單純皰疹病毒1型實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及病毒的生物檢測技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及將特異性靶標(biāo)捕獲技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)結(jié)合的單純皰疹病毒I型(HSV-1)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測中使用的引物、探針及相關(guān)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]單純皰疹病毒在全球分布廣泛,人群中極易感染,潛伏和復(fù)發(fā)感染者較多,患者和病毒攜帶者都是該病毒的傳染源,病毒可通過呼吸道、口腔、皮膚、粘膜的直接接觸或性接觸途徑進(jìn)入機(jī)體,潛居在人體的正常粘膜、血液、唾液以及感覺神經(jīng)節(jié)細(xì)胞內(nèi)。原發(fā)性感染多為隱性,大多無臨床癥狀或者呈亞臨床表現(xiàn),僅少數(shù)可出現(xiàn)臨床癥狀。HSV-1型的原發(fā)感染常局限在口咽部尤以齦口炎最為多見。臨床表現(xiàn)為牙齦和咽頰部成群皰疹、發(fā)熱、咽喉痛,破潰后形成潰瘍。此外還可引起腦炎、皮膚皰疹性濕疹。成人可引起咽炎和扁桃體炎。正常人群中約50%以上人為本病毒的攜帶者。該病毒可在雞胚絨毛尿囊膜上以及人、猴、雞等的動物培養(yǎng)細(xì)胞中大量地增殖。HSV的動物感染宿主較多,包括家兔、豚鼠及小鼠等實(shí)驗(yàn)?zāi)P蜕?。HSV在多種細(xì)胞中能增殖,常用原代兔腎、人胚腎細(xì)胞以及地鼠腎等傳代細(xì)胞培養(yǎng)分離病毒。
[0003]新生兒皰疹是臨床上常見而又嚴(yán)重的感染,據(jù)相關(guān)統(tǒng)計(jì)死亡率高達(dá)50%,存活者中嚴(yán)重?fù)p傷者也超過50%。單純皰疹病毒通過母體產(chǎn)道感染新生兒,包括皮膚、眼和口腔的局部損傷;腦炎;引起死亡的內(nèi)臟膿毒血癥等感染類型。早期抗感染能夠有效的減少死亡率。妊娠婦女感染HSV-1型,病毒有可能經(jīng)胎盤感染胎兒,會影響胚胎細(xì)胞的分裂和增殖,使之發(fā)生先天畸形。早孕時(shí)感染會使流產(chǎn)幾率增大3倍,孕晚期感染會使早產(chǎn)明顯增多,還會引起宮內(nèi)發(fā)育遲緩、智力低下、小頭、小眼、心臟異常、肢體畸形或痙攣性癱瘓、腦發(fā)育不良、腦積水等。
[0004]目前,HSV常用的檢查有培養(yǎng)法、Real-Time PCR法、血清學(xué)檢查及其他抗原試驗(yàn)等多種選擇。培養(yǎng)法非常耗時(shí),設(shè)備要求高,而且只能檢查有癥狀的患者,無癥狀患者樣本中,敏感度較低,不足50%,這使得大部分的HSV感染者直接被漏檢,而且無法區(qū)分HSV-1與HSV-2 ;細(xì)胞學(xué)檢查,不能區(qū)別HSV感染或水痘-帶狀皰疹病毒感染,特異性差;酶聯(lián)免疫法法(ELISA)需要過夜包被抗原,無法達(dá)到快速、定量檢測的效果;免疫熒光法(IFA)在檢查無癥狀患者樣本時(shí),其敏感度在35%?70%范圍,結(jié)果判斷很大程度依賴的臨床主觀經(jīng)驗(yàn)。乳膠凝集試驗(yàn)(LA)敏感性較差。核酸檢測主要是Real-Time PCR法,需要經(jīng)歷幾十個(gè)溫度變化的循環(huán)過程,擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間長,且產(chǎn)物為DNA,易污染。因此,開發(fā)一種快速、靈敏、特異且不易污染的檢測試劑盒非常必要。
[0005]實(shí)時(shí)突光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)(Simultaneous Amplificat1n and Testing,簡稱SAT)是一種直接快速檢測RNA的方法,與檢測DNA的實(shí)時(shí)熒光PCR相比,不同之處,前者檢測體系多了一個(gè)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的步驟,核酸擴(kuò)增在一個(gè)溫度下進(jìn)行(42°C ),無需熱循環(huán)。采用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶和T7 RNA聚合酶進(jìn)行核酸擴(kuò)增,相對于其它核酸擴(kuò)增技術(shù),反應(yīng)抑制物更少,能有效減少假陰性結(jié)果。然而,SAT技術(shù)在不同種類病毒的檢測中應(yīng)用所面臨的問題各不相同,需要具體分析病毒的特性進(jìn)行專門設(shè)計(jì)。