本申請要求2014年7月16日提交的、名稱為“Isothermal Methods for Amplifying Nucleic Acid Samples”的美國臨時申請序列號62,025,345的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)，所述申請以引用的方式整體并入本文中。

背景

1.發(fā)明領(lǐng)域。

本發(fā)明提供了核酸擴增和檢測反應(yīng)的方法，其適用于快速病原體檢測或疾病診斷。

2.背景信息。

基于核酸核苷酸序列互補性的核酸分析方法可直接分析遺傳性狀。因此，這些方法是用于鑒定遺傳疾病、癌癥、微生物等的非常強大的手段。然而，檢測樣品中以極少量存在的靶基因或核酸不太容易，且因此，靶基因或其檢測信號的擴增是必需的。因此，體外核酸擴增技術(shù)(NAAT)是在研究和診斷的許多領(lǐng)域中用于檢測和分析少量核酸的極有價值的和強大的工具。

NAAT技術(shù)允許以高靈敏度和特異性檢測并量化樣品中的核酸。NAAT技術(shù)可用于確定具體的模板核酸在樣品中的存在，如通過進(jìn)行具體的NAAT之后擴增產(chǎn)物(即擴增子)的存在所指示。反之，任何擴增產(chǎn)物的不存在指示模板核酸在樣品中的不存在。這類技術(shù)在診斷應(yīng)用中非常重要，例如用于判定病原體是否存在于樣品中。因此，NAAT技術(shù)適用于檢測和量化用于感染性和遺傳疾病的診斷的特異性核酸。

可根據(jù)工序的溫度要求對NAAT進(jìn)行分組。例如，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)是作為體外擴增核酸技術(shù)的最常見方法。此方法被堅定地確立為借助于基于指數(shù)擴增作用的高靈敏度的極佳檢測方法。此外，由于擴增產(chǎn)物可作為DNA回收，所以此方法被廣泛地應(yīng)用為支持如基因克隆和結(jié)構(gòu)測定的遺傳工程技術(shù)的重要工具。然而，在PCR方法中，溫度循環(huán)或?qū)ｉT的溫度控制器是實踐所必需的；擴增反應(yīng)的指數(shù)進(jìn)展在量化上造成問題；并且樣品和反應(yīng)溶液容易被外界污染，從而容許核酸錯誤地混合以用作模板(參見R.K.Saiki等人1985.Science 230,1350-1354)。其他基于PCR的擴增技術(shù)，例如，基于轉(zhuǎn)錄的擴增(D.Y.Kwoh等人1989.Proc.Natl.Acad Sci.USA 86,1173-1177)、連接酶鏈反應(yīng)(LCR；D.Y.Wu等人1989.Genomics 4,560-569；K.Barringer等人1990.Gene 89,117-122；F.Barany.1991.Proc.Natl.Acad.Sci.USA88,189-193)、以及限制擴增(美國專利號5,102,784)同樣需要溫度循環(huán)。

近年來，已經(jīng)開發(fā)了許多等溫核酸擴增技術(shù)(iNAAT)。換句話說，這些技術(shù)不依賴熱循環(huán)來驅(qū)動擴增反應(yīng)。等溫擴增技術(shù)通常利用具有鏈置換活性的DNA聚合酶，因此消除為PCR所需的高溫解鏈循環(huán)。這允許等溫技術(shù)與PCR相比更快且更為能源有效，且還允許更簡單且由此成本更低的儀器裝備，因為不需要快速溫度循環(huán)。舉例來說，方法如鏈置換擴增(SDA；G.T.Walker等人1992.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89,392-396；G.T.Walker等人1992.Nuc.Acids.Res.20,1691-1696；USP 5,648,211和EP 0 497 272，所有公開內(nèi)容以引用的方式并入本文中)；自動維持序列復(fù)制(3SR；J.C.Guatelli等人1990.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87,1874-1878，其以引用的方式并入本文中)；以及Qβ復(fù)制酶系統(tǒng)(P.M.Lizardi等人1988.BioTechnology 6,1197-1202，其以引用的方式并入本文中)是等溫反應(yīng)(也參見Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies–A Review.Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids,2008.v27(3):224-243，其以引用的方式并入本文中)。

在SDA方法中，將專門的DNA聚合酶用于合成互補鏈，從與某一核苷酸序列模板的3'-側(cè)互補的擴增引物開始，并且包括擴增引物上游的一個或多個緩沖引物以置換雙股鏈(如果在序列模板的5'-側(cè)處有的話)。因為在5'-側(cè)處的雙股鏈被新合成的互補鏈置換，所以此項技術(shù)被稱作SDA方法。在PCR方法中重要的改變溫度步驟在SDA方法中可通過將限制酶識別序列預(yù)先插入到退火序列中作為引物來消除。也就是說，由限制酶生成的切口產(chǎn)生3'-OH基團，該基團充當(dāng)合成互補鏈的起點，并且先前合成的互補鏈通過鏈置換合成被釋放作為單股鏈，接著再次被利用作為模板用于后續(xù)的互補鏈合成。以此方式，在PCR方法中重要的復(fù)雜溫度控制在SDA方法中并不需要。

然而，在SDA方法中，除鏈置換型DNA聚合酶之外，還應(yīng)使用生成切口的限制酶。對于另外的酶的這種要求是導(dǎo)致成本較高的主要原因。此外，因為限制酶并不被用于雙股鏈的裂解，而是用于引入切口(也就是說，僅一條鏈的裂解)，所以dNTP衍生物如α-硫基dNTP應(yīng)被用作合成的底物以致使另一條鏈對酶的消化有抗性。因此，通過SDA的擴增產(chǎn)物具有不同于天然核酸的結(jié)構(gòu)，并且這對于用限制酶的裂解或擴增產(chǎn)物應(yīng)用于基因克隆是一種限制。在此方面中，這也是造成成本較高的主要原因。另外，當(dāng)SDA方法應(yīng)用于未知序列時，存在以下可能性：與用于引入切口的限制酶識別序列相同的核苷酸序列可存在于待合成的區(qū)域中。在此情況下，完整的互補鏈有可能被阻止進(jìn)行合成。

環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)是另一種等溫核酸擴增技術(shù)。在LAMP中，使用兩個或三個引物組及除復(fù)制活性之外具有高鏈置換活性的聚合酶在60-65℃的恒溫下擴增靶序列。(參見Nagamine K,Hase T,Notomi T(2002)."Accelerated reaction by loop-mediated isothermal amplification using loop primers".Mol.Cell.Probes 16(3):223–9；及USP 6,410,278，其以引用的方式并入本文中)。

LAMP最初被發(fā)明并制定作為對四個引物具有嚴(yán)格要求的等溫擴增：兩個環(huán)生成引物(相應(yīng)地包含F(xiàn)1、F2及B1、B2引發(fā)位點的FIP和BIP)和兩個“置換引物”(F3和B3)(圖1)。然而，在此實施方式中，LAMP技術(shù)對于大部分實際應(yīng)用來說太過緩慢。為了提高基于LAMP的測定的速度，LAMP的發(fā)明者們提出了另外的“環(huán)引物”，所述環(huán)引物當(dāng)連同LAMP中使用的其他引物一起添加時，造成顯著更快的測定。目前，LAMP的常用實施方案需要總共六個引物：兩個環(huán)生成引物、兩個置換引物及兩個“環(huán)引物”(L_B和L_F)。

由于這些引物作用的特殊性質(zhì)，在LAMP中產(chǎn)生的DNA的量顯著高于基于PCR的擴增。反應(yīng)可通過測量濁度或通過使用嵌入染料的熒光實時進(jìn)行追蹤。染料分子嵌入或直接標(biāo)記DNA，并且又可與最初存在的拷貝數(shù)相關(guān)聯(lián)。因此，LAMP也可以定量。因此，LAMP提供歸因于其簡易性、耐用性及低成本的主要優(yōu)點，并且具有在護理領(lǐng)域中或臨床醫(yī)師現(xiàn)場護理時用作簡單篩選測定的潛能。

LAMP測定的引物設(shè)計因此需要選擇靶核酸序列的八個分隔區(qū)域(FIP和BIP引物各自包括兩個引物結(jié)合位點)，其中BIP/FIP和環(huán)引物對它們彼此之間的定位具有顯著限制?！碍h(huán)引物”必須分別被嚴(yán)格地定位在B2與B1位點及F2與F1位點之間，并且必須在一個具體的方向上取向。此外，在引物設(shè)計中必須十分當(dāng)心以避免所需六個引物之間的引物-二聚體(當(dāng)FIP和BIP引物在長度上一般大于40個核苷酸時尤其困難)。因此，LAMP引物設(shè)計極其有挑戰(zhàn)性，尤其當(dāng)靶向含有復(fù)雜的二級結(jié)構(gòu)的高度多晶型標(biāo)記物和序列時。而且，因為LAMP使用靶向基因組相當(dāng)小的區(qū)段內(nèi)的6個(或8個)區(qū)域的4個(或6個)引物，且因為引物設(shè)計經(jīng)受眾多限制，所以難以“通過肉眼”設(shè)計用于LAMP的引物組。軟件一般用于輔助LAMP引物設(shè)計，盡管引物設(shè)計限制意味著與PCR相比存在較少自由度來選擇靶位點。在診斷應(yīng)用中，這必須與選擇適當(dāng)靶標(biāo)(例如，在高度變化的病毒基因組中的保守位點、或者對于具體病原體菌株具有特異性的靶標(biāo))的需要保持平衡。

已經(jīng)觀察到LAMP比PCR對于復(fù)雜樣品(如血液)中的抑制劑敏感性較小，這可能是由于使用不同的DNA聚合酶(通常Bst DNA聚合酶，而非在PCR中的Taq聚合酶)。LAMP主要適用作為診斷或檢測技術(shù)，但不適用于克隆或無數(shù)其他通過PCR進(jìn)行的分子生物學(xué)應(yīng)用。

并且，LAMP的多重途徑相對未開發(fā)。在LAMP中每個靶標(biāo)的較大引物數(shù)目提高多重靶標(biāo)組的引物-引物相互作用的可能性。LAMP的產(chǎn)物是靶區(qū)域的一系列多聯(lián)體(concatemer)，在凝膠上產(chǎn)生特征性“梯帶”或帶型，而非PCR中的單一條帶。雖然當(dāng)用LAMP檢測單個靶標(biāo)時這不是個問題，但“傳統(tǒng)的”(終點)多重PCR應(yīng)用(其中靶標(biāo)的身份通過凝膠上的條帶尺寸證實)在LAMP中并不可行。在LAMP中的多重性通過選擇具有限制位點的靶區(qū)域并且在凝膠上運行之前消化以使得每種產(chǎn)物產(chǎn)生不同尺寸的片段來實現(xiàn)，不過此途徑向?qū)嶒炘O(shè)計和方案中增加了復(fù)雜性。鏈置換DNA聚合酶在LAMP中的使用還排除了使用水解探針，例如TaqMan探針，其依賴Taq聚合酶的5'-3'核酸外切酶活性。

近年來，研究者已開發(fā)了修改過的LAMP技術(shù)，稱為STEM。LAMP-STEM系統(tǒng)利用“Stem引物”，其涉及LAMP擴增子(或“啞鈴”)的莖部分。Stem引物可用作LAMP“環(huán)引物”的一種替代物(參見圖2)。當(dāng)除環(huán)生成和置換引物之外使用時，Stem引物在對環(huán)引物的速度和靈敏度中提供相似益處。(參見Gandelman等人,Loop-Mediated Amplificaiton Accelerated by Stem Primers.Int.J.Mol.Sci.2011,v12:9108-9124，及US 2012/0157326，其以引用的方式并入本文中)。Stem引物的這個有益作用是驚人的，因為它們不結(jié)合至單鏈DNA環(huán)，這定義了LAMP技術(shù)的本質(zhì)。Stem引物可以任一取向使用，不需要B2/B1或F2/F1位點以特定距離間隔，可以是多重的，并且允許F1和B1位點比在LAMP中彼此更加遠(yuǎn)離地定位。

STEM引物顯著地促進(jìn)僅包含環(huán)生成和置換引物的LAMP。它們獨自或與其他STEM引物或甚至環(huán)引物協(xié)同使用。Stem引物添加到LAMP中對速度和靈敏度都具有積極效果。在一些情況下，它們改善在低拷貝數(shù)下的再現(xiàn)性。Stem引物的作用可經(jīng)由LAMP的建議機制而合理化。它們與擴增子的單鏈區(qū)域瞬時退火并且再復(fù)制用于BIP/FIP引物的整個結(jié)合位點。另外的獨特特性是當(dāng)Stem引物劃定擴增子時另外的強分子內(nèi)自引發(fā)。

一般說來，Stem引物的定位與環(huán)引物的定位相比受到較少限制。涉及選擇至少八個結(jié)合位點的相當(dāng)有挑戰(zhàn)性的引物設(shè)計由此被簡化。此外，Stem引物就莖長度、取向及B1-B2和F1-F2位點之間的距離而言對引物設(shè)計施加較少限制。與依賴置換引物參與的假設(shè)的LAMP機制相反，Stem引物可偶而允許完全不使用置換引物，但并不清楚其中的原因。這對于引物設(shè)計有著顯著意義，因為其允許省略一種置換引物或必要時甚至兩種的能力。

在許多情形如現(xiàn)場護理診斷時，有利的是能夠使用單一測定同時擴增和檢測單一樣品中的多重靶標(biāo)。這通常是通過使用連接至每個不同靶引物組或探針上的不同染料組合同一管中的多重靶標(biāo)的擴增來完成。這種十分常見的方法具有兩個明顯的缺點。其一，因為所有引物共同在一種溶液中，所以它們彼此交叉反應(yīng)并生成二聚體及其他將干擾結(jié)果的假產(chǎn)物的可能性極高。這通過費力地篩選引物組的許多組合以找到不進(jìn)行交叉反應(yīng)的那個來克服。

此方法的第二主要限制在于存在可當(dāng)在同一溶液中時單獨檢測的有限的染料。因為從染料發(fā)出的光的波長具有一定的帶寬，所以每種染料的發(fā)射光譜為了特異性和可靠的檢測必須與其他充分分離。實際上，這將每個擴增反應(yīng)限于5種或6種不同靶標(biāo)的檢測。

可檢測來自同一樣品的較高數(shù)目的靶標(biāo)而不損害靈敏度的技術(shù)對許多應(yīng)用如呼吸道感染篩選組來說是巨大的改進(jìn)，其中約20種不同靶標(biāo)為全面測試所需。另一個實例是肺結(jié)核，其中必須篩選約20個不同等位基因以便準(zhǔn)確地且特異性地判定對兩種一線藥物中任一種的抗性的存在。

概述

本發(fā)明提供了一種改進(jìn)的核酸擴增技術(shù)(NAAT)，其是穩(wěn)定的、成本有效的，在引物放置和設(shè)計中提供靈活性，并且還在低拷貝數(shù)下顯示出增加的速率、靈敏度及再現(xiàn)性。如本文所述的方法對于實時檢測目標(biāo)核酸區(qū)域以便例如診斷疾病或感染是有利的。

如本文所述的方法提供第一階段速率減緩的等溫預(yù)擴增，接著是多個離散的第二階段擴增及對來自第一階段初級擴增子擴增產(chǎn)物的產(chǎn)物直接并行進(jìn)行的檢測反應(yīng)。至少一個第二階段反應(yīng)包括位點或序列特異性二級引物(“位點特異性引物”)，其中如果模板包含位點特異性引物的互補位點，那么位點特異性引物擴增反應(yīng)在相對于第一階段反應(yīng)和第二階段反應(yīng)(其中不添加二級引物)兩者的較快速率下進(jìn)行。在某些實施方案中，至少一個第二階段反應(yīng)包括具有堿基對錯配的二級引物(“錯配引物”)，例如3’錯配核苷酸(“3’錯配引物”)，其中位點特異性引物擴增反應(yīng)在相對于第一階段反應(yīng)、第二階段反應(yīng)(其中不添加二級引物)及第二階段錯配引物反應(yīng)的較快速率下進(jìn)行。

例如，完成第一階段區(qū)域特異性預(yù)擴增步驟，然后將反應(yīng)分到多個反應(yīng)室中，其中在每個室中借助于例如3'端匹配/錯配或退火溫度差異引入不同組的二級引物，例如環(huán)或莖引物，這些引物是位點特異性敏感的，以便速度高得多的指數(shù)反應(yīng)僅在二級引物正確地與樣品序列匹配時發(fā)生。在擴增速率上的顯著差異可通過例如嵌入染料的實時熒光測量來檢測，且因此，在同一目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的多個位點特異性反應(yīng)可用單一測定單獨鑒定。

因此，一方面，本發(fā)明提供兩階段核酸擴增反應(yīng)，其包括：提供靶核酸模板和至少一種引物，所述引物在靠近待擴增的目標(biāo)區(qū)域處與靶核酸模板退火；進(jìn)行第一階段核酸擴增(或“預(yù)擴增(pre-amp)”)反應(yīng)以擴增目標(biāo)區(qū)域(擴增子)。在某些實施方案中，提供正向和反向引物并且用于合成和擴增目標(biāo)區(qū)域或目標(biāo)擴增子。

隨后，在一個或多個第二階段擴增反應(yīng)中利用預(yù)擴增反應(yīng)產(chǎn)物(“擴增的目標(biāo)區(qū)域”)，其中這些反應(yīng)中的至少一個包括位點特異性二級引物，以便只有當(dāng)位點特異性引物的互補序列(即位點特異性目標(biāo)區(qū)域)存在于來自階段一的擴增的目標(biāo)區(qū)域(即，來自階段一的目標(biāo)核酸區(qū)域?qū)τ谀繕?biāo)位點呈陽性)中時才發(fā)生快速擴增。如本文所述，擴增產(chǎn)物在每個第二階段反應(yīng)中的出現(xiàn)可同時和實時檢測并比較，其中相對于第一階段反應(yīng)、第二階段反應(yīng)(其中不添加二級引物)及第二階段錯配引物反應(yīng)的快速擴增速率指示位點特異性目標(biāo)區(qū)域的存在。

在某些實施方案中，位點特異性引物包含在除3’端以外的位點處的核苷酸錯配。

在某些實施方案中，多個第二階段核酸擴增反應(yīng)并行進(jìn)行。在一個優(yōu)選實施方案中，位點特異性引物反應(yīng)與其中使用相似的位點特異性引物但在其核酸序列中包含錯配的單獨反應(yīng)并行進(jìn)行和監(jiān)測。

另一方面，描述了一種方法，其包括利用第一階段擴增產(chǎn)物或初級擴增子進(jìn)行多個單獨的或離散的第二階段擴增反應(yīng)，其中檢測第二階段擴增反應(yīng)的速率并在至少一個具有與初級擴增子模板上的目標(biāo)位點或序列互補的位點特異性引物的反應(yīng)與具有二級引物的反應(yīng)之間比較，所述二級引物退火于相同位點但包含堿基對錯配(在本文中“錯配引物”)，其中相對于另一個的更快反應(yīng)速率指示目標(biāo)特異性位點或區(qū)域的存在或不存在。在又一些實施方案中，將第二階段擴增反應(yīng)的速率檢測并在以下反應(yīng)之間比較，至少一個具有與初級擴增子模板上的目標(biāo)位點或序列互補的位點特異性引物的反應(yīng)、具有錯配引物的反應(yīng)及沒有二級引物的反應(yīng)，其中相對于另一個反應(yīng)的更快反應(yīng)速率指示目標(biāo)特異性位點或區(qū)域的存在或不存在。

在某些實施方案中，錯配引物是錯配Stem引物。在本文所述的任何實施方案中，錯配引物包含至少一個錯配的核苷酸(即不與模板互補的核苷酸)。在某些實施方案中，錯配核苷酸處于錯配引物的3’端處(“3’錯配引物)。

在某些實施方案中，位點特異性引物和錯配引物在它們的3'端處包含對多等位基因或多態(tài)位點有特異性或互補的核苷酸，以便根據(jù)核酸模板包含哪個等位基因或多態(tài)性，位點特異性引物可包含3'端核苷酸錯配，并且錯配引物可含有3'端互補核苷酸。換言之，在某些實施方案中，所述方法包括進(jìn)行多個第二階段擴增反應(yīng)，其中每個反應(yīng)包含位點特異性引物。然而，如本文所述，僅那些在其3'端處包含與目標(biāo)位點互補的引物的擴增反應(yīng)將在相對于第一階段反應(yīng)并且相對于包含3'錯配的第二階段反應(yīng)的提高的速率下進(jìn)行。

在某些實施方案中，所述方法包括進(jìn)行多個第二階段擴增反應(yīng)，其中每個相應(yīng)反應(yīng)包含位點特異性引物。在某些實施方案中，位點特異性引物對于不同的多等位基因或多態(tài)位點有特異性。在這類配置中，所述方法提供一種同時確定多個多態(tài)性的存在或不存在的多重方法。

在某些實施方案中，所述方法包括并行進(jìn)行至少一個另外的第二階段擴增反應(yīng)，其中不添加另外的引物，并且實時監(jiān)測和比較以下反應(yīng)之間的第二階段擴增反應(yīng)的速率：包含位點特異性引物的反應(yīng)、包含錯配引物的反應(yīng)及不包含引物的反應(yīng)，其中相對于其他的提高的反應(yīng)速率指示目標(biāo)特異性位點或區(qū)域的存在。

在某些實施方案中，所述方法包括大致同時進(jìn)行多個單獨的或離散的第二階段擴增反應(yīng)。在某些另外的實施方案中，離散反應(yīng)包含相同或不同的位點特異性引物。在某些實施方案中，離散反應(yīng)包含多個位點特異性引物或位點特異性引物的組合(即“多重反應(yīng)”)。

