換生物產(chǎn)生的蛋白。在APAGE和SDS-PAGE(圖4A和4B)上的單一帶，以及分別示于圖4C和4D中的FPLC和HPLC層析譜上的單一峰證實了所分離的由桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP的純度。N-末端測序進一步證實了純化rHuAFP的身份。所述rHuAFP的N-末端序列為Asp-Leu-Gly-Phe-Met-Thr-Leu-His-Arg-Asn(序列22)。對來自由重組桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞的無血清上清液進行Western印跡分析，檢測到一條單一的和非特異性抗-HuAFPAb的免疫反應(yīng)帶，而在未感染的或由野生型病毒感染的Sf9細(xì)胞中缺乏這條帶。用本領(lǐng)域已知方法進行實驗，以測定由HuAFP所產(chǎn)生的桿狀病毒的生物學(xué)活性。例如，100μg/ml由桿狀病毒產(chǎn)生的HuAFP的免疫抑制活性是根據(jù)其抑制上述人AMLR的能力測定的。如圖5和6A所示，由桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP能在144小時時抑制由自身非T細(xì)胞刺激所產(chǎn)生的自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)。而加入等量的人血清白蛋白不能減弱淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)。為了證實rHuAFP是決定抑制自身增殖的T細(xì)胞的底物，用市售鼠抗人AFP單克隆抗體(MAb)阻止由rHuAFP介導(dǎo)的AMLR的抑制作用。如圖5所示，抗HuAFP能徹底阻止由100μg/ml大腸桿菌和桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP對增殖的自身反應(yīng)T細(xì)胞的抑制作用。而加入100μg/mlHSA不能減弱AMLR效應(yīng)，而在反應(yīng)培養(yǎng)物中僅有MAb存在無任何作用。另外，我們試驗了在僅補充2mg/ml純化人白蛋白(ICN，Mississanga，ON)的RPMI組織培養(yǎng)基中rHuAFP抑制由絲裂原誘導(dǎo)的外周血淋巴細(xì)胞(PBL)增殖的生物學(xué)活性。如表II(下文)和圖6B所示，100μg/mlrHuAFP能抑制ConA刺激的PBLs，而相同濃度的白蛋白不起作用。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法，用如本文所披露的任何方法能由上述桿狀病毒表達系統(tǒng)產(chǎn)生其它rHuAFP[例如，rHuAFP(氨基酸1(THr)-590(Val)；序列5)；結(jié)構(gòu)域I(氨基酸1(THr)-197(Ser)；序列6)；結(jié)構(gòu)域II(氨基酸198(Ser)-389(Ser)；序列7)；結(jié)構(gòu)域III(氨基酸390(Gln)-590(Val)；序列8)；結(jié)構(gòu)域I+II(氨基酸1(THr)-389(Ser)；序列9)；結(jié)構(gòu)域II+[II，(氨基酸198(Ser)-590(Val)；序列11)]。在一個實施例中，載體pVT-PlacZ/HuAFP(氨基酸1-590)是通過將編碼HuAFP的cDNA插入pVT-P10中而構(gòu)建成的，pVT-P10是構(gòu)建pVT-PLacZ的中間載體[Richardson等，(1992)“用桿狀病毒表達系統(tǒng)設(shè)計分泌的糖蛋白”(EngineeringGlycoproteinsforSecretionusingthebaculovirusexpressionSystem)。見“桿狀病毒和產(chǎn)生重組蛋白的方法”(BaculovirusandRecombinantProteinProductionProcesses)，J.M.Viak，E-J.Schlaeger和A.R.Bernard，EditionesRoche著，Basel，Switzerland，PP.67-73]。用BamHI消化pVT-P10載體，接著再與綠豆核酸酶(NewEnglandBiolabs，Mississ-auga，Ont.)一起溫育。然后在平端BamHI位點下游用EcoRI對該載體做進一步水解，以利于HuAFPcDNA的直接克隆。編碼氨基酸1-590的rHuAFPcDNA是通過PCR擴增獲得的，擴增時采用了以下寡核苷酸引物(5′-AAAAAACTCGAGATACACTGCATAGAAATGAA-3′；序列23)，其含有一個Xhol位點(5′-AAAAAAGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGCACG-3′；序列24)并含有一個EcoRI位點，而且作為模板DNA的質(zhì)粒p118含有HuAFP的編碼片段。所述PCR反應(yīng)按標(biāo)準(zhǔn)方法進行，例如，在含有34μLH2O，10μL10×反應(yīng)緩沖液，20μLdNTP，2μlDNA模板，10μL10pmol/μL5′引物，10μL10pmol/μL3′引物，1μL甘油，10μL二甲基亞砜(DMSO)和1μLPfu聚合酶的反應(yīng)混合物中進行。退火、延伸和變性溫度也是按照標(biāo)準(zhǔn)條件，例如分別在50℃、72℃和94℃下進行，用GeneAmpPCR系統(tǒng)9600(PerKingElmerCetus)進行30次循環(huán)。用Genaclean試劑盒(BioIIInc.，LaJolla，CA)純化來自PCR反應(yīng)的DNA。rHuAFP片段先用Xhol消化，接著再用綠豆核酸酶處理。接著用EcoRI消化HuAFPcDNA，以利于將其直接克隆到pVT-P10上。將PCR產(chǎn)生的rHuAFPcDNA連接到平端5′BamHI位點和3′EcoRI位點上。通過用限制性酶BamHI消化從載體pJVNheI[Vialard等，(1990)“用新的具有α-半乳糖苷酶基因的桿狀病毒載體合成麻疹病毒的膜融和血凝素蛋白”(SynthesisofthemembranefusionandhemagglutininproteinsofMeasles(Virus，usinganovelbaculovirusvectorcontainingtheβ-galactosidasegene)，“病毒學(xué)雜志”(J.Virology)6437-50]中分離的在其3′末端含有源于SV40的聚腺苷酸位點的β-半乳糖苷基團，再將其插入相容的BgIII，產(chǎn)生最終的結(jié)構(gòu)pVT-PLacZ/HuAFP(含有氨基酸1-590)。然后將該結(jié)構(gòu)用于表達rHuAFP(1-590)。片段和類似物本發(fā)明包括有生物學(xué)活性的rHuAFP片段。具有生物學(xué)活性的rHuAFP的片段具有下列活性中的至少一種(a)指導(dǎo)與一種靶細(xì)胞的特異性相互作用，例如，與表達一種可由rHuAFP識別的受體的細(xì)胞結(jié)合(例如，諸如MCF-7的癌細(xì)胞或骨髓細(xì)胞膜)；(b)終止、減弱或抑制腫瘤或自身反應(yīng)免疫細(xì)胞的生長(例如，與細(xì)胞表面受體結(jié)合并產(chǎn)生一種抗增殖信號)；刺激、提高、擴展或以其它方式影響諸如骨髓細(xì)胞的細(xì)胞增殖(例如，在細(xì)胞表面受體上結(jié)合一個增殖或刺激信號)；或阻止或抑制或防止免疫病理學(xué)抗體反應(yīng)?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知的任何標(biāo)準(zhǔn)結(jié)合試驗測定rHuAFP片段或類似物結(jié)合可由rHuAFP識別的受體的能力。用本領(lǐng)域公知方法(如在本文中披露的方法)測定這種片段和類似物的生物學(xué)活性。一般，rHuAFP片段是用上述多肽表達和純化技術(shù)產(chǎn)生的。例如，可以通過用結(jié)合在合適表達載體上的編碼HuAFP的cDNA片段的一部分(如上述cDNA)轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)菌細(xì)胞來產(chǎn)生合適的rHuAFP片段。另外，可以用標(biāo)準(zhǔn)的PCR技術(shù)產(chǎn)生上述片段并克隆到表達載體(同上)上。也可以用化學(xué)合成法產(chǎn)生片段(例如，用披露于“固相肽合成”(SolidPhasePeptideSyn-thesis)，第二版，1984中的方法，ThePierceChemicalCo.，Rockford，I1)。因此，一旦rHuAFP片段被表達，可以用各種本領(lǐng)域公知的層析和/或免疫方法進行分離。在進行親合層析之前，可以用標(biāo)準(zhǔn)方法裂解含有rHuAFP的細(xì)胞并進行分級分離。用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢測候選rHuAFP片段表現(xiàn)出甲胎蛋白生物活性的能力(例如，用本文所披露的方法)。如上文所述，rHuAFP片段也可以融合蛋白形式表達，以與麥芽糖結(jié)合蛋白融合形式在大腸桿菌中產(chǎn)生。采用麥芽糖結(jié)合蛋白融合和純化系統(tǒng)(NewEnglandBiolabs，Beverly，MA)，可將克隆的人cDNA序列插在編碼麥芽糖結(jié)合蛋白(malE)基因的下游，并位于該基因的讀框中，然后就可以超量表達malE融合蛋白。當(dāng)所述人cDNA序列上缺乏常見的限制位點時，可以用PCR方法在該cDNA片段的5′和3′末端引入適應(yīng)載體的限制位點，以便于將cDNA片段插入該載體中。在融合蛋白表達之后，可以通過親合層析進行純化。例如，可以利用融合蛋白的麥芽糖結(jié)合蛋白部分與固定在柱上的直鏈淀粉結(jié)合的能力純化該融合蛋白。為了方便蛋白純化，質(zhì)粒pMalE在cDNA插入該載體的位點的上游含有一個Xa因子裂解位點。因此，隨后可以用Xa因子裂解上述純化的融合蛋白，將麥芽糖結(jié)合蛋白同人重組cDNA基因產(chǎn)物分離?？梢詫υ摿呀猱a(chǎn)物進行進一步層析，以使從麥芽糖結(jié)合蛋白中純化rHuAFP。另外，可以融合蛋白形式表達rHuAFP片段，所生產(chǎn)的融合蛋白含有聚組氨酸片段。然后，可以通過聚組氨到片段與一種親和柱的結(jié)合來分離這種甲胎蛋白融合蛋白，所述親和柱具有能以高親和力結(jié)合聚組氨酸片段的鎳部分。可以通過改變親和柱里的pH洗脫該融合蛋白。通過用特殊蛋白酶裂解該融合蛋白，可以將rHuAFP從存在于所得到的融合蛋白的聚組氨酸序列上釋放下來?？梢杂妹庖邔W(xué)方法測定重組HuAFP片段表達產(chǎn)物(例如，由上述任何原核系統(tǒng)所產(chǎn)生)，如重組細(xì)胞提取物的Western印跡、免疫沉淀分析，或免疫熒光(例如，用Ausubel等所披露的方法，“現(xiàn)代分子生物學(xué)方案”(CurrentProtocolsInMolecularBiology)，GreenePublishingAssociatesandWileyInterscience(JhonWiley&Sons)，NewYork，1994)。如果需要，可以用眾所周知的方法(見Coligan等著，“現(xiàn)代免疫學(xué)方案”(CurrentProtocolsinImmunology)1992，GreenePublishingAssociatesandWiley-Interscience)將純化的基因產(chǎn)物或其片段用于制備抗人重組甲胎蛋白的多克隆抗體或單克隆抗體。為了制備單克隆抗體，可以用重組蛋白免疫接種小鼠，分離能分泌抗體的B細(xì)胞，并用非分泌性骨髓瘤細(xì)胞融合供體進行無限增殖化。然后篩選用于產(chǎn)生重組人甲胎蛋白(或其片段或類似物)特異性抗體的雜交瘤，并進行克隆，以獲得能產(chǎn)生單克隆抗體的均勻細(xì)胞群。如在本文中所用到的，“片段”一詞在用于表示rHuAFP多肽時，優(yōu)選其至少有20個連續(xù)的氨基酸，優(yōu)選至少有50個連續(xù)的氨基酸，更優(yōu)選有至少約100個連續(xù)的氨基酸，最優(yōu)選至少有約200-400或更多連續(xù)的氨基酸?？梢杂帽绢I(lǐng)域技術(shù)人員所知的方法制備rHuAFP片段，例如，通過蛋白分解裂解或重組肽的表達來制備，或由普通蛋白加工(例如，從新生多肽上除去與生物學(xué)活性無關(guān)的氨基酸)來制備。感興趣的重組HuAFP片段包括，但不限于結(jié)構(gòu)域I(氨基酸1(Thr)-197(Ser)，參見圖1，序列6)；結(jié)構(gòu)域II(氨基酸198(Ser)-389(Ser)，參見圖1，序列7)，結(jié)構(gòu)域III(氨基酸390(Gln)-590(Val)，參見圖1，序列)；結(jié)構(gòu)域I+II(氨基酸1(Thr)-389(Ser)；參見圖1，序列9)；結(jié)構(gòu)域II+III(氨基酸198(Ser)-590(Val)，參見圖1，序列10)，和rHuAFP片段I(氨基酸266(Met)-590(Val)，參見圖1，序列11)。用實驗方法測定片段的活性，采用常規(guī)技術(shù)和分析方法，例如，本文所披露的方法。本發(fā)明還包括完整長度rHuAFP或其片段的類似物。類似物可以因氨基酸序列差異或不影響其序列的修飾(例如，翻譯后修飾)或同時因為以上兩種原因而不同于rHuAFP。本發(fā)明的類似物與rHuAFP全部或部分氨基酸序列的同源性一般至少為80％，更優(yōu)選85％，最優(yōu)選90％或甚至99％。修飾(通常不改變其一級序列)包括多肽的體內(nèi)成體外化學(xué)衍生化，例如，乙?；螋然?；這種修飾可以在多肽合成或加工期間進行，或在用單獨的修飾酶進行處理之后。類似物也可以因一級序列的改變而不同于天然存在的rHuAFP，例如，用一種氨基酸取代另一種有類似特性氨基酸(例如，用纈氨酸取代甘氨酸，用精氨酸取代賴氨酸等)或進行不喪失該多肽的生物學(xué)活性的一個或幾個非保守氨基酸的置換、缺失或插入。其中包括天然的和誘導(dǎo)的遺傳變體[例如通過輻射或乙磺酸甲酯處理進行隨機誘變或用Sambrook等所披露的方法(“分子克隆實驗指南”(MolecularCloningALaboratoryManual)，2nded.ColdSpringHarborPress，1989，或Ausubel等，同上)]進行位點特異性誘變，還包括環(huán)化肽分子和含有L-氨基酸以外殘基的類似物，例如，D-氨基酸或非天然存在的或合成氨基酸，例如，β或γ氨基酸，或帶有非天然側(cè)鏈的L-氨基酸(例如，參見Noren等，“科學(xué)”(Science)244182，1989)。例如，Ellman等披露了(見“科學(xué)”(Science)255；197，1992)將非天然氨基酸摻入蛋白質(zhì)的蛋白主鏈的位點特異性摻入方法。還包括化學(xué)合成的多肽或具有修飾肽鍵(例如，在美國專利4,897,445和美國專利5,059,653中所披露的非肽鍵)或修飾側(cè)鏈的肽，以獲得本文所述的理想藥物特性。采用常規(guī)方法，例如本文所披露的方法鑒定有用的突變體和類似物。將重組HuAFP作為免疫抑制劑用任何標(biāo)準(zhǔn)方法分析體內(nèi)或體外免疫調(diào)節(jié)活性，以測定rHuAFP(或其片段或類似物)的免疫抑制作用。如下文所述，本領(lǐng)域提供了若干用于體內(nèi)檢驗rHuAFP(或其片段或類似物)對自身免疫病，例如，非肥胖糖尿病(NOD)小鼠的免疫抑制特征的動物系統(tǒng)。另外，還有多種可用于檢驗rHuAFP的免疫抑制特征的體外系統(tǒng)，例如，一種這樣的體外分析方法可以測定在自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(AMLR)中對自身抗原誘導(dǎo)的T細(xì)胞增殖的抑制作用。以下的實施例證實，非糖基化的rHuAFP和rHuAFP片段能抑制T細(xì)胞效應(yīng)于自身抗原的自動增殖。這些實施例的用意在于說明，而不是限制本發(fā)明。實施例材料和方法凝膠電泳、免疫印跡和純化用標(biāo)準(zhǔn)方法通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和非變性堿性PAGE(APAGE)測定rHuAFP的純度和特征。隨后對凝膠進行以下分析或通過考馬斯亮藍(lán)染色，或通過電泳將分離的多肽轉(zhuǎn)移到Immobilon膜(Millipore，Mississauga，ON)上進行免疫印跡分析。用堿性磷酸酶綴合的羊抗兔IgG鑒定重組HuAFP非特異性兔抗天然HuAFP多克隆抗體復(fù)合體，并按照生產(chǎn)商的說明書，用BCIP/NBT顯色溶液(BioRadLaboratoriesMississange，ON)檢測免疫反應(yīng)帶。按標(biāo)準(zhǔn)方法進行柱層析。rHuAFP片段的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)用分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