目前尚無針對單純皰疹病毒I型(HSV-1)的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測技術(shù)的研究報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]目前單純皰疹病毒I型產(chǎn)品大部分選用單純皰疹病毒I型的糖蛋白G (US4)的部分基因序列作為檢測的靶標(biāo)序列,作為HSV的保守區(qū)域,在此區(qū)域設(shè)計(jì)能夠檢測,并區(qū)分HSV兩個(gè)亞型(I型與2型);Gen_probe公司曾選用前體mRNA序列(US8.5轉(zhuǎn)錄)進(jìn)行設(shè)計(jì),其保守型較好,能有效區(qū)分HSV兩種亞型,而且在發(fā)病前期前提mRNA異?;钴S的,有助于病原體的低量檢測。但兩種方法都有一個(gè)共同的問題,GC含量較高。將熒光定量PCR技術(shù)應(yīng)用于HSV-DNA檢測的關(guān)鍵技術(shù)在于引物和熒光探針的設(shè)計(jì),普通探針設(shè)計(jì)由于GC含量太高(70%以上),導(dǎo)致探針TM值太高,易形成非特異結(jié)合,導(dǎo)致假陽性,大大影響了檢測的準(zhǔn)確性。而本發(fā)明是由發(fā)明人經(jīng)過長期而深入的研究,經(jīng)過大量篩選和驗(yàn)證,選擇了 US 5基因的mRNA作為檢測靶標(biāo),開發(fā)出高特異性,高靈敏的專用引物對和探針。其DNA序列保守性較好,GC含量較低(45%左右),能夠有效的避免GC含量過高帶來的檢測假陽性問題,有效提高檢測的準(zhǔn)確性,對HSV兩個(gè)亞型以及其他感染部位相同和癥狀相似的病毒有較好的區(qū)分度。
[0007]本發(fā)明的目的是提供一種快速,高靈敏度、高特異性,污染易控,設(shè)備簡單,成本低的HSV-1 mRNA擴(kuò)增檢測試劑盒。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):
一種單純皰疹病毒I型實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒,包含有一條序列表中序列I所示的HSV-1的靶標(biāo)核酸的捕獲探針,一對用于靶標(biāo)核酸擴(kuò)增的檢測引物T7和nT7,和一條用于所述靶標(biāo)核酸擴(kuò)增產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的HSV-1檢測探針。
[0009]進(jìn)一步,所述的試劑盒包含的捕獲探針的核苷酸序列如序列表中序列2所示;所述HSV-1檢測引物由Τ7引物和ηΤ7引物組成,Τ7引物序列如序列表中序列3所示,ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示;所述HSV-1檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示,5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán),3 ’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
[0010]再進(jìn)一步,所述的試劑盒還包含有M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶,所述M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶和Τ7 RNA聚合酶存在于SAT酶液中,所述捕獲探針存在于病毒核酸提取液中,所述Τ7引物、ηΤ7引物和檢測探針存在于擴(kuò)增檢測液中。
[0011]更進(jìn)一步,所述的試劑盒還包含有HSV-1內(nèi)標(biāo)和內(nèi)標(biāo)檢測探針;所述HSV-1內(nèi)標(biāo)為單純皰疹病毒I型核苷酸序列的競爭性內(nèi)標(biāo),可與捕獲探針特異性結(jié)合,并使用Τ7和ηΤ7引物,由序列表中序列6所示的體外轉(zhuǎn)錄RNA ;所述內(nèi)標(biāo)檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列7所示,5’端標(biāo)記HEX突光基團(tuán),3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán),且所述內(nèi)標(biāo)檢測探針存在于擴(kuò)增檢測液中。
[0012]具體的,所述的試劑盒包含裂解液、病毒核酸提取液、洗滌液、HSV-1擴(kuò)增檢測液、SAT酶液、HSV-1陽性對照、HSV-1陰性對照、HSV-1內(nèi)標(biāo),其中:
裂解液:含硫酸銨(NH4)2SO4和HEPES ;
病毒核酸提取液:含捕獲探針和磁珠; 洗滌液:含NaCl和SDS ;
HSV-1擴(kuò)增檢測液:含dNTP、NTP、T7引物、nT7引物、HSV-1檢測探針和內(nèi)標(biāo)檢測探針; SAT酶液:含M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶、Τ7 RNA聚合酶;