雖然若干方面和實施方案涉及兩階段擴增方案，但本發(fā)明不限于此。實際上，本文所述的方法是建立在以下驚人發(fā)現(xiàn)上：目標(biāo)特異性位點或序列在靶核酸區(qū)域中的存在可通過位點特異性或序列特異性(即互補)引物相對于錯配引物的較慢擴增反應(yīng)速率的提高的擴增速率來檢測，所述錯配引物(而對于錯配堿基)與相同靶區(qū)域退火。因此，可進(jìn)行任何數(shù)目的另外的擴增步驟，例如3、4、5、6、7、8、9個等，且因此，可檢測任何數(shù)目的目標(biāo)位點、區(qū)域或序列。類似地，關(guān)于每個待進(jìn)行的相應(yīng)位點特異性引物反應(yīng)，可進(jìn)行平行錯配引物反應(yīng)并且監(jiān)測兩個反應(yīng)的擴增速率。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，第一階段擴增反應(yīng)可包含位點特異性引物，以便第一階段預(yù)擴增反應(yīng)對于特定的目標(biāo)位點有選擇性，并且只有當(dāng)那個位點或區(qū)域存在于樣品中時模板的快速擴增才在第二或稍后階段擴增反應(yīng)中進(jìn)行。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，第二階段(或稍后階段)擴增反應(yīng)可包含多重位點特異性引物(即“多重反應(yīng)”)。通過使用差異性標(biāo)記的位點特異性寡核苷酸，可在同一反應(yīng)內(nèi)檢測和比較(即多重)不同的擴增產(chǎn)物。

另一方面，本發(fā)明提供一種用于檢測和比較核酸擴增的方法，所述方法包括：提供第一反應(yīng)室；在第一反應(yīng)室中進(jìn)行如本文所述的第一階段預(yù)擴增反應(yīng)；將一定量或體積的第一階段預(yù)擴增反應(yīng)直接引入到多個第二反應(yīng)室中，其中至少一個第二反應(yīng)室包含位點特異性引物，且至少一個第二反應(yīng)室包含錯配引物；以及在每個第二反應(yīng)室中進(jìn)行如本文所述的第二階段擴增反應(yīng)；并且同時檢測和比較每個反應(yīng)的擴增速率，其中在位點特異性引物中相對于錯配引物反應(yīng)的更快擴增速率指示目標(biāo)位點的存在。

在本文所述的任何實施方案中，階段一和階段二的擴增反應(yīng)在同一反應(yīng)容器或室中相繼地進(jìn)行。在某些實施方案中，相繼地進(jìn)行擴增反應(yīng)，但在不同的反應(yīng)容器或室中。在一個優(yōu)選實施方案中，第二階段反應(yīng)在多個容器或室中并行進(jìn)行，并且檢測和比較。

在本文所述的任何實施方案中，靶核酸模板被包含在合適的緩沖劑中并引入包含環(huán)形成引物的容器中。在又一些實施方案中，來自第一階段擴增反應(yīng)的混合物被引入包含位點特異性或錯配引物的容器中。

在另外的實施方案中，在包括與一個或多個另外的容器或室流體連通的通道的容器或室中進(jìn)行第一階段擴增反應(yīng)，所述另外的容器或室包含用于進(jìn)行第二階段擴增反應(yīng)的引物(即位點特異性引物、位點特異性Stem引物；錯配引物、錯配Stem引物等)。在又一些實施方案中，第一階段反應(yīng)室包括與一個或多個另外的容器或室單向流體連通的通道，所述另外的容器或室包含用于進(jìn)行第二階段擴增反應(yīng)的引物。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，第一階段擴增反應(yīng)是等溫核酸擴增反應(yīng)。在某些實施方案中，第二階段擴增反應(yīng)是等溫核酸擴增反應(yīng)。在另外的實施方案中，第一階段擴增反應(yīng)和第二階段擴增反應(yīng)都是等溫核酸擴增反應(yīng)。在某些實施方案中，第一階段和/或第二階段擴增反應(yīng)是基于LAMP的等溫擴增反應(yīng)。在一個優(yōu)選實施方案中，第一階段擴增是基于LAMP的等溫擴增反應(yīng)且第二階段是基于LAMP-STEM的等溫擴增反應(yīng)。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，錯配引物包含3’末端核苷酸錯配。在某些實施方案中，如本文所述的位點特異性引物在3’終端包含與靶核酸模板中的目標(biāo)核苷酸互補的核苷酸。

另一方面，本發(fā)明提供一種診斷遺傳疾病、SNP、病毒或微生物感染的兩階段方法，其中所述方法包括從待測試的受試者提供核酸樣品，進(jìn)行如本文所述的兩階段擴增反應(yīng)，其中位點特異性引物對于與遺傳疾病、突變、SNP、病毒或細(xì)菌中的至少一個有關(guān)的目標(biāo)區(qū)域或核苷酸有特異性，且其中位點特異性引物相對于錯配引物的提高的擴增速率指示具有關(guān)于遺傳疾病、突變、SNP、病毒或微生物的等位基因的受試者。在某些實施方案中，所述微生物是細(xì)菌。

在某些實施方案中，診斷疾病或病原性感染的方法包括用適當(dāng)?shù)闹委焺?例如，抗生素、藥物等)治療經(jīng)測試對目標(biāo)核苷酸呈陽性的患者的步驟。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢校龇椒ㄟM(jìn)一步包括檢測擴增子形成的步驟。在某些實施方案中，擴增反應(yīng)混合物包含熒光標(biāo)記的dNTP或熒光DNA嵌入染料。在某些實施方案中，通過測量熒光的增加實時檢測擴增子的形成。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，核酸模板包含多個引物結(jié)合區(qū)，其中所述引物充當(dāng)合成起點并且界定待使用聚合酶擴增的多核苷酸區(qū)(即，“擴增子”)。

在本文所述的任何實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在擴增反應(yīng)中添加至少一種置換或緩沖引物。

在本文所述的任何實施方案中，靶核酸模板包含基因組DNA、cDNA或RNA或其片段，來自病毒、植物、微生物或多細(xì)胞生物體，例如哺乳動物，如人類。在某些實施方案中，基因組DNA來自于病原性病毒或微生物，例如細(xì)菌或古生菌。在某些實施方案中，靶核酸模板來自于結(jié)核桿菌(MTB或TB)。在某些另外的實施方案中，靶核酸模板來自于rpoB基因，該基因來自MTB。在另外其他實施方案中，靶核酸模板是rpoB13.5F6。

在本文所述的任何實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括添加至少一種環(huán)引物，所述環(huán)引物與擴增子的第一環(huán)或第二環(huán)中的區(qū)域互補。

在本文所述的任何實施方案中，第一擴增反應(yīng)通過加熱步驟繼續(xù)進(jìn)行，其中將靶核酸模板和引物加熱至大約95℃持續(xù)約1分鐘至約15分鐘。在某些實施方案中，將靶核酸模板和引物加熱至大約95℃持續(xù)約5分鐘至約10分鐘。

在本文所述的任何實施方案中，擴增反應(yīng)在約50℃至約75℃的溫度下進(jìn)行。在某些實施方案中，擴增反應(yīng)在約55℃至約65℃的溫度下進(jìn)行。

在本文所述的任何實施方案中，位點特異性引物(例如，位點特異性Stem引物)是處于正向。在某些實施方案中，位點特異性引物是處于反向。在另外的實施方案中，正向和反向位點特異性引物都包括在反應(yīng)中。

在本文所述的任何實施方案中，3’SNP特異性核苷酸包含在環(huán)形成引物、置換引物或環(huán)引物中的至少一種內(nèi)。

在本文所述的任何實施方案中，引物或核苷酸試劑包含化學(xué)修飾。

在本文所述的任何實施方案中，第一階段和第二階段擴增反應(yīng)在同一反應(yīng)容器或室中相繼地進(jìn)行。在某些實施方案中，第一階段和第二階段擴增反應(yīng)(及任何后續(xù)擴增反應(yīng))相繼地進(jìn)行，但在不同的反應(yīng)室中。

在本文所述的任何實施方案中，引物可包含核酸內(nèi)切酶限制位點、或用于切口酶的識別元件。

在本文所述的任何實施方案中，所述擴增反應(yīng)可包括包含第一和第二區(qū)段的發(fā)夾引物，其中所述第一區(qū)段與模板上的引物結(jié)合區(qū)基本上互補且第二區(qū)段包含與引物中的另一區(qū)基本上互補的序列；

在本文所述的任何實施方案中，擴增反應(yīng)可包含環(huán)提供引物，該引物包含發(fā)夾引物，其中反向重復(fù)序列被接頭區(qū)分隔開。

在本文所述的任何實施方案中，擴增反應(yīng)可包含嵌合引物。

效用的先前一般領(lǐng)域僅作為實例給出并且不意圖限制本公開及所附權(quán)利要求的范圍。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員根據(jù)本發(fā)明的權(quán)利要求、內(nèi)容及實施例將理解與本發(fā)明的組合物、方法及方法有關(guān)的另外的目標(biāo)和優(yōu)點。例如，本發(fā)明的各種方面和實施方案可以許多組合形式使用，所有都明確地由本發(fā)明所涵蓋。這些另外的優(yōu)點、目標(biāo)及實施方案都明確地包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本文中用于闡明本發(fā)明背景且在具體情況下提供關(guān)于實踐的其他細(xì)節(jié)的出版物及其他材料以引用的方式并入。

附圖簡述

并入本說明書中并構(gòu)成本說明書的一部分的附圖說明了本發(fā)明的若干實施方案并且與說明書一同用于解釋本發(fā)明的原理。附圖僅僅是用于說明本發(fā)明的實施方案，而不意圖限制本發(fā)明。本發(fā)明的更多目標(biāo)、特征及優(yōu)點將由以下詳細(xì)說明連同附圖一起變得顯而易見，這些附圖示出了本發(fā)明的說明性實施方案，其中：

圖1.環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)的一般原理的圖示。在如本文所述的示例性方法中，進(jìn)行基于LAMP方法的第一階段等溫擴增反應(yīng)，其包括FIP和BIP“環(huán)形成引物”(LFP)(分別包含F(xiàn)1c和F2、B1c和B2引發(fā)位點)、及“置換引物”(F3和B3)。LAMP反應(yīng)產(chǎn)生“啞鈴”結(jié)構(gòu)的多聯(lián)體(c)。如本文所述，初始LAMP反應(yīng)在相對較慢速率下進(jìn)行。

圖2.如本文所述的示例性修改過的LAMP-STEM技術(shù)的一般原理的圖示。如本文所述，進(jìn)行LAMP-STEM擴增反應(yīng)作為第二階段。反應(yīng)包括至少一種“位點特異性Stem引物”，該引物與來自階段一的擴增反應(yīng)的擴增子中的目標(biāo)位置或序列互補。位點特異性Stem引物反應(yīng)與單獨的擴增反應(yīng)并行進(jìn)行，所述單獨的擴增反應(yīng)包含具有錯配的Stem引物，例如，在其3'端處的錯配(“錯配Stem引物”)；并且同時監(jiān)測和比較兩個反應(yīng)，其中位點特異性Stem引物反應(yīng)相對于錯配Stem引物反應(yīng)的擴增速率的提高指示在擴增子(或其多聯(lián)體)中存在目標(biāo)位點，并且其中當(dāng)位點特異性Stem引物反應(yīng)的速率與錯配Stem引物反應(yīng)相同或比錯配Stem引物反應(yīng)慢時其指示不存在目標(biāo)位點。

圖3.如本文所述的另一示例性修改過的LAMP-STEM技術(shù)的一般原理的圖示。該技術(shù)類似于圖2中所描繪的，但除SNP-Stem引物之外還進(jìn)一步包括“環(huán)引物”。參見WO0028082，其以引用的方式并入本文中。

圖4.示出了被配置用于進(jìn)行如本文所述的兩階段擴增方法的示例性系統(tǒng)。在此實施例中，在中央室中進(jìn)行第一階段反應(yīng)，其與一個或多個另外的室連通(例如，流體連通)。在一個優(yōu)選實施方案中，第一階段反應(yīng)混合物被均勻地分布在其中發(fā)生第二階段擴增反應(yīng)的一個或多于一個另外的室中。

圖5.10²和10⁶個起始拷貝的實時理論信號及10x第二階段擴增效率對比第一階段反應(yīng)效率。上圖在對數(shù)標(biāo)度上顯示兩個指數(shù)反應(yīng)速率，且下圖在線性標(biāo)度上顯示它們?？v軸表示存在的擴增子的拷貝數(shù)目；輸入材料和擴增材料兩者。此軸線還表示可使用嵌入染料生成并檢測的信號。水平虛線表示測量可通過所述染料生成的熒光信號的儀器的檢測極限。兩幅圖的水平軸線表示以分鐘為單位的時間。8分鐘時間點是第二階段引物添加到反應(yīng)中時的點。如果第二階段引物與通過第一反應(yīng)生成的初級擴增子內(nèi)的位點匹配，這便是加速反應(yīng)起始之時，它是由log圖中斜率增加的線來表示。在log圖上較低斜率線的連續(xù)性指示如果二級引物不與擴增子內(nèi)的目標(biāo)位點匹配那么將存在信號。

圖6.示出了由于Stem引物中的錯配堿基所致的對擴增速率的影響。(a)左圖例示了包含3’端錯配的Stem引物，其代表對目標(biāo)SNP無特異性的引物。對比匹配的或SNP-特異性Stem引物(“SNP-Stem引物”)，3'錯配誘導(dǎo)擴增反應(yīng)中的延遲。擴增速率的提高在右圖中例示，其中虛線表示達(dá)到熒光最大斜率(t_max1)之時的最早時間(t)，并且ΔCt1表示在SNP-Stem引物與3'端錯配Stem引物之間的至t_max的時間滯后。(b)右圖例示了如本文所述的另一實施方案，其中Stem引物(SNP-Stem引物和3'端錯配引物)在其序列中含有另一個堿基對錯配。第二錯配向擴增的右側(cè)(即，減小速率)移位(ΔCt2)并且延遲至t_max2的時間。

圖7.使用Bio-Rad CFX實時PCR儀器的處理過的熒光跡線，其示出了匹配的Stem引物(即，SNP-Stem引物)LAMP反應(yīng)(n＝4)和錯配的Stem引物L(fēng)AMP反應(yīng)(n＝4)。

圖8.示出了根據(jù)如本文所述的示例性方法所觀察到的提高的擴增速率。(a)提供示出了匹配的Stem引物(即SNP-STEM)反應(yīng)(淡跡線)和錯配的Stem引物反應(yīng)(深跡線)的原始跡線。(b)量化周期(Cq；參見Hellemans等人,2007)是從擬合的原始跡線起計算作為最大斜率點。將匹配引物的Cq連同錯配的Stem引物(深色點)和無Stem引物的LAMP(“啞鈴”)反應(yīng)(開環(huán))一起繪圖(淡色點)。

詳述

以下為提供用于幫助本領(lǐng)域技術(shù)人員實踐本發(fā)明的詳細(xì)說明。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可在不背離本公開的精神或范圍下在本文所述的實施方案中進(jìn)行修改和改動。本文所提及的所有出版物、專利申請、專利、圖和其他參考文獻(xiàn)都以引用的方式清楚地整體并入。

本發(fā)明提供一種改進(jìn)的核酸擴增技術(shù)(NAAT)，且尤其是iNAAT，其是穩(wěn)定的、成本有效的、在引物放置和設(shè)計中提供靈活性，并且還在低拷貝數(shù)下具體說來與例如SDA或LAMP相比顯示出增加的速率、靈敏度及再現(xiàn)性。

如上所述，有利的是具有一個平臺，其將擴增樣品分到多個單獨的反應(yīng)中，因此不存在染料或引物的干擾，以使得更多測試可根據(jù)樣品可靠地進(jìn)行。為了在不稀釋樣品且由此減小靈敏度或誘導(dǎo)多個反應(yīng)室之間的不均勻性下完成此舉，樣品中的核酸應(yīng)在分配給最終反應(yīng)區(qū)域之前稍微擴增。這將確保所有下游反應(yīng)室具有足量的起始DNA(或RNA)以便可靠地提供一個有意義的結(jié)果。

完成此舉的一種已知方式是使用初始PCR反應(yīng)，該反應(yīng)擴增含有目標(biāo)區(qū)域但稍微較大的產(chǎn)物，接著分配那個產(chǎn)物以分隔僅擴增每個小目標(biāo)區(qū)域(或SNP)的下游反應(yīng)。此被稱為嵌套式PCR，因為每個靶序列或SNP是“嵌套”在較大的擴增區(qū)域內(nèi)。如果使用此方法，那么通常需要稀釋步驟，以便預(yù)擴增引物不會污染最終的反應(yīng)和檢測步驟。稀釋步驟是自動化儀器中非常不希望有的，因為其需要另外的流體來源及樣品流體的另外操縱。這要簡單得多且因此更為有利，以便能夠使用含有直接在最終擴增和檢測反應(yīng)中的預(yù)擴增樣品的流體。

完成此舉的另一種方式是在預(yù)擴增引物中使用Irma而非胸腺嘧啶，接著使用酶(其破壞尿嘧啶)破壞后續(xù)步驟中的引物，然后使用所生成的預(yù)擴增但無引物的溶液用于最終的擴增和檢測步驟。此方法的優(yōu)點是不需要引入稀釋劑，但需要另外的酶，所述酶可以干燥和固定化(凍干)形式提供，這比稀釋步驟更為簡單：進(jìn)一步期望使用不需要溫度循環(huán)(等溫)的方法。這是因為等溫擴增反應(yīng)傾向于比溫度循環(huán)反應(yīng)(如PCR)要更快，且因為等溫要求造成較低成本和較低電力的儀器。

用于預(yù)擴增樣品的另一種已知方法是使用全基因組擴增，由此樣品中的所有遺傳物質(zhì)都同等地擴增。這是使用短(6或7個堿基)引物的文庫完成，所述引物文庫代表幾乎所有的可能的序列且可因此覆蓋所有的基因組。幾乎所有的核酸樣品都將被來自除目標(biāo)以外的生物體的核酸污染，且有時存在與目標(biāo)遺傳物質(zhì)相比超過10⁸倍過量的此不需要的遺傳物質(zhì)。

因此，對于此方法，為此預(yù)擴增方法所需的絕大多數(shù)擴增資源將被不希望有的污染DNA的擴增所消耗。并且在目標(biāo)核酸內(nèi)，在最終擴增反應(yīng)中僅測試很少一部分(通常.01％或更少)基因組，所以全基因組擴增方法在非信息基因組區(qū)域處以超過10¹²倍進(jìn)一步被錯過導(dǎo)向(miss-directed)。另外，全基因組擴增方法采取相對較長時間(數(shù)小時)，且需要高濃度的特殊的、高度加工的鏈置換酶，這為測定增加了成本。如果使用此方法預(yù)擴增太多的物質(zhì)，這可在高度污染的樣品中發(fā)生，那么陽性信號可產(chǎn)生最終的檢測區(qū)，即使不存在目標(biāo)DNA。需要稀釋步驟來防止此假陽性信號，這為采用此技術(shù)的儀器的流體處理系統(tǒng)增加了成本和復(fù)雜性。

不具有以上另外測定要求及其相關(guān)缺點的方法是優(yōu)選的。

如本文所述的方法提供低速等溫預(yù)擴增，接著是高速位點特異性擴增和檢測步驟。舉例來說，如本文所述的示例性方法包括第一階段慢速等溫反應(yīng)，緊接著是單獨的或第二階段快速指數(shù)等溫擴增反應(yīng)，該反應(yīng)是以相對于第一反應(yīng)的提高的速率進(jìn)行。

在另一實施例中，在環(huán)引物或莖引物不存在下，使用LAMP系統(tǒng)完成區(qū)域特異性預(yù)擴增步驟，因此導(dǎo)致非常慢的指數(shù)反應(yīng)速度。一旦(在預(yù)定的時間幀內(nèi))實現(xiàn)大致100-100,000x的擴增，便將反應(yīng)分到多個反應(yīng)室中，其中在每個室中借助于例如3'端匹配/錯配或退火溫度差異引入不同組的位點特異性敏感的環(huán)或莖引物，以便速度高得多的指數(shù)反應(yīng)僅在環(huán)或莖引物正確地與樣品序列匹配時發(fā)生。在擴增速率上的顯著差異可通過例如嵌入染料的實時熒光測量來檢測，且因此，在同一目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的多個位點特異性反應(yīng)可用單一測定單獨鑒定。

因此，一方面，本發(fā)明提供兩階段核酸擴增反應(yīng)，其包括：提供靶核酸模板和至少一種引物，所述引物在待擴增的目標(biāo)區(qū)域附近與靶核酸模板退火；進(jìn)行第一階段核酸擴增(或“預(yù)擴增”)反應(yīng)以擴增目標(biāo)區(qū)域(擴增子)。在某些實施方案中，提供正向和反向引物并且用于合成和擴增目標(biāo)區(qū)域或目標(biāo)擴增子。

隨后，在一個或多個第二階段擴增反應(yīng)中利用預(yù)擴增反應(yīng)產(chǎn)物(“初級擴增子”或“目標(biāo)擴增區(qū)域”)，其中這些反應(yīng)中的至少一個包括位點或序列特異性二級引物(“位點特異性引物”)，以便只有當(dāng)位點特異性引物的互補序列(即位點特異性目標(biāo)區(qū)域)存在于來自階段一的初級擴增子或擴增的目標(biāo)區(qū)域中時才發(fā)生快速擴增。換言之，來自階段一的目標(biāo)核酸區(qū)域?qū)δ繕?biāo)位點呈陽性。如本文所述，擴增產(chǎn)物在每個第二階段反應(yīng)中的出現(xiàn)可同時和實時檢測并比較，其中相對于第一階段反應(yīng)、第二階段反應(yīng)(其中不添加二級引物)及第二階段錯配引物反應(yīng)的快速擴增速率指示位點特異性目標(biāo)區(qū)域的存在。