技術(shù)人員公知的PCR技術(shù)制備編碼人甲胎蛋白片段的質(zhì)粒結(jié)構(gòu)，使用被設(shè)計用于擴增人甲胎蛋白的基因特定部分的寡核苷酸引物[例如，參見“PCR技術(shù)”(PCRTechnology)，H.A.Erlich，著，StochtonPress，NewYork，1989；“PCR方案方法和應(yīng)用指南”(PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications)，M.A，Innis，DavidH.Gelfand，JohnJ.Sninsky，和ThomasJ.White著，AcademicPress，Inc.，NewYork，1990，和Ausubel等，同上]。制備以下6種rHuAFP片段，測定其生物學(xué)活性(例如，用本文所披露的方法)結(jié)構(gòu)域I氨基酸1(Thr)-197(Ser)，(圖1，序列6)結(jié)構(gòu)域II氨基酸198(Ser)-389(Ser)，(圖1，序列7)結(jié)構(gòu)域III氨基酸390(Gln)-590(Val)，(圖1，序列8)結(jié)構(gòu)域I+II氨基酸1(THr)-389(Ser)，(圖1，序列9)結(jié)構(gòu)域II+III氨基酸198(Ser)-590(Val)，(圖1，序列10)rHuAFP片段I氨基酸266(Met)-590(Val)，(圖1，序列11)氨基酸序列是根據(jù)所示人甲胎蛋白(1(Thr)-590(Val)；圖1中序列5)的序列推定的。被命名為結(jié)構(gòu)域I、結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域III、結(jié)構(gòu)域I+II、結(jié)構(gòu)域II+III和rHuAFP片段I的rHuAFP的片段是用標(biāo)準(zhǔn)的PCR反應(yīng)條件合成的，在100μL反應(yīng)混合物中含有34μLH2O、10μL10×反應(yīng)緩沖液、20μL1mMdNTP、2μLDNA模板(克隆在pI18上的HuAFP)、適量的5′和3′寡核苷酸引物(10μL10pmol/μL5′引物，10μL10pmol/μL3′引物)、1μL甘油、10μL二甲基亞砜(DMSO)和1μLPfu聚合酶(Stratagene，LaJolla，CA)。用于PCR擴增的引物為結(jié)構(gòu)域I255’-AAAAAAGGTACCACACTGCATAGAAATGAA-3’(序列14)結(jié)構(gòu)域I35’-AAAAAAGGATCCTTAGCTTTCTCTTAATTCTIT-3’(序列15)結(jié)構(gòu)域II55’-AAAAAAATCGATATGAGCTTGTTAAATCAACAT-3’(序列16)結(jié)構(gòu)域II35’-AAAAAAGGATCCTTAGCTCTCCTGGATGTATIT-3’(序列16)結(jié)構(gòu)域III55’-AAAAAAATCGATATGCAAGCATTGGCAAAGCGA-3’(序列16)結(jié)構(gòu)域III35-AAAAAAGGATCCTTAAACTCCCAAAGCAGCACG-3’(序列17)5’rHuAFP片段I5’-AAAAAAATCGATATGTCCTACATATGTICTCAA-3’(序列18)因此，可將引物對DomI25和DomI3、DomII5和DomII3、DomIII5和DomIII3、5′rHuAFP片段I和DomIII3、DomI25和DomII3、以及DomII5和DomIII3分別用于提取rHuAFP的結(jié)構(gòu)域I、結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域III、rHuAFP片段I、結(jié)構(gòu)域I+II、以及結(jié)構(gòu)域II+III的cDNA序列。退火、延伸和變性溫度分別為50℃、72℃和94℃，進行30次循環(huán)。用標(biāo)準(zhǔn)方法純化PCR產(chǎn)物。純化編碼結(jié)構(gòu)域I和結(jié)構(gòu)域I+II的PCR產(chǎn)物單獨用KpnI和BamHI消化，并分別克隆到KpnI/BamHI處理過的pTrp4上。編碼結(jié)構(gòu)域II、結(jié)構(gòu)域III、結(jié)構(gòu)域II+III和rHuAFP片段I的純化PCR產(chǎn)物分別用Bsp106I和BamHI消化，并分別克隆到Bsp106I/BamHI處理過的pTrp4上。隨后將每種質(zhì)粒結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞里。由于表達產(chǎn)物始于由翻譯起始信號蛋氨酸編碼的氨基酸序列，預(yù)計該信號將被除去，或在任何情況下都不會影響最終表達產(chǎn)物的生物活性。自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(AMLR)提取人外周血單核細(xì)胞(PBMC)，用標(biāo)準(zhǔn)方法將其分級分離成非T細(xì)胞群和AMLR。通過讓1.5×108PMBC從市售Ig-抗-Ig親和柱(BiotekLaboratories)上通過來分離效應(yīng)T細(xì)胞，隨后將2×105效應(yīng)細(xì)胞與來自單一供體的自身137Cs-輻射的(2500拉德)非T刺激細(xì)胞一起培養(yǎng)。所用的培養(yǎng)基為補充了20mMHEPES(Gibco)、5×10-5M2-巰基乙醇(BDH、Montreal，QC)、4mML-谷氨酰胺(Gibco)、100μ/ml青霉素(Gibco)和100μg/ml硫酸鏈酶素的RPMI-1640，在用于AMLR時再加入10％效應(yīng)T細(xì)胞供體的自體新鮮人血清。在開始培養(yǎng)時加入各種濃度的純化rHuAFP、人血清白蛋白(HSA)、抗HuAFP單克隆抗體Clone#164(在培養(yǎng)物中的終濃度為125μg/ml)(LeincoTcchnologiesSt.Louis，MO)。將AMLR培養(yǎng)物在37℃下于95空氣和5％CO2中培養(yǎng)4-7天。以指明的間隔，通過用1μCi3H-胸苷(比活性為56-80Ci/mmole，ICN)進行6小時脈沖，測定DNA合成。在一個多樣品收集器(Skatron，Sterling，VA)上收集培養(yǎng)物，并在一臺Packard2500TR液體閃爍計數(shù)器上測定3H-TdR的摻入。所給出的結(jié)果為平均cpm±3個或4個重復(fù)培養(yǎng)的平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。外周血淋巴細(xì)胞(PBL)測定以1∶1的比例用PBS稀釋肝素化來自正常人體的血液，通過在Ficoll-Hypaque(Sigma，St.louis，MO)上進行密度離心從紅血細(xì)胞中分離人外周血淋巴細(xì)胞(PBL)。至少用PBS將其洗3次，并通過臺盼藍(lán)排斥法鑒定細(xì)胞活性。用標(biāo)準(zhǔn)方法培養(yǎng)人PBL(2.5×105細(xì)胞)。以平均Cpm胸苷摻入量±3次重復(fù)培養(yǎng)的SEM來表示結(jié)果。結(jié)果表達和純化分解在圖1A-1B中所示出的考馬斯殼藍(lán)染色的APAGE和SDS-PAGE的單一帶證實了所分離的在大腸桿菌中表達的rHuAFP的純度。源于大腸桿菌的可溶性單體rHuAFP是通用Q-Sepharose層析洗脫含HuAFP的蛋白級分而得到的。通過FPLCMono-Q陰離子交換，用220-230mMNaCl從每升細(xì)菌培養(yǎng)物中回故到約1mg純rHuAFP，其為單一的均勻峰，其在SDS-PAGE的遷移量約為65KD(1B)，在SDS-PAGE上，重組HuAFP的分子量比天然HuAFP的低，因為原核表達系統(tǒng)缺乏蛋白糖基化所需的酶促機制。在FPLC和HPLC上對純的rHuAFP樣品進行再層析，得到圖1C和1D所示的單一峰，證實了該rHuAFP的純度。另外，N-末端測序資料與預(yù)期的rHuAFP的N-末端氨基酸序列一致。另外，按上述方法培養(yǎng)含有編碼rHuAFP的表達質(zhì)粒的大腸桿菌。圖2(泳道D)中示純化rHuAFP片段1的特征。N-末端氨基酸序列分析表明，rHuAFP片段I具有的氨基酸序列為Ser267-Tyr-Ile-Cys-Ser-Gln-Gln-Asp-Thr275(序列13)，該序列與預(yù)期的rHuAFP片段I的N-末端氨基酸序列(參見圖1，序列11)一致，其中，開頭的蛋氨酸在細(xì)胞內(nèi)部切除。自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(AMLR)的抑制根據(jù)其抑制人自體混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(AMLR)的能力測定rHuAFP的免疫抑制活性。如圖8A所示，通過在4-7天時間內(nèi)測定自身增殖，測定rHuAFP對由自身非T細(xì)胞刺激的自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞增殖效應(yīng)的抑制。如圖8B所示，由在T細(xì)胞自身增殖峰處進行的劑量效應(yīng)研究所得到的結(jié)果證實，在培養(yǎng)開始時加入rHuAFP可以與劑量有關(guān)的方式抑制AMLR。另外，平行活性研究證實，rHuAFP對人自身反應(yīng)T細(xì)胞的抑制活性不是由于非特異性細(xì)胞毒性作用。為了進一步證實rHuAFP是決定自身增殖T細(xì)胞的抑制作用的抑制劑，用市售鼠抗人AFP單克隆抗體(MAb)阻止rHuAFP介導(dǎo)的AMLR的抑制作用。如圖5所示，抗HuAFPMAb可以完全阻止100μg/ml對增殖的自身反應(yīng)T細(xì)胞的抑制作用。加入100μg/mlHSA不會破壞AMLR效應(yīng)，在反應(yīng)培養(yǎng)物中僅有MAb也沒有任何作用。在原核表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的重組多肽在從細(xì)胞中提取時有被宿主細(xì)胞脂多糖(LPS)污染的危險。業(yè)已證實，少量的LPS可以拮抗細(xì)胞因子的生物活性，從而破壞巨噬細(xì)胞的免疫反應(yīng)。因此，內(nèi)毒素對各種rHuAFP制劑的影響是這樣測定的用從Detoxi-gel(pierce)上通過而除盡了內(nèi)毒素的重組蛋白和未處理過的rHuAFP進行AMLR實驗。以上實驗表明，兩種制劑具有相同水平的免疫抑制活性。如圖8A和8B所示，這一研究的結(jié)果還表明，rHuAFP能以與糖基化rHuAFP相同的效力抑制自身反應(yīng)T細(xì)胞的增殖，在體外反應(yīng)中對自身增殖的T細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用，當(dāng)rHuAFP的濃度在5μg/ml-100μg/ml范圍內(nèi)時有很明顯的抑制作用。另外，如表1和圖3所示，在144小時時rHuAFP片段I能抑制由自身非T細(xì)胞刺激的自身反應(yīng)淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)。而且，如圖3所示，結(jié)構(gòu)域I和III也能抑制AMLR。表1</tables>外周血淋巴細(xì)胞反應(yīng)(PBL)的抑制還檢驗了100μg/mlrHuAFP片段I、和由大腸桿菌和桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP(如下文所述)的免疫抑制活性，來檢驗抑制人外周血淋巴細(xì)胞反應(yīng)(PBL)的能力。如表II所示，由大腸桿菌和桿狀病毒產(chǎn)生的rHuAFP和片段I(按上述方法生產(chǎn))被證實能抑制ConA刺激的人外周血淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)。表II</tables>自身免疫病如上文所述，自身免疫病的特點是喪失對自身抗原的耐受性，導(dǎo)致諸如T或B細(xì)胞(或兩者)的免疫系統(tǒng)細(xì)胞與自身的組織抗原反應(yīng)。自身免疫病涉及所有器官系統(tǒng)，不過某些器官比另一些器官更易受影響。受自身受免癥狀影響的組織的例子有多發(fā)性硬化患者腦和脊髓的白質(zhì)；類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)的襯里；和胰島素依賴型糖尿病患者的胰腺上的分泌胰島素的β島細(xì)胞。其它形式的自身免疫病能破壞重癥肌無力患者的神經(jīng)與肌肉之間的連接或破壞系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的腎臟及其它器官。其它自身免疫病的例子包括，但不限于Addison′s病、節(jié)段性回腸炎、Grrave′s病、牛皮癬、硬皮病、和潰瘍性結(jié)腸炎。本領(lǐng)域提供了多種用于試驗治療與自身免疫病有關(guān)的人體疾病的轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因的實驗動物系統(tǒng)[例如，參見Panl，W.E.，“基礎(chǔ)免疫學(xué)”FundamentalImmunology)，2nded，RavenPress，NewYork，1989；和Kandel等，“神經(jīng)科學(xué)方法”(PrinciplesofNeuralScience)，3rded.，Appleton和Lange，Novwalk，CT，1991；以及“當(dāng)今免疫學(xué)方案”(CurrentProtocolsInImmunology)，Coligan，J.E.，Kruisbeek，A.M.，Margulies，D.H.SherachE.M.，和Strober著，GreenPublishingAssociates(JohnWiley&amp;Sons)。NewYork1992]。上述實驗結(jié)果證實了非糖基化rHuAFP的免疫抑制活性，有理由認(rèn)為服用這種在原核系統(tǒng)中產(chǎn)生的rHuAFP(或其片段或類似物)可以治療其它自身免疫病。因此，本發(fā)明提供了將rHuAFP(或其片段或類似物)用于治療(即預(yù)防，或抑制，或改善，或促進緩解)一切自身免疫病的用途。以下是可用于測定重組人甲胎蛋白或其免疫細(xì)胞抗增殖片段或類似物在治療自身免疫病方面的效力的動物系統(tǒng)的例子。這些例子是用于說明本發(fā)明的，而不是要限定本發(fā)明。多發(fā)性硬化多發(fā)性硬化(MS)是一種涉及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的白質(zhì)的分散部分的脫髓鞘病。在MS中，髓鞘堿性蛋白和蛋白脂質(zhì)蛋白是其它免疫系統(tǒng)成分中涉及T淋巴細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)的主要目標(biāo)。神經(jīng)細(xì)胞髓鞘的喪失(脫髓鞘)，會導(dǎo)致神經(jīng)病學(xué)癥狀，并最終導(dǎo)致昏迷或癱瘓。實驗自身免疫腦脊髓炎(EAE)是本領(lǐng)域用于檢驗和測定治療MS的治療劑的效果的主要模型。EAE是通過對中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫而在實驗動物中誘發(fā)的炎性自身免疫脫髓鞘病。當(dāng)給動物(如小鼠、大鼠、腸鼠、兔、猴等)注射諸如弗氏完全佐劑加髓鞘堿性蛋白或蛋白脂質(zhì)蛋白之類的左劑時，可誘發(fā)EAE，其在病理學(xué)上類似MS[例如，參見Alvord等，“實驗自身免疫腦脊髓炎-一種有用的用于多發(fā)性硬化的模型”(ExperimentalAllergieEnceph-alomyelitis-AUsefulModelforMultipleSclerosis)，Liss，NewYork，1984；Swanberg，“酶學(xué)方法”(Meth.Enzymol.)162413，1988；和McCarron等)“免疫學(xué)雜志”J.Immunol.)，1473296，199l]。為了檢驗rHuAFP或其片段或類似物，在合適的實驗動物上誘發(fā)EAE，例如，用本領(lǐng)域已知方法在小鼠或兔上誘發(fā)EAE。為了評價某種化合物對EAE的免疫抑制效果，即其預(yù)防或改善EAE的能力，用諸如靜脈內(nèi)或腸膜內(nèi)注射的標(biāo)準(zhǔn)方法以適當(dāng)劑量每天給藥所述化合物。一般，給藥是在誘發(fā)EAE之前和/或出現(xiàn)EAE臨床癥狀之后開始。對照對物接受諸如人血清白蛋白之類的安慰劑，以類似于給藥rHuAFP或相關(guān)分子的方式給藥安慰劑。根據(jù)任何標(biāo)準(zhǔn)方法檢測試驗分子對EAE的影響。例如，每天監(jiān)測EAE誘發(fā)動物的重量減少和肌肉癱瘓。如果需要，對腦和脊髓組織進行組織學(xué)檢測[例如，用任何標(biāo)準(zhǔn)組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法，例如參見Ausubel等，“現(xiàn)代分子生物學(xué)方案”(CurrentProtocolsInMolecularBiology)，GreenePublishingAssociates(JohnWiley&amp;Son)，NewYork，1994；Bancroft和Stevens，“組織化學(xué)技術(shù)的理論和實踐”(TheoryandPracticeofHistochemicalTechniques)，ChurchillLivingstone，1982]，并對組織樣品進行顯微鏡檢查，尋找EAE的證據(jù)，例如血管周細(xì)胞滲液的證據(jù)。