HSV-1陽性對照;含單純皰疹病毒I型US5基因核酸的稀釋物或者單純皰疹病毒I型體外轉(zhuǎn)錄RNA的稀釋物,所述單純皰疹病毒I型的體外轉(zhuǎn)錄RNA序列為序列8所示;
HSV-1陰性對照:不含有單純皰疹病毒I型靶標(biāo)核酸序列或不含有單純皰疹病毒I型的溶液;
HSV-1內(nèi)標(biāo):HSV-1 IC RNA的稀釋物。
[0013]再具體的,所述的試劑盒中一個(gè)反應(yīng)單位的各種試劑組成如下:
(1)裂解液:25-250mMHEPES,5-50mM (NH4) 2S04 ;
(2)病毒核酸提取液:HEPES250-800mM, LLS 4-10%,捕獲探針1_50 μ M,磁珠50_500mg/L ;
(3)洗滌液:HEPES5-50mM, NaCl 50-500 mM, 1% SDS,EDTA 1-1OmM ;
(4)HSV-1 擴(kuò)增檢測液:Tris 10-50mM, MgCl2 10-40mM, dNTP 0.1-1OmM, NTP l_20mM,PVP40 1-10%, KCl 5-40mM, HSV-1 引物和探針濃度在 2.5-1OpmoI/ 反應(yīng);
(5)SAT酶液:M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶400-4000U/反應(yīng)、T7 RNA聚合酶200-2000U/反應(yīng)、2-1OmM HEPES pH7.5、10-100 mM N-acetyl-L-cysteine、0.04-0.4 mM zinc acetate、10-100 mM trehalose,40-200 mM Tris-HCl pH 8.0、40-200mM KCl、0.01-0.5mM EDTA,
0.1-1% (v/v) Triton X-100 和 20-50% (v/v) glycerol ;
(6)HSV-1陽性對照:含15-1O8拷貝/mL單純皰疹病毒I型US5基因核酸稀釋液或含單純皰疹病毒I型體外轉(zhuǎn)錄RNA的稀釋物;
(7)HSV-1陰性對照:不含有單純皰疹病毒I型靶標(biāo)核酸序列或不含有單純皰疹病毒I型的溶液;
(8)HSV-1 內(nèi)標(biāo):含 14-1O8 拷貝 /mL HSV-1 IC RNA 的稀釋物。
[0014]更具體的,所述的試劑盒,其HSV-1擴(kuò)增檢測液中T7引物濃度為5pmol/反應(yīng),nT7引物濃度為5pmol/反應(yīng),HSV-1檢測探針濃度為5pmol/反應(yīng),內(nèi)標(biāo)檢測探針濃度為5pmol/反應(yīng);其他組分不變。
[0015]更為具體的,所述單純皰疹病毒I型核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒中的專用試劑,為以下表示的物質(zhì)之一:
(1)用于擴(kuò)增HSV-1靶標(biāo)核酸的HSV-1檢測引物T7和nT7,T7引物序列如序列表中序列3所示,ηΤ7引物序列如序列表中序列4所示;
(2)用于與在Τ7RNA聚合酶作用下HSV-1靶標(biāo)核酸擴(kuò)增產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的HSV-1檢測探針,所述HSV-1檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列5所示,5’端標(biāo)記FAM熒光基團(tuán),3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán);
(3)用于與HSV-1核苷酸成競爭性的內(nèi)標(biāo)核苷酸擴(kuò)增產(chǎn)生的RNA拷貝特異結(jié)合的HSV-1內(nèi)標(biāo)檢測探針,所述內(nèi)標(biāo)檢測探針的核苷酸序列如序列表中序列7所示,5’端標(biāo)記HEX突光基團(tuán),3’端標(biāo)記DABCYL淬滅基團(tuán)。
[0016]本發(fā)明提供了一種單純皰疹病毒I型的實(shí)時(shí)熒光核酸恒溫?cái)U(kuò)增檢測試劑盒,使用該試劑盒進(jìn)行檢測,與現(xiàn)有HSV-1檢測相比,具有以下優(yōu)點(diǎn): (1)本發(fā)明試劑盒針對HSV-1的US5基因進(jìn)行靶標(biāo)篩選、引物設(shè)計(jì),具有高準(zhǔn)確度、高特異性,可以實(shí)現(xiàn)對拭子、刮取物、腦脊液等樣本中的單純皰疹病毒I型進(jìn)行快速、準(zhǔn)確測定;
(2)本發(fā)明試劑盒中加入內(nèi)標(biāo),可進(jìn)一步有效監(jiān)控假陰性的存在,提供更準(zhǔn)確的檢測結(jié)果;
(3)本發(fā)明將核酸的擴(kuò)增與檢測在同一封閉體系中同步進(jìn)行,整個(gè)