顯然，因為在某些實施方案中，擴增的區(qū)域在第一階段和第二階段反應(yīng)中是相同的，所以有利的是在存在來自第一階段擴增反應(yīng)的可測量產(chǎn)物而不能檢測到第二階段擴增產(chǎn)物之前很好地引入第二階段擴增反應(yīng)引物。

如本文所述的方法提供第一階段慢速等溫預(yù)擴增，接著是多個離散的第二階段擴增和檢測反應(yīng)，所述第二反應(yīng)直接對來自第一階段擴增的產(chǎn)物并行進(jìn)行。至少一個第二階段反應(yīng)包括位點特異性二級引物，其中如果初級擴增子模板包含位點特異性引物的互補位點，那么位點特異性引物擴增反應(yīng)在相對于第一階段反應(yīng)和第二階段反應(yīng)(其中不添加二級引物)兩者的較快速率下進(jìn)行。在某些實施方案中，至少一個第二階段反應(yīng)包括具有錯配核苷酸的二級引物(“錯配引物”)，例如3’錯配(“3’錯配引物”)，其中位點特異性引物擴增反應(yīng)在相對于第一階段反應(yīng)、第二階段反應(yīng)(其中不添加二級引物)及第二階段錯配引物反應(yīng)的較快速率下進(jìn)行。

例如，本發(fā)明提供一種方法，其中進(jìn)行第一階段區(qū)域特異性預(yù)擴增步驟，然后將反應(yīng)分到多個反應(yīng)室中，其中在至少一個室中借助于例如3'端匹配/錯配或退火溫度差異引入位點特異性敏感的二級引物，例如環(huán)或莖引物，以便速度高得多的指數(shù)反應(yīng)僅在二級引物正確地與樣品序列匹配時發(fā)生。在擴增速率上的顯著差異可通過例如嵌入染料的實時熒光測量來檢測，且因此，在同一目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的多個位點特異性反應(yīng)可用單一測定單獨鑒定。

除非另外定義，本文所用的全部技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有本發(fā)明相關(guān)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。本發(fā)明中所用的術(shù)語僅僅是用于描述具體的實施方案，而不意圖限制本發(fā)明。

當(dāng)提供一個數(shù)值范圍時，應(yīng)該理解的是介于該范圍的上下限間的每一個中間值(除非文中另外清楚地指出，否則所述中間值是下限單位的十分之一，如在含有許多碳原子的組的情況下，提供落在此范圍內(nèi)的每個碳原子數(shù))和任何其他所說明的或者在所說明的范圍中的中間值都被包括在本發(fā)明內(nèi)。這些較小范圍的上下限可獨立地被包括在該較小的范圍中，且在所說明范圍內(nèi)明確地排除極限值的條件下也被包括在本發(fā)明內(nèi)。當(dāng)所述范圍包括所述上下限中的一個或兩個時，排除了那些所包括的上下限中的一個或兩個的范圍也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。

以下術(shù)語被用于描述本發(fā)明。在術(shù)語并未在本文中特別定義的情況下，該術(shù)語被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員給予本領(lǐng)域公知的含義，本領(lǐng)域技術(shù)人員將該術(shù)語在上下文中應(yīng)用于描述本發(fā)明的其用途中。

除非上下文另外清楚地指示，如本文和所附權(quán)利要求書中所用的冠詞“一個(種)”在本文中用于指代一個或多于一個(即至少一個)該冠詞的語法對象。舉例來說，“一個要素”意指一個要素或多于一個要素。

如在本文說明書和權(quán)利要求書中所用的短語“和/或”應(yīng)理解為指這樣結(jié)合起來的要素中的“任一個或二者”，即在一些情況下聯(lián)合性地存在而在其他情況下分離性地存在的要素。用“和/或”列出的多個要素應(yīng)以相同的方式理解，即這樣結(jié)合起來的要素中的“一個或多個”。除了通過“和/或”措辭所具體指出的要素之外，可任選地存在另外的要素，而不論與所具體指出的要素是否相關(guān)。因此，作為非限制性實例，當(dāng)與開放式表述如“包括”聯(lián)合使用時，表述“A和/或B”在一個實施方案中可僅有A(任選地包括除了B以外的要素)；在另一實施方案中，可僅有B(任選包括除了A以外的要素)；在又一實施方案中，可表示A和B二者(任選包括其他要素)；等等。

如本文說明書和權(quán)利要求書中所用，“或”應(yīng)理解為具有與如上所定義的“和/或”相同的含義。舉例來說，當(dāng)在列表中分列項目時，“或”或“和/或”應(yīng)該認(rèn)為是包括性的，即包括要素列表或大量要素中的至少一個，而且包括多于一個，并且任選地包括另外的未列出的項目。只有明確表示相反含義的術(shù)語，如“僅僅之一”或“正好之一”或當(dāng)在權(quán)利要求中使用“由...組成”時，將表示包括要素列表或大量要素中的正好一個要素。一般說來，當(dāng)前面有排他術(shù)語如“兩者之一”、“其一”、“僅有其一”或“恰好其一”時，本文使用的術(shù)語“或”應(yīng)理解為表示排他的替代方案(即“一個或另一，但非兩者”)。

在權(quán)利要求書以及上面的說明書中，所有過渡性表述如“包含”、“包括”、“載有”、“具有”、“含有”、“涉及”、“持有”、“含”等均應(yīng)理解為開放性的，即理解為指包括但不限于。只有過渡性表述“由...組成”和“基本上由...組成”分別為封閉式或半封閉式的過渡性表述，如美國專利局專利審查手冊第2111.03部分所規(guī)定。

關(guān)于一個或多個要素的列表，本說明書和權(quán)利要求書中用到的表述“至少一個”應(yīng)理解為指選自所述要素列表中的任何一個或多個要素的至少一個要素，但不一定包含所述要素列表內(nèi)明確列舉的每個要素中的至少一個，也不排除所述要素列表中要素的任何組合。此定義還允許可任選地存在除表述“至少一個”所修飾的要素列表內(nèi)明確指出的要素以外的要素，無論與那些明確指出的要素相關(guān)或不相關(guān)。因此，作為非限制性實例，“A和B中的至少一個”(或等同地，“A或B中的至少一個”，或等同地，“A和/或B中的至少一個”)在一個實施方案中可表示至少一個A，任選地包括多于一個A，但不存在B(并且任選地包括除了B以外的要素)；在另一個實施方案中，可表示至少一個B，任選地包括多于一個B，但不存在A(并且任選地包括除了A以外的要素)；在又一個實施方案中，可表示至少一個A，任選地包括多于一個A，以及至少一個B，任選地包括多于一個B(并且任選地包括其他要素)；等等。

還應(yīng)理解，除非上下文另外指出，在本文所述的包括多于一個步驟或動作的某些方法中，方法的步驟或動作順序不一定限于所述方法的步驟或動作順序。

除非另有陳述，如本文所用的術(shù)語“化合物”是指本文所公開的任何特定化合物并且包括互變異構(gòu)體、位置異構(gòu)體、幾何異構(gòu)體、及適用時立體異構(gòu)體，包括其光學(xué)異構(gòu)體(對映異構(gòu)體)及其他立體異構(gòu)體(非對映異構(gòu)體)，以及在上下文中適用時其藥學(xué)上可接受的鹽和衍生物(包括前藥形式)。在上下文的使用中，術(shù)語化合物一般指的是單一化合物，而且還可包括其他化合物，如立體異構(gòu)體、位置異構(gòu)體和/或光學(xué)異構(gòu)體(包括外消旋混合物)以及所公開的化合物的特定對映異構(gòu)體或?qū)τ钞悩?gòu)體富集的混合物。在上下文中的術(shù)語還指的是已被修飾以促進(jìn)化合物施用和遞送到活性位點的化合物的前藥形式。注意到，在描述本化合物時，尤其描述眾多取代基及與其相關(guān)的變量。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)理解本文所述的分子是一般如下文所述的穩(wěn)定化合物。當(dāng)示出鍵時，雙鍵和單鍵都在所示化合物的情形中展示。

術(shù)語“患者”或“受試者”在說明書通篇中用于描述動物，優(yōu)選人或馴養(yǎng)動物，提供用根據(jù)本發(fā)明的組合物對其進(jìn)行的治療，包括預(yù)防性治療。對于治療針對某種具體動物如人患者的感染、病狀或疾病狀態(tài)而言，術(shù)語患者是指所述特定動物，包括馴養(yǎng)動物，如狗或貓或農(nóng)畜，如馬、母牛、綿羊等。一般說來，在本發(fā)明中，除非另有說明或從術(shù)語使用的上下文中所暗示，術(shù)語患者是指人患者。

術(shù)語“有效”被用于描述當(dāng)在其預(yù)定用途的情形中使用時實現(xiàn)預(yù)期結(jié)果的化合物、組合物或組分的量。術(shù)語有效包括所有其他有效量或有效濃度術(shù)語，其另外描述或用于本發(fā)明應(yīng)用中。

術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”及“寡核苷酸”是指核苷酸的生物聚合物，并且除非上下文中另外指示，包括修飾的和未修飾的核苷酸，及DNA和RNA兩者。例如，在某些實施方案中，核酸是肽核酸(PNA)。通常，使用DNA作為用于擴增的核酸模板進(jìn)行本文所述的方法。然而，其核苷酸被人工衍生物取代的核酸或來自天然DNA或RNA的修飾的核酸也包括在本發(fā)明的核酸中，在所述核酸用作合成互補鏈的模板的限度內(nèi)。本發(fā)明的核酸一般包含在生物樣品中。生物樣品包括動物、植物或微生物組織、細(xì)胞、培養(yǎng)物及排泄物、或其提取物。在某些方面中，生物樣品包括細(xì)胞內(nèi)寄生蟲基因組DNA或RNA，如病毒或支原體。核酸可來源于包含在所述生物樣品中的核酸。例如，基因組DNA、或由mRNA合成的cDNA、或基于來源于生物樣品的核酸擴增的核酸優(yōu)選用于所述方法中。

術(shù)語“引物”或“寡核苷酸引物”可指的是滿足以下要求的短多核苷酸：其必須形成足以與所需核酸模板退火的互補堿基配對，并且得到充當(dāng)互補鏈在3'-末端處的合成起點的--OH基團。因此，其主鏈不一定限于經(jīng)由磷酸二酯鍵的那個。舉例來說，其可包含具有S而非O作為基于肽鍵的主鏈或肽核酸的硫代磷酸酯衍生物。堿基可以是能夠互補堿基配對的那些。在自然界中，存在5個堿基，亦即A、C、T、G及U，但堿基可以是類似物，如溴脫氧尿苷。如本文所用的寡核苷酸不僅可用作合成起點，而且用作合成互補鏈的模板。術(shù)語多核苷酸包括寡核苷酸，其具有相對較短的鏈長度。顯然，引物不必完全互補，以便退火至多核酸上的結(jié)合位點。

在某些實施方案中，引物與結(jié)合位點序列互補。在其他實施方案中，引物包含一個或多個錯配核苷酸(即不與結(jié)合位點互補的堿基)。在又一些實施方案中，引物可包含不與同引物與其退火的多核酸的反向鏈互補的多核酸退火的區(qū)段。在某些實施方案中，引物在長度上是2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70或更多個核苷酸。在一個優(yōu)選實施方案中，引物包含2至100個核苷酸。

寡核苷酸可用于與相同或不同生物體中的基因組DNA或cDNA序列雜交。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解，各種程度的雜交嚴(yán)格性可用于測定中?？蓹z測的結(jié)合所需的互補性程度(序列同一性)將根據(jù)雜交介質(zhì)和/或洗滌介質(zhì)的嚴(yán)格性而變化。隨著雜交條件變得更嚴(yán)格，在探針與要發(fā)生的雙鏈體形成的靶標(biāo)之間必須存在更大程度的互補性。嚴(yán)格性程度可通過以下一個或多個來控制：溫度、離子強度、pH及部分變性溶劑如甲酰胺的存在。例如，雜交嚴(yán)格性方便地通過經(jīng)由例如將甲酰胺濃度操控在0％至50％范圍內(nèi)改變反應(yīng)物的極性而變化。通過降低雜交的嚴(yán)格性可以補償探針和引物中的微小序列變化。

“互補性”是指一個核酸通過傳統(tǒng)的沃森-克里克或其他非傳統(tǒng)類型與另一個核酸序列形成一個或多個氫鍵或與其雜交的能力。如本文所用的雜交是指分子在低、中等、或高度嚴(yán)格條件下僅與特定的核苷酸序列的結(jié)合、成雙鏈或雜交，包括當(dāng)那個序列存在于復(fù)雜的混合物(例如總細(xì)胞)DNA或RNA中時。參見，例如Ausubel等人,CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John Wiley&Sons,New York,N.Y.,1993

如果在多核苷酸的某些位置處的核苷酸能夠與在反平行的DNA或RNA鏈中的相同位置處的核苷酸形成沃森-克里克配對，那么所述多核苷酸與所述DNA或RNA分子在那個位置處彼此互補。當(dāng)在每個分子中的足夠數(shù)量的相應(yīng)位置被可彼此雜交或退火以實現(xiàn)所需過程的核苷酸占據(jù)時，多核苷酸與DNA或RNA分子彼此“基本上互補”?；パa序列是能夠在嚴(yán)格條件下退火以提供充當(dāng)合成互補鏈的起點的3'-末端的序列。

“正向引物結(jié)合位點”和“反向引物結(jié)合位點”是指正向和反向引物所結(jié)合至的模板DNA和/或擴增子上的區(qū)域。引物用于劃定在擴增期間以指數(shù)方式擴增的原始模板多核苷酸的區(qū)域。在一些實施方案中，另外的引物可結(jié)合至正向引物和/或反向引物的5'區(qū)域。當(dāng)使用這類另外的引物時，正向引物結(jié)合位點和/或反向引物結(jié)合位點可包括這些另外的引物的結(jié)合區(qū)以及引物本身的結(jié)合區(qū)。例如，在一些實施方案中，所述方法可使用一個或多個另外的引物，所述引物結(jié)合至位于正向和/或反向引物結(jié)合區(qū)的5'處的區(qū)域。這類方法公開于例如WO0028082中，所述專利公開了“置換引物”或“外部引物”的用途。

在本發(fā)明中使用的術(shù)語“模板”意指充當(dāng)核酸擴增技術(shù)中用于合成互補鏈的模板的核酸。具有與模板互補的核苷酸序列的互補鏈具有作為對應(yīng)于模板的鏈的含義，但兩者之間的關(guān)系僅僅是相對的。也就是說，根據(jù)本文所述的方法，作為互補鏈合成的鏈可再次用作模板。換言之，互補鏈可變成模板。在某些實施方案中，模板來源于生物樣品，例如植物、動物、病毒、微生物、細(xì)菌、真菌等。在某些實施方案中，動物是哺乳動物，例如人患者。

“患者樣品”是指從患者處采集的任何樣品并且可包括血液、糞便、拭子、痰液、肺泡灌洗液、組織樣品、尿液或脊髓液。其他合適的患者樣品及提取它們的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。樣品所采集自的“患者”或“受試者”可以是人或非人動物。當(dāng)樣品不被明確地稱為患者樣品時，該術(shù)語也包括采集自其他來源的樣品。實例包括來自表面的拭子、水樣品(例如廢水、海水、湖水、飲用水)、食物樣品、美容產(chǎn)品、醫(yī)藥產(chǎn)品、發(fā)酵產(chǎn)物、細(xì)胞和微生物培養(yǎng)物及其中需要檢測微生物的其他樣品。

在本發(fā)明中，使用核酸的術(shù)語“合成”和“擴增”。在本發(fā)明中的核酸合成意指核酸從充當(dāng)合成起點的寡核苷酸的伸長或延伸。如果不僅此合成而且其他核酸的形成及由此形成的核酸的伸長或延伸反應(yīng)連續(xù)地發(fā)生，那么一系列這些反應(yīng)全被稱為擴增。

“同一性”正如本領(lǐng)域所知的，是指通過比較序列而確定的兩個或更多個多肽序列、或兩個或更多個多核苷酸序列之間的關(guān)系。在本領(lǐng)域中，“同一性”還意指多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)性程度，如通過所述序列鏈之間的匹配所確定。“同一性”和“相似性”可容易地通過已知方法計算，所述方法包括但不限于，Computational Molecular Biology,Lesk,A.M.,編著,Oxford University Press,New York,1988；Biocomputing:Informatics and Genome Projects,Smith,D.W.,編著,Academic Press,New York,1993；Computer Analysis of Sequence Data,第I部分,Griffin,A.M.,和Griffin,H.G.,編著；Humana Press,New Jersey,1994；Sequence Analysis in Molecular Biology,von Heinje,G.,Academic Press,1987；以及Sequence Analysis Primer,Gribskov,M.和Devereux,J.,編著,M Stockton Press,New York,1991；以及Carillo,H.,和Lipman,D.,Siam J.Applied Math.,48:1073(1988)中描述的那些。另外，同一性百分比的值可從使用AlignX component of Vector NTI Suite 8.0(Informax,Frederick,Md.)的默認(rèn)設(shè)置生成的氨基酸和核苷酸序列比對中獲得。

測定同一性的優(yōu)選方法被設(shè)計來得出測試序列之間的最大匹配。測定同一性和相似性的方法都編纂在公眾可獲得的計算機程序中。測定兩個序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選計算機程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux,J.等人,Nucleic Acids Research 12(1):387(1984))、BLASTP、BLASTN和FASTA(Atschul,S.F.等人,J.Molec.Biol.215:403-410(1990))。BLAST X程序可公開獲自NCBI及其他來源(BLAST Manual,Altschul,S.等人,NCBINLM NIH Bethesda,Md.20894:Altschul,S.等人,J.Mol.Biol.215:403-410(1990))。公知的Smith Waterman算法也可用于測定同一性。

“單核苷酸多態(tài)性”(SNP)是通常發(fā)生在群體(例如1％)內(nèi)的DNA序列變化，其中在基因組(或其他共享序列)中的單核苷酸-A、T、C或G-在生物學(xué)物種的成員或成對染色體之間不同。例如，來自不同個體(AAGCCTA至AAGCTTA)的兩個經(jīng)測序的DNA片段在單核苷酸中含有差異(即，存在兩個等位基因)。幾乎所有常見的SNP都僅具有兩個等位基因。SNP可存在于DNA的編碼、非編碼或基因間區(qū)域中。SNP的基因組分布是不均勻的；相比在編碼區(qū)中，SNP更常出現(xiàn)于非編碼區(qū)中，或一般說來，其中自然選擇起作用并且‘固定’構(gòu)成最有利的遺傳適應(yīng)性的SNP的等位基因(消除其他變體)。其他因子，像遺傳重組和突變率，也可測定SNP densi。編碼序列內(nèi)的SNP不一定改變所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，由于遺傳密碼的簡并性。

在編碼區(qū)中的SNP具有兩種類型，同義和非同義SNP。同義SNP不影響蛋白質(zhì)序列，而非同義SNP改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。非同義SNP具有兩種類型：錯義和無義。不在蛋白質(zhì)編碼區(qū)域中的SNP仍然可以影響基因剪接、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、信使RNA降解、或非編碼RNA的序列。由此類SNP實現(xiàn)的基因表達(dá)被稱為eSNP(表達(dá)SNP)并且可在該基因的上游或下游。

至于基因，存在SNP的生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫。dbSNP是來自國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的SNP數(shù)據(jù)庫。Kaviar是來自多個數(shù)據(jù)源(包括dbSNP)的SNP的一覽表。SNPedia是支持個人基因組注釋、解釋及分析的wiki-style數(shù)據(jù)庫。OMIM數(shù)據(jù)庫描述了多態(tài)性與疾病(例如，以文本形式給出疾病)之間的關(guān)聯(lián)性，人類基因突變數(shù)據(jù)庫提供了引起或與人類遺傳疾病有關(guān)的基因突變及功能性SNP，并且GWAS Central允許用戶在一個或多個基因組范圍的關(guān)聯(lián)研究中目測查詢實際的概要水平關(guān)聯(lián)數(shù)據(jù)。國際SNP Map工作組通過比對Genebank中的大插入克隆的基因組序列對側(cè)接每個SNP的序列進(jìn)行繪圖。另一個數(shù)據(jù)庫是國際人類基因組單體型圖計劃(International HapMap Project)，其中研究人員鑒定Tag SNP以便能夠確定存在于每個受試者中的單倍型的集合。

通過所采用的擴增技術(shù)產(chǎn)生的多核酸一般被稱為“擴增子”或“擴增產(chǎn)物”。所產(chǎn)生的擴增子的特性根據(jù)實踐中的NAAT而顯著不同。例如，NAAT如PCR可產(chǎn)生基本上相同尺寸和序列的擴增子。其他NAAT產(chǎn)生尺寸非常不同的擴增子，其中擴增子由不同數(shù)量的重復(fù)序列構(gòu)成以便擴增子是不同長度的多聯(lián)體的集合。來自所述多聯(lián)體的重復(fù)序列將反映作為進(jìn)行中的測定的對象的多核酸的序列。

在本說明書中，簡單表述“5'-側(cè)”或“3'-側(cè)”是指充當(dāng)模板的核酸鏈的那側(cè)，其中5'端一般包括磷酸基且3'端一般包括游離的-OH基團。

術(shù)語“疾病狀態(tài)或病狀”用于描述任何疾病狀態(tài)或病狀，具體說來，與遺傳異常有關(guān)或由于存在致病生物如病毒、細(xì)菌、古生菌、原生動物或多細(xì)胞生物體所致的那些。

方法

如本文所述，已經(jīng)驚人地且出人意料地發(fā)現(xiàn)使用引物進(jìn)行兩階段核酸擴增反應(yīng)允許目標(biāo)核酸序列的快速實時檢測，所述引物根據(jù)目標(biāo)特異性序列的存在或不存在提供差異反應(yīng)速率，這種方法為現(xiàn)場護理診斷提供優(yōu)勢。