處理過的動物和對照動物之間的對比研究用于確定試驗分子在預(yù)防或改善EAE方面的相對效力。能預(yù)防或改善(減輕，或抑制，或緩解，或減弱)EAE的癥狀的分子被視為可用于本發(fā)明。類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性病，這種病會使多種關(guān)節(jié)的滑膜發(fā)炎，造成對軟骨和骨的損傷。RA與人淋巴抗原(HLA)-DR4相關(guān)，并被視為一種涉及T細(xì)胞的自身免疫病，例如，參見Sewell等，“柳葉刀”(Lancet)341283，1993。RA是因滑膜細(xì)胞與各種細(xì)胞因子(及其可溶性產(chǎn)物)的相互作用所致，所述細(xì)胞因子是從循環(huán)系統(tǒng)滲入關(guān)節(jié)的滑膜襯里。所發(fā)生的一系列生物學(xué)事件最終導(dǎo)致侵入和侵蝕關(guān)節(jié)的膠原和軟骨基質(zhì)的損害作用。若干AR動物模型，例如MRL-lpr/lpr小鼠在本領(lǐng)域中是眾所周知的，這些模型能產(chǎn)生類似人類疾病的關(guān)節(jié)炎癥狀(例如，參見“基礎(chǔ)免疫學(xué)”(FundamentalImmunology)同上)。另外可以用標(biāo)準(zhǔn)方法在合適的動物上誘發(fā)自身免疫膠原關(guān)節(jié)炎(ACA)和佐劑關(guān)節(jié)炎(AA)(adjuvantarthritis)。為了測定rHuAFP或其片段或類似物對RA的免疫抑制，即該化合物預(yù)防或改善RA的能力，用標(biāo)準(zhǔn)方法給MRL-lpr/lpr小鼠服用試驗分子，所述方法如靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射，以合適的劑量每日給藥。一般，給藥是在RA發(fā)作之前和/或出現(xiàn)RA臨床癥狀之后開始。對照動物接受安慰劑，例如，人血清白蛋白，以與給藥rHuAFP或相關(guān)分子類似的方法給藥安慰劑。用標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測試驗分子對RA的影響。例如，通過每日監(jiān)測對滑膜關(guān)節(jié)的細(xì)胞成分的分析結(jié)果。如果需要，可以對滑膜關(guān)節(jié)進行組織學(xué)檢測(例如，采用任何標(biāo)準(zhǔn)的組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法，例如，參見Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并對組織樣品進行顯微鏡檢驗，以尋找RA的證據(jù)，例如，關(guān)節(jié)中膠原和軟骨基質(zhì)侵蝕的證據(jù)。處理過的動物與對照動物之間的比較研究被用于測定試驗分子在預(yù)防或改善RA方面的相對效力。能預(yù)防或改善(減輕，或抑制，或緩解，或促進減弱)RA癥狀的試驗分子被視為可用于本發(fā)明。重癥肌無力重癥肌無力(MG)是一種神經(jīng)肌肉傳遞疾病，這種病會產(chǎn)生抗神經(jīng)肌肉接頭的乙酰膽堿受體的自身抗體?？贵w侵害所述接頭，導(dǎo)致虛弱和癱瘓。女性的發(fā)病率為男性的2倍，通常在30歲左右發(fā)病。這種病的主要特點為肌無力。臨床癥狀包括眼瞼下垂和雙視象。MG與甲狀腺機能亢進相關(guān)。業(yè)已研究了包括兔、猴、Lewis大鼠和小鼠自交品系在內(nèi)的多種動物的實驗自身免疫MG(EAMG)，EAMG的癥狀類似于人類疾病的基本特征。[例如參見“神經(jīng)科學(xué)方法”(PrinciplesofNeutralScience)，同上]。與佐劑一起注射一次乙酰膽堿受體，例如，從鰻(Torpedocalifornica)的電器管中純化的受體，在8-12天內(nèi)會引起急性無力癥狀，然后在30天左右后出現(xiàn)慢性無力癥狀。對鰻受體的反應(yīng)是T細(xì)胞決定型的。C57BL/6品系(H-2B)是Torpedo受體的高效應(yīng)體，而且高度易感EAMG。為了檢驗RhuAFP或其片段或類似物，用本領(lǐng)域公知的方法在諸如C57BL/6品系(H-2B)小鼠的合適實驗動物上誘發(fā)EAMG。為了檢驗?zāi)撤N化合物對EAMG的免疫抑制效果，即預(yù)防或改善EAMG的能力，用標(biāo)準(zhǔn)方法給藥該化合物，例如，以靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射的形式以適當(dāng)劑量每日給藥。一般，給藥是在誘發(fā)EAMG之前和/或出現(xiàn)EAMG臨床癥狀之后開始。對照動物接受安慰劑，如人血清白蛋白，以與給藥rHuAFP或相關(guān)分子類似的方式給藥安慰劑。用標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測試驗分子對EAMG的作用。例如，可以對EAMG誘發(fā)的動物的肌電圖分析中進行神經(jīng)刺激分析(例如，用Pachner等披露的方法，“神經(jīng)病學(xué)紀(jì)事”(Ann.Neurol.)1148，1982)。如果需要，可以對組織樣品進行組織學(xué)檢驗(例如，用任何標(biāo)準(zhǔn)的組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法，例如，參見Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并對組織樣品進行顯微鏡查檢，以發(fā)現(xiàn)EAMG的證據(jù)，例如，單核細(xì)胞滲入和/或自身抗體定位于神經(jīng)肌肉接頭的乙酰膽堿受體的證據(jù)。處理過的動物和對照動物之間的對比研究被用于測定試驗分子在預(yù)防或改善EAMG方面的相對效力。能預(yù)防或改善(減輕，或抑制，或緩解，或促進減弱)EAMG癥狀的分子被視為可用于本發(fā)明。胰島素依賴性糖尿病糖尿病是一種葡萄糖代謝疾病。胰島素依賴性糖尿病(IDDM)又被稱作I型糖尿病，它是一種自身免疫病，其特征是由T細(xì)胞介導(dǎo)的朗氏島上的胰腺β細(xì)胞的破壞，伴隨著由多種自身肽引起的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致高血糖及其它病理學(xué)癥狀。IDDM患者依靠外源胰島素維持正常的葡萄糖代謝?？梢栽诟哐前l(fā)作之前根據(jù)抗胰島素、島細(xì)胞、谷氨酸羧化酶及其它自身蛋白的異常出現(xiàn)確定有發(fā)生IDDM危險的人體(例如，參見，Baekkeskov等，“臨床研究雜志”(J.Clin.lnvest.)79926，1987；Dean等，“糖尿病學(xué)”(Diabetologia)29339，1986；Rossini等，“免疫學(xué)年評”(Annu.Rev.Immunol.)3289，1985；Srikanta等，“新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志”(N.Engl.J.Med.)308322，1983)。一般自身抗體的類型可以預(yù)示最終的疾病發(fā)展和/或發(fā)病的危險(例如，參見Keller等，“柳葉刀”(Lancet)341927，1993)。能自發(fā)發(fā)生類似于人體疾病的動物模型的例子包括Bio-Breeding(BB)大鼠和非肥胖糖尿病(NOD)小鼠。糖尿病也可以用鏈脲霉素(streptozotocin)通過實驗方法誘發(fā)。BB大鼠能自發(fā)發(fā)生類似于IDDM的疾病，伴有胰島炎(單核細(xì)胞滲入胰島)和抗自身細(xì)胞和胰島素(例如，參見Baekkeskov等，“臨床研究雜志”(J.Clin.Invest.)79926，1987；Rossini等，同上；Nakhooda等)“糖尿病”(Diabetes)26100，1977，Dean等，“臨床實驗免疫學(xué)”(Clin.Exp.Immunol.)69308，1987)。NOD小鼠通常在5-8周齡時發(fā)生胰島炎，在7月齡時有70％的雌性、40％的雄性變得患糖尿病。將糖尿病小鼠的T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到初生非糖尿病NOD小鼠體內(nèi)在2-3周內(nèi)可誘發(fā)糖尿病(例如，參見Bendelac等，“實驗醫(yī)學(xué)雜志”(J.Exp.Med.)166823，1987)。NOD小鼠在發(fā)生糖尿病后通常在1-2月內(nèi)死亡，除非接受胰島素治療。通過多次小劑量注射鏈脲霉素可以以化學(xué)方法誘發(fā)糖尿病，鏈脲霉素對胰腺β細(xì)胞有毒性，它可以導(dǎo)致嚴(yán)重的胰島炎和糖尿病(例如，參見Kikutani等，“免疫學(xué)進展”(Adv.Immunol.)51285，1992)。因此，本領(lǐng)域提供了多種模擬人IDDM的動物模型，可將這些動物模型用于檢驗和試驗用于預(yù)防或改善糖尿病的方法，這些方法涉及rHuAFP(或其片段或類似物)。為了測定rHuAFP或其片段或類似物對糖尿病小鼠的發(fā)病的免疫抑制效果，即該化合物治療或預(yù)防胰島炎和糖尿病的能力，用諸如靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射的標(biāo)準(zhǔn)方法以適當(dāng)劑量每天給合適的試驗動物給藥適當(dāng)?shù)脑囼灮衔?。一般，給藥是在胰島炎和糖尿病發(fā)作之前和/或在出現(xiàn)糖尿病臨床癥狀之后進行。對照動物接受安慰劑，如人血清蛋白，以與給藥rHuAFP或相關(guān)分子類似的方式給藥安慰劑。用標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測試驗分子對胰島炎和糖尿病的影響。例如，每日監(jiān)測體重下降、酮體形成和血糖濃度。如果需要，可以對胰島細(xì)胞進行組織學(xué)檢查(例如，用任何標(biāo)準(zhǔn)的組織化學(xué)或免疫化學(xué)方法，例如，參見Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并對組織樣品進行顯微鏡檢，以尋找胰島炎和β細(xì)胞損害的證據(jù)。處理過的動物和對照動物之間的對比研究可用于測定試驗分子在預(yù)防或改善糖尿病癥狀方面的相對效果。能預(yù)防或改善(減輕，或抑制，或緩解，或促進減弱)糖尿病，，如IDDM癥狀的分子被視為可用于本發(fā)明。系統(tǒng)性紅斑狼瘡系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)是一種嚴(yán)重的系統(tǒng)性自身免疫病。這種病的患者約有90％為年輕女性。這種顯著的女性優(yōu)勢在青春期之前和絕經(jīng)之后并不存在。這種病通常始于成年初期，發(fā)病時在患者的顴骨和前額出現(xiàn)特有的皮疹。脫發(fā)是常見的，還會出現(xiàn)嚴(yán)重的腎臟損害、關(guān)節(jié)炎、在心臟周圍積液、和肺部襯里的發(fā)炎。有接近半數(shù)的患者的腦血管也會發(fā)炎，導(dǎo)致癱瘓和驚厥。這種病的作用與其它自身免疫病一樣，會產(chǎn)生波動長時期的健康良好的靜態(tài)期可能突然終止并莫名其妙的重新發(fā)病。已知在SLE中有大量不同的自身抗體，例如，抗DNA、RNA和組蛋白的自身抗體(例如，參見“基礎(chǔ)免疫學(xué)”(FundamentalImmunolgy)，同上)。若干種人類SLE的動物模型在本領(lǐng)域中是公知的，例如，自交小鼠品系，包括NIB小鼠及其F1雜種、MRL小鼠和BXSB小鼠(例如，參見Bielschowsky等，“Otago大學(xué)藥學(xué)院院刊”(Proc.Univ.OtagoMed.Sch.)379，1959；Braverman等，“皮膚學(xué)研究雜志”(J.Invest.Derm.)50483，1968；Howie等，“免疫學(xué)進展”(Adv.Immunol.)9215，1968；“自身免疫病的遺傳控制控制”(GeneticContralofAutoimmuneDiease)，Rose，M.Bigazzi，P.E.，和Warner，N.L著，Elsevier，Amsterdam，1979；和“現(xiàn)代免疫學(xué)方案”(CurrentProtocolsInImmunology)，同上)。例如，NZB×NZWF1小鼠是一種極好的人類SLE模型，雌性小鼠會產(chǎn)生大量抗雙鏈和抗單鏈DNA自身抗體，其它抗核抗體和患腎??；通常在約8個月時出現(xiàn)死亡(例如，參見Theofilopoulos等，“免疫學(xué)進展”Adv.Immunol.)37269，1985)。為了測定rHuAFP或其片段或類似物對SLE的免疫抑制作用，即化合物rHuAFP預(yù)防或改善SLE的能力，用諸如靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射的標(biāo)準(zhǔn)方法以適當(dāng)劑量每天給合適的諸如NZB×NZWF1小鼠的動物給藥試驗化合物。一般，給藥是在SLE發(fā)作之前和/或出現(xiàn)SLE臨床癥狀之后開始。對照動物接受安慰劑，例如，人血清蛋白，以與給藥rHuAFP或相關(guān)分子類似的方式給藥安慰劑。用標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測所述試驗化合物對SLE的影響。例如，可以監(jiān)測對諸如抗DNA抗體的自身抗體的分析。如果需要，可以對腎組織進行組織學(xué)檢查(例如，用任何標(biāo)準(zhǔn)組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法，例如，參見Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并對組織樣品進行顯微鏡檢，以尋找SLE的證據(jù)，例如，狼瘡腎炎的證據(jù)。處理過的動物和對照動物之間的比較研究可用于測定試驗化合物在預(yù)防或改善SLE方面的相對效果。能預(yù)防或改善(減弱，或抑制，或緩解，或促進減輕)SLE癥狀的分子被視為可用于本發(fā)明。治療給藥如上所述，重組甲胎蛋白，如rHuAFP(或其片段或類似物)能有效抑制自身免疫細(xì)胞的增殖，因此，可被用于預(yù)防或改善自身免疫病，包括，但不限于多發(fā)性硬化、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡和重癥肌無力。因此，可以用已知方法配制重組人甲胎蛋白(或其片段或類似物)，以制備可以藥用的組合物。優(yōu)選以能有效預(yù)防或改善自身免疫病癥狀的量給該病的患者給藥重組甲胎蛋白，如rHuAFP(或其片段或類似物)。一般，以0.1ng/kg體重-10g/kg體重的劑量為宜。如果需要，可以每天給藥的方式進行。因為沒有已知和重組人甲胎蛋白有關(guān)的有害副作用，因此，據(jù)認(rèn)為可以安全地以較高劑量給藥。例如，可以用包含于生理上可以接受的載體中的治療有效量的rHuAFP(或其片段或類似物)治療人類患者。合適的載體及其配方由E.WMartin披露于Remington＇s藥學(xué)(PharmaceuticalSciences)中。rHuAFP的給藥量因給藥方式、患者的年齡和體重、患病類型和易感病或正在患病的患者的體型不同而不同。例如，優(yōu)選的給藥方式包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或真皮內(nèi)注射，這些方法可以持續(xù)維持患者體內(nèi)的藥物水平。在其它優(yōu)選給藥方式中，可以通過注射或植入緩釋制劑的方式給患者給藥rHuAFP，例如，所述rHuAFP為緩慢解離的聚合或結(jié)晶形式；在這類持續(xù)給藥之前，可以用更常的方式(如上述方式)進行最初的給藥。另外，可以用灌輸泵(例如，外置的或可植入的灌輸泵)給藥rHuAFP，以便能夠精確控制藥物釋放速度，或以類似于用于促進胰島素吸入的方式將rHuAFP植入鼻道。作為經(jīng)鼻粘膜吸收的一種替代方式，可將rHuAFP以粉狀物的氣溶膠沉淀或溶液形式輸入肺部。另外，本發(fā)明的方法還可以采用組合治療形式，其中，rHuAFP與諸如普通或特殊耐受劑的治療劑同時或依次服用，例如，所述治療劑為抗獨特型劑(如單克隆抗體)或治療疫苗或口服劑(如胰島素、膠原或髓鞘堿性蛋白)或細(xì)胞因子(如I1-15)或干擾素(α-干擾素)或免疫抑制劑。優(yōu)選以有效劑量給藥免疫抑制劑，該劑量低于單獨使用該免疫抑制劑時的劑量。優(yōu)選的免疫抑制劑為環(huán)孢菌素、FK-506、類固醇、硫唑嘌呤、或15-脫氧精胍菌素。治療一般始臺于診斷或懷疑患上自身免疫病時，并且一般每天重復(fù)治療。在發(fā)病之前給藥rHuAFP可以防止或預(yù)防自身免疫病的發(fā)生(或發(fā)展或惡化)。如果需要，可以用監(jiān)測或診斷患者自身免疫病的方法對治療或預(yù)防方案的效果進行檢驗。將重組人AFP用于治療或診斷癌癥細(xì)胞毒性劑通過用常規(guī)技術(shù)將全長rHuAFP或其片段或類似物同任何數(shù)量的已知毒性劑綴合制備rHuAFP的雜合細(xì)胞毒素。這些毒素可用于抑制腫瘤的發(fā)生(如下文所述)。有用的細(xì)胞毒素優(yōu)選是僅在存在于細(xì)胞內(nèi)時才有明顯的細(xì)胞毒性，而且基本上被排除在缺乏靶結(jié)構(gòu)域的特定細(xì)胞之外。如上所述，肽毒素滿足以上標(biāo)準(zhǔn)并且能方便的結(jié)合到雜合分子上。如果需要也可以使用混合的細(xì)胞毒素(即由兩種或兩種以上的毒素的全部或部分組成的細(xì)胞毒素)。下面將對幾種有用的毒素作更詳細(xì)地說明。用于本發(fā)明方法的毒素分子優(yōu)選是諸如肽毒素的毒素，這種毒素只有在出現(xiàn)于細(xì)胞內(nèi)時才有明顯的細(xì)胞毒性。當(dāng)然，在這種情況下，所述毒素分子必需能夠進入帶有靶受體的細(xì)胞。這種能力取決于分子的性質(zhì)和細(xì)胞受體的性質(zhì)。例如，可使自然地攝取配體的細(xì)胞受體似乎能夠為包括有毒素的分子提供進入帶有所述受體的細(xì)胞的手段。如下文所述，可用于本發(fā)明方法的肽毒素是通過產(chǎn)生一種編碼一種雜合蛋白的分子而同rHuAFP(或其片段或類似物)結(jié)合域融合。很多肽毒素具有通用的真核受體結(jié)合域；在這種情況下，必須對所述毒素進行修飾以防止帶有非受體細(xì)胞中毒。任何所述修飾都必需以能保留該分子的細(xì)胞毒性功能的形式進行[參見“美國衛(wèi)生和人類服務(wù)部，美國流水號401.412”(U.S.DepartmentofHealthandHumanService，U.S.SerialNo.401.412)]。潛在的有用毒素包括，但不限于霍亂毒素、蓖麻毒蛋白、O-志賀樣毒素(SLT-I、SLT-II、SLTIIv)、LT毒素、C3毒素、志賀毒素、百日咳毒素、破傷風(fēng)毒素、假單孢桿菌屬外毒素、皂草素、modeccin和gelanin。如果需要，可用于本發(fā)明的某些分子的細(xì)胞毒性部分可以由混合毒素分子提供?；旌隙舅胤肿邮窃从趦煞N不同多肽毒素的分子。一般，如上所述，除了決定通用的真核細(xì)胞結(jié)合的結(jié)構(gòu)域外，多肽毒素還有一個酶促活性結(jié)構(gòu)域和一個轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域。該結(jié)合結(jié)構(gòu)域和轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域分別為細(xì)胞識別和毒素進入所必需。一旦毒素分子進入細(xì)胞，由所述酶促活性結(jié)構(gòu)域決定細(xì)胞毒性活性。已知具有轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的天然蛋白包括白喉毒素、假單孢桿菌屬外毒素A及其它可能的肽毒素。對白喉毒素和假單孢桿菌屬外毒素A的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域的特征已有充分說明[例如，參見Hoch等，“美國國家科學(xué)院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)821692，1985；Colombatti等，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)261；3030，1986；和Deleers等，“歐洲生物化學(xué)學(xué)會聯(lián)合會通訊”(FEBSLett.)16082，1983]，并且，可以用Hwang等(“細(xì)胞”(Cell)48129，1987)和Gray等(“美國國家科學(xué)院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)812645，1984)所采用的方法測定這種結(jié)構(gòu)域在其它分子上的存在和位置。例如，一種有用的rHuAFP/混合毒素雜合分子是通過將大腸桿菌志賀樣毒素的酶促活性A亞基(例如，參見Calderwood等，“美國國家科學(xué)院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)844364，1987)同白喉毒素的轉(zhuǎn)運結(jié)構(gòu)域(氨基酸殘基202-460)和rHuAFP融合而形成的。這種有3部分的雜合體的rHuAFP部分使該分子能夠特異結(jié)合帶有可由rHuAFP識別的受體的細(xì)胞，而白喉毒素轉(zhuǎn)運部分的作用是將志賀樣毒素的酶促活性A亞基插入靶細(xì)胞內(nèi)。志賀樣毒素的酶促活性部分與白喉毒素一樣作用于細(xì)胞的蛋白合成機構(gòu)，以阻止蛋白合成，從而殺死該細(xì)胞。本發(fā)明雜合細(xì)胞毒素的官能部分通過非共價鍵或共價鍵或同時由二者連接在一起。非共價的相互作用可以是離子型、疏水型或親水型的，這種相互作用涉及亮氨酸-拉鏈相互作用或抗體-蛋白G相互作用(例如，參見Denick等，“自然”(Nature)359752，1992)。共價連接的一個例子是二硫鍵。雜合細(xì)胞毒素是通過用化學(xué)方法將rHuAFP(或片段或類似物)和任何數(shù)量的已知毒性部分，如上文所述毒性成分綴合而制成的。該反應(yīng)是用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進行的。將一種蛋白和一種蛋白毒素(例如，包括細(xì)菌毒素，如白喉毒素或假單孢桿菌屬外毒素A，或植物毒素，如蓖麻毒蛋白)綴合的常用方法是通過一個二硫鍵的交聯(lián)作用實現(xiàn)的(例如，參見Chang等，“生物化學(xué)雜志”(J.Biol.Chem.)2521515，1977)或通過異基雙功能分子實現(xiàn)(例如，參見Cawley等，“細(xì)胞”(Cell)，22563，1980)。此可參見Stevens等，美國專利No.4,894,227。另外，所述雜合細(xì)胞毒素是通過用本領(lǐng)域普通技術(shù)人員了解的技術(shù)[例如，參見Murphy，美國專利No4,675,382，和Chadhary等，“美國國家科學(xué)院院刊”(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)844538,1987]表達用工程方法產(chǎn)生的編碼rHuAFP(或其片段或類似物)和毒素(或其毒性部分)的雜合DNA而制成的。例如，用本領(lǐng)域公知方法(例如，參見Murphy，同上，和Huston等，“酶學(xué)方法”(Meth.Enzymol.)20346，1991)制備rHuAFP和細(xì)胞毒性劑的重組融合蛋白。如果雜合細(xì)胞毒素是通過表達一個融合基因而產(chǎn)生的話，由一個肽鍵在細(xì)胞毒性劑和靶配體之間起連接作用。可用于將一種蛋白或多肽和一種蛋白毒素綴合的方法采用了聚合物、單甲氧基聚乙二醇(mPEG)[如Maiti等所述，“國際癌癥雜志副刊”(Int.J.CancerSuppl.)317，1988]。如果需要，在合成雜合細(xì)胞毒素后用標(biāo)準(zhǔn)方法對其進行親和純化，采用抗該分子的靶部分的抗體，例如，抗人甲胎蛋白的抗體。類似地，也可以通過標(biāo)準(zhǔn)的免疫技術(shù)用抗細(xì)胞毒性劑的抗體純化雜合細(xì)胞毒素分子。然后將所得到的雜合細(xì)胞毒素配制成用作抗諸如癌細(xì)胞的有害細(xì)胞的制劑，采用藥學(xué)領(lǐng)域的標(biāo)準(zhǔn)方法進行制備?？梢杂帽绢I(lǐng)域公知的分析方法，如在本文中所披露的方法篩選本發(fā)明分子降低帶有靶受體的細(xì)胞的生活力的能力。因為本發(fā)明的雜合細(xì)胞毒素是帶有可由rHuAFP識別的受體的細(xì)胞的有效毒性劑，所以，可將rHuAFP用于治療涉及有害的甲胎蛋白受體陽性細(xì)胞，如癌細(xì)胞的疾病。診斷劑可將重組rHuAFP或其片段或類似物與可檢測的標(biāo)記結(jié)合，制成可用于體內(nèi)、原位或體外檢測和定位腫瘤的制劑。用于將這種標(biāo)記連接在蛋白上的方法為本領(lǐng)域所熟知。例如，可以用化學(xué)方法連接可檢測的標(biāo)記，但當(dāng)標(biāo)記是多肽時，也可以用遺傳工程技術(shù)連接。可檢測的標(biāo)記一般選自本領(lǐng)域已知的多種此類標(biāo)記，但通常放射性同位素、熒光團、酶(例如，辣根過氧化物酶)、或其它能發(fā)射可檢測的信號的部分或化合物(如放射性、熒光、顏色)或在該標(biāo)記接觸其底物后能發(fā)射可檢測的信號的部分或化合物。各種可檢測的標(biāo)記/底物對(例如，辣根過氧化物酶/二氨基聯(lián)苯胺、親和素/鏈毒親和素、熒光素酶/熒光素、β-半乳糖苷酶/X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚基-D吡喃半乳糖苷)及為這種檢測目的而標(biāo)記蛋白的方法在本領(lǐng)域中是公知的?？梢杂萌缦路椒y定這種制劑的用途例如，將諸如MCF-7的腫瘤細(xì)胞系植入諸如小鼠的宿主，并通過采用閃爍照像法的放射顯象技術(shù)檢測本發(fā)明的制劑是否已可檢測地標(biāo)記了由植入的細(xì)胞所產(chǎn)生的腫瘤。還可將這種制劑用于檢測是否存在任何有害的帶有甲胎蛋白受體的細(xì)胞，例如，采用Western印跡分析或用已知方法對組織樣品進行組織化學(xué)染色。重組HuAFP作為抗癌劑本發(fā)明的抗癌劑(如rHuAFP或其片段或類似物；或rHuAFP的雜合細(xì)胞毒素)可用于抑制腫瘤，如乳腺癌或前列腺癌。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解，任何用于體外和體內(nèi)測定抗癌劑的效果的方法均可用于本發(fā)明。例如，在給藥試驗化合物之后監(jiān)測長有前列腺癌(例如，LNCaP雄激素受體陽性人類前列腺癌細(xì)胞系的腫瘤異種移植)的小鼠或大小鼠的腫瘤生長的減少。在一個實施例中，通過胰蛋白酶消化將生長于培養(yǎng)物中的人類腫瘤細(xì)胞系[例如，諸如MCF-7(ATCCHTB22)、T-47D(ATCCHTB133)、MDA-MB-231(ATCCHTB26)、BT-20(ATCCHTB19)、NIHOV-CAR-3(ATCCHTB161)、LnCap.FGC(ATCCCRL1740)和Du-145(ATCCHTB81)從單層細(xì)胞中釋出，稀釋成單細(xì)胞懸浮液，并通過離心固化成沉淀，然后，在37℃下用15μl血纖蛋白原(50mg/ml)和10μl凝血酶(50單位/ml)處理30分鐘。然后將含有腫瘤的血纖蛋白塊切成直徑約為1.5mm的小塊。然后用標(biāo)準(zhǔn)方法將各腫瘤塊植入小鼠的腎囊下面。如果需要，可以在即將植入腫瘤之前開始用常規(guī)方法每日皮下注射(S.C.)60mg/kg環(huán)孢菌素A(SandimmuneIV)對小鼠進行免疫抑制。如果需要，用標(biāo)準(zhǔn)方法對小鼠進行雌激素和雄激素補充，例如植入含有雌二醇的硅化橡膠管或注射丙酸睪酮。通常，激素補充始于腫瘤移植的當(dāng)天。一般，試驗分子的使用是在腫瘤移植之前和/或腫瘤移植之后開始。對照動物接受安慰劑，如人血清蛋白或稀釋劑，以與給藥rHuAFP或相關(guān)分子類似的方式給藥安慰劑。用任何標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測試驗分子對腫瘤生長的影響。例如，通過剖腹術(shù)每周測定腫瘤大小的方式監(jiān)測腫瘤的生長，采用裝配有目鏡測微尺的解剖顯微鏡。通過實驗證明能夠阻止或減弱或抑制這種移植的腫瘤生長的分子被認(rèn)為可用于本發(fā)明?？梢杂萌魏螛?biāo)準(zhǔn)方法在體外測定試驗化合物對帶有可由rHuAFP識別的受體的細(xì)胞的毒性。例如，將培養(yǎng)的癌細(xì)胞系，如MCF-7雌激素受體-陽性人類乳腺癌細(xì)胞系維持在盛于塑料組織培養(yǎng)瓶(Costar)中的Dulbecco的改進Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中，DMEM中含有青霉素(100U/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、5％胎牛血清、胰島素(10ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和非必須氨基酸(1％)。以1×105/孔的濃度接種到96孔V形底的板上(Linbro-FlowLaboratoris，Mclean，VA)的完全培養(yǎng)基中。以各種濃度(10-12M-10-6M)加入推定的毒素，并在37℃下在5％CO2氣體中將培養(yǎng)物培養(yǎng)18小時。培養(yǎng)之后，于170xg離心所述的板5分鐘，除去培養(yǎng)基，并代之以100μl無亮氨酸的培養(yǎng)基(MEM，Gibco)，該培養(yǎng)基含有8μCi/ml(3H-亮氨酸；NewEnglandNuclear，Bostoa，MA)。在37℃下再培養(yǎng)90分鐘，然后以170xg離心所述板5分鐘，除去培養(yǎng)基，并用細(xì)胞收集器(Skatron，Sterling，VA)將細(xì)胞收集在玻璃纖維濾膜上。洗滌濾膜、干燥、并用標(biāo)準(zhǔn)方法計數(shù)。將僅用培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)胞作為對照。與未處理的對照細(xì)胞相比，對作為毒性指示的能減弱或阻止或抑制細(xì)胞生長的試驗化合物進行測定，并被視為可用于本發(fā)明。測定一種試驗化合物是否能產(chǎn)生抗腫瘤(乳腺癌或前列腺癌)發(fā)生的保護作用的方法一般涉及使用一種已知能產(chǎn)生腫瘤的動物(例如，在美國專利No.4,736,866中所披露的轉(zhuǎn)基因小鼠)。按標(biāo)準(zhǔn)方法用試驗化合物處理合適的動物，并將檢測到的與未處理的對照動物相比腫瘤發(fā)病的發(fā)病率的降低作為保護作用的指示。如下文所述，本發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在原核表達系統(tǒng)中產(chǎn)生的非糖基化rHuAFP能有效治療癌癥。例如，業(yè)已發(fā)現(xiàn)rHuAFP是體外生長的乳腺癌的有效的抑制劑。下面披露的實驗例證實了rHuAFP作為抗癌劑的效力。這些實驗例是用于說明本發(fā)明的，而不是要對本發(fā)明進行限定。實施例材料和方法培養(yǎng)基和腫瘤細(xì)胞從GIBCO(BRL)購買Dulbecco＇s改進的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)、RPMI1640、胎牛血清、谷氨酰胺、非必需氨基酸和青霉素-鏈毒素混合物。供體牛血清購自Hyclone，Logan，UT，而豬胰島素購自Squibb，Inc.，Princeton，NJ。MCF-7雌激素-受體-陽性人類乳腺癌細(xì)胞系由InstituteofExperimentalBiologyandMedicine，BuenosAires，ArgentinaAlbertoC.Baldi博士提供。母培養(yǎng)物維持于塑料組織培養(yǎng)燒瓶(Costar)中所盛的DMEM中，該DMEM含有青霉素(100u/ml)、鏈霉素(100μg/ml)、5％胎牛血清、胰島素(10ng/ml)、L-谷氨酰胺(2mM)和非必需氨基酸(1％)。雌激素刺激的MCF-7細(xì)胞在培養(yǎng)中的鋪滿后生長。該試驗基于以下發(fā)現(xiàn)MCF-7細(xì)胞在含雌激素的培養(yǎng)基中生長經(jīng)過鋪滿期，并聚積成集中點；但是，在缺乏雌激素的條件下，當(dāng)培養(yǎng)物中形成細(xì)胞-細(xì)胞接觸后細(xì)胞增殖終止，不能形成集中點(例如，參見Gierthy等，“乳腺癌的研究治療”(BreastCancerRes.Treat.)12227，1988)。將1×107MCF-7乳腺癌細(xì)胞接種到24-孔組織培養(yǎng)板的16mm孔中。培養(yǎng)基是無酚紅的DMEM，其中補充了5％供體牛血清(預(yù)先篩選可檢測雌激素的缺乏)、L-谷氨酰胺(2mM)、非必需氨基酸(1×，GIBCO)、胰島素(10ng/ml)、青霉素-鏈霉素(1×，GIBCO)和終濃度稀釋至1.8×10-9M的雌二醇。在24小時時向培養(yǎng)物中補充培養(yǎng)基，隨后每4天補充一次，每次補充2ml含有rHuAFP和人血清白蛋白的培養(yǎng)基，使每孔的最終蛋白濃度為100μg/ml。細(xì)胞在5天內(nèi)達到鋪滿，在10天內(nèi)在僅含雌激素的孔內(nèi)出現(xiàn)大量的集中點。用緩沖的福爾馬林固定細(xì)胞并用1％羅丹明B染色。用一臺Artek870Macro-MicroAutomatedColomyCounter對染色的集中點進行定量。所給出的數(shù)據(jù)為每個處理組的平均集中點的數(shù)目。結(jié)果rHuAFP抗MCF-7乳腺癌細(xì)胞活性圖9所示結(jié)果表明，rHuAFP能抑制雌激素刺激的MCF-7乳腺癌細(xì)胞在體外的鋪滿后生長。采用人白蛋白或無蛋白的對照實驗對MCF-7集中點的形成無影響。以上資料表明，rHuAFP對癌細(xì)胞培養(yǎng)物的生長有直接抑制作用。治療給藥如上所述，rHuAFP能有效抑制腫瘤，例如，乳腺細(xì)胞癌。因此，可以用已知方法將本發(fā)明的化合物配制成可以藥用的組合物?？梢杂冒谏韺W(xué)上可以接受的載體中的治療有效量的rHuAFP抗癌劑治療人類患者。合適的載體及其配方由E.W.Martin披露于Remington′s“藥學(xué)”(PharmaceuticalSciences)中?？拱﹦┑慕o藥量因給藥方式、患者的年齡和體重、以及疾病的類型而不同。一般，其用量在用于治療癌癥的其它制劑的用量范圍內(nèi)，不過，在某些場合需要較低的用量，因為該化合物的特異性較高。