一方面，本發(fā)明提供兩階段核酸擴增反應(yīng)，其包括：提供靶核酸模板和至少一種引物，所述引物在待擴增的目標(biāo)區(qū)域附近與靶核酸模板退火；進(jìn)行第一階段核酸擴增(或預(yù)擴增)反應(yīng)以擴增目標(biāo)區(qū)域(擴增子)。在某些實施方案中，提供正向和反向引物并且用于合成和擴增目標(biāo)區(qū)域或目標(biāo)擴增子。

隨后，在一個或多個離散的第二階段核酸擴增反應(yīng)中利用預(yù)第一階段擴增反應(yīng)產(chǎn)物(“初級擴增子”或“目標(biāo)擴增區(qū)域”)，其中在至少一個第二階段反應(yīng)中包括位點特異性引物，以便只有當(dāng)位點特異性引物的互補序列(即目標(biāo)位點特異性區(qū)域)存在于初級擴增子中時才發(fā)生快速或加速擴增。換句話說，如果第二階段擴增反應(yīng)的速率相對于階段一反應(yīng)、及缺少另外的引物的任何第二階段反應(yīng)、和/或具有錯配引物的第二階段反應(yīng)是加速的，那么來自階段一的目標(biāo)核酸區(qū)域?qū)τ谀繕?biāo)位點呈陽性。

因此，根據(jù)本文所述的某些方法，第二階段反應(yīng)的速率相對于第一通過特異性引物結(jié)合序列的存在而選擇性地提高，所述特異性引物結(jié)合序列與第二階段引物(在本文中，“位點特異性引物”)的3’端完全互補或至少是互補的。在某些實施方案中，相對擴增反應(yīng)速率如下：第二階段位點特異性引物擴增>>第一階段擴增反應(yīng)。在又一些實施方案中，相對擴增反應(yīng)速率如下：第二階段位點特異性引物擴增>>第一階段反應(yīng)≈第二階段錯配引物擴增。如本文所用，術(shù)語“錯配引物”一般指的是具有不與模板上的引物結(jié)合位點互補的3'端核苷酸的引物。

如上所指出，第一階段與第二階段之間，以及第二階段位點特異性引物對比第二階段錯配引物之間的差異相對擴增反應(yīng)速率對于能夠選擇性地檢測目標(biāo)位點的存在(即擴增)是重要的。例如，圖5示出了第一階段預(yù)擴增反應(yīng)相對緩慢地進(jìn)行至閾值信號水平(即，Cq更長)。然而，在互補引物存在下，第二階段擴增反應(yīng)以指數(shù)方式進(jìn)行(即，互補引物的Cq比第一階段反應(yīng)和第二階段錯配引物反應(yīng)兩者的Cq更快)。

在某些實施方案中，第二階段擴增速率是指數(shù)的。在本文所述方法的某些實施方案中，第二階段位點特異性引物反應(yīng)速率比第二階段錯配引物反應(yīng)快至少約5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、500、1000、10000、100000倍或更大倍數(shù)。在本文所述方法的某些實施方案中，第二階段位點特異性引物反應(yīng)速率比第二階段錯配引物反應(yīng)快約5、10、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、500、1000、10000、100000倍或更大倍數(shù)。

在本文所述方法的某些實施方案中，第二階段位點特異性引物反應(yīng)所得到的Cq(至陽性反應(yīng)檢測的時間)比第二階段錯配引物反應(yīng)快至少約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、500％、1000％、10000％或更多。在本文所述方法的某些實施方案中，第二階段位點特異性引物反應(yīng)所得到的Cq(至陽性反應(yīng)檢測的時間)比第二階段錯配引物反應(yīng)快約10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、500％、1000％、10000％或更多。在本文所述方法的某些實施方案中，第二階段位點特異性引物反應(yīng)所得到的Cq(至陽性反應(yīng)檢測的時間)比第二階段錯配引物反應(yīng)快至少約25％。在本文所述方法的某些實施方案中，第二階段位點特異性引物反應(yīng)所得到的Cq(至陽性反應(yīng)檢測的時間)比第二階段錯配引物反應(yīng)快約10％至約1000％、約20％至約500％、或約25％至約100％。然而，重要因素在于時間上的差異足以超過系統(tǒng)的可變性以便確信地區(qū)分哪個第二階段反應(yīng)是匹配的(即，第二階段引物與模板上的引物結(jié)合位點互補，特別是3'端處)。

如下所述，在某些實施方案中，第一階段擴增反應(yīng)是相對緩慢的基于LAMP的擴增。在另一些實施方案中，第二階段擴增反應(yīng)是相對快速的基于LAMP-STEM的擴增，其中反應(yīng)速率通過將位點特異性Stem引物結(jié)合至目標(biāo)位點來提高。因此，如本文所述的方法提供穩(wěn)定、快速、有效及高度特異性的所需基因序列的擴增。所需擴增子的擴增可通過任何已知方法監(jiān)測或檢測，包括例如嵌入染料、標(biāo)記試劑等。

在某些實施方案中，位點特異性引物是位點特異性Stem引物。在某些實施方案中，錯配引物是錯配Stem引物。在本文所述的任何實施方案中，錯配引物包含至少一個錯配核苷酸(即不與模板互補的核苷酸)。在某些實施方案中，錯配核苷酸處于錯配引物的3’端(“3’錯配引物”)。

在某些實施方案中，位點特異性引物和錯配引物在它們的3'端處分別包含對多等位基因或多態(tài)位點中的一個形式有特異性或互補的核苷酸，以便根據(jù)核酸模板包含哪個等位基因或多態(tài)性，位點特異性引物可包含3'端核苷酸錯配，并且錯配引物可含有3'端互補核苷酸。換言之，在某些實施方案中，所述方法包括進(jìn)行多個第二階段擴增反應(yīng)，其中每個反應(yīng)包含對特定的等位基因有特異性的引物。然而，如本文所述，僅那些在其3'端處包含與目標(biāo)位點互補的二級引物的擴增反應(yīng)將在相對于第一階段反應(yīng)并且相對于包含3'錯配的第二階段反應(yīng)的提高的速率下進(jìn)行。

在某些實施方案中，所述方法包括進(jìn)行多個第二階段擴增反應(yīng)，其中每個相應(yīng)反應(yīng)包含位點特異性或等位基因特異性引物。在某些實施方案中，在每個相應(yīng)的第二階段擴增反應(yīng)中的每個位點特異性引物對不同的等位基因、突變或多態(tài)性有特異性。在這類配置中，所述方法提供一種同時確定多個多態(tài)性的存在或不存在的多重方法。如所述的方法因此尤其便于區(qū)分多等位基因、基因型、分化體、形式、組、亞組、類別、物種或株系。例如，某些致病菌與非致病株系或物種密切相關(guān)。因此，在一個示例性方面中，本發(fā)明提供包括多個第二階段反應(yīng)的方法，其中每個相應(yīng)反應(yīng)包含對目標(biāo)位點或等位基因有特異性的引物(或引物對)，其允許同時確定例如微生物的物種和株系。

舉例來說，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種兩階段核酸擴增和實時檢測方法，所述方法包括：

a.提供靶核酸模板和至少一種引物，所述引物在靠近待擴增的目標(biāo)區(qū)域處與靶核酸模板退火；

b.進(jìn)行第一階段核酸擴增反應(yīng)以擴增所述目標(biāo)區(qū)域，由此形成初級擴增子；

c.將(b)分成至少兩個反應(yīng)，二級位點特異性引物包括在至少一個所述反應(yīng)中，所述二級位點特異性引物與在初級擴增子中并界定目標(biāo)位點的位點特異性引物結(jié)合區(qū)(即，目標(biāo)位點特異性區(qū))互補，并且包括其中不含二級引物的至少一個反應(yīng)；

d.進(jìn)行第二核酸擴增反應(yīng)，由此擴增目標(biāo)區(qū)域；以及

e.實時檢測并比較位點特異性引物反應(yīng)和錯配引物反應(yīng)的擴增速率，其中在位點特異性引物反應(yīng)中相對于錯配引物反應(yīng)的提高的擴增速率指示目標(biāo)位點的存在。在某些實施方案中，提供正向和反向引物并且用于合成和擴增目標(biāo)區(qū)域或目標(biāo)擴增子。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，錯配引物包含3’末端核苷酸錯配。在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，位點特異性引物在3’末端包含與靶核酸模板中的目標(biāo)核苷酸互補的核苷酸。在某些實施方案中，位點特異性引物包含在除3’端以外的位點處的核苷酸錯配。

在某些實施方案中，多個第二階段核酸擴增反應(yīng)并行進(jìn)行。在一個優(yōu)選實施方案中，位點特異性引物反應(yīng)與其中使用相似的位點特異性引物但在其核酸序列中包含錯配的分離反應(yīng)并行進(jìn)行和監(jiān)測。換言之，在一個反應(yīng)中，位點特異性引物與靶核酸上的目標(biāo)位點完全互補，并且在另一個反應(yīng)中，引物退火于相同位點，但包含錯配，例如3’端錯配。本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)，在位點特異性引物中的錯配減緩擴增反應(yīng)速率，這樣足以使得通過直接實時檢測或監(jiān)測并且同時比較兩個擴增反應(yīng)，有可能鑒定存在于核酸樣品中的序列變化的存在或不存在。換句話說，第二擴增反應(yīng)的速率基于與位點特異性引物互補的序列的存在選擇性地得到提高或抑制。不受任何特定理論的約束，據(jù)信第二階段擴增的速率通過利用位點特異性引物得到提高，因為該位點特異性引物充當(dāng)另一個延伸起點。

另一方面，描述了一種方法，其包括利用第一階段擴增產(chǎn)物進(jìn)行多個單獨的或離散的第二階段擴增反應(yīng)，其中第二階段擴增反應(yīng)的速率在以下反應(yīng)之間比較，至少一個具有與模板上的目標(biāo)區(qū)域或序列互補的位點特異性引物的反應(yīng)與具有退火于相同位點但包含堿基對錯配(在本文中“錯配引物”)的引物的反應(yīng)，其中相對于另一個的更快反應(yīng)速率指示目標(biāo)特異性位點或區(qū)域的存在或不存在。

在某些實施方案中，所述方法包括與其中不添加另外的引物的位點特異性和錯配擴增反應(yīng)并行進(jìn)行至少一個另外的第二階段擴增反應(yīng)，并且實時監(jiān)測和比較以下反應(yīng)之間的擴增速率：包含位點特異性引物的第二階段擴增反應(yīng)、包含錯配引物的反應(yīng)及不包含引物的反應(yīng)，其中相對于其他的提高的反應(yīng)速率指示目標(biāo)特異性位點或區(qū)域的存在。

本發(fā)明中使用的靶模板可為包含合適的引物結(jié)合區(qū)的任何多核酸，所述引物結(jié)合區(qū)允許擴增目標(biāo)多核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，正向和反向引物結(jié)合位點需要以一定方式定位在靶模板上以使得正向引物結(jié)合區(qū)和反向引物結(jié)合區(qū)定位在分別將要在有義和反義鏈上擴增的序列的5'處。

靶模板可以是單鏈或雙鏈的。當(dāng)靶模板是單鏈多核酸時，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解靶模板最初將僅包含一個引物結(jié)合區(qū)。然而，第一引物的結(jié)合將造成互補鏈的合成，該互補鏈則含有第二引物結(jié)合區(qū)。

靶模板可來源于RNA分子，在此情況下，RNA需要在實踐本發(fā)明方法之前轉(zhuǎn)錄成DNA。用于轉(zhuǎn)錄RNA的合適試劑在本領(lǐng)域中是公知的并且包括但不限于逆轉(zhuǎn)錄酶。

如本文所述的方法可用任何NAAT實踐。舉例來說，DNA或RNA擴增的已知方法包括但不限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)及相關(guān)擴增工藝(參見，例如授予Mullis等人的美國專利號4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等人的4,795,699和4,921,794；授予Innis的5,142,033；授予Wilson等人的5,122,464；授予Innis的5,091,310；授予Gyllensten等人的5,066,584；授予Gelfand等人的4,889,818；授予Silver等人的4,994,370；授予Biswas的4,766,067；授予Ringold的4,656,134)及RNA介導(dǎo)的擴增，其將反義RNA用于靶序列作為雙鏈DNA合成的模板(授予Malek等人的美國專利號5,130,238，商品名稱NASBA)，這些參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中(參見，例如Ausubel,同上；或Sambrook,同上。)。

舉例來說，聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)可用于擴增本發(fā)明的多核苷酸序列及直接來自基因組DNA或cDNA文庫的相關(guān)基因。PCR及其他體外擴增方法也可適用于例如克隆編碼待表達(dá)的蛋白質(zhì)的核酸序列，以使得核酸用作檢測所需mRNA在樣品中的存在的探針，用于核酸測序，或用于其他目的。足以指導(dǎo)本領(lǐng)域技術(shù)人員進(jìn)行體外擴增方法的技術(shù)的實例見于以下文獻(xiàn)中：Berger,同上,Sambrook,同上,及Ausubel,同上,以及Mullis等人,美國專利號4,683,202(1987)；及Innis等人,PCR Protocols A Guide to Methods and Applications,編著,Academic Press Inc.,San Diego,Calif.(1990)?？缮藤彨@得的用于基因組PCR擴增的試劑盒在本領(lǐng)域中是已知的。參見，例如Advantage-GC Genomic PCR Kit(Clontech)。另外，例如，T4基因32蛋白(Boehringer Mannheim)可用于改善長PCR產(chǎn)物的產(chǎn)率。

在某些方面中，本文所述的方法中利用的NAAT是等溫核酸擴增技術(shù)。一些等溫擴增技術(shù)取決于作為擴增工藝的一部分的轉(zhuǎn)錄，例如基于核酸序列的擴增(NASBA；美國專利號5,409,818)和轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)的擴增(TMA；美國專利號5,399,491)，而其他取決于解旋酶或重組酶的作用，分別例如解旋酶依賴性擴增(HDA；WO2004027025)和重組酶聚合酶擴增(RPA；WO03072805)，而另一些則取決于某些DNA聚合酶的鏈置換活性，例如鏈置換擴增(SDA；美國專利號5,455,166)、環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP；WO0028082、WO0134790、WO0224902)、嵌合體置換反應(yīng)(RDC；WO9794126)、滾環(huán)擴增(RCA；Lizardi,P.M.等人Nature Genetics,(1998)19.225-231)、核酸的等溫嵌合擴增(ICAN；WO0216639)、SMart擴增工藝(SMAP；WO2005063977)、線性等溫多聚化擴增(LIMA；Isothermal amplification and multimerization of DNA by Bst DNA polymerase,Hafner G.J.,Yang I.C.,Wolter L.C.,Stafford M.R.,Giffard P.M,BioTechniques,2001,第30卷,第4期,第852-867頁)、以及如美國專利號6,743,605(在本文中被稱為‘模板再引發(fā)擴增’或TRA)和WO9601327(在本文中被稱為‘自延伸擴增’或SEA)中所述的方法。

這些NAAT的特征是在于，它們經(jīng)由引物或引物組的作用提供多核酸的拷貝并且通過反向引物或引物組提供所述拷貝的再拷貝。這使得能夠在指數(shù)速率下生成原始多核酸的拷貝。一般說來，參考NAAT，有助于將通過方法檢測的核酸的物理碎片與以下物質(zhì)區(qū)分開：由此原始核酸制成的第一拷貝、由此原始核酸制成的拷貝的第一拷貝、一份拷貝的此拷貝的其他拷貝。為了清楚起見，來源于本身被分析的樣品的核酸被稱為“靶核酸模板”。參考本文所述的兩階段方法，第一階段引物依賴性擴增反應(yīng)與第二階段反應(yīng)相比相對緩慢。

如熟練技術(shù)人員應(yīng)理解，生成引物的擴增子導(dǎo)致擴增子通過靶核酸模板的重復(fù)擴增反應(yīng)以及擴增子本身的引發(fā)的進(jìn)一步生成。擴增子有可能包含與靶模板的組合。

擴增子可具有非?？勺兊拈L度，因為靶模板可從超出由特定的NAAT中采用的引物所限定的核酸區(qū)域的第一引發(fā)位點進(jìn)行拷貝。一般說來，NAAT的關(guān)鍵特征將是提供一種方法，由此擴增子可對于由方法所用的另一引物變得可用，以便生成(經(jīng)由重復(fù)擴增反應(yīng))將具有由所用引物限定的離散長度的擴增子。NAAT的關(guān)鍵特征又是提供一種方法，由此擴增子變得可由反向引物進(jìn)一步引發(fā)以生成其他拷貝。對于一些NAAT，后代擴增子可基本上不同于第一代擴增子，具體說來，所形成的擴增子可以是第一代擴增子的多聯(lián)體。

產(chǎn)生以直接來自線性靶模板的多聯(lián)體形式的擴增子的方法包括LAMP(包括LAMP-STEM)、TRA、SEA及SMAP(后者是LAMP與SEA的混合型)。在每個情況下，多聯(lián)體由涉及第一代擴增子的過程產(chǎn)生。因此，優(yōu)選的是多核酸的合成使用選自由以下組成的組的NAAT進(jìn)行：LAMP、TRA、SEA及SMAP。因此，在每個情況下，本發(fā)明與NAAT有關(guān)，NAAT提供一種或多種具有產(chǎn)生直接來自線性靶模板的多聯(lián)體的能力的引物。

如所述的方法優(yōu)選地用造成模板多聯(lián)體的形成的NAAT進(jìn)行。如本文所用的術(shù)語“多聯(lián)體”是指具有基本上類似的核苷酸序列的多核酸，這些核苷酸序列在單股鏈中交替地連接。這些排列序列可以是彼此簡單的重復(fù)、反向重復(fù)或其組合。此外，所述過程被視為是由下一代擴增子進(jìn)行重復(fù)，以使得可形成更長更長的多聯(lián)體。

適用于生成多聯(lián)體的NAAT在本領(lǐng)域中是公知的并且一般包括“等溫”擴增技術(shù)。這意味著多核酸的擴增不需要孵育溫度的變化，相反于已知的熱循環(huán)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)。例如，等溫擴增方法包括例如SDA、LAMP、LAMP-STEM，如上所述，可與本文所述的方法聯(lián)合使用。

因此，LAMP、TRA、SMAP及SEA的共同特征在于第一代擴增子依賴性引發(fā)，即當(dāng)?shù)谝淮鷶U增子用作引物本身時，不管是通過分子內(nèi)事件抑或分子間事件，產(chǎn)生下一代擴增子，其在尺寸上大于第一代擴增子并且其在本質(zhì)上是多聯(lián)的。實際上，這是這些NAAT的特征：更長更長的擴增子從較短的擴增子生成以便用于莖引物的結(jié)合位點數(shù)目在擴增過程期間以指數(shù)方式增加且因此莖引物加速擴增的能力。對于在這些NAAT中生成多聯(lián)體的引物的作用機制的認(rèn)識有助于理解莖引物是如何發(fā)揮其作用的。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員了解造成多聯(lián)體生成的機制將能夠容易地鑒定可用于本發(fā)明方法中的其他合適的NAAT。

在本文所述的某些實施方案中，第一階段擴增反應(yīng)是等溫核酸擴增反應(yīng)。在某些實施方案中，第二階段擴增反應(yīng)是等溫核酸擴增反應(yīng)。在另外的實施方案中，第一階段擴增反應(yīng)和第二階段擴增反應(yīng)都是等溫核酸擴增反應(yīng)。在某些實施方案中，第一階段和/或第二階段擴增反應(yīng)是基于LAMP的等溫擴增反應(yīng)。在一個優(yōu)選實施方案中，第一階段擴增是基于LAMP的等溫擴增反應(yīng)且第二階段是基于LAMP-STEM的等溫擴增反應(yīng)，其中位點特異性引物加速擴增速率(相對于第一擴增反應(yīng))，并且允許相對于3'錯配引物，擴增產(chǎn)物的更早檢測。

在某些實施方案中，除正向和反向引物結(jié)合區(qū)之外，靶模板還需要包含莖區(qū)域，所述莖區(qū)域需要具有足夠長度以允許一種或多種莖引物(例如，位點特異性Stem引物或錯配Stem引物)的結(jié)合，如本文所述。因此，優(yōu)選的是莖區(qū)域具有以下長度：至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少15個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少50個核苷酸、至少100個核苷酸、至少200個核苷酸、至少300個核苷酸或至少500個核苷酸。

WO0028082描述了環(huán)形成引物(LFP)的用途，其中LFP應(yīng)理解為包含第一和第二區(qū)段，其中第一區(qū)段與模板上的引物結(jié)合區(qū)基本上互補且第二區(qū)段包含與由第一引物的第一區(qū)段生成的擴增子中的區(qū)域基本上互補的序列，以便第二區(qū)段能夠形成環(huán)，并且提及NAAT除LFP之外還使用兩種“外部引物”。這些引物的特征在于“第一外部引物”將3'結(jié)合至模板中的“F2”位點(即第一外部引物結(jié)合“F3”位點，圖1)且“第二外部引物”將3'結(jié)合至第二LFP的結(jié)合區(qū)，“R2c”位點(即第二外部引物結(jié)合“R3c”位點，圖1)。因此，這些引物不在擴增子的莖區(qū)域中結(jié)合，其位于LFP的引物結(jié)合位點的5'處。