例如，如下文所述，以能抑制惡性細(xì)胞增殖的劑量系統(tǒng)給藥rHuAFP，劑量范圍通常為0.1ng-10g/kg體重。另外，本發(fā)明的方法也可以采用組合治療，其中rHuAFP與化療劑同時給藥或依次給藥。一般，用標(biāo)準(zhǔn)方法給藥化療劑，或者，以低于單用化療劑的劑量使用化療劑?；焺┑睦影ǎ幌抻诘?、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥、六羥甲基三聚氰氨、硫化三磷、白消安、亞硝脲氮芥、羅氮芥、賽氮芥、鏈脲菌素、氮烯咪胺、氨甲蝶呤、氟尿嘧啶、阿糖胞苷、巰基嘌呤、硫代鳥嘌呤、戊抑制素、長春花堿、長春新堿、鬼臼乙叉苷、鬼臼毒素、放線菌素D、道諾霉素、阿霉素、博來霉素、普卡霉素、絲裂霉素、順鉑、米托蒽醌、羥脲、鹽酸甲基芐肼、鄰氯苯對氯苯二氯乙烷、氨基苯乙哌啶酮、強的松、羥基孕酮、己烯雌酚、它莫西芬、氟硝丁酰胺、或促性腺激素釋放激素類似物。治療一般自診斷出腫瘤或懷疑有腫瘤時開始，通常是每天重復(fù)用藥。每天給藥rHuAFP也能防止腫瘤的發(fā)生。如果需要，用監(jiān)測或診斷患者是否患癌癥的方法對治療或保護方案的效果進行評價。另外，本發(fā)明的化合物也可用于治療哺乳動物，以殺死任何與病理學(xué)癥狀有關(guān)的、有害的、帶有甲胎蛋白受體的細(xì)胞。本發(fā)明方法也可用于治療非人類哺乳動物，例如，家畜或牲畜。如下文所述，本發(fā)明抗癌劑可以系統(tǒng)給藥或局部給藥。系統(tǒng)給藥本發(fā)明的化合物在被用作抗癌劑時可以系統(tǒng)給藥，例如，配制成藥學(xué)上可以接受的緩沖液，如生理鹽水。舉例來說，給藥的優(yōu)選方法包括皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)或真皮內(nèi)注射，以這種方法連續(xù)維持患者體內(nèi)的藥物水平。在其它優(yōu)選給藥方法中，可以通過注射一種緩釋制劑，例如，以緩慢解離的聚合或結(jié)晶形式將所述化合物輸入患者體內(nèi)；在這種持續(xù)給藥方式之前，可以用更常見的方法(例如，如上文所述的方法)開始給藥。另外，可以用灌輸泵給藥所述化合物，以便精確控制藥物釋放速度，或以類似于用于促進胰島素吸收的方式將所述化合物放入鼻道。作為經(jīng)鼻粘膜吸收的一種替代方式，可以用粉狀物的氣溶膠沉淀或溶液形式將本發(fā)明的化合物輸入肺部。局部給藥本發(fā)明的抗癌劑也可以局部給藥，以治療癌癥。由于所希望的治療劑的作用通常取決于涉及的組織的大小，例如，腫瘤的大小，因此以能導(dǎo)致腫瘤附近有很高的局部濃度的方式輸送藥物是特別理想的。將重組HuAFP作為診斷劑在檢測、監(jiān)測或分析腫瘤(例如，乳腺癌或前列腺癌)存在時可將與檢測標(biāo)記連接的重組HuAFP(或其片段或類似物)用于診斷目的。例如，可以用可檢測地標(biāo)記的rHuAFP(Tc-99m-標(biāo)記的rHuAFP)對人類患者進行體內(nèi)研究，以確定腫瘤的存在。一般，靜脈內(nèi)給藥可檢測地標(biāo)記的rHuAFP，并通過本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法用掃描儀進行顯像，例如，用閃爍照像法進行放射性顯像。在另一種實施方案中，可以用和一種檢測標(biāo)記連接的rHuAFP(或其片段或類似物)檢測諸如活組織、體液的組織樣品中腫瘤或任何帶有可由rHuAFP識別的受體的細(xì)胞的存在。在經(jīng)過以上測定后，應(yīng)當(dāng)檢驗取自患者的組織樣品、活組織或體液樣品、特別是淋巴、血、血清、或尿液中這種細(xì)胞的存在。因此，可由rHuAFP識別的受體的亞細(xì)胞定位或存在用分級分離的細(xì)胞通過任何標(biāo)準(zhǔn)生化或組織化學(xué)方法(例如，參見Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，“組織學(xué)技術(shù)的理論和實踐”(TheoryandPracticeofHistologicalTechniques)，ChurdillLivingstone，1982)進行原位或體外測定。用于分析的合適對照樣品包括自不具有帶有甲胎蛋白的細(xì)胞的個體內(nèi)采集的組織樣品或體液(負(fù)對照)，或含有已知的、預(yù)定數(shù)量甲胎蛋白受體的樣品(正對照)。診斷試驗可以用任何標(biāo)準(zhǔn)方法在溶液中或用固體(不可溶性)支持體(例如，聚苯乙烯、硝酸纖維素或珠粒)或在為組織學(xué)檢查而制備的組織樣品中進行。例如，為了確定從其身上采集試驗樣品的患者是否具有帶有可由rHuAFP識別的受體的細(xì)胞，將試驗樣品中可檢測地標(biāo)記的rHuAFP結(jié)合水平與其在負(fù)對照樣品和/或正對照樣品中的結(jié)合水平進行比較。當(dāng)在試驗樣品中的結(jié)合水平高于在負(fù)對照樣品中的結(jié)合水平時，或至少等于在正對照樣品中的結(jié)合水平時，表明該患者具有攜帶甲胎蛋白受體的細(xì)胞。用于按本發(fā)明方法進行診斷分析的材料，可以以帶有使用說明的試劑盒形式提供。一般，該試劑盒的部分地由rHuAFP(或其片段或類似物)組成。這種試劑盒還可以包括另一種試劑，例如，被用于標(biāo)記rHuAFP(或其片段或類似物)的檢測標(biāo)記。例如，上述試劑盒可用于體外檢測人體組織樣品中腫瘤的存在，或用于體內(nèi)檢測目的。下面所述的實驗范例證實了rHuAFP診斷腫瘤的效果。實施例材料和方法動物用本領(lǐng)域已知方法，在雌激素刺激條件下使植入CB-17SCID小鼠側(cè)胸部的MCF-7人類乳腺癌細(xì)胞生長至直徑為1cm大小(約5克)。锝標(biāo)記由與0.5m10.9％NaCl注射液(BaxterHealthcareCorporation，Deerfield，IL)混合的AFP試樣制備99mTc標(biāo)記的重組甲胎蛋白。將上述溶液加入UltraTagRBCReactionVial(MallinckrodtMedicalInc.，St.Louis，Mo63134LotNo.0683040)中，其中含有在氬氣下保存的凍干形式的氯化亞錫二水合物、檸檬酸鈉二水合物、和無水葡萄糖。通過輕微回蕩，混合上述小瓶中的內(nèi)含物，并在室溫下溫育5分鐘。在溫育結(jié)束時加入體積為1-2ml的0.8-1.2GbqTechnetium99mTcSodiumPertechnetateInjection(99mTcGeneratorMallincroletMedical，Inc.St.Louis，MO)。通過輕微回蕩，混合上述小瓶中的內(nèi)容物，并溫育15分鐘。在制備后0、3和6小時分析劑型試樣。用ITLC-SG(GelmanInstrumentCo.，AnnArbor，MI)以0.9％NaCl對制劑進行薄層層析，表明有95-99％的99Tc被結(jié)合在重組甲胎蛋白上。顯像用Medafane鎮(zhèn)靜實驗動物。然后將一個24徑計、3/4英寸的導(dǎo)管(SurfloIV導(dǎo)管，TerumoMedical)固定在側(cè)向尾脈沖。然后通過靜脈內(nèi)緩慢輸入20-25mg/kg體重戊巴比妥對上述動物作進一步麻醉。視需要通過另外注射5mg戊巴比妥保持麻醉，以便約束其行動。用一臺ElscintDymax409γ照像機收集同位素的生物分布數(shù)據(jù)。隨后用計算機(SiemansGammasonicsMicrodelta)分析這些數(shù)據(jù)。對動物進行3次顯像，動物以背躺著的姿勢放置在聚乙烯薄板上。為了避免在顯像期間動物活動，必要時可對動物進行約束，用膠帶將其肢體縛在上述板上，以便不會限制其呼吸。將所獲得的60分鐘的動態(tài)圖像用于測定標(biāo)記蛋白的生物分布。通常，以低能量一般目的的校準(zhǔn)獲得12幅順序的5分鐘圖像，并將1.5硬件放大成具有128×128像素的計算機矩陣。研究用動物通常注射37MBq的Tc-99m標(biāo)記的蛋白。結(jié)果示蹤劑生物分布和動力學(xué)在從尾脈中給藥37MBq(約4-6μgTc-99m重組人甲胎蛋白)之后，在注射后的頭1個小時和第24小時測定示蹤劑生物分布的動力學(xué)。以注射的活性/100感興趣的部位(ROI，RegionofInterested)象素的60％形式(％IA)測定組織吸收動力學(xué)。在第一小時內(nèi)，能迅速從腎臟消除，中度定位于肝臟，而在其它器官中很少有明顯活性。在第一小時時，腫瘤吸收為(平均±SEM1.9±0.3％IA)，而腫瘤與心臟(T/H)部位比值為0.84±0.23。到24小時時，腫瘤吸收為(0.8+/-0.1％IA)而T/A和腫瘤與背景(T/B上胸)部分之比分別為1.43±0.41和2.66±0.54。對在相同的動物上重復(fù)進行的99mTc-標(biāo)記的rHuAFP和99mTc-標(biāo)記的人血清白蛋白(用作非特異蛋白對照)的對比研究表明，對于99mTc標(biāo)記的rHuAFP來說，在1小時和24小時時的T/B圖像ROI活性比分別為2.7和5.8，而且，在24小時時99mTc標(biāo)記的rHuAFP的活性比Tc-99m人血清白蛋白高40％。以上結(jié)果表明，rHuAFP可以用Tc-99m標(biāo)記，而且，這種標(biāo)記的制劑具有低的非特異性組織吸收力并能由腎臟迅速從血液中清除。在人類乳腺癌異種移植體中的定位起初很快，并隨時間推移而加快，這是由于特異的腫瘤吸收。這些結(jié)果表明，用Tc-99m標(biāo)記的rHuAFP可用作乳腺癌的診斷劑。診斷用途如上所述，與可檢測的標(biāo)記連接的rHuAFP(或其片段或類似物)可用于診斷目的，用于腫瘤(如乳腺細(xì)胞癌)的檢測、監(jiān)測或分析。因此，出現(xiàn)典型的癌癥癥狀，如乳腺癌或前列腺癌癥狀的患者，或具有表明易患這種癌癥的醫(yī)學(xué)病史的患者可以用本發(fā)明方法進行檢驗。適合這種測試的其他患者包括那些具有乳腺癌或前列腺癌家族史的患者。還應(yīng)當(dāng)檢驗正接受藥物的患者或被涉及癌癥誘發(fā)的毒素作用過的患者。本發(fā)明的采用了可檢測地標(biāo)記過的rHuAFP(或其片段或類似物)的診斷方法可用于在出現(xiàn)與癌癥相關(guān)的臨床癥狀之前或之后檢測癌癥的存在。本發(fā)明的方法有利于在出現(xiàn)臨床癥狀(如可觸知的腫塊)之前和同時診斷腫瘤。例如，本發(fā)明的主題方法可用于在出現(xiàn)臨床癥狀之前診斷乳腺癌。另外，本發(fā)明的方法可使醫(yī)師準(zhǔn)確診斷出諸如乳腺癌或前列腺癌的腫瘤。本發(fā)明的診斷顯像方法可以用含于生理上可以接受的載體中的診斷有效量的rHuAFP診斷劑進行。例如，合適的載體及其配方由E.W.Martin披露于“Remington′s藥學(xué)”(Remingyon′sPharmaceuticalSciences)。欲給藥的診斷劑的量取決于以下因素給藥方式、患者的年齡和體重、疾病的類型、疾病的蔓延程度、以及患這種病的患者的體型。不過，一般用量在其它用于診斷癌癥的制劑的用量范圍內(nèi)，盡管在某些場合需要較低的用量，這是因為其具有較高的化合物特異性。例如，以靜脈內(nèi)注射方式給上述患者給藥可檢測地標(biāo)記的rHuAFP，以使腫瘤能夠顯像的劑量給藥，例如，用閃爍照查法進行放射性顯像。通常，劑量在0.1ng-10g/kg體重范圍內(nèi)。在本說明書中所提及的所有出版物、專利和專利申請均以相等的份量被收作本文的參考資料，如同每份出版物或?qū)＠暾埍痪唧w地或單獨地指明為可收作本發(fā)明的參考。本發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)基本發(fā)明還提供了用于細(xì)胞培養(yǎng)的含rHuAFP(或其片段或類似物)的培養(yǎng)基。雖然本發(fā)明培養(yǎng)基一般不需要使使用血清(例如，胎牛血清、牛血清、馬血清、正常小鼠血清、人血清、豬血清、兔血清等)，因為欲將所述rHuAFP用于取代或補充血清的用途，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，如果需要，可以加入血清。配養(yǎng)基成份一般是用本領(lǐng)域公知方法制備的。因此，任何標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基，如RMPI-1630培養(yǎng)基、CMRL培養(yǎng)基、Dulbecco′s改進的Eagle培養(yǎng)基(D-MEM)、Fischer′s培養(yǎng)基、Iscove′s改進的Dulbecco′s培養(yǎng)基、Mccoy′s培養(yǎng)基、極限必需培養(yǎng)基、NCTC培養(yǎng)基等可以以需要的有效濃度用rHuAFP(或其片段或類似物)配制。如果需要，用已知方法加入培養(yǎng)基補充成分，例如，鹽溶液(如Hank′s平衡鹽溶液或Earle′s平衡鹽溶液)、抗生素、核酸、氨基酸、糖類和維生素。如果需要，還可以有標(biāo)準(zhǔn)方法向培養(yǎng)基中加入生長因子、集落刺激因子、細(xì)胞因子等。例如，本發(fā)明培養(yǎng)基可以單獨或以組合形式含有下列任何物質(zhì)和rHuAFP(或其片段或類似物)紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞/巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)、巨噬細(xì)胞集落刺激因子(M-CSF)、白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5等)，胰島素生長因子(IGF)、運鐵蛋白、白蛋白、和干細(xì)胞生長因子(SCF)。本發(fā)明的培養(yǎng)基可用于培養(yǎng)多種真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞、酵母細(xì)胞、兩棲類細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞。本發(fā)明的培養(yǎng)基還可以用于培養(yǎng)任何組織或器官。所述培養(yǎng)基還可用于多種培養(yǎng)條件，并用于多種生物學(xué)目的。所述培養(yǎng)條件的例子包括，但不限于生物反應(yīng)器(如連續(xù)的或中空纖維生物反應(yīng)器)、細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物、半固體培養(yǎng)物、和長期細(xì)胞懸浮培養(yǎng)物。本發(fā)明的培養(yǎng)基還可用于工業(yè)用途，例如，培養(yǎng)雜交瘤細(xì)胞、遺傳工程哺乳動物細(xì)胞、組織或器官。將重組人甲胎蛋白作為細(xì)胞增殖劑用任何用于體外和體內(nèi)分析細(xì)胞增殖的試驗方法測定rHuAFP(或其片段或類似物)的細(xì)胞生長促進作用。如下文所述，本領(lǐng)域有用于體內(nèi)試驗rHuAFP(或其片段或類似物)的細(xì)胞生長促進或增進特征的動物系統(tǒng)。另外，還有多種可用于試驗rHuAFP(或其片段或類似物)的生長促進或生長增進特征的體外系統(tǒng)?？梢杂帽绢I(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定任何效應(yīng)于rHuAFP(或其片段或類似物)而增殖的細(xì)胞。例如，可以這樣監(jiān)測細(xì)胞(如骨髓細(xì)胞)增殖在含有試驗化合物的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)細(xì)胞，將試驗化合物單獨或以與其它生長因子組合形式人為加入無血清或血清基培養(yǎng)基。另外，可以在稀瓊脂或甲基纖維素的半固體基質(zhì)里培養(yǎng)所述骨髓細(xì)胞，而將試驗化合物單獨或以與其它生長因子組合形式人為加入到無血清或血清減少了的培養(yǎng)基中。在所述半固體基質(zhì)中，分離的前體細(xì)胞的子代效應(yīng)于rHuAFP或其片段或類似物增殖，以可鑒別的集落保持在一起。例如，一個骨髓細(xì)胞可以形成由多個骨髓細(xì)胞組成的克隆，所述細(xì)胞如NK細(xì)胞。這種系統(tǒng)提供了一種分析一種細(xì)胞是否單獨效應(yīng)于rHuAFP(或其片段或類似物)或效應(yīng)于rHuAFP與其它生長因子的組合的便捷方法。如果需要，按照標(biāo)準(zhǔn)方法鑒定并分離擴增的細(xì)胞亞群。例如，可以用熒光激活細(xì)胞分選儀(FACS)分析細(xì)胞。該方法一般包括用與熒光染料結(jié)合的抗體標(biāo)記細(xì)胞，并在一臺FACS上將標(biāo)記細(xì)胞和未標(biāo)記細(xì)胞分離，所述FACS如FACScan(BectonDickson)。因此，通過分析細(xì)胞表面抗原的存在，實際上可以對任何細(xì)胞進行鑒定和分離(例如，參見Shah等，“免疫學(xué)雜志”(J.Immunol.)1401861，1988)。當(dāng)?shù)玫揭粋€細(xì)胞群時，對其進行生化分析，或?qū)⑵渥鳛榱硪淮渭?xì)胞培養(yǎng)的原始群體，以便可以在培養(yǎng)條件確定的條件下對細(xì)胞的作用進行測定。在一個實施例中，用如下方法檢驗rHuAFP(或其片段或類似物)對人骨髓細(xì)胞生長的作用。一般，人體骨髓樣品是在獲得許可后用標(biāo)準(zhǔn)方法獲得。例如，骨髓是從健康供體的髂嵴中獲得的，并在室溫下將骨髓細(xì)胞稀釋在磷酸緩沖的鹽溶液里。然后洗滌細(xì)胞并使其在合適的生長培養(yǎng)基中生長。例如，可以通過將骨髓細(xì)胞接種在20-30ml含有50U/ml青霉素、50U/ml鏈霉素和2mML-谷氨酰胺的McCoy′s培養(yǎng)基中建立培養(yǎng)。在有或沒有單獨存在的或與諸如運鐵蛋白或GM-CSF的其它生長因子組合的條件下培養(yǎng)所述培養(yǎng)物。隨后在37℃下，在含有5％CO2、5％O2和90％N2的潮濕空氣中將培養(yǎng)物培養(yǎng)，持續(xù)所需要的時間。用標(biāo)準(zhǔn)方法進行細(xì)胞增殖試驗。例如，通過用1-2μCi的3HTdR脈沖細(xì)胞對在有和沒有試驗化合物的條件下培養(yǎng)的復(fù)制樣品進行分析。在經(jīng)過一定的培養(yǎng)時間后，將培養(yǎng)物收獲到玻璃纖維濾膜上并通過液體閃爍測定摻入的3H。對處理過的細(xì)胞和對照細(xì)胞，如在有rHuAFP的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞和在無rHuAFP的條件下培養(yǎng)的細(xì)胞進行對比研究，將其用于測定試驗分子在刺激細(xì)胞增殖方面的相對效力。能刺激細(xì)胞增殖的分子被視為可用于本發(fā)明。為了測定rHuAFP(或其片段或類似物)的增殖作用，例如，試驗化合物的體內(nèi)血細(xì)胞生成作用，用諸如靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射的標(biāo)準(zhǔn)方法，以合適劑量每天給亞致死輻射小鼠(或用諸如環(huán)孢菌素或FK-506的免疫抑制劑，或用諸如5-氟尿嘧啶或環(huán)磷酰胺的化療劑，或用本領(lǐng)域已知的任何其它貧化骨髓的方法處理過的小鼠)和正常小鼠給藥試驗分子。一般，給處理過的小鼠給藥試驗化合物是在用諸如亞致死輻射、免疫治療或化療法處理動物之前和/或之后開始。對照動物接受諸如人血清白蛋白或稀釋劑的安慰劑，以與給藥rHuAFP或相關(guān)分子類似的方法給藥安慰劑。用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)監(jiān)測試驗分子對血細(xì)胞生成的作用。例如，分析處理動物和對照動物的外周血和脾內(nèi)的白血球數(shù)。對諸如淋巴細(xì)胞譜系或骨髓譜系或任何其它類型細(xì)胞的骨髓進行定性和定量分析，也可以用常規(guī)方法進行測定和分析。比較處理過的動物和對照動物的數(shù)據(jù)，并將其用于測定試驗分子在促進細(xì)胞增殖方面的相對效力，例如，促進骨髓細(xì)胞產(chǎn)生、成熟B淋巴細(xì)胞、胸腺細(xì)胞或外周T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生。能刺激細(xì)胞增殖的試驗分子被視為可用于本發(fā)明。以下實施例證實了非糖基化rHuAFP在體外刺激骨髓生長的能力。該實施例是用了說明本發(fā)明的，而不是要限定本發(fā)明的范圍。實施例材料和方法動物由Jackson實驗室(BarHarbor，Maine)獲得成年雄性和雌性CBA/J小鼠。所有小鼠均在我們的動物飼養(yǎng)裝置中飼養(yǎng)和維持。用于該研究的動物為12-20周齡。培養(yǎng)物用改進的Dulbecco′s磷酸緩沖的鹽溶液(PBS)沖洗CBA/J小鼠的脛骨和股骨，并用消毒的注射器和25-規(guī)格(gauge)針頭收集骨髓細(xì)胞。通過讓細(xì)胞混合物反復(fù)從巴斯德移液管中通過獲得均勻的單細(xì)胞懸浮液。所有細(xì)胞通過在250xg下在PBS中離心10分鐘洗滌2次，然后通過臺盼藍(lán)染料排除法測其生活力。在所有實驗中均記錄到95％或更高的細(xì)胞活力。然后在使用之前將細(xì)胞調(diào)至理想濃度。在96孔圓底微量滴定板(FloWLaboratories，Mississauga，Ontario，Canada)中培養(yǎng)骨髓細(xì)胞(250,000)。培養(yǎng)基為無血清RPMI加4mML-谷氨酰胺、20mMHepes、100u/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素(GIBCOLaboratories，Burlington，Ontario，Canada)、5μg/ml運鐵蛋白和5×10-5乙-巰基乙醇(EastmanChemicalsCo.，RochesterN.Y.)。分別在沒有rHuAFP或有濃度為400μg/ml的rHuAFP的條件下培養(yǎng)細(xì)胞。所有培養(yǎng)物的總體積為0.2ml。細(xì)胞在37℃下在溫度為95％、含5％CO2的空氣中進行。收獲之前6小時，用1μCi氚化胸苷(NEN，比活性77.1Ci/mmol)對培養(yǎng)物進行脈沖。然后用多樣品收集器(Skatron，F(xiàn)loWLabs)將細(xì)胞收集在玻璃纖維墊(FlowLabs)上。用一臺LKB1215RackbetaII、通過標(biāo)準(zhǔn)液體閃爍技術(shù)測定不溶于水的氚化胸苷的摻入量。結(jié)果rHuAFP在無血清培養(yǎng)基中對骨髓增殖的作用在無血清培養(yǎng)基中測定純化rHuAFP對培養(yǎng)的鼠骨髓的影響。在該實施方案中，在沒有或有終濃度為400μg/ml以及終濃度為5μg/ml的運鐵蛋白的無血清RPMI中將獲自CBA/J小鼠的2.5×105活細(xì)胞培養(yǎng)72小時。圖10中所示數(shù)據(jù)表明，在有非糖基化rHuAFP的條件下，骨髓細(xì)胞能進行顯著的增殖反應(yīng)；刺激指數(shù)(SI)為35。在沒有rHuAFP的條件下培養(yǎng)骨髓細(xì)胞未觀察到這種增殖作用。治療如上所述，rHuAFP能有效促進細(xì)胞增殖，因此，可用于涉及促進細(xì)胞增殖，如骨髓細(xì)胞增殖的治療，并可用于預(yù)防免疫抑制療法、放療或化療、或其它已知會抑制免疫系統(tǒng)并抑制骨髓產(chǎn)生導(dǎo)致骨髓毒性的療法的副作用的治療。因此，rHuAFP(或其片段或類似物)被用于治療成紅細(xì)胞祖細(xì)胞或干細(xì)胞缺陷或相關(guān)疾病。重組HuAFP(或其片段或類似物)也可用于治療癌癥及其它導(dǎo)致骨髓毒性的其它病理學(xué)癥狀，治療受到輻射或藥物作用，例如包括白細(xì)胞減少、細(xì)菌和病毒感染、貧血、B細(xì)胞或T細(xì)胞缺陷，包括自身或非自身骨髓移植的免疫細(xì)胞或成紅細(xì)胞缺陷。重組HuAFP(或其片段或類似物)也可用于體外或體內(nèi)刺激巨核細(xì)胞和天然殺傷細(xì)胞的發(fā)育。本發(fā)明的培養(yǎng)基、組合物和方法也可用于治療通過骨髓移植(BMT)進行治療的癌癥，該方法包括自患者體內(nèi)取出骨髓，在來自體內(nèi)的培養(yǎng)物中維持這些細(xì)胞，同時對患者進行放療或化療，并在治療結(jié)束后將這些細(xì)胞重新植入患者體內(nèi)，以恢復(fù)患者的骨髓。因此，rHuAFP可用于BMT，作為在來自體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)基中重建骨髓的手段，并用于在體內(nèi)促進骨髓細(xì)胞的增殖。重組HuAFP(或其片段或類似物)也可用于其它細(xì)胞療法，例如細(xì)胞擴增和/或基因療法，需要來自體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)物的療法。重組HuAFP(或其片段或類似物)也可用于預(yù)防自身或同種骨髓移植的排斥作用。治療給藥可用已知方法將重組HuAFP(或其片段或類似物)配制成可以藥用的組合物。重組人甲胎蛋白，如rHuAFP(或其片段或類似物)優(yōu)選以能有效預(yù)防或改善髓毒性的癥狀的劑量向患者給藥。一般0.1ng/kg-10g/kg體重的劑量是足夠的。例如，可以用治療有效量的、包含于生理上可以接受的載體中的rHuAFP(或其片段或類似物)治療人類患者。例如，合適的載體及其配方由E.W.Martin披露于Remingtor′s藥學(xué)(Remington＇sPharmaceuticalSciences)中。rHuAFP的用量取決于以下因素；給藥方式、患者的年齡和體重、疾病的類型、傾向于患或正患該病的患者的體型。例如，給藥的優(yōu)選方法包括經(jīng)口給藥，皮下、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、肌內(nèi)、經(jīng)皮或真皮內(nèi)注射，由此持續(xù)保持患者體內(nèi)的藥物水平。在其它優(yōu)選給藥方法中，可以通過注射或植入諸如緩慢解離的聚合成結(jié)晶形式的緩釋制劑的方法給患者給藥rHuAFP；在這種持續(xù)給藥之前，可以用更常見的方法(如上所述)開始用藥。另外，可以用外置的或可植入的灌輸泵給藥rHuAFP，以便精確地控制藥物的釋放速度，或以類似于用于促進胰島素吸收的方式將rHuAFP放入鼻道。作為經(jīng)鼻粘膜吸收的一種替代形式，可以粉狀物的氣溶膠沉淀或溶液形式將rHuAFP輸入肺部。本發(fā)明的治療方法和組合物還包括與其它人類生長因子一起給藥。用于這種目的的細(xì)胞因子或血細(xì)胞生成素的例子包括，但不限于諸如白介素(IL-1)、GM-CSF、G-CSF、M-CSF、腫瘤壞死因子(TNF)、運鐵蛋白和紅細(xì)胞生成素的因子。諸如B細(xì)胞生長因子、B細(xì)胞分化因子或嗜伊紅粒細(xì)胞分化因子的生長因子也可以用于與rHuAFP(或其片段或類似物)一起給藥。可以對上述劑量進行調(diào)整，以補償治療組合物中的上述其它成分?？梢杂贸Ｒ?guī)方法監(jiān)測受治患者的進展。一般，治療始于診斷出或懷疑有骨髓毒性時，并且有規(guī)律地重復(fù)進行或每天重復(fù)進行，以改善或預(yù)防癥狀的發(fā)展或惡化。在發(fā)病之前給藥rHuAFP也可以防止或預(yù)防骨髓毒性的發(fā)展。如果需要，可以用監(jiān)測或診斷患者骨髓毒性的方法測定治療或預(yù)防的效果。本發(fā)明方法也可用于治療非人類哺乳動物，例如，家畜或牲畜。其它實施方案在其它實施方案中，本發(fā)明包括將rHuAFP(或其片段或類似物)用于預(yù)防或治療獲得性免疫缺損綜合癥(AIDS)。為了測定rHuAFP或其片段或類似物對AIDS的免疫抑制作用，即該化合物預(yù)防或改善AIDS的自身免疫作用的能力，用諸如靜脈內(nèi)或腹膜內(nèi)注射的標(biāo)準(zhǔn)方法以上述合適劑量每日給合適動物(如人類患者)給藥試驗化合物。一般，給藥是在AIDS發(fā)作之前和/或出現(xiàn)AIDS臨床癥狀之后開始。對照動物接受安慰劑，如人血清白蛋白，以與給藥rHuAFP或相關(guān)分子類似的方式給藥安慰劑。用標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測試驗化合物對AIDS的影響。例如，可以監(jiān)測對試驗化合物抑制、預(yù)防或改善輔助T細(xì)胞的破壞作用的分析。對處理過的動物和對照動物的對比研究可用于確定試驗化合物在預(yù)防或改善AIDS方面的相對效力。能預(yù)防或改善(減弱，或抑制，或緩解，或促進減輕)AIDS癥狀的分子被視為可用于本發(fā)明。本發(fā)明還包括將治療有效量的rHuAFP(或其片段或類似物)用于抑制哺乳動物的器官(如心臟、肝臟、肺、胰腺和腎臟)、組織(如皮膚、骨髓、硬腦膜、骨、植入的膠原、植入的生物反應(yīng)器)或細(xì)胞(如β胰島細(xì)胞、干細(xì)胞、血細(xì)胞生成細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞或腎上腺細(xì)胞)移植的排斥作用。所述移植器官、組織或細(xì)胞可以源于任何來源，例如，這種生物材料可以是同種型的、同表型的、自身的、合成的、人工的或遺傳工程的。例如，當(dāng)患者是同種異體移植，如來自另一物種的心臟或腎臟的受體時可以采用該方法。在一種實施方案中，rHuAFP對臨床移植的免疫抑制作用，即rHuAFP預(yù)防或改善移植排斥作用(例如，超急性排斥、急性排斥和慢性排斥)的能力是用諸如靜脈內(nèi)注射或腹膜內(nèi)注射的標(biāo)準(zhǔn)方法以合適劑量每天給NIH小型豬給藥rHuAFP的方式進行測定。一般，rHuAFP的給藥是在移植，如腎臟移植之前和/或移植過程之后開始。對照動物接受安慰劑，如人血清白蛋白，以給藥rHuAFP的類似方法給藥。用標(biāo)準(zhǔn)方法監(jiān)測rHuAFP對移植排斥的影響。排斥過程的一種表現(xiàn)形式是移植器官的功能受到損傷，例如，可以監(jiān)測尿液排出量的分析。如果需要，可以對腎組織進行組織學(xué)檢驗(例如，用任何標(biāo)準(zhǔn)的組織化學(xué)或免疫組織化學(xué)方法，例如，參見Ausubel等，同上；Bancroft和Stevens，同上)，并對通過活檢獲得的組織樣品進行顯微鏡檢，以尋找移植排斥的證據(jù)，如慢性間質(zhì)纖維化、血管血栓形成或異常淋巴浸潤的出現(xiàn)。對處理過的動物和對照動物的比較研究可用于測定rHuAFP在預(yù)防或改善抑制排斥方面的相對效力。能預(yù)防或改善(減弱，或抑制，或緩解，或促進減輕)移植排斥癥狀的重組HuAFP(或其片段或類似物)被視為可用于本發(fā)明。在本發(fā)明說明書中提及的所有出版物、生產(chǎn)商的說明、專利、及專利申請被以同樣的份量收作本發(fā)明的參考資料，如同每份出版物或?qū)＠暾埍惶匾夂头謩e指明收作本文的參考一樣。序列表(1)一般資料(i)申請人Murgita，RobertA(ii)發(fā)明名稱克隆人甲胎蛋白的表達和純化(iii)序列數(shù)目20(iv)通訊地址(A)收件人Fish和RichardsonP.C.(B)街道225FranklinStreet，Suite3100(C)城市Boston(D)洲MA(E)國家USA(F)由編02110-2804(V)計算機可讀形式(A)媒介類型軟盤(B)計算機IBMPC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentInRe1ease#1.0，#1.30版(vi)當(dāng)前申請資料(A)申請?zhí)朠CT/US96/---(B)申請日1996年1月24日(C)分類(vii)在先申請資料(A)申請?zhí)?8/377,317(B)申請日1995年1月24日(C)分類(A)申請?zhí)?8/377,311(B)申請日1995年1月24日(C)分類(A)申請?zhí)?8/377,309(B)申請日1995年1月24日(C)分類(A)申請?zhí)?8/377,316(B)申請日1995年1月24日(C)分類(A)申請?zhí)?8/505,012(B)申請日1995年7月21日(C)分類(viii)律師/代理人資料(A)姓名Clark，PaulT.(B)注冊號30,162(C)資料/文件號06727/003001(ix)通訊資料(A)電話(617)542-5070(B)傳真(617)542-8906(C)電傳200154(2)序列l(wèi)資料(i)序列特征(A)長度21個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列1TGTCTGCAGGATGGGGAAAAA(2)序列2資料(i)序列特征(A)長度18個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列2CATGAAATGACTCCAGTA(2)序列3資料(i)序列特征(A)長度18個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列3CATAGAAATGAATATGGA(2)序列4資料(i)序列特征(A)長度2022個堿基(B)類型核酸(C)鏈型未涉及(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列4ATATTGTGCTTCCACCACTGCCAATAACAAAATAACTAGCAACCATGAAGTGGGTGGAAT60CAATTTTTTTAATTTTCCTACTAAATTTTACTGAATCCAGAACACTGCATAGAAATGAAT120ATGGAATAGCTTCCATATTGGATTCTTACCAATGTACTGCAGAGATAAGTTTAGCTGACC180TGGCTACCATATTTTTTGCCCAGTTTGTTCAAGAAGCCACTTACAAGGAAGTAAGCAAAA240TGGTGAAAGATGCATTGACTGCAATTGAGAAACCCACTGGAGATGAACAGTCTTCAGGGT300GTTTAGAAAACCAGCTACCTGCCTTTCTGGAAGAACTTTGCCATGAGAAAGAAATTTTGG360AGAAGTACGGACATTCAGACTGCTGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAAGACATAACTGTTTTC420TTGCACACAAAAAGCCCACTGCAGCATGGATCCCACTTTTCCAAGTTCCAGAACCTGTCA480CAAGCTGTGAAGCATATGAAGAAGACAGGGAGACATTCATGAACAAATTCATTTATGAGA540TAGCAAGAAGGCATCCCTTCCTGTATGCACCTACAATTCTTCTTTCGGCTGCTGGGTATG600AGAAAATAATTCCATCTTGCTGCAAAGCTGAAAATGCAGTTGAATGCTTCCAAACAAAGG660CAGCAACAGTTACAAAAGAATTAAGAGAAAGCAGCTTGTTAAATCAACATGCATGTCCAG720TAATGAAAAATTTTGGGACCCGAACTTTCCAAGCCATAACTGTTACTAAACTGAGTCAGA780AGTTTACCAAAGTTAATTTTACTGAAATCCAGAAACTAGTCCTGGATGTGGCCCATGTAC840ATGAGCACTGTTGCAGAGCAGATGTGCTGGATTGTCTGCAGGATGGGGAAAAAATCATGT900CCTACATATGTTCTCAACAAGACACTCTGTCAAACAAAATAACAGAATGCTGCAAACTGA960CCACGCTGGAACGTGGTCAATGTATAATTCATGCAGAAAATGATGAAAAACCTGAAGGTC1020TATCTCCAAATCTAAACAGGTTTTTAGGAGATAGAGATTTTAACCAATTTTCTTCAGGGG1080AAAAAAATATCTTCTTGGCAAGTTTTGTTCATGAATATTCAAGAAGACATCCTCAGCTTG1140CTGTCTCAGTAATTCTAAGAGTTGCTAAAGGATACCAGGAGTTATTGGAGAAGTGTTTCC1200AGACTGAAAAACCCTCTTGAATGCCAAGATAAAGGAGAAGAAGAATTACAGAAATACATCC1260AGGAGAGCCAAGCATTGGCAAAGCGAAGCTGCGGCCTCTTCCAGAAACTAGGAGAATATT1320ACTTACAAAATGAGTTTCTCGTTGCTTACACAAAGAAAGCCCCCCAGCTGACCTCGTCGG1380AGCTGATGGCCATCACCAGAAAAATGGCAGCCACAGCAGCCACTTGTTGCCAACTCAGTG1440AGGACAAACTATTGGCCTGTGGCGAGGGAGCGGCTGACATTATTATCGGACACTTATGTA1500TCAGACATGAAATGACTCCAGTAAACCCTGGTGTTGGCCAGTGCTGCACTTCTTCATATG1560CCAACAGGAGGCCATGCTTCAGCAGCTTGGTGGTGGATGAAACATATGTCCCTCCTGCAT1620TCTCTGATGACAAGTTCATTTTCCATAAGGATCTGTGCCAAGCTCAGGGTGTAGCGCTGC1680AAAGGATGAAGCAAGAGTTTCTCATTAACCTTGTGAAGCAAAAGCCACAAATAACAGAGG1740AACAACTTGAGGCTCTCATTGCAGATTTCTCAGGCCTGTTGGAGAAATGCTGCCAAGGCC1800AGGAACAGGAAGTCTGCTTTGCTGAAGAGGGACAAAAACTGATTTCAAAAACTGGTGCTG1860CTTTGGGAGTTTAAATTACTTCAGGGGAAGAGAAGACAAAACGAGTCTTTCATTCGGTGT1920GAACTTTTCTCTTTAATTTTAACTGATTTAACACTTTTTGTGAATTAATGATAAAGACTT1980TTATGTGAGATTTCCTTATCACAGAAATAAAATATCTCCAAA2022(2)序列5資料(i)序列特征(A)長度590個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未涉及(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列5ThrLeuHisArgAsnGluTyrGlyIleAlaSerIleLeuAspSerTyr151015GlnCysThrAlaGluIleSerLeuAlaAspLeuAlaThrIlePhePhe202530AlaGlnPheValGlnGluAlaThrTyrLysGluValSerLysMetVal354045LysAspAlaLeuThrAlaIleGluLysProThrGlyAspGluGlnSer505560SerGlyCysLeuGluAsnGlnLeuProAlaPheLeuGluGluLeuCys65707580HisGluLysGluIleLeuGluLysTyrGlyHisSerAspCysCysSer859095GlnSerGluGluGlyArgHisAsnCysPheLeuAlaHisLysLysPro100105110ThrAlaAlaTrpIleProLeuPheGlnValProGluProValThrSer115120125CysGluAlaTyrGluGluAspArgGluThrPheMetAsnLysPheIle130135140TyrGluIleAlaArgArgHisProPheLeuTyrAlaProThrIleLeu145150155160LeuSerAlaAlaGlyTyrGluLysIleIleProSerCysCysLysAla165170175GluAsnAlaValGluCysPheGlnThrLysAlaAlaThrValThrLys180185190GluLeuArgGluSerSerLeuLeuAsnGlnHisAlaCysProValMet195200205LysAsnPheGlyThrArgThrPheGlnAlaIleThrValThrLysLeu210215220SerGlnLysPheThrLysValAsnPheThrGluIleGlnLysLeuVal225230235240LeuAspValAlaHisValHisGluHisCysCysArgAlaAspValLeu245250255AspCysLeuGlnAspGlyGluLysIleMetSerTyrIleCysSerGln260265270GlnAspThrLeuSerAsnLysIleThrGluCysCysLysLeuThrThr275280285LeuGluArgGlyGlnCysIleIleHisAlaGluAsnAspGluLysPro290295300GluGlyLeuSerProAsnLeuAsnArgPheLeuGlyAspArgAspPhe305310315320AsnGlnPheSerSerGlyGluLysAsnIlePheLeuAlaSerPheVal325330335HisGluTyrSerArgArgHisProGlnLeuAlaValSerValIleLeu340345350ArgValAlaLysGlyTyrGlnGluLeuLeuGluLysCysPheGlnThr355360365GluAsnProLeuGluCysGlnAspLysGlyGluGluGluLeuGlnLys370375380TyrIleGlnGluSerGlnAlaLeuAlaLysArgSerCysGlyLeuPhe385390395400GlnLysLeuGlyGluTyrTyrLeuGlnAsnGluPheLeuValAlaTyr405410415ThrLysLysAlaProGlnLeuThrSerSerGluLeuMetAlaIleThr420425430ArgLysMetAlaAlaThrAlaAlaThrCysCysGlnLeuSerGluAsp435440445LysLeuLeuAlaCysGlyGluGlyAlaAlaAspIleIleIleGlyHis450455460LeuCysIleArgHisGluMetThrProValAsnProGlyValGlyGln465470475480CysCysThrSerSerTyrAlaAsnArgArgProCysPheSerSerLeu485490495ValVa1A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rgLysMetAlaAla225230235240ThrAlaAlaThrCysCysGlnLeuSerGluAspLysLeuLeuAlaCys245250255GlyGluGlyAlaAlaAspIleIleIleGlyHisLeuCysIleArgHis260265270GluMetThrProVa1AsnProGlyValGlyGlnCysCysThrSerSer275280285TyrAlaAsnArgArgProCysPheSerSerLeuValValAspGluThr290295300TyrValProProAlaPheSerAspAspLysPheIlePheHisLysAsp305310315320LeuCysGlnAlaGlnGlyValAlaLeuGlnArgMerLysGlnGluPhe325330335LeuIleAsnLeuValLysGlnLysProGlnIleThrGluGluGlnLeu340345350GluAlaLeuIleAlaAspPheSerGlyLeuLeuGluLysCysCysGln355360365GlyGlnGluGlnGluValCysPheAlaGluGluGlyGlnLysLeuIle370375380SerLysThrGlyAlaAlaLeuGlyVal385390(2)序列11資料(i)序列特征(A)長度325個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未涉及(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列11MetSerTyrIleCysSerGlnGlnAspThrLeuSerAsnLyeIleThr151015GluCysCysLysLeuThrThrLeuGluArgGlyGlnCysIleIleHis202530AlaGluAsnAspGluLysProGluGlyLeuSerProAsnLeuAsnArg354045PheLeuGlyAspArgAspPheAsnGlnPheSerSerGlyGluLysAsn505560IlePheLeuAlaSerPheValHisGluTyrSerArgArgHisProGln65707580LeuAlaValSerValIleLeuArgValAlaLysGlyTyrGlnGluLeu859095LeuGluLysCysPheGlnThrGluAsnProLeuGluCysGlnAspLys100105110GlyGluGluGluLeuGlnLysTyrIleGlnGluSerGlnAlaLeuAla115120125LysArgSerCysGlyLeuPheGlnLysLeuGlyGluTyrTyrLeuGln130135140AsnGluPheLeuValAlaTyrThrLysLysAlaProGlnLeuThrSer145150155160SerGluLeuMetAlaIleThrArgLysMetAlaAlaThrAlaAlaThr165170175CysCysGlnLeuSerGluAspLysLeuLeuAlaCysGlyGluGlyAla180185190AlaAspIleIleIleGlyHisLeuCysIleArgHisGluMetThrPro195200205ValAsnProGlyValGlyGlnCysCysThrSerSerTyrAlaAsnArg210215220ArgProCysPPheGerSerLeuValValAspGluThrTyrValProPro225230235240AlaPheGerAspAspLysPheIlePheHisLysAspLeuCysGlnAla245250255GlnGlyValAlaLeuGlnArgMetLysGlnGluPheLeuIleAsnLeu260265270ValLysGlnLysProGlnIleThrGluGluGlnLeuGluAlaLeuIle275280285AlaAspPheSerGlyLeuLeuGluLysCysCysGlnGlyGlnGluGln290295300GluValCysPheAlaGluGluGlyGlnLysLeuIleSerLysThGly305310315320AlaAlaLeuGlyVal325(2)序列12資料(i)序列特征(A)長度324個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未涉及(D)拓樸結(jié)構(gòu)蛋白(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列12SerTyrIleCysSerGlnGlnAspThrLeuSerAsnLysIleThrGlu151015CysCysLysLeuThrThrLeuGluArgGlyGlnCysIleIleHisAla202530GluAsnAspGluLysProGluGlyLeuSerProAsnLeuAsnArgPhe354045LeuGlyAspArgAspPheAsnGlnPheSerSerGlyGluLysAsnIle505560PheLeuAlaSerPheValHisGluTyrSerArgArgHisProGlnLeu65707580AlaValSerVa1IleLeuArgValAlaLysGlyTyrGlnGluLeuLeu859095GluLysCysPheGlnThrGluAsnProLeuGluCysGlnAspLysGly100105110GluGluGluLeuGlnLysTyrIleGlnGluSerGlnAlaLeuAlaLys115120125ArgSerCysGlyLeuPheGlnLysLeuGlyGluTyrTyrLeuGlnAsn130135140GluPheLeuValAlaTyrThrLysLysAlaProGlnLeuThrSerSer145150155160GluLeuMetAlaIleThrArgLysMetAlaAlaThrAlaAlaThrCys165170175CysGlnLeuSerGluAspLysLeuLeuAlaCysGlyGluGlyAlaAla180185190AspIleIleIleGlyHisLeuCysIleArgHisGluMetThrProVal195200205AsnProGlyValGlyGlnCysCysThrSerSerTyrAlaAsnArgArg210215220ProCysPheSerSerLeuValValAspGluThrTyrValProProAla225230235240PheSerAspAspLysPheIlePheHisLysAspLeuCysGlnAlaGln245250255GlyValAlaLeuGlnArgMetLysGlnGluPheLeuIleAsnLeuVal260265270LysGlnLysProGlnIleThrGluGluGlnLeuGluAlaLeuIleAla275280285AspPheSerGlyLeuLeuGluLysCysCysGlnGlyGlnGluGlnGlu290295300ValCysPheAlaGluGluGlyGlnLysLeuIleSerLysThrGlyAla305310315320AlaLeuGlyVal(2)序列13資料(i)序列特征(A)長度9個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未涉及(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列13SerTyrIleCysSerGlnGlnAspThr15(2)序列14資料(i)序列特征(A)長度30個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列14AAAAAAGGTACCACACTGCATAGAAATGAA(2)序列15資料(i)序列特征(A)長度33個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列15AAAAAAGGATCCTTAGCTTTCTCTTAATTCTTT(2)序列16資料(i)序列特征(A)長度33個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列16AAAAAATCGATATGAGCTTGTTAAATCAACAT(2)序列17資料(i)序列特征(A)長度33個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列17AAAAAAGGATCCTTAGCTCTCCTGGATGTATTT(2)序列18資料(i)序列特征(A)長度33個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列18AAAAAAATCGATATGCAAGCATTGGCAAAGCGA(2)序列19資料(i)序列特征(A)長度33個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列19AAAAAAGGATCCTTAAACTCCCAAAGCAGCACG(2)序列20資料(i)序列特征(A)長度33個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列20AAAAAAATCGATATGTCCTACATATGTTCTCAA(2)序列21資料(i)序列特征(A)長度21個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列21GATCTAGAATTCGGATCCGGT(2)序列22資料(i)序列特征(A)長度10個氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型未涉及(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型蛋白(xi)序列描述序列22AspLeuGluPheMetThrLeuHisArgAsn1510(2)序列23資料(i)序列特征(A)長度32個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列23AAAAAACTCGAGATACACTGCATAGAAATGAA(2)序列24資料(i)序列特征(A)長度33個堿基(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述序列24AAAAAAGAATTCTTAAACTCCCAAAGCAGCACG權(quán)利要求1.