LAMP中所用的引物在擴增子中生成單鏈環(huán)并且在本文中被稱為“環(huán)形成引物”。如本文所用的環(huán)形成引物是指包含第一和第二區(qū)段的引物，其中第一區(qū)段與模板上的引物結(jié)合區(qū)基本上互補且第二區(qū)段包含與由第一引物的第一區(qū)段生成的擴增子中的區(qū)域基本上互補的序列以便第二區(qū)段能夠形成環(huán)。環(huán)形成引物的一般結(jié)構(gòu)示于圖1中。由通過環(huán)形成引物引發(fā)靶模板產(chǎn)生的第一(及下一)代擴增子含有單鏈多核苷酸的環(huán)，其側(cè)接有由反向重復(fù)序列的沃森-克里克堿基配對形成的雙鏈多核苷酸。多核苷酸的單鏈環(huán)應(yīng)理解為用于被議論中的NAAT所采用的另一引物結(jié)合，但并非特異性地由莖引物結(jié)合。

本發(fā)明的引物寡核苷酸可通過本領(lǐng)域中已知的任何方法制備，所述方法包括通過直接化學(xué)合成(參見，例如Ausubel等人，同上)。化學(xué)合成一般產(chǎn)生單鏈寡核苷酸，其可通過與互補序列雜交或通過使用單鏈作為模板用DNA聚合酶聚合而轉(zhuǎn)化為雙鏈DNA。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到雖然DNA的化學(xué)合成可被限于約100個或更多個堿基的序列，但是可通過較短序列的連接獲得更長的序列。

核酸延伸通過DNA聚合酶，例如熱穩(wěn)定的鏈置換(SD)DNA聚合酶來促進(jìn)。因為熱穩(wěn)定性SD聚合酶，所以不需要熱循環(huán)?？杉{入置換或緩沖引物(F3和B3)以促進(jìn)FIP和BIP引物的置換，并且允許互補DNA鏈的更有效的延伸。

正向和反向引物結(jié)合區(qū)之間的區(qū)域代表了確保形成擴增子的一部分但本身不會常規(guī)地提供任何引物結(jié)合位點的區(qū)域。此區(qū)域在本文中被稱為擴增子的“莖區(qū)域”。結(jié)合至莖區(qū)域的引物在本文中被稱為“莖引物”。莖引物可被定義為結(jié)合至莖區(qū)域的引物(圖2)。它們可進(jìn)一步被定義為結(jié)合正向鏈上的正向引物結(jié)合區(qū)的3'處的區(qū)域與反向鏈上的反向引物結(jié)合位點的3'處的區(qū)域的引物。應(yīng)當(dāng)理解，引物結(jié)合位點與莖引物的結(jié)合位點不會顯著重疊。優(yōu)選的是，引物結(jié)合位點與莖引物的結(jié)合位點完全不重疊。

在重疊引物結(jié)合區(qū)的上下文中的“顯著地”意味著引物結(jié)合位點重疊小于10個核苷酸、小于9個核苷酸、小于8個核苷酸、小于7個核苷酸、小于6個核苷酸、小于5個核苷酸、小于4個核苷酸、小于3個核苷酸、小于2個核苷酸或小于1個核苷酸。優(yōu)選的是，它們完全不重疊。Stem引物可又被定義為結(jié)合正向鏈上的正向引物結(jié)合區(qū)的3'處的區(qū)域和反向鏈上的反向引物結(jié)合位點的3'處的區(qū)域的引物，但其中引物結(jié)合區(qū)基本上不與任何分子內(nèi)二級結(jié)構(gòu)重疊，所述分子內(nèi)二級結(jié)構(gòu)作為由特定的NAAT(尤其是LFP)所采用的引物的直接結(jié)果生成。

Stem引物的使用顯著地提高擴增速率。這具有以下明顯優(yōu)勢：診斷測試?yán)缈稍谳^短時間內(nèi)提供測試結(jié)果，這是診斷測試用戶之間的共同價值。更快擴增的另一益處在于，這可以降低假陽性結(jié)果的可能性且因此提高測試的特異性。已觀察到采用鏈置換聚合酶的NAAT變得越來越傾向于非特異性擴增，因為擴增所需的時間長度增加了。因而，更快的擴增也可產(chǎn)生更精確的結(jié)果。因此，莖引物的使用提高了NAAT如環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)的擴增速率，并且在對于給定靶模板的引物選擇中提供更大的靈活性。

因此，在另一實施方案中，所述方法包括基于LAMP和LAMP-STEM中使用的等溫方法的擴增技術(shù)的性能。環(huán)介導(dǎo)的等溫擴增(LAMP)的一般方法示于圖1中。簡單說來，正向和反向環(huán)形成引物(被稱為FIB和BIP引物)分別在靶(單鏈)核酸模板上包含例如F1c和F2、B1c和B2引發(fā)位點(圖1a-b)。靶核酸可來自基因組DNA、cDNA、RNA。有時必需將雙鏈核酸模板變性(經(jīng)由加熱、離子強度或溶劑條件)以允許引物結(jié)合至模板。

在如本文所述的某些方法中，進(jìn)行第一階段擴增(即“預(yù)擴增”)反應(yīng)，例如LAMP反應(yīng)。包括例如環(huán)形成引物和一種或多種置換引物的LAMP反應(yīng)在相對緩慢速率下進(jìn)行。LAMP反應(yīng)導(dǎo)致被稱為“啞鈴”的單鏈擴增子的形成，所述單鏈擴增子包含莖或中間區(qū)域，側(cè)接有由環(huán)形成引物生成的3'端和5'端上的環(huán)(圖1c)。其他擴增周期導(dǎo)致“啞鈴”擴增子的多聯(lián)體的產(chǎn)生，所述多聯(lián)體具有交替互補性以便環(huán)形成引物以及啞鈴結(jié)構(gòu)驅(qū)動另幾輪的延伸。

在如本文所述的示例性擴增方法中，使用NAAT(例如LAMP方法)進(jìn)行第一階段等溫擴增反應(yīng)(即“預(yù)擴增步驟”)(即圖1a-c)，其包括正向和反向引物、FIP和BIP引物(分別包含F(xiàn)1c和F2、B1c和B2引發(fā)位點)、及置換引物(F3和B3)以擴增包含一個或多個SNP序列的靶核酸上的區(qū)域。包括例如LAMP生成的擴增子、緩沖和擴增試劑(例如dNTP)及環(huán)形成引物的反應(yīng)混合物可直接用于如本文所述的示例性擴增方法的第二階段中。

在本文所述的任何實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括在第一階段和/或第二階段擴增反應(yīng)中加入至少一種置換或緩沖引物。

根據(jù)本發(fā)明合成或擴增核酸的方法受到催化用于互補鏈合成的鏈置換型反應(yīng)的DNA聚合酶的支持。反應(yīng)期間，還含有不一定需要鏈置換型聚合酶的反應(yīng)步驟。然而，關(guān)于組成試劑的簡化且從經(jīng)濟的角度來看，有利的是使用一種類型的DNA聚合酶。以下酶已知作為此類DNA聚合酶。此外，本發(fā)明中可利用這些酶的各種突變，只要它們兼?zhèn)溆糜诨パa鏈合成的序列依賴性活性和鏈置換活性。本文中提及的突變包括僅具有產(chǎn)生酶所需的催化活性的結(jié)構(gòu)的那些或通過例如氨基酸中的突變對催化活性、穩(wěn)定性或熱穩(wěn)定性有修改的那些。用于所述方法中的示例性聚合酶包括Bst DNA聚合酶、Bca(外-)DNA聚合酶、DNA聚合酶I Klenow片段、Vent DNA聚合酶、Vent(外-)DNA聚合酶(缺乏核酸外切酶活性的Vent DNA聚合酶)、Deep Vent DNA聚合酶、Deep Vent(外-)DNA聚合酶(缺乏核酸外切酶活性的Deep Vent DNA聚合酶)、.PHI.29噬菌體DNA聚合酶、MS-2噬菌體DNA聚合酶、Z-Taq DNA聚合酶(Takara Shuzo Co.,Ltd.)、KOD DNA聚合酶(Toyobo Co.,Ltd.)。

在這些酶之中，Bst DNA聚合酶和Bca(外)DNA聚合酶是尤其需要的酶，因為它們具有一定程度的熱穩(wěn)定性和高催化活性。在一個優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明的反應(yīng)可等溫地進(jìn)行，但因為解鏈溫度(Tm)等的調(diào)整，并不總是可能利用酶穩(wěn)定性所需的溫度條件。因此，所需條件之一是：酶是熱穩(wěn)定的。雖然等溫反應(yīng)是可行的，但可進(jìn)行熱變性以提供核酸作為第一模板，且在此方面中，熱穩(wěn)定酶的利用還使得測定方案的選擇變寬。

Vent(外-)DNA聚合酶是兼具鏈置換活性和高度熱穩(wěn)定性的酶。眾所周知，涉及通過DNA聚合酶的鏈置換的互補鏈合成反應(yīng)通過添加單鏈結(jié)合蛋白來促進(jìn)(Paul M.Lizardi等人,Nature Genetics,19,225-232,1998年7月)。將此舉應(yīng)用于本發(fā)明，并且通過添加單鏈結(jié)合蛋白，可為預(yù)期促進(jìn)互補鏈合成的效果。例如，T4基因32有效作為用于Vent(外-)DNA聚合酶的單鏈結(jié)合蛋白。

圖2示出了第二階段擴增反應(yīng)的示例性實施方案，如本文所述的LAMP-STEM技術(shù)。在此實例中，第二階段擴增反應(yīng)進(jìn)一步包含至少一個位點特異性引物(即位點特異性Stem引物)，其與來自階段一的擴增子中的位點特異性Stem引物結(jié)合區(qū)或序列退火或互補。在一個優(yōu)選實施方案中，位點特異性Stem引物在其3'端具有與來自階段一的擴增子中的目標(biāo)核苷酸(例如SNP)互補的核苷酸。

在某些實施方案中，所述方法包括監(jiān)測和比較第二階段反應(yīng)中的擴增速率。如果來自階段一的擴增子中的位點特異性Stem引物結(jié)合區(qū)含有與位點特異性Stem引物的3'端互補的核苷酸，那么模板將在相對于錯配引物(即，結(jié)合至與位點特異性Stem引物相同的位置但在其3'端具有不與擴增子互補的核苷酸的引物)的提高速率下被擴增。因為SNP-Stem引物與錯配引物之間的差異擴增速率，所以有可能并行運行兩個反應(yīng)并比較速率。擴增產(chǎn)物在位點特異性Stem引物中相對于錯配引物的更快速出現(xiàn)指示目標(biāo)等位基因的存在。

環(huán)形成引物生成擴增子的穩(wěn)定單鏈區(qū)域的能力對快速增殖其他擴增子來說是重要的并且代表了采用這些引物的技術(shù)的關(guān)鍵方面。這意味著多聯(lián)擴增子可含有用于被討論中的NAAT所采用的引物的許多新引發(fā)位點。在例如LAMP中，在擴增子中生成反向重復(fù)的環(huán)形成引物還提供擴增子的單鏈區(qū)域，它們本身可結(jié)合至并因此引發(fā)擴增子的進(jìn)一步再拷貝且由此進(jìn)一步增強擴增。在LAMP中，除了LFP以外還可使用另外的引物，這些引物同樣結(jié)合至擴增子的這些單鏈區(qū)域以有助于進(jìn)一步增強擴增(被稱為環(huán)引物)。本發(fā)明的一方面在于，莖引物不結(jié)合至由環(huán)形成引物和/或環(huán)引物所生成的所述穩(wěn)定單鏈環(huán)，但經(jīng)由獨特的機制促進(jìn)擴增。

如本文所述的技術(shù)的LAMP-STEM組分可進(jìn)一步包括另外的引物，例如，“環(huán)引物”(圖3)，其與由環(huán)形成引物生成的環(huán)內(nèi)的區(qū)域退火。環(huán)引物可進(jìn)一步提高LAMP擴增反應(yīng)的速率。在本文所述的任何實施方案中，所述方法進(jìn)一步包括添加至少一種環(huán)引物，所述環(huán)引物與擴增子的第一環(huán)或第二環(huán)中的區(qū)域互補。

在本文所述的任何實施方案中，第一階段擴增反應(yīng)通過加熱步驟進(jìn)行，其中將靶核酸模板和引物加熱至大約95℃持續(xù)約1分鐘至約30分鐘，包括2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、2,5、26、27、28、29、30，包括其間的所有時間。在某些實施方案中，將靶核酸模板和引物加熱至大約95℃持續(xù)約5分鐘至約10分鐘。

在本文所述的任何實施方案中，擴增反應(yīng)(即第一階段和/或第二階段)在約50℃至約80℃的溫度下進(jìn)行。在某些實施方案中，擴增反應(yīng)在約55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80℃的溫度下進(jìn)行。在某些實施方案中，擴增反應(yīng)在約55℃至約65℃的溫度下進(jìn)行。

在本文所述的任何實施方案中，位點特異性引物是處于正向。在某些實施方案中，位點特異性引物是處于反向。在另外的實施方案中，正向和反向位點特異性引物都包括在反應(yīng)中。

在本文所述的任何實施方案中，位點特異性核苷酸是包含在環(huán)形成引物、置換引物、位點特異性引物、環(huán)引物或其組合中的至少一個的3'端處。

在本文所述的任何實施方案中，引物或核苷酸試劑包含化學(xué)修飾。

根據(jù)上文，用于檢測目標(biāo)位點的示例性兩階段等溫核酸擴增方法包括以下步驟：

A)進(jìn)行第一階段核酸擴增反應(yīng)，其包括：

1)提供包含至少一個第一引物結(jié)合區(qū)的靶核酸模板及第一和第二環(huán)形成引物，其中所述靶核酸模板界定目標(biāo)區(qū)域并且包含目標(biāo)位點；

2)使包含第一和第二區(qū)段的第一環(huán)形成引物與靶模板退火，其中第一區(qū)段與模板上的第一引物結(jié)合區(qū)基本上互補且第二區(qū)段包含與第一引物中的另一區(qū)或由第一環(huán)形成引物的第一區(qū)段生成的擴增子中的區(qū)域基本上互補的序列，以便第二區(qū)段能在合適的條件下在擴增子中形成第一單鏈環(huán)；

3)在合適的條件下用具有鏈置換活性的聚合酶將第一環(huán)形成引物從其3'端開始延伸，以形成單鏈核酸分子，其中第一環(huán)形成引物的第二區(qū)段雜交到由第一環(huán)形成引物的第一區(qū)段生成的擴增子中的區(qū)域以形成具有第一環(huán)形成引物的5'端的第一單鏈環(huán)；

4)使包含第一和第二區(qū)段的第二環(huán)形成引物與來自(3)的擴增子退火，其中第一區(qū)段與來自(3)的擴增子上的第二環(huán)形成引物結(jié)合區(qū)基本上互補，且第二區(qū)段包含與第二環(huán)形成引物中的另一區(qū)或由第二環(huán)形成引物的第一區(qū)段生成的擴增子中的區(qū)域基本上互補的序列，以便第二區(qū)域能夠在擴增子中形成第二單鏈環(huán)；

5)在合適的條件下用具有鏈置換活性的聚合酶將第二環(huán)形成引物從其3'端開始延伸，以形成單鏈核酸分子，其中第二環(huán)形成引物的第二區(qū)段雜交到擴增子中的區(qū)域以形成具有第二環(huán)形成引物的5'端的第二單鏈環(huán)；

6)重復(fù)步驟A2-5，且由此擴增包含目標(biāo)位點的兩個環(huán)形成引物之間的核酸模板區(qū)域，其中形成包含擴增的核酸(初級擴增子)及第一和第二環(huán)形成引物的混合物；和

B)進(jìn)行第二階段擴增反應(yīng)，其包括：

1)提供來自步驟A6的混合物，并且分成多個反應(yīng)，其中將至少一個位點特異性Stem引物納入至少一個所述反應(yīng)中，所述引物與初級擴增子中的位點特異性引物結(jié)合區(qū)(位點特異性目標(biāo)區(qū)域)基本上互補，且其中至少一個其他反應(yīng)不包含二級引物；

2)將Stem引物、及第一和第二環(huán)形成引物與初級擴增子退火，并且在合適的條件下用具有鏈置換活性的聚合酶將它們從其3'端開始延伸；

3)重復(fù)步驟B2，且由此進(jìn)一步擴增初級擴增子；以及

4)實時檢測并比較位點特異性Stem引物的擴增速率和沒有二級引物的反應(yīng)中的擴增速率，其中位點特異性Stem引物相對于其他反應(yīng)的擴增速率的提高指示目標(biāo)位點在擴增核酸中的存在，且其中較慢或類似的速率指示目標(biāo)位點在擴增核酸中的不存在。

在某些實施方案中，第二階段擴增反應(yīng)在相對于第一的提高的速率下進(jìn)行。

在某些實施方案中，多個反應(yīng)包括近似相等體積或量的來自第一階段擴增反應(yīng)的初級擴增子。

在某些實施方案中，步驟(B)(1)進(jìn)一步包括將錯配Stem引物納入至少一個另外的反應(yīng)中。在另外的實施方案中，步驟(B)(4)包括實時檢測和比較位點特異性引物反應(yīng)、錯配引物反應(yīng)及沒有二級引物的反應(yīng)的擴增速率，其中在位點特異性引物反應(yīng)中相對于其他(以及第一階段反應(yīng))的擴增速率的提高指示目標(biāo)位點的存在。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解，在如本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，所述方法可被修改以便包括任何所需?shù)量的單獨或離散的第二階段反應(yīng)，任何數(shù)量的所述第二階段反應(yīng)可分別不包括二級引物、包括位點特異性引物或錯配引物。實際上，所述方法包括以下配置：其中相同或不同的位點特異性引物和/或相同或不同的錯配引物在單獨的反應(yīng)中并行運行，并且全部都是同時且實時檢測和比較。

當(dāng)引物進(jìn)一步含有第二區(qū)段時，所述第二區(qū)段包含與第一引物中的另一區(qū)段或由第一引物的第一區(qū)段生成的擴增子中的區(qū)域基本上互補的序列以使得第二區(qū)域能夠形式環(huán)?！坝傻谝灰?或第二引物)的第一區(qū)段生成的擴增子”是指當(dāng)?shù)谝灰锿ㄟ^聚合酶延伸時生成的模板的第一拷貝。所述擴增子包括在其5'端的第一引物的序列。

在某些實施方案中，第二區(qū)段與引物所結(jié)合至的靶模板上的區(qū)域和/或擴增子基本上同一。這類引物在本文中被稱為環(huán)形成引物。“基本上同一”意指第二區(qū)段具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％與模板上的區(qū)域和/或擴增子的同一性。還設(shè)想僅一部分第二區(qū)域顯示出與靶模板上的區(qū)域的基本上同一性。不管是引物的全部抑或僅一部分第二區(qū)段顯示與靶模板上的區(qū)域的基本上同一性，與靶模板和/或擴增子上的區(qū)域基本上同一的第二區(qū)段的區(qū)域在長度上是至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少60個核苷酸、或甚至至少70個核苷酸。在本發(fā)明的此方面中，一旦引物的第一區(qū)段已延伸形成第一擴增子，第二區(qū)段便能夠結(jié)合至同一鏈內(nèi)的互補區(qū)域且由此形成環(huán)。

本發(fā)明方法可使用相同種類的正向和反向引物，例如環(huán)形成引物(LFP)、發(fā)夾引物等來實踐。當(dāng)提及“相同種類的引物”時，這意味著引物全部都是簡單引物、LFP、LPP或發(fā)夾引物。術(shù)語“不同種類的引物”因此涉及兩種或更多種引物的組合，其中引物中的至少一個與另外一個或多個引物不是相同種類。舉例來說，當(dāng)方法使用四個引物，其中三個是LFP且一個是LPP時，這些引物將被視為是不同種類的。因此，還設(shè)想使用并非相同種類的正向和反向引物。舉例來說，可使用正向引物，其是LFP與反向引物的組合，所述反向引物是LPP或發(fā)夾引物。還可能將LFP或發(fā)夾引物與簡單引物組合，只要引物組合造成多聯(lián)體的形成。當(dāng)用于擴增的NAAT采用多于一個(即兩個或更多個)正向和/或反向引物時，還可能在同一引物結(jié)合位點上組合相同或不同種類的引物。在本發(fā)明的一方面中，兩個或更多個正向和/或反向引物全部是LFP。合適的引物組合將為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。舉例來說，本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，全部是簡單引物的正向和反向引物的組合未必能提供保證多聯(lián)體形成的機制且因此這種組合不適用于本發(fā)明中。

應(yīng)理解，一般說來，正向和反向引物或引物組作用于靶模板的不同鏈。此外，引物(或每組引物之一)將用于劃定所拷貝和再拷貝的原始多核苷酸的區(qū)域。因此，指數(shù)式擴增需要至少兩個引物結(jié)合區(qū)、正向引物結(jié)合區(qū)及反向引物結(jié)合區(qū)之間活性的聯(lián)合(圖1)。正向和反向引物結(jié)合區(qū)各自可包含用于引物的單一結(jié)合位點，由此位點在相反的有義鏈上，即一個引物結(jié)合位點在“正向鏈”上，一個在“反向鏈”上(如圖1所示)。正向和反向引物區(qū)域還可包含用于兩個或更多個引物各自的結(jié)合位點，其中多于兩個引物被特定的NAAT所采用。在此情況下，有可能在正向和/或反向引物結(jié)合區(qū)域中的兩個或更多個引物結(jié)合位點都位于靶模板和/或擴增子的相同鏈上或靶模板和/或擴增子的不同鏈上。

如在本文所述的某些方法中使用的Stem引物可定位在正向和反向引物結(jié)合區(qū)之間的任何位置處，只要一種或多種莖引物的一個或多個結(jié)合位點不明顯地與正向或反向結(jié)合位點重疊。應(yīng)理解的是，在采用LFP的情況下，當(dāng)LFP是正向引物時，正向引物結(jié)合區(qū)不僅包括F2位點(即正向引物結(jié)合區(qū))，而且還包括F1位點(即與LFP的第二區(qū)段基本上同一的正向鏈上的區(qū)域)，并且當(dāng)LFP是反向引物時，反向引物結(jié)合區(qū)不僅包括R2c位點(即反向引物結(jié)合區(qū))，而且還包括R1c位點(即與LFP的第二區(qū)段基本上同一的反向鏈上的區(qū)域；圖1)。以此方式，當(dāng)采用兩個LFP(如在LAMP和TRA中)時，莖引物可定位在R1(c)與F1(c)位點之間的任何位置處；當(dāng)在特定的NAAT中采用單一LFP時，莖引物可結(jié)合在R1(c)或F1(c)位點與由非LFP占據(jù)的另一個引物結(jié)合區(qū)之間。

有可能僅采用一個莖引物，其結(jié)合正向或反向多核苷酸鏈(如圖2所示)?；蛘?，可使用兩種或更多種莖引物，其可結(jié)合至擴增子的鏈或相同的鏈。本發(fā)明方法可用一個、兩個、三個、四個或更多莖引物實踐，所述莖引物可以任何空間組合使用并且可結(jié)合反向或正向鏈，只要莖引物的結(jié)合位點不顯著地與正向或反向引物結(jié)合區(qū)重疊或完全不重疊。莖引物可進(jìn)一步結(jié)合至莖區(qū)域內(nèi)的任何部分。因此，一個或多個莖引物可具有密切靠近正向或反向引物結(jié)合區(qū)的結(jié)合位點?！懊芮锌拷币馕吨o引物的結(jié)合區(qū)與正向/反向引物結(jié)合區(qū)相隔不超過10bp、50bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、800bp、900bp或1000bp。

在某些實施方案中，莖引物在長度上可以是至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少60個核苷酸、至少70個核苷酸、至少80個核苷酸或至少90個核苷酸。莖引物可以是簡單引物。然而，還設(shè)想使用莖引物，其為LFP、發(fā)夾引物、LPP、嵌合引物或其他衍生物。當(dāng)使用多于一種莖引物時，莖引物可以是相同種類的或者可以是不同種類引物的組合。

存在“簡單引物”、LFP、發(fā)夾引物、含有RNA的引物、含有切口酶位點的引物及其他新型引物的許多種可能的組合，這些引物可以新型組合形式使用以生成在相應(yīng)的NAAT方法中概述的方法的衍生物。當(dāng)所述組合產(chǎn)生生成能夠自身復(fù)制以生成更長多聯(lián)體的多聯(lián)擴增子的方法時，莖引物預(yù)期是適用的。

在某些實施方案中，位點特異性Stem引物在其3’端包含與擴增的核酸模板或擴增子中的目標(biāo)核苷酸互補的核苷酸。在又一些實施方案中，錯配Stem引物包含不與擴增的核酸模板或擴增子中的目標(biāo)核苷酸互補的3'端核苷酸。

在某些另外的實施方案中，互補或位點特異性Stem引物可將檢測具體類型和量的靶模板所需的時間與其中不添加一種或多種stem引物或錯配stem引物的對照反應(yīng)相比減少至少1分鐘、至少2分鐘、至少3分鐘、至少5分鐘、至少10分鐘、至少20分鐘、至少30分鐘或至少60分鐘。

Stem引物經(jīng)由與發(fā)生于正向和反向結(jié)合區(qū)的過程的聯(lián)合用于提高采用LFP的方法的擴增速率并且由于已經(jīng)在文獻(xiàn)中教導(dǎo)，LAMP方法具有為所采用的LFP分隔正向和反向結(jié)合位點的核苷酸數(shù)目的上限(Notomi等人Loop-mediated isothermal amplification of DNA,Nucleic Acids Research,(2000)第28卷,第12期,e63)，莖引物的使用明顯可允許正向和反向結(jié)合位點在序列中比先前可行的相隔更遠(yuǎn)(尤其是如果采用若干種莖引物的話)。當(dāng)需要展示序列的兩個區(qū)域一起存在于多核苷酸上，但其中兩個區(qū)域之間的距離太遠(yuǎn)以致不允許每個相應(yīng)區(qū)域有效地用作本文所述的NAAT中的正向和反向結(jié)合區(qū)時，這可具有很大益處。

由于莖引物的使用可允許正向和反向結(jié)合區(qū)比其不存在時相隔遠(yuǎn)得多并且仍允許有效擴增，所以可確定兩個獨特位點在多核苷酸上的存在。因此，本發(fā)明提供一種擴增多核酸的方法，其中正向和反向引物結(jié)合區(qū)間隔一定距離以使得多核酸的合成可僅在一種或多種莖引物的存在下發(fā)生。此距離可用實驗方法通過并行進(jìn)行兩個單獨的NAAT來定義，其中NAAT、所用的試劑和擴增條件是相同的，例外的是一種或多種莖引物被添加到一個反應(yīng)而不是另一個中。當(dāng)多核酸的合成僅在一種或多種莖引物的存在下發(fā)生時，引物結(jié)合位點被認(rèn)為相隔一定距離以使得多核酸的合成僅在一種或多種莖引物的存在下發(fā)生。

莖引物可排外地含有天然存在的核酸。然而，還設(shè)想利用含有修飾的堿基的引物。這類修飾的堿基的實例包括但不限于N4-甲胞嘧啶、肌苷、核苷酸(ribocleotide)、熒光堿基、可光分解的堿基或通用堿基。還設(shè)想使用已用一個部分標(biāo)記的核酸，該部分允許莖引物和/或標(biāo)記的莖引物所結(jié)合至的擴增子被檢測。例如，核酸可被熒光標(biāo)記。莖引物替代地可用捕獲部分(例如生物素)標(biāo)記。

重要的是，莖引物不直接負(fù)責(zé)擴增子的指數(shù)式擴增，其是由結(jié)合至正向和反向引物結(jié)合位點的引物介導(dǎo)，但僅提高擴增的速率。這是因為莖引物被認(rèn)為針對由特定的NAAT采用的其他引物的擴增產(chǎn)物起作用。因此，莖引物藉由提高由正向和反向引物介導(dǎo)的反應(yīng)的擴增速率起作用。這示于圖2中，其中可見莖引物引發(fā)并從靶模板延伸，靶模板的部分拷貝僅含有正向引物結(jié)合區(qū)或反向引物區(qū)，而不是兩個都含。因此，從莖引物生成的初級擴增子不允許交互拷貝且因此不能促進(jìn)靶模板的指數(shù)式擴增。相同的論點適用于莖引物拷貝由被特定的NAAT所采用的其他引物生成的初級擴增子并且類似地針對第一代擴增子。

并且，僅預(yù)期莖引物顯著地提高靶模板的擴增速率，如果下一代擴增子(即，第一代擴增子的進(jìn)一步拷貝(以及這些拷貝的拷貝))在本質(zhì)上是多聯(lián)體的話。莖引物作用于多聯(lián)體的要求是從以下要求得出：對于促進(jìn)指數(shù)式擴增的特定多核酸，其必須含有能夠充當(dāng)正向和反向引物結(jié)合區(qū)的區(qū)域。多聯(lián)體結(jié)構(gòu)經(jīng)由莖引物的拷貝可產(chǎn)生多核苷酸拷貝，其兼?zhèn)湔蚝头聪蛞锝Y(jié)合位點，而拷貝非多聯(lián)體結(jié)構(gòu)則不是。因此，莖引物的使用將對造成多聯(lián)體形成的擴增方法有益處。

如本文所述的方法很適合與等溫核酸擴增方法一起使用，使得其它們對易于進(jìn)行、有效、穩(wěn)定且可再生。所述方法的一個益處在于，它們允許所需靶核酸(例如，遺傳突變、SNP、病原體感染等)在樣品(包括復(fù)雜混合物)中的快速鑒定?？焖贁U增當(dāng)然意味著需要較少時間來鑒定靶標(biāo)遺傳元件的存在或不存在，且因此，本方法提供一種用于現(xiàn)場護理基因檢測和診斷的便利手段。

術(shù)語“基本上互補”意味著第一區(qū)段在通常用于NAAT期間的條件下具有足以結(jié)合至模板和/或擴增子上的引物結(jié)合區(qū)的互補性。此要求引物的第一區(qū)段具有至少70％、80％、90％、95％、99％或100％與模板上的引物結(jié)合區(qū)的互補性。引物的第一區(qū)段在長度上可以是至少5個核苷酸、至少10個核苷酸、至少20個核苷酸、至少30個核苷酸、至少40個核苷酸、至少50個核苷酸、至少60個核苷酸、或甚至至少70個核苷酸。

在本文所述的任何實施方案中，第一或第二階段引物可包含核酸內(nèi)切酶限制位點、或用于切口酶的識別元件。

在本文所述的任何實施方案中，所述擴增反應(yīng)可包括包含第一和第二區(qū)段的發(fā)夾引物，其中所述第一區(qū)段與模板上的引物結(jié)合區(qū)基本上互補且第二區(qū)段包含與引物中的另一區(qū)基本上互補的序列；

在本文所述的任何實施方案中，擴增反應(yīng)可包含環(huán)提供引物，該引物包含發(fā)夾引物，其中反向重復(fù)序列通過接頭區(qū)隔開。

在本文所述的任何實施方案中，擴增反應(yīng)可包含嵌合引物。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，第一階段擴增反應(yīng)可在包括與一個或多個另外的容器或室流體連通的通道的容器或室中進(jìn)行，所述另外的容器或室包含用于進(jìn)行第二階段擴增反應(yīng)的引物(即位點特異性引物、位點特異性Stem引物；錯配引物、錯配Stem引物等)。在又一些實施方案中，第一階段反應(yīng)室包括與一個或多個另外的容器或室單向流體連通的通道，所述另外的容器或室包含用于進(jìn)行第二階段擴增反應(yīng)的引物。舉例來說，如圖4中所示，第一階段反應(yīng)在與用于進(jìn)行第二階段擴增反應(yīng)的多個另外的室流體連通的中央室中進(jìn)行。在一個優(yōu)選實施方案中，將來自第一階段擴增反應(yīng)的反應(yīng)混合物自動并同時引入另外的室中，所述反應(yīng)混合物包含用于進(jìn)行第二階段反應(yīng)的引物。

在一個優(yōu)選實施方案中，近似相等量或體積的第一階段反應(yīng)混合物經(jīng)由例如離心力被從中心室自動地引入到軸向排列的另外的室中。在某些實施方案中，所述方法包括大致同時進(jìn)行多個單獨的或離散的第二階段擴增反應(yīng)。在某些另外的實施方案中，離散反應(yīng)包含相同或不同的位點特異性引物。在又一些實施方案中，離散反應(yīng)包含多個位點特異性引物或位點特異性引物的組合(即“多重反應(yīng)”)。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，每個第二階段反應(yīng)體積可以是約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100μl或更大。在一個優(yōu)選實施方案中，每個相應(yīng)的第二階段反應(yīng)體積是8μl。

在某些實施方案中，本發(fā)明提供一種用于檢測和比較核酸擴增的方法，所述方法包括：提供第一階段反應(yīng)室；在第一階段反應(yīng)室中進(jìn)行如本文所述的第一階段預(yù)擴增反應(yīng)；將一定量或體積的第一階段預(yù)擴增反應(yīng)直接引入到多個第二階段反應(yīng)室中，其中至少一個第二階段反應(yīng)室包含位點特異性引物，且至少一個其他第二階段反應(yīng)室包含錯配引物；以及在每個第二階段反應(yīng)室中進(jìn)行如本文所述的第二階段擴增反應(yīng)；并且實時檢測和比較每個反應(yīng)的擴增速率，其中在位點特異性引物中相對于錯配引物反應(yīng)的更快擴增速率指示目標(biāo)位點的存在。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢?，第一階段擴增反應(yīng)可包含位點特異性引物，以便第一階段預(yù)擴增反應(yīng)對于特定的目標(biāo)位點有選擇性，并且只有當(dāng)那個位點或區(qū)域存在于樣品中時模板的快速擴增才在第二或稍后階段擴增反應(yīng)中進(jìn)行。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢校诙A段(或稍后階段)擴增反應(yīng)可包含多個位點特異性引物(即“多重反應(yīng)”)。通過使用差異性標(biāo)記的位點特異性寡核苷酸，可在同一反應(yīng)內(nèi)檢測和比較(即多重)不同的擴增產(chǎn)物。

雖然若干方面和實施方案涉及兩階段擴增方案，但本發(fā)明不受限于此。實際上，本文所述的方法是建立在以下驚人發(fā)現(xiàn)上：目標(biāo)特異性位點或序列在靶核酸區(qū)域中的存在可通過位點特異性或序列特異性(即互補)引物相對于錯配引物的較慢擴增反應(yīng)速率的提高的擴增速率來檢測，所述錯配引物(而對于錯配堿基)與相同靶區(qū)域退火。因此，可進(jìn)行任何數(shù)目的另外擴增步驟，例如3、4、5、6、7、8、9個等，且因此，可檢測任何數(shù)目的目標(biāo)位點、區(qū)域或序列。類似地，關(guān)于每個待進(jìn)行的相應(yīng)位點特異性引物反應(yīng)，可進(jìn)行平行錯配引物反應(yīng)并且監(jiān)測兩個反應(yīng)的擴增速率。

本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉，除了擴增所需的引物之外，NAAT還將需要進(jìn)一步的試劑以便合成多核酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將顯而易知所需的試劑，但一般包括合適的緩沖劑、dNTP、聚合酶等。

如本領(lǐng)域技術(shù)人員將了解，在添加用于進(jìn)行所討論的NAAT的所有必需組分之后，必須提供合適的條件用于合成多核酸。舉例來說，這可通過提供合適的孵育溫度而實現(xiàn)。擴增優(yōu)選地在等溫條件下發(fā)生。這意味著在擴增期間，溫度保持恒定?！昂愣ā币庵笢囟茸兓怀^+/-10℃。然而，包括擴增過程期間單一溫度變化大于10℃、兩個溫度變化大于10℃、三個溫度變化大于10℃、四個溫度變化大于10℃或五個溫度變化大于10℃的方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

另一方面，本發(fā)明提供一種兩階段等溫核酸擴增和檢測方法，所述方法包括以下步驟：

a.提供包含多聯(lián)體化的擴增子的LAMP擴增的核酸模板，其中所述擴增子是由以下形成：(i)包含位于3'末端處的第一區(qū)域的3'端部分，該第一區(qū)域在合適的條件下與第一互補區(qū)退火以形成第一環(huán)；和(ii)包含位于5'末端處的第二區(qū)域的5'端部分，該第二區(qū)域在合適的條件下與第二互補區(qū)退火以形成第二環(huán)；

b.將來自(a)的一部分核酸模板與以下混合：(i)包含至少一種位點特異性Stem引物的反應(yīng)混合物，所述引物與第一和第二引物結(jié)合區(qū)之間的目標(biāo)位點或區(qū)域基本上互補，其中位點特異性引物在其3'端處包括與模板中的目標(biāo)核苷酸互補的核苷酸，和(ii)不包含二級引物的反應(yīng)混合物；

c.使來自(b)的引物與核酸模板退火；

d.在合適的等溫條件下用具有鏈置換活性的聚合酶從3'端開始延伸引物；以及

e.重復(fù)步驟c-d，且由此快速地擴增核酸模板，并且實時檢測和比較反應(yīng)(b)(i)相對于反應(yīng)(b)(ii)的擴增速率，其中在反應(yīng)(b)(i)中相對于反應(yīng)(b)(ii)的擴增速率的提高指示存在目標(biāo)位點。

在某些實施方案中，每個反應(yīng)混合物包括大致相等體積或量的核酸模板。

在某些實施方案中，步驟(b)進(jìn)一步包含將來自(a)的核酸模板的一部分混合到(iii)包含錯配Stem引物的反應(yīng)混合物中。在另外的實施方案中，步驟(e)包括實時檢測和比較反應(yīng)(b)(i)、(b)(ii)及(b)(iii)的擴增速率，其中在反應(yīng)(b)(i)中相對于反應(yīng)(b)(ii)和(b)(iii)的擴增速率的提高指示存在目標(biāo)位點。

在本文所述的任何方面或?qū)嵤┓桨钢校龇椒ㄟM(jìn)一步包括實時檢測擴增子形成的步驟。在某些實施方案中，擴增反應(yīng)混合物包含熒光標(biāo)記的dNTP、熒光DNA嵌入染料、化學(xué)發(fā)光、電化學(xué)或其他報道系統(tǒng)作為實時追蹤擴增程度的手段。因此，在某些實施方案中，通過測量熒光的增加實時監(jiān)測擴增子的形成?？赏ㄟ^本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法檢測根據(jù)本發(fā)明的多核酸的擴增。合適的方法包括但不限于使用熒光嵌入染料、熒光引物或探針、濁度測量、電化學(xué)探針、生物發(fā)光信號及化學(xué)發(fā)光探針。

多核酸的擴增可使用實時方法來檢測，即當(dāng)多核酸擴增時可對其進(jìn)行檢測的方法。這類檢測系統(tǒng)的實例包括但不限于熒光(例如，在擴增期間添加的熒光探針)、生物發(fā)光信號及電化學(xué)探針。一方面，將引物本身用可檢測的部分，例如熒光標(biāo)記、化學(xué)發(fā)光標(biāo)記或電化學(xué)標(biāo)記進(jìn)行標(biāo)記，所述可檢測的部分允許檢測一種或多種引物所結(jié)合至的擴增子。因此，莖引物在形成NAAT的多聯(lián)體中的進(jìn)一步效用可為用于熒光、化學(xué)發(fā)光或電化學(xué)報道系統(tǒng)中的探針作為實時追蹤擴增程度的手段。其他合適的報道系統(tǒng)將為本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見。Stem引物可具有作為含有例如LFP或發(fā)夾引物的引物的探針的益處，因為不需要它們來生成可能影響某些類型探針的擴增子中的反向重復(fù)序列?；蛘?，擴增產(chǎn)物可使用終點測量來檢測，即，在多核酸擴增已經(jīng)完成之后進(jìn)行的測量。

多核酸的擴增也可通過NAAT檢測中采用的其他檢測方法來檢測。合適的實例包括但不限于基因陣列、側(cè)流條、電泳、質(zhì)譜法和聲波檢測。

在一個實施方案中，實時生物發(fā)光測定(BART)報道系統(tǒng)被用于檢測多核酸的合成。此系統(tǒng)詳細(xì)地描述于WO2004/062338和WO2006/010948中，這些文獻(xiàn)以引用的方式并入本文。BART是為等溫NAAT設(shè)計的報道系統(tǒng)的一個實例，其由樣品得到單一類型的信號：生物發(fā)光信號。BART利用無機焦磷酸的螢火蟲熒光素酶依賴性檢測：此當(dāng)使用NAAT擴增‘靶’序列時大量地產(chǎn)生。因而，分子診斷可用BART僅通過在均相測定中測量從封閉管發(fā)射的光來實現(xiàn)。BART是用若干不同的NAAT證實，在50-63℃之間操作。BART報道系統(tǒng)是追蹤NAAT的擴增速率的尤其有效手段，因為光輸出表示擴增瞬時速率的量度(而例如熒光輸出展示信號的積累且因此測量值必須被差分以獲得擴增速率)。

BART聯(lián)合LAMP用于檢測特定的靶DNA分子的稀釋系列。注意到樣品中的靶DNA的量減少，達(dá)到最大光增加的時間的滯后期(其與達(dá)到最大擴增的滯后期成比例)延長。換言之，達(dá)到與BART中的陽性樣品有關(guān)的特征性光峰值的時間增加，與樣品中的靶多核酸的量成反比。強調(diào)指出當(dāng)實例利用BART報道系統(tǒng)時，本發(fā)明不限于BART的使用且同樣適用于方法，如熒光、濁度、其他分光技術(shù)或電化學(xué)測量方法，不管這些方法是否用于擴增的實時測量或終點測量中。

優(yōu)選地，本發(fā)明的方法在密封容器中進(jìn)行。這具有很大效用，因為其降低或甚至防止樣品變得被污染的可能性。此外，其降低或甚至防止實驗室變得被污染的可能性。這是尤其重要的，因為如果甚至模板多核酸或擴增子的一個拷貝逃逸到實驗室中，這可潛在地污染其他待測試的樣品并且得到假陽性結(jié)果。因此，防止污染的能力特別重要，其中本發(fā)明方法被用于診斷應(yīng)用中。

另一方面，本發(fā)明提供用于確定具體的多核酸序列是否存在于核酸樣品或生物體遺傳密碼中的方法。舉例來說，所述方法可用于確定模板核酸所來源于的核酸是否已被遺傳修飾，用于檢測與特定的非遺傳修飾的植物品種或遺傳修飾的植物有關(guān)的DNA，用于檢測與動物的譜系品種有關(guān)的DNA或用于醫(yī)學(xué)或獸醫(yī)學(xué)診斷應(yīng)用，如遺傳測試或法醫(yī)學(xué)。

在本文所述的任何實施方案中，靶核酸模板可包含基因組DNA、cDNA或RNA或其片段，來自病毒、植物、微生物、真菌、支原體、單細(xì)胞生物體、或多細(xì)胞生物體，例如哺乳動物，如人類。在某些實施方案中，基因組DNA來自于病原性病毒或微生物，例如細(xì)菌或支原體。

因此，另一方面，本發(fā)明提供用于診斷應(yīng)用的方法。具體說來，所述方法允許鑒定和量化患者及其他樣品中的生物體。本發(fā)明的方法還適用于檢測突變、遺傳疾病、或單核苷酸多態(tài)性(SNP)。本發(fā)明的方法還適用于檢測病原性和非病原性微生物或病毒。

所述生物體可以是任何微生物，如病毒、細(xì)菌、支原體及真菌。微生物可以是病原性的，但其也可以是非病原性微生物。微生物也可以是遺傳修飾的生物體(GMO)。此外，本發(fā)明方法可用于鑒定遺傳修飾的作物和動物，用于檢測疾病狀態(tài)；用于預(yù)測療法的不良反應(yīng)；并且還用于預(yù)測疾病狀態(tài)易感性。