大體上純的有生物活性的重組人甲胎蛋白，其含有一段大體上相同于圖1的氨基酸1-389(序列9)或其片段的序列。2.如權(quán)利要求1的純的重組人甲胎蛋白，其中，所述人甲胎蛋白是用一種原核細(xì)胞生產(chǎn)的。3.大體上純的有生物活性的重組人甲胎蛋白，其含有一段大體上相同于圖1的氨基酸198-590(序列10)或其片段的序列。4.如權(quán)利要求3的純的重組人甲胎蛋白，其中，所述甲胎蛋白是用一種原核細(xì)胞生產(chǎn)的。5.大體上純的有生物活性的重組人甲胎蛋白，其含有一段大體上相同于圖1的氨基酸198-389(序列7)或其片段的序列。6.如權(quán)利要求5的純的重組人甲胎蛋白，其中，所述人甲胎蛋白是用一種原核細(xì)胞生產(chǎn)的。7.大體上純的有生物活性的重組人甲胎蛋白，其含有一段大體上相同于圖1的氨基酸390-590(序列8)或其片段的序列。8.大體上純的重組人甲胎蛋白，其中，所述人甲胎蛋白是用一種原核細(xì)胞生產(chǎn)的。9.大體上純的有生物活性的重組人甲胎蛋白，其含有一段大體上相同于圖1的氨基酸267-590(序列11)或其片段的序列。10.如權(quán)利要求9的純的重組人甲胎蛋白，其中，所述人甲胎蛋白是用一種原核細(xì)胞生產(chǎn)的。11.一種治療組合物，其含有權(quán)利要求1、3、5、7和9的大體上純的人重組甲胎蛋白。12.一種用昆蟲細(xì)胞生產(chǎn)有生物活性的重組人甲胎蛋白或其片段或類似物的方法，包括(a)提供一種轉(zhuǎn)化了的昆蟲細(xì)胞，其含有一個編碼所述人甲胎蛋白或其片段或類似物的重組DNA分子，該DNA分子可操作地和一個表達控制因子連接，由該控制因子指導(dǎo)所述人甲胎蛋白或其片段或類似物的表達；(b)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)化細(xì)胞；和(c)回收所述有生物學(xué)活性的人甲胎蛋白或其片段或類似物。13.如權(quán)利要求12的方法，其中，所述昆蟲細(xì)胞是草地食夜蛾(Spodopterafrugiperda)。14.用權(quán)利要求12的方法生產(chǎn)的大體上純的人甲胎蛋白或其片段或類似物。15.一種治療組合物，其含有權(quán)利要求14的大體上純的人甲胎蛋白或其片段或類似物。16.一種抑制哺乳動物自身反應(yīng)免疫細(xì)胞增殖的方法，該方法包括向所述哺乳動物給藥治療有效量的重組人甲胎蛋白或其免疫細(xì)胞抗增殖片段或類似物。17.如權(quán)利要求16的方法，其中，所述免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞。18.如權(quán)利要求16的方法，其中，所述免疫細(xì)胞包括B細(xì)胞。19.如權(quán)利要求16的方法，其中，所述哺乳動物是人類患者。20.如權(quán)利要求16的方法，其中，所述重組甲胎蛋白是在一種原核細(xì)胞中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。21.如權(quán)利要求20的方法，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。22.一種治療哺乳動物自身免疫病的方法，該方法包括向所述哺乳動物給藥治療有效量的重組人甲胎蛋白或其免疫細(xì)胞抗增殖片段或類似物。23.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是多發(fā)性硬化。24.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎。25.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是重癥肌無力。26.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是胰島素依賴性糖尿病。27.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述自身免疫病是系統(tǒng)性紅斑狼瘡。28.如權(quán)利要求22的方法，其中，所述重組甲胎蛋白是在一種原核細(xì)胞中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。29.如權(quán)利要求28的方法，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。30.如權(quán)利要求16的方法，其中還包括向所述哺乳動物給藥一種有效劑量的免疫抑制劑，該劑量低于單獨使用所述免疫抑制劑的標(biāo)準(zhǔn)劑量。31.如權(quán)利要求16的方法.其中還包括向所述動物給藥一種耐受劑。32.如權(quán)利要求30或31的方法，其中所述重組人甲胎蛋白是在原核細(xì)胞中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。33.如權(quán)利要求32的方法，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。34.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述免疫抑制劑是環(huán)孢菌素。35.如權(quán)利要求30的方法，其中，所述免疫抑制劑是類固醇、硫唑嘌呤，F(xiàn)K-506或15-脫氧精胍菌素。36.一種抑制哺乳動物腫瘤的方法，該方法包括向所述哺乳動物給藥治療有效量的重組人甲胎蛋白或其抗腫瘤片段或類似物。37.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述哺乳動物是人類患者。38.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述腫瘤是惡性腫瘤。39.如權(quán)利要求38的方法，其中，所述惡性腫瘤是乳腺癌。40.如權(quán)利要求38的方法，其中所述惡性腫瘤是前列腺癌。41.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述重組人甲胎蛋白是在原核細(xì)胞中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。42.如權(quán)利要求41的方法，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。43.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述腫瘤細(xì)胞能表達一種可由所述重組人甲胎蛋白識別的受體。44.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述腫瘤是癌。45.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述腫瘤是腺癌。46.如權(quán)利要求36的方法，其中所述腫瘤是肉瘤。47.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述腫瘤增殖效應(yīng)于雌激素。48.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述的給藥能抑制所述哺乳動物的所述腫瘤的細(xì)胞增殖。49.如權(quán)利要求36的方法，其中，所述的給藥能殺死所述哺乳動物的所述腫瘤的細(xì)胞。50.如權(quán)利要求36的方法，其還包括向所述哺乳動物給藥一種有效量的化療劑，該劑量低于單獨使用所述療劑時的標(biāo)準(zhǔn)劑量。51.一種預(yù)防哺乳動物產(chǎn)生腫瘤的方法，其包括向所述哺乳動物給藥治療有效量的重組人甲胎蛋白。52.如權(quán)利要求51的方法，其中，所述重組人甲胎蛋白是在一種原核細(xì)胞中產(chǎn)生的，而且是非糖基化的。53.如權(quán)利要求52的方法，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。54.一種雜合細(xì)胞毒素，其含有與一種細(xì)胞毒性劑連接的重組人甲胎蛋白。55.如權(quán)利要求54的雜合細(xì)胞毒素，其中，所述細(xì)胞毒性劑是一種蛋白。56.如權(quán)利要求54的雜合細(xì)胞毒素，其中，所述細(xì)胞毒性劑通過化學(xué)方法和所述重組人甲胎蛋白綴合。57.如權(quán)利要求54的雜合細(xì)胞毒素，其中，所述細(xì)胞毒素是通過一個肽鍵與所述重組人甲胎蛋白連接，所述雜合毒素是通過表達遺傳工程的雜合DNA分子而產(chǎn)生的。58.一種可檢測地標(biāo)記的重組人甲胎蛋白或其可檢測地標(biāo)記的片段或類似物，其能夠與人類腫瘤細(xì)胞結(jié)合。59.如權(quán)利要求58的分子，其被用一種放射性核素標(biāo)記。60.如權(quán)利要求59的分子，其中，所述放射性核素是锝-99m。61.如權(quán)利要求58的分子，其中，所述重組人甲胎蛋白是在原核細(xì)胞中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。62.如權(quán)利要求61的分子，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。63.一種在活體內(nèi)對人類患者的具腫瘤細(xì)胞的部位進行顯像的方法，該方法包括(a)提供一種權(quán)利要求58的可檢測地標(biāo)記的分子；(b)向所述患者給藥該分子；(c)讓所述標(biāo)記分子和含有所述細(xì)胞的部位結(jié)合，并將未結(jié)合的分子從所述的具腫瘤細(xì)胞的部位清除；和(d)獲得所述含腫瘤細(xì)胞部位的圖像。64.如權(quán)利要求63的方法，其中，所述部位是乳腺。65.如權(quán)利要求63的方法，其中，所述部位是前列腺。66.如權(quán)利要求63的方法，其中，所述部位是骨髓。67.如權(quán)利要求63的方法，其中，所述部位是肝臟。68.如權(quán)利要求63的方法，其中，所述圖像是用閃爍照像法獲得的。69.一種診斷生物樣品中的腫瘤的方法，該方法包括(a)將所述生物樣品與權(quán)利要求58的可檢測地標(biāo)記了的分子結(jié)合；和(b)檢測所述與該樣品結(jié)合的標(biāo)記，其中，當(dāng)標(biāo)記檢測高于背景水平時表明患者患有腫瘤。70.如權(quán)利要求69的方法，其中，所述生物樣品含有在所述接觸步驟之前被固定和切片的細(xì)胞，而且所述和該樣品結(jié)合的標(biāo)記與相當(dāng)于該細(xì)胞的細(xì)胞膜的部位結(jié)合。71.如權(quán)利要求69的方法，其中，所述生物樣品獲自人類患者的乳腺。72.如權(quán)利要求69的方法，其中，所述生物樣品獲自人類患者的前列腺。73.一種體內(nèi)檢測哺乳動物的腫瘤的方法，包括(a)給藥一種診斷有效量的權(quán)利要求58的可檢測地標(biāo)記的分子；和(c)檢測與所述哺乳動物組織結(jié)合的所述可檢測標(biāo)記的存在，其中，當(dāng)標(biāo)記的量是高于背景水平時表明在所述哺乳動物體內(nèi)存在腫瘤。74.如權(quán)利要求73的方法，其中，所述哺乳動物是被懷疑患有乳腺癌的人類患者，而所述組織是乳腺組織。75.如權(quán)利要求73的方法，其中，所述哺乳動物是被懷疑患有前列腺癌的人類患者，而所述組織是前列腺組織。76.如權(quán)利要求73的方法，其中，所述可檢測標(biāo)記是放射性核素，而所述檢測步驟是通過放射性顯像實現(xiàn)的。77.如權(quán)利要求76的方法，其中，所述放射性核素是锝-99m，而所述放射性顯像是閃爍照像法。78.一種試劑盒，其具有(a)含有重組人甲胎蛋白或其片段或類似物的第一試劑；和(b)含有一種可檢測標(biāo)記的第二試劑。79.如權(quán)利要求78的試劑盒，其中，所述可檢測標(biāo)記是放射性核素。80.如權(quán)利要求79的試劑盒，其中，所述放射性核素是锝-99m。81.如權(quán)利要求79的試劑盒，其中，所述放射性核素包括碘或銦。82.如權(quán)利要求78的試劑盒，其中，所述試劑盒還包括用于連接所述可檢測標(biāo)記和所述重組人甲胎蛋白或其片段或類似物的第三試劑。83.如權(quán)利要求78的試劑盒，其中，所述可檢測標(biāo)記包括酶、熒光團或抗體。84.如權(quán)利要求78的試劑盒，其還包括用于檢測所述和重組甲胎蛋白或其片段或類似物連結(jié)的可檢測的標(biāo)記。85.如權(quán)利要求78的試劑盒，其中，所述重組人甲胎蛋白是在原核細(xì)胞中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。86.如權(quán)利要求78的試劑盒，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。87.一種細(xì)胞培養(yǎng)基，含有重組人甲胎蛋白或其片段或類似物。88.如權(quán)利要求87的培養(yǎng)基，其中，所述重組人甲胎蛋白是在原核細(xì)胞中生產(chǎn)的而且是非糖基化的。89.如權(quán)利要求88的培養(yǎng)基，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。90.一種細(xì)胞培養(yǎng)方法，該方法包括(a)提供權(quán)利要求87的培養(yǎng)基；(b)提供一種細(xì)胞；和(c)在所述培養(yǎng)基中生長所述細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞增殖并被維持。91.如權(quán)利要求90的方法，其中，所述細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。92.如權(quán)利要求91的方法，其中，所述細(xì)胞是骨髓細(xì)胞。93.如權(quán)利要求92的方法，其中，所述骨髓細(xì)胞是T細(xì)胞。94.如權(quán)利要求92的方法，其中，所述骨髓細(xì)胞是天然殺傷細(xì)胞。95.如權(quán)利要求92的方法，其中，所述骨髓細(xì)胞是淋巴細(xì)胞。96.如權(quán)利要求91的方法，其中，所述細(xì)胞是雜交瘤。97.如權(quán)利要求90的方法，其中，所述方法包括來自體內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)。98.一種抑制哺乳動物的骨髓毒性的方法，包括向所述哺乳動物給藥治療有效量的重組人甲胎蛋白或其骨髓毒性抑制類似物或片段。99.如權(quán)利要求98的方法，其中，所述哺乳動物是人類患者。100.如權(quán)利要求99的方法，其中，所述重組人甲胎蛋白是在原核細(xì)胞中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。101.如權(quán)利要求100的方法，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。102.一種抑制哺乳動物骨髓細(xì)胞增殖的抑制作用的方法，該方法包括向所述哺乳動物給藥有效量的重組甲胎蛋白或其抗抑制片段或類似物。103.如權(quán)利要求102的方法，其中，所述重組人甲胎蛋白是在一種原核細(xì)胞中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。104.如權(quán)利要求103的方法，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。105.一種促進哺乳動物骨髓增殖的方法，該方法包括向所述哺乳動物給藥有效量的重組人甲胎蛋白或其細(xì)胞刺激片段或類似物。106.如權(quán)利要求105的方法，其中，所述重組人甲胎蛋白是在原核細(xì)胞生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。107.如權(quán)利要求106的方法，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。108.一種抑制哺乳動物骨髓細(xì)胞移植排斥的方法，該方法包括向所述動物給藥有效量的重組人甲胎蛋白或其抗排斥片段或類似物。109.如權(quán)利要求108的方法，其中，所述重組人甲胎蛋白是在原核細(xì)胞中生產(chǎn)的，而且是非糖基化的。110.如權(quán)利要求109的方法，其中，所述原核細(xì)胞是大腸桿菌。全文摘要總體上披露了抑制哺乳動物自身反應(yīng)免疫細(xì)胞增殖的方法,包括向哺乳動物給藥治療有效量的重組人甲胎蛋白或其免疫細(xì)胞抗增殖的片段或類似物;抑制哺乳動物腫瘤的方法,包括向哺乳動物給藥治療有效量的重組人甲胎蛋白或其抗腫瘤片段或類似物;以及細(xì)胞培養(yǎng)方法,包括采用含有重組人甲胎蛋白或其片段或類似物的培養(yǎng)基。文檔編號A61K51/00GK1179106SQ96192764公開日1998年4月15日申請日期1996年1月24日優(yōu)先權(quán)日1995年1月24日發(fā)明者羅伯特·A·默吉塔申請人:羅伯特·A·默吉塔