例如，在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種檢測目標(biāo)核酸的存在或診斷疾病的兩階段方法。在某些實施方案中，本文所述的方法可用于實時快速鑒定微生物，如病毒、細(xì)菌、支原體、真菌、或遺傳疾病、突變、SNP，其中所述方法包括：由待測試的受試者提供核酸樣品(例如患者樣品)，進(jìn)行如本文所述的兩階段擴增反應(yīng)，以及實時檢測和比較位點特異性引物擴增的擴增速率和錯配引物擴增速率，其中位點特異性引物擴增速率相對于錯配引物擴增速率的提高指示存在目標(biāo)特異性位點、區(qū)域或核苷酸，例如，與遺傳疾病、突變、SNP、病毒或微生物(例如細(xì)菌)中的至少一種有關(guān)的位點、區(qū)域或核苷酸。

在某些實施方案中，所述微生物是細(xì)菌。在某些實施方案中，所述細(xì)菌是選自由以下組成的組的屬的成員：芽孢桿菌屬、巴爾通氏體屬、博代桿菌屬、疏螺旋體屬、布魯氏桿菌、彎曲桿菌屬、衣原體屬、嗜衣體屬、梭狀芽孢桿菌、棒狀桿菌屬、腸球菌屬、埃希氏桿菌屬、弗朗西斯氏菌屬、嗜血桿菌屬、軍團菌屬、鉤端螺旋體屬、李斯特菌屬、分支桿菌屬、支原體、奈瑟氏菌屬、假單胞菌屬、立克次氏體屬、沙門氏菌屬、志賀氏菌屬、葡萄球菌屬、鏈球菌屬、密螺旋體屬、尿素原體、弧菌屬以及耶爾森氏鼠疫桿菌屬(Yershinia)。

在某些實施方案中，所述細(xì)菌是由以下組成的組的成員：炭疽桿菌、蠟樣芽孢桿菌、韓瑟勒巴通氏菌、五日熱巴爾通體、百日咳桿菌、伯氏疏螺旋體、伽氏疏螺旋體、埃氏疏螺旋體、回歸熱螺旋體、流產(chǎn)布魯氏菌、犬布魯氏菌、馬爾他布魯氏菌、豬布魯氏菌、空腸彎曲桿菌、肺炎衣原體、沙眼衣原體、鸚鵡熱嗜衣原體、肉毒桿菌、艱難梭菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、破傷風(fēng)桿菌、白喉棒狀桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、大腸桿菌、土拉弗朗西斯菌、流感嗜血桿菌、幽門螺桿菌、嗜肺軍團菌、腎臟鉤端螺旋體、圣地羅西鉤端螺旋體、韋氏鉤端螺旋體、野口鉤端螺旋體、單核細(xì)胞增多性李氏桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、肺炎支原體、淋病奈瑟氏菌、腦膜炎奈瑟菌、綠膿假單胞菌、立克次氏體、傷寒沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、宋內(nèi)氏痢疾桿菌、金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、無乳鏈球菌、鏈球菌肺炎、釀膿鏈球菌、蒼白密螺旋體、解脲脲原體、霍亂弧菌、鼠疫耶爾森氏菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌以及假結(jié)核病耶爾森氏菌。

在某些實施方案中，靶核酸模板來自于結(jié)核桿菌(MTB或TB)。在某些另外的實施方案中，靶核酸模板來自于rpoB基因，該基因來自MTB。在另外其他實施方案中，靶核酸模板是rpoB13.5F6。

在某些實施方案中，所述病毒是選自由以下組成的組的科的成員：腺病毒科、皰疹病毒科、乳頭瘤病毒科、多瘤病毒科、痘病毒科、肝病毒科、細(xì)小病毒科、星狀病毒科、杯狀病毒科、小核糖核酸病毒科、冠狀病毒科、黃病毒科、披膜病毒科、肝炎病毒科、逆轉(zhuǎn)錄病毒科、正粘病毒科、砂粒病毒科、布尼亞病毒科、絲狀病毒科、副粘病毒科、彈狀病毒科以及呼腸孤病毒科。

在某些實施方案中，所述病毒是選自由以下組成的組的成員：腺病毒、1型單純性皰疹、2型單純性皰疹、水痘-帶狀皰疹病毒、埃-巴二氏病毒、人巨細(xì)胞病毒、8型人皰疹病毒、人乳頭狀瘤病毒、BK病毒、JC病毒、天花、乙型肝炎、人博卡病毒、細(xì)小病毒B19、人星狀病毒、諾瓦克病毒、柯薩奇病毒、甲型肝炎病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒、鼻病毒、重度急性呼吸綜合征病毒、丙型肝炎病毒、黃熱病病毒、登革熱病毒、西尼羅病毒、風(fēng)疹病毒、戊型肝炎病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、流感病毒、瓜納里托病毒、胡寧病毒、拉沙病毒、馬丘波病毒、薩比亞病毒(Sabiávirus)、克里米亞-剛果出血熱病毒、埃博拉病毒、馬伯格氏病毒、麻疹病毒、腮腺炎病毒、副流感病毒、呼吸道合胞病毒、人偏肺病毒、亨得拉病毒、尼帕病毒、狂犬病病毒、丁型肝炎、輪狀病毒、環(huán)狀病毒、科羅拉多壁蝨熱病毒以及版納病毒。

另一方面，提供一種用于根據(jù)本發(fā)明的方法中的試劑盒。優(yōu)選地，所述試劑盒包含為實踐本文所述的方法所必需的所有組分，包括配對的位點特異性與錯配引物。在某些方面中，所述試劑盒包含待測試的靶多核酸、和/或用于制備本文所述的方法中的所納入的生物樣品的試劑。

用于根據(jù)本發(fā)明方法中的試劑盒優(yōu)選地包含多核酸聚合酶、用于核酸聚合酶的底物以及適用于如之前所述的靶多核酸的等溫擴增的引物。更優(yōu)選地，所述試劑盒進(jìn)一步包含緩沖試劑，如鎂離子來源；或在本領(lǐng)域中已知改善NAAT性能的添加劑如甜菜堿或已知改善試劑盒試劑的保質(zhì)期的添加劑如海藻糖或已知幫助保存試劑的添加劑如疊氮化鈉。或者，用于根據(jù)本發(fā)明方法中的試劑盒可僅包含這些組分中的一些和/或另外的組分。已從試劑盒中省略的樣品及任何其他組分隨后可在使用期間添加到試劑盒中。

優(yōu)選地，試劑盒的組分中的至少一種呈凍干形式或適于儲存在試劑盒中的另一種形式。更優(yōu)選地，試劑盒的所有組分都呈凍干形式或一種或多種適于儲存的其他形式。這種其他形式包括其中已添加穩(wěn)定因子的組分和/或含有試劑盒的組分的冷藏或冷凍主體混合物。

另一方面，本發(fā)明提供一種治療或預(yù)防疾病的方法，所述方法包括對患者樣品進(jìn)行如本文所述的兩階段核酸擴增，且其中如果患者對于與疾病或感染有關(guān)的目標(biāo)位點的存在測試呈陽性，那么用有效量的以下適當(dāng)治療劑或生物活性劑治療或施用于患者：例如抗生素、抗癌劑、抗炎藥、抗微生物劑、抗病毒劑、抗真菌劑、抗精神病藥等。術(shù)語“生物活性劑”用于描述具有生物活性以幫助實現(xiàn)預(yù)定的治療、抑制和/或預(yù)防/防治的試劑。如本文所用的術(shù)語“治療(treat/treating/treatment)”是指向患者提供益處的任何作用，包括任何疾病狀態(tài)或病狀的治療。

可使用根據(jù)本發(fā)明的化合物治療的疾病狀態(tài)或病狀包括例如哮喘、自身免疫疾病如多發(fā)性硬化癥、各種癌癥、纖毛病變(ciliopathies)、腭裂、糖尿病、心臟病、高血壓、炎性腸病、智力遲鈍、心境障礙、肥胖、屈光不正、不育癥、Angelman綜合征、卡納萬氏病、腹腔病、進(jìn)行性腓骨肌萎縮(Charcot-Marie-Tooth disease)、囊性纖維化、杜氏肌營養(yǎng)不良、血色病、血友病、格來弗德氏綜合征、神經(jīng)纖維瘤病、苯丙酮酸尿癥、多囊腎病、(PKD1)或4(PKD2)普-威綜合征(Prader-Willi syndrome)、鐮刀形紅細(xì)胞病、泰-薩克斯病(Tay-Sachs disease)、特納氏綜合征(Turner syndrome)。

可由本發(fā)明化合物治療的其他疾病狀態(tài)或病狀包括阿爾茨海默氏病、肌萎縮性側(cè)索硬化(Lou Gehrig病)、神經(jīng)性厭食、焦慮癥、動脈粥樣硬化、注意力缺陷多動障礙、孤獨癥、雙相障礙、慢性疲勞綜合征、慢性阻塞性肺病、克羅恩氏病、冠心病、癡呆、抑郁癥、1型糖尿病、2型糖尿病、癲癇、格林巴利綜合征、腸易激綜合征、狼瘡、代謝綜合征、多發(fā)性硬化癥、心肌梗塞、肥胖癥、強迫癥、恐慌癥、帕金森氏病、牛皮癬、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)病、精神分裂癥、中風(fēng)、閉塞性血栓血管炎、圖雷特綜合征、血管炎。

可由本發(fā)明化合物治療的另外其他疾病狀態(tài)或病狀包括無血漿銅藍(lán)蛋白、II型軟骨成長不全、軟骨發(fā)育不全、塔頭畸形、2型戈謝病、急性間歇性卟啉病、卡納萬氏病、腺瘤性結(jié)腸息肉病、ALA脫水酶缺乏癥、腺苷酸琥珀酸裂解酶缺乏癥、腎上腺性變態(tài)綜合征、腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥、ALA-D卟啉癥、ALA脫水酶缺乏癥、尿黑酸尿、亞歷山大病、黑尿癥、α1-抗胰蛋白酶缺乏癥、α-1蛋白酶抑制因子、肺氣腫、肌萎縮性側(cè)索硬化、阿爾斯特倫綜合征(syndrome)、亞歷山大病、釉質(zhì)生長不全、ALA脫水酶缺乏癥、安德森-法布里病(Anderson-Fabry disease)、雄激素不敏感綜合征、貧血彌漫性體血管角質(zhì)瘤、視網(wǎng)膜血管瘤(希林二氏病)阿佩爾氏綜合征(Apert syndrome)、蜘蛛腳樣指(馬凡綜合征)、史蒂克勒氏綜合征(Stickler syndrome)、先天性多發(fā)性關(guān)節(jié)松弛(愛-唐綜合征#arthrochalasia型)共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張、雷特氏綜合征(Rett syndrome)、原發(fā)性肺動脈高壓、山霍夫氏病(Sandhoff disease)、II型神經(jīng)纖維瘤病、貝爾-史蒂文森皮膚回狀頭皮綜合征(Beare-Stevenson cutis gyrata syndrome)、地中海熱、家族性本杰明綜合征、β地中海貧血、雙側(cè)聽神經(jīng)纖維瘤病(II型神經(jīng)纖維瘤病)、凝血因子V萊頓血栓形成傾向、色素失調(diào)癥(色素失禁癥)、布盧姆綜合征、X連鎖鐵粒細(xì)胞性貧血、Bonnevie-Ullrich綜合征(特納氏綜合征)、布爾尼維利病(結(jié)節(jié)性硬化癥)、朊病毒病、Birt–Hogg–Dubé綜合征、脆骨病(成骨不全)、廣泛性拇指-拇趾綜合征(魯賓斯坦-泰比綜合征)、青銅色糖尿病/青銅色肝硬化(血色沉著病)、延髓肌肉萎縮(肯尼迪病)、Burger-Grutz綜合征(脂蛋白脂肪酶缺乏癥)、CGD慢性肉芽腫病、彎肢發(fā)育異常(Campomelic dysplasia)、生物素酶缺乏癥、心肌病(努南綜合征)、貓叫綜合征(Cri du chat)、CAVD(先天性輸精管缺如)、凱勒心面綜合征(CBAVD)、CEP(先天性紅血球缺紫質(zhì)癥)、囊性纖維化、先天性甲狀腺功能低下、軟骨營養(yǎng)障礙綜合征(軟骨發(fā)育不全)、耳鼻-脊柱-骨骺發(fā)育異常(otospondylomegaepiphyseal dysplasia)、累-納氏綜合征(Lesch-Nyhan syndrome)、半乳糖血癥、埃勒斯-當(dāng)洛二氏綜合征(Ehlers-Danlos syndrome)、致死性發(fā)育異常、卡芬-勞瑞二氏綜合征(Coffin-Lowry syndrome)、科克因綜合征(Cockayne syndrome)、(家族性腺瘤性息肉病)、先天性紅血球缺紫質(zhì)癥、先天性心臟病、高鐵血紅蛋白血癥/先天性高鐵血紅蛋白血癥、軟骨發(fā)育不全、X聯(lián)鎖鐵粒細(xì)胞性貧血、結(jié)締組織病、異常面容綜合征、庫利氏貧血(β地中海貧血)、銅貯積病(威爾森氏癥)、銅轉(zhuǎn)運病(門克斯病)、遺傳性糞紫質(zhì)增多癥、多錯構(gòu)瘤綜合征(Cowden syndrome)、顱面構(gòu)音障礙(克魯宗綜合征(Crouzon syndrome))、克雅二氏癥(Creutzfeldt-Jakob disease)(朊病毒病)、科克納氏綜合征、多錯構(gòu)瘤綜合征、庫-巴-思三氏綜合征(Curschmann-Batten-Steinert syndrome)(肌強直性營養(yǎng)不良)、貝爾-史蒂文森皮膚回狀頭皮綜合征、原發(fā)性高草酸尿、脊椎干骺端發(fā)育不良(斯特拉德威克型(Strudwick type))、肌肉萎縮癥、杜鄉(xiāng)和貝克爾型(Duchenne and Becker types)(DBMD)、烏謝爾綜合征(Usher syndrome)、包括德-格羅烏稀綜合征(de Grouchy syndrome)和代-索二氏綜合征(Dejerine-Sottas syndrome)在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病、發(fā)育障礙、遠(yuǎn)端脊肌萎縮癥V型、雄激素不敏感綜合征、彌漫性球樣體硬化(克拉伯病(Krabbe disease))、狄喬治綜合征(Di George's syndrome)、二氫睪酮受體缺陷、雄激素不敏感綜合征、唐氏綜合征、侏儒癥、紅細(xì)胞生成性原卟啉病、紅細(xì)胞5-氨乙酰丙酸合成酶缺乏癥、紅細(xì)胞生成性卟啉病、紅細(xì)胞生成性原卟啉病、紅細(xì)胞生成性尿卟啉病、弗里德棘希氏共濟失調(diào)(Friedreich's ataxia)、家族性陣發(fā)性多漿膜炎、遲發(fā)性皮膚卟啉病、家族性壓力敏感神經(jīng)病、原發(fā)性肺動脈高壓(PPH)、胰腺纖維囊腫病、脆性X綜合征、半乳糖血癥、先天性腦病、巨細(xì)胞性肝炎(新生兒血色素沉著癥)、格-斯二氏綜合征(彈性假黃瘤)、根達(dá)病(先天性紅血球缺紫質(zhì)癥)、血色病、海爾格倫綜合征、鐮狀細(xì)胞性貧血、血友病、肝紅細(xì)胞生成性卟啉病(HEP)、希林二氏病(希林二氏病(von Hippel-Lindau disease))、亨廷頓舞蹈病、早年衰老綜合征(郝-吉二氏綜合征)、雄激素過多癥、軟骨發(fā)育不良、低色性貧血、包括X聯(lián)鎖的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷的免疫系統(tǒng)病癥、Insley-Astley綜合征、杰克遜-外斯綜合征(Jackson-Weiss syndrome)、朱伯特綜合征(Joubert syndrome)、累-納氏綜合征、杰克遜-外斯綜合征、包括高草酸尿在內(nèi)的腎病、格來弗德氏綜合征(Klinefelter's syndrome)、克尼斯克發(fā)育不良(Kniest dysplasia)、腔隙性癡呆、Langer-Saldino軟骨成長不全、共濟失調(diào)毛細(xì)血管擴張、林奇綜合征(Lynch syndrome)、賴氨酸羥化酶缺乏癥、馬查多-約瑟夫病(Machado-Joseph disease)、包括克尼斯克發(fā)育不良在內(nèi)的代謝障礙、馬凡綜合征、運動障礙、莫瓦特-威爾遜綜合征(Mowat-Wilson syndrome)、囊性纖維化、穆魯克綜合征(Muenke syndrome)、多發(fā)性神經(jīng)纖維瘤病、南希-英斯利綜合征(Nance-Insley syndrome)、南希-斯威尼軟骨發(fā)育不良(Nance-Sweeney chondrodysplasia)、尼-皮二氏病、諾亞克綜合征(Pfeiffer綜合征)、奧斯勒-韋伯-朗迪病(Osler-Weber-Rendu disease)、黑斑息肉病(Peutz-Jeghers syndrome)、多囊腎病、多骨性纖維性結(jié)構(gòu)不良(McCune-Albright綜合征)、黑斑息肉病、普-拉-威綜合征、血色沉著病、原發(fā)性高尿酸血綜合征(累-納氏綜合征)、原發(fā)性肺動脈高壓、原發(fā)性老年性退行性癡呆、朊病毒病、郝-吉二氏綜合征(郝-吉二氏綜合征(Hutchinson Gilford Progeria Syndrome))、進(jìn)行性舞蹈病、慢性遺傳性(亨廷頓)(亨廷頓舞蹈病)、進(jìn)行性肌萎縮、脊髓性肌萎縮、丙酸血癥、原卟啉病、近端肌強直性營養(yǎng)不良、肺動脈高壓、PXE(彈性假黃瘤)、Rb(成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤)、神經(jīng)纖維瘤病(I型神經(jīng)纖維瘤病)、復(fù)發(fā)性多漿膜炎、視黃醇病、成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤、雷特氏綜合征、3型RFALS、雷克綜合征(Ricker syndrome)、里-代二氏綜合征(Riley-Day syndrome)、魯-雷綜合征(Roussy-Levy syndrome)、具有發(fā)育遲緩和黑棘皮病的重度軟骨發(fā)育不全(SADDAN)、李-佛美尼綜合征(Li-Fraumeni syndrome)、肉瘤、乳腺、白血病和腎上腺(SBLA)綜合征、結(jié)節(jié)狀硬化(結(jié)節(jié)性硬化)、SDAT、SED先天性(先天性脊椎骨骺發(fā)育不良)、SED斯特拉德威克(脊椎干骺端發(fā)育不良，斯特拉德威克型)、SEDc(先天性脊椎骨骺發(fā)育不良)SEMD、斯特拉德威克型(脊椎干骺端發(fā)育不良，斯特拉德威克型)、腭心面綜合征(Shprintzen syndrome)、皮膚色素沉著癥、史-倫-奧三氏綜合征、南非遺傳性卟啉癥(混合型卟啉病)、嬰兒發(fā)病的上行遺傳性痙攣性麻痹、語言和溝通障礙、鞘脂沉積病、泰-薩克斯病、脊髓小腦性共濟失調(diào)、史蒂克勒氏綜合征、中風(fēng)、雄激素不敏感綜合征、四氫生物蝶呤缺乏癥、β地中海貧血、甲狀腺疾病、臘腸樣神經(jīng)病(遺傳性壓力易感性神經(jīng)病)、特-柯二氏綜合征(Treacher Collins syndrome)、X三體綜合征(triple X syndrome)、21三體(唐氏綜合征)、X三體(Trisomy X)、VHL綜合征(腦視網(wǎng)膜血管瘤病(von Hippel-Lindau disease))、視力損害和失明(阿爾斯特倫綜合征)、成骨不全癥(Vrolik disease)、瓦登伯革氏綜合征(Waardenburg syndrome)、Warburg Sjo Fledelius綜合征、Weissenbacher-Zweymüller綜合征、沃夫-賀許宏氏綜合征(Wolf-Hirschhorn syndrome)、沃爾夫周期性疾病、Weissenbacher-Zweymüller綜合征及著色性干皮病等。

術(shù)語“癌癥”是指導(dǎo)致癌性或惡性贅生物的形成和生長的病理過程，即通過細(xì)胞增殖而生長的異常組織，經(jīng)常生長得比正常更快并且在引發(fā)新生長的刺激停止之后繼續(xù)生長。惡性贅生物展示結(jié)構(gòu)組織和與正常組織的機能協(xié)調(diào)的部分或完成缺乏并且大多數(shù)侵襲周圍組織，轉(zhuǎn)移到若干部位，并且可能在試圖除去之后復(fù)發(fā)并導(dǎo)致患者死亡(除非經(jīng)過適當(dāng)治療)。如本文所用，術(shù)語瘤形成用于描述所有癌性疾病狀態(tài)并且包括或涵蓋與惡性造血、腹水及實體腫瘤有關(guān)的病理過程?？赏ㄟ^本發(fā)明化合物單獨或與至少一種另外的抗癌劑組合治療的示例性癌癥包括鱗狀細(xì)胞癌、基底細(xì)胞癌、腺癌、肝細(xì)胞癌及腎細(xì)胞癌；膀胱癌、腸癌、乳腺癌、子宮頸癌、結(jié)腸癌、食道癌、頭癌、腎癌、肝癌、肺癌、頸癌、卵巢癌、胰腺癌、前列腺癌及胃癌；白血??；良性和惡性淋巴瘤，尤其是伯基特氏淋巴瘤和非何杰金氏淋巴瘤；良性和惡性黑色素瘤；骨髓增生性疾??；肉瘤，包括尤因氏肉瘤、血管肉瘤、卡波濟氏肉瘤、脂肪肉瘤、肌肉瘤、外周神經(jīng)上皮瘤、滑膜肉瘤、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、星形細(xì)胞瘤、寡樹突神經(jīng)膠細(xì)胞瘤、室管膜瘤、惡性膠質(zhì)瘤、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、節(jié)細(xì)胞神經(jīng)瘤、神經(jīng)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)瘤、成神經(jīng)管細(xì)胞瘤、松果體細(xì)胞瘤、腦膜瘤、腦膜肉瘤、纖維神經(jīng)瘤及許旺氏細(xì)胞瘤；腸癌、乳腺癌、前列腺癌、子宮頸癌、子宮癌、肺癌、卵巢癌、睪丸癌、甲狀腺癌、星形細(xì)胞瘤、食道癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、黑色素瘤；癌肉瘤、何杰金氏病、韋爾姆斯氏瘤(Wilms'tumor)以及畸胎癌?？墒褂帽景l(fā)明化合物治療的另外的癌癥包括例如T細(xì)胞系急性淋巴母細(xì)胞性白血病(T-ALL)、T細(xì)胞系成淋巴細(xì)胞性淋巴瘤(T-LL)、外周T細(xì)胞淋巴瘤、成人T細(xì)胞白血病、Pre-B ALL、Pre-B淋巴瘤、大B細(xì)胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、B細(xì)胞ALL、費城染色體陽性ALL及費城染色體陽性CML。

術(shù)語“抗癌劑”用于描述抗癌劑。這些試劑包括例如依維莫司、曲貝替定、白蛋白結(jié)合型紫杉醇、TLK 286、AV-299、DN-101、帕唑帕尼、GSK690693、RTA 744、ON 0910.Na、AZD 6244(ARRY-142886)、AMN-107、TKI-258、GSK461364、AZD 1152、恩扎妥林(enzastaurin)、凡德他尼、ARQ-197、MK-0457、MLN8054、PHA-739358、R-763、AT-9263、FLT-3抑制劑、VEGFR抑制劑、EGFR TK抑制劑、極光激酶抑制劑、PIK-1調(diào)節(jié)劑、Bcl-2抑制劑、HDAC抑制劑、c-MET抑制劑、PARP抑制劑、Cdk抑制劑、EGFR TK抑制劑、IGFR-TK抑制劑、抗HGF抗體、PI3激酶抑制劑、AKT抑制劑、mTORC1/2抑制劑、JAK/STAT抑制劑、檢查點-1或2抑制劑、局灶性粘附激酶抑制劑、Map激酶(mek)抑制劑、VEGF捕獲劑抗體、培美曲塞、埃羅替尼、達(dá)沙替尼、尼洛替尼、達(dá)卡替尼、帕尼單抗、氨柔比星、奧戈伏單抗、Lep-etu、洛拉曲塞、azd2171、巴巴布林(batabulin)、奧法木單抗、扎木單抗(zanolimumab)、edotecarin、倒地拱素、魯比替康、替米利芬、奧利默森、ticilimumab、易普利單抗、棉酚、Bio 111、131-I-TM-601、ALT-110、BIO 140、CC 8490、西侖吉肽、吉馬替康、IL13-PE38QQR、INO 1001、IPdR₁KRX-0402、硫蒽酮、LY317615、neuradiab、vitespan、Rta 744、Sdx 102、他侖帕奈、阿曲生坦、Xr 311、羅咪酯肽、ADS-100380、舒尼替尼、5-氟尿嘧啶、伏立諾他、依托泊苷、吉西他濱、阿霉素、阿霉素脂質(zhì)體、5'-脫氧-5-氟尿苷、長春新堿、替莫唑胺、ZK-304709、seliciclib；PD0325901、AZD-6244、卡培他濱、L-谷氨酸、N-[4-[2-(2-氨基-4,7-二氫-4-氧代-1H-吡咯并[2,3-d]嘧啶-5-基)乙基]苯甲?；鵠-、二鈉鹽、七水化物、喜樹堿、PEG標(biāo)記的依立替康、他莫昔芬、檸檬酸托瑞米芬、阿那曲唑、依西美坦、來曲唑、DES(己烯雌酚)、雌二醇、雌激素、結(jié)合雌激素、貝伐單抗、IMC-1C11、CHIR-258)；3-[5-(甲基磺酰基哌啶甲基)-吲哚基-喹諾酮、瓦他拉尼堿、AG-013736、AVE-0005、醋酸性瑞林、醋酸亮丙瑞林、雙羥萘酸曲普瑞林、醋酸甲羥孕酮、己酸羥孕酮、乙酸甲地孕酮、雷洛昔芬、比卡魯胺、氟他胺、尼魯米特、乙酸甲地孕酮、CP-724714；TAK-165、HKI-272、埃羅替尼、拉帕替尼、卡奈替尼、ABX-EGF抗體、愛必妥、EKB-569、PKI-166、GW-572016、艾那法尼(Ionafarnib)、BMS-214662、替吡法尼；氨磷汀、NVP-LAQ824、辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoyl analide hydroxamic acid)、丙戊酸、曲古抑菌素A、FK-228、SU11248、索拉非尼、KRN951、氨魯米特、arnsacrine、阿那格雷、L-天冬酰胺酶、卡介苗(BCG)疫苗、阿霉素、博來霉素、布舍瑞林、白消安、卡鉑、卡莫司汀、氮芥苯丁酸、順鉑、克拉屈濱、氯膦酸鹽、環(huán)丙孕酮、阿糖胞苷、氮烯唑胺、放線菌素、柔紅霉素、己烯雌酚、表柔比星、氟達(dá)拉濱、氟氫可的松、氟烴甲基睪丸素、氟他胺、格列衛(wèi)、吉西他濱、羥基脲、伊達(dá)比星、異環(huán)磷酰胺、伊馬替尼、亮丙瑞林、左旋四咪唑、洛莫司汀、氮芥、美法侖、6-巰基嘌呤、美司鈉、氨甲蝶呤、絲裂霉素、米托坦、米托蒽醌、尼魯米特、奧曲肽、奧沙利鉑、帕米膦酸二鈉、噴司他丁、普卡霉素、卟菲爾鈉、甲基芐肼、雷替曲塞、利妥昔單抗、鏈脲霉素、替尼泊苷、睪酮、沙利度胺、硫鳥嘌呤、硫替派、維甲酸、長春地辛、13-順式-視黃酸、苯基丙氨酸氮芥、尿嘧啶氮芥、雌氮芥、六甲蜜胺、氟尿苷、5-脫氧尿苷、阿糖胞苷、6-硫基嘌呤、脫氧柯福霉素、鈣三醇、戊柔比星、光神霉素、長春花堿、長春瑞濱、拓?fù)涮婵?、雷佐生、馬立馬司他、COL-3、癌立消、BMS-275291、角鯊胺、內(nèi)皮抑素、SU5416、SU6668、EMD121974、白介素-12、IM862、制管張素、vitaxin、屈洛昔芬、idoxyfene、螺甾內(nèi)酯、非那雄胺、甲腈咪胍、曲妥單抗、地尼白介素(denileukin diftitox)、吉非替尼、硼替佐米(bortezimib)、紫杉醇、無克列莫佛的紫杉醇、多西他賽、epithilone B、BMS-247550、BMS-310705、屈洛昔芬、4-羥基他莫昔芬、哌噴昔芬、ERA-923、阿佐昔芬、氟維司群、阿考比芬、拉索昔芬、艾多昔芬、TSE-424、HMR-3339、ZK186619、拓?fù)涮婵?、PTK787/ZK 222584、VX-745、PD 184352、雷帕霉素、40-O-(2-羥基乙基)-雷帕霉素、替西羅莫司、AP-23573、RAD001、ABT-578、BC-210、LY294002、LY292223、LY292696、LY293684、LY293646、渥曼青霉素、ZM336372、L-779,450、PEG-非格司亭、達(dá)貝泊汀、促紅細(xì)胞生成素、粒細(xì)胞集落刺激因子、唑來膦酸鹽(zolendronate)、強的松、西妥昔單抗、粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子、組氨瑞林、聚乙二醇化干擾素α-2a、干擾素α-2a、聚乙二醇化干擾素α-2b、干擾素α-2b、阿扎胞苷、PEG-L-天冬酰胺酶、來那度胺、吉妥單抗、氫化可的松、白介素-11、右雷佐生、阿來組單抗、全反式維甲酸、酮康唑、白細(xì)胞介素-2、甲地孕酮、免疫球蛋白、氮芥、甲基強的松龍、替伊莫單抗、雄激素、地西他濱、六甲蜜胺、蓓薩羅丁、托西莫單抗、三氧化二砷、可的松、editronate、米托坦、環(huán)孢菌素、柔紅霉素脂質(zhì)體、Edwina-天冬酰胺酶、鍶89、卡索匹坦、奈妥吡坦、NK-1受體拮抗劑、帕洛諾司瓊、阿瑞匹坦、苯海拉明、羥嗪、滅吐靈、氯羥安定、阿普唑侖、氟哌丁苯、達(dá)哌啶醇、屈大麻酚、地塞米松、甲基強的松龍、丙氯拉嗪、格拉司瓊、昂丹司瓊、多拉司瓊、托烷司瓊、乙二醇化非格司亭、促紅細(xì)胞生成素、阿法依泊汀(darbepoetin alfa)、達(dá)依泊汀α及其混合物。

術(shù)語“抗病毒劑”包括例如核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(NRTI)、其他非核苷逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑(即不代表本發(fā)明的那些)、蛋白酶抑制劑、融合抑制劑，其示例性化合物尤其可包括例如3TC(拉米夫定)、AZT(疊氮胸苷)、(-)-FTC、ddI(去羥肌苷)、ddC(扎西他賓)、阿巴卡韋(ABC)、替諾福韋(PMPA)、D-D4FC(Reverset)、D4T(司他夫定)、Racivir、L-FddC、L-FD4C、NVP(奈韋拉平)、DLV(地拉韋啶)、EFV(依法韋侖)、SQVM(甲磺酸沙奎那韋)、RTV(利托那韋)、IDV(茚地那韋)、SQV(沙奎那韋)、NFV(奈非那韋)、APV(安普那韋)、LPV(洛匹那韋)、融合抑制劑如T20、尤其fuseon及其混合物，包括目前在臨床試驗或開發(fā)中的抗HIV化合物。

可使用的其他抗HIV試劑包括例如其他NNRTI(即，除根據(jù)本發(fā)明的NNRTI以外)，可選自由以下組成的組：奈韋拉平(BI-R6-587)、地拉韋啶(U-90152S/T)、依法韋侖(DMP-266)、UC-781(N-[4-氯-3-(3-甲基-2-丁烯氧基)苯基]-2甲基3-呋喃硫代甲酸硫羰胺)、依曲韋林(TMC125)、曲韋定(Ly300046.HCl)、MKC-442(乙米韋林，coactinon)、HI-236、HI-240、HI-280、HI-281、利匹韋林(TMC-278)、MSC-127、HBY 097、DMP266、黃芩苷(TJN-151)ADAM-II(3’,3’-二氯-4’,4”-二甲氧基-5’,5”-雙(甲氧羰基)-6,6-二苯基己烯酸甲酯)、3-溴-5-(1-5-溴-4-甲氧基-3-(甲氧羰基)苯基)庚-1-烯基)-2-甲氧基苯甲酸甲酯(烯基二芳基甲烷類似物，Adam類似物)、(5-氯-3-(苯基亞硫酰基)-2’-吲哚甲酰胺)、AAP-BHAP(U-104489或PNU-104489)、Capravirine(AG-1549，S-1153)、阿替韋啶(U-87201E)、金精三羧酸(SD-095345)、1-[(6-氰基-2-吲哚基)羰基]-4-[3-(異丙基氨基)-2-吡啶基]哌嗪、1-[5-[[N-(甲基)甲基磺?；被鵠-2-吲哚基羰基-4-[3-(異丙基氨基)-2-吡啶基]哌嗪、1-[3-(乙基氨基)-2-[吡啶基]-4-[(5-羥基-2-吲哚基)羰基]哌嗪、1-[(6-甲酰基-2-吲哚基)羰基]-4-[3-(異丙基氨基)-2-吡啶基]哌嗪、1-[[5-(甲基磺酰氧基)-2-吲哚基)羰基]-4-[3-(異丙基氨基)-2-吡啶基]哌嗪、U88204E、雙(2-硝基苯基)砜(NSC 633001)、胡桐內(nèi)酯A(NSC675451)、胡桐內(nèi)酯B、6-芐基-5-甲基-2-(環(huán)己氧基)嘧啶-4-酮(DABO-546)、DPC 961、E-EBU、E-EBU-dm、E-EPSeU、E-EPU、膦甲酸鈉(Foscavir)、HEPT(1-[(2-羥基乙氧基)甲基]-6-(苯硫基)胸腺嘧啶)、HEPT-M(1-[(2-羥基乙氧基)甲基]-6-(3-甲基苯基)硫代)胸腺嘧啶)、HEPT-S(1-[(2-羥基乙氧基)甲基]-6-(苯硫基)-2-硫代胸腺嘧啶)、海棠果素P、L-737,126、米歇爾胺A(NSC650898)、米歇爾胺B(NSC649324)、米歇爾胺F、6-(3,5-二甲基芐基)-1-[(2-羥基乙氧基)甲基]-5-異丙基尿嘧啶、6-(3,5-二甲基芐基)-1-(乙氧基甲基)-5-異丙基尿嘧啶、NPPS、E-BPTU(NSC648400)、奧替普拉(4-甲基-5-(吡嗪基)-3H-1,2-二硫雜環(huán)戊二烯-3-硫酮)、N-{2-(2-氯-6-氟苯乙基]-N’-(2-噻唑基)硫脲(PETT Cl、F衍生物)、N-{2-(2,6-二氟苯乙基]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲{PETT衍生物)、N-{2-(2,6-二氟苯乙基]-N’-[2-(5-甲基吡啶基)]硫脲{PETT吡啶基衍生物)、N-[2-(3-氟代呋喃基)乙基]-N’-[2-(5-氯吡啶基)]硫脲、N-[2-(2-氟-6-乙氧基苯乙基)]-N’-[2-(5-溴吡啶基)]硫脲、N-(2-苯乙基)-N'-(2-噻唑基)硫脲(LY-73497)、L-697,639、L-697,593、L-697,661、3-[2-(4,7-二氟苯并噁唑-2-基)乙基}-5-乙基-6-甲基(吡啶-2(1H)-硫酮(2-吡啶酮衍生物)、3-[[(2-甲氧基-5,6-二甲基-3-吡啶基)甲基]胺]-5-乙基-6-甲基(吡啶-2(1H)-硫酮、R82150、R82913、R87232、R88703、R89439(洛韋胺)、R90385、S-2720、舒拉明鈉、TBZ(噻唑并苯并咪唑，NSC 625487)、噻唑并異吲哚-5-酮、(+)(R)-9b-(3,5-二甲基苯基-2,3-二氫噻唑并[2,3-a]異吲哚-5(9bH)-酮、替韋拉平(R86183)、UC-38及UC-84等等。

抗微生物劑包括例如抗生素。在某些實施方案中，抗微生物劑是抗肺結(jié)核藥物，尤其例如吡嗪酰胺或苯甲酰胺、pretomanid及貝達(dá)喹啉。

實施例

在整個本申請中引用的所有參考文獻(xiàn)、專利、申請中的專利申請和公布的專利的內(nèi)容以引用的方式清楚地并入本文中。以上描述的組合物和方法進(jìn)一步參考以下附圖和隨附描述舉例說明。

圖6示出了由于在Stem引物中的錯配堿基所致的對擴增速率的影響。(a)左圖例示了包含3’端錯配的Stem引物，其代表對目標(biāo)SNP無特異性的引物。3'錯配誘導(dǎo)擴增反應(yīng)中對比匹配的或位點特異性SNP Stem引物(“SNP-Stem引物”)的延遲。擴增速率的提高例示于右圖中，其中虛線表示達(dá)到熒光最大斜率(t_max1)之時的最早時間(t)，且ΔCt1表示SNP-Stem引物與3'端錯配Stem引物之間的至t_max的時間滯后。(b)右圖例示了如本文所述的另一實施方案，其中Stem引物(SNP-Stem引物和3'端錯配引物)在其序列中含有另一個堿基對錯配。第二錯配向擴增的右側(cè)(即，減小速率)移位(ΔCt2)并且延遲至t_max2的時間。

圖7使用Bio-Rad CFX實時PR儀器展示處理后的熒光跡線，其示出了匹配的Stem引物(即，SNP-Stem引物)LAMP反應(yīng)(n＝4)和錯配的Stem引物L(fēng)AMP反應(yīng)(n＝4)。將反應(yīng)保持在65℃下并且每個循環(huán)由每15秒的熒光測量組成。在48孔微板中在冰上組裝反應(yīng)系統(tǒng)。該溶液由以下組成：約200個拷貝的MTB基因組DNA/反應(yīng)、20mM Tries pH 8.8、10mM硫酸銨、50mM KCl、和2.0mM硫酸鎂、0.1％NP-40、1x EVAgreen染料、Bst DNA聚合酶及1.4mM dNTP。

圖8示出了根據(jù)如本文所述的示例性方法所觀察到的提高的擴增速率。(a)提供示出了位點特異性Stem引物反應(yīng)的匹配的Stem引物反應(yīng)(淺跡線)和錯配的Stem引物反應(yīng)(深跡線)的原始跡線。(b)量化周期(Cq；參見Hellemans等人,2007)是從擬合的原始跡線起計算作為最大斜率點。將匹配引物的Cq連同錯配的Stem引物(深色點)和無Stem引物的LAMP(“啞鈴”)反應(yīng)(開環(huán))一起繪圖(淡色點)。第一LAMP反應(yīng)(在第一室中進(jìn)行)的混合物含有約200個拷貝的MTB基因組DNA，在AMP緩沖液(20mM Tris pH 8.8、10mM硫酸銨、50mM KCl、及3.4mM硫酸鎂、0.1％NP-40、1x EVAgreen染料、Bst DNA聚合酶和1.4mM dNTP)的溶液中。將溶液引入65℃下的第一室中，并且孵育5分鐘，之后直接自動地分布，且同時引入許多第二反應(yīng)室中。將rpoB基因的LAMP引物在第一反應(yīng)室中干燥并支持LAMP擴增。

加速的Stem引物在第二反應(yīng)室中干燥并且在MTB rpoB基因的D435耐藥性突變的3'端處完全匹配(代表SNP-Stem引物)或錯配。作為陰性對照，若干第二反應(yīng)室不含Stem引物并且顯示無加速擴增。第二反應(yīng)室中的擴增通過直接測量由EVAgreen染料嵌入到雙鏈擴增的DNA中所引起的熒光增加來檢測。連續(xù)地監(jiān)測熒光反應(yīng)持續(xù)150個周期，每個周期15秒時間。

表1.rpoB STEM-LAMP測試。

示例性實施方案

在一個實施方案中，本發(fā)明提供一種兩階段核酸擴增和實時檢測方法，所述方法包括：a.提供包含靶核酸模板和至少一種引物的組合物，所述引物與所述靶核酸模板在靠近待擴增的目標(biāo)區(qū)域處退火；b.進(jìn)行第一核酸擴增反應(yīng)以擴增所述目標(biāo)區(qū)域，由此形成初級擴增子；c.將(b)分成至少兩個二級反應(yīng)，并且位點特異性二級引物包括在至少一個所述反應(yīng)中，所述位點特異性二級引物與可存在于初級擴增子內(nèi)并界定目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的目標(biāo)位點的位點特異性引物結(jié)合位點互補；d.僅在位點特異性引物結(jié)合位點與位點特異性引物互補時進(jìn)行第二核酸擴增反應(yīng)(第二階段反應(yīng))，由此加速目標(biāo)區(qū)域的擴增；以及e.檢測并比較所述至少兩個二級反應(yīng)的實時擴增速率，其中在具有二級引物的反應(yīng)中提高的相對擴增速率指示存在與二級引物互補的目標(biāo)位點。

在本文所述的任何實施方案中，步驟(a)包括正向和反向環(huán)形成引物。在本文所述的任何實施方案中，步驟(a)包括正向和反向置換引物。

在本文所述的任何實施方案中，第一核酸擴增是等溫核酸擴增反應(yīng)。在本文所述的任何實施方案中，第二核酸擴增是等溫核酸擴增反應(yīng)。

在本文所述的任何實施方案中，第一和/或第二等溫核酸擴增反應(yīng)是LAMP或LAMP-STEM。

在本文所述的任何實施方案中，初級擴增子是多聯(lián)體。

在本文所述的任何實施方案中，位點特異性引物包含與突變、單核苷酸多態(tài)性(SNP)、等位基因或擴增子上的生物標(biāo)記物互補的3’端核苷酸。

在本文所述的任何實施方案中，所述方法包括將(b)分成至少一個另外的二級反應(yīng)，其中所述另外的二級反應(yīng)包括錯配的二級引物。在本文所述的任何實施方案中，所述錯配引物包含3’端核苷酸錯配或與不同于位點特異性引物的等位基因、突變或多態(tài)性互補的3’端核苷酸。

在本文所述的任何實施方案中，步驟(e)包括實時檢測和比較所有二級反應(yīng)的擴增速率，其中與其他兩個反應(yīng)相比提高的相對擴增速率指示存在與二級引物互補的目標(biāo)位點。

在本文所述的任何實施方案中，所述突變、SNP或生物標(biāo)記物對遺傳疾病、微生物或病毒有特異性。

在本文所述的任何實施方案中，進(jìn)行第二核酸擴增反應(yīng)的步驟包括在熒光標(biāo)記或染料存在下的擴增，由此標(biāo)記擴增產(chǎn)物。在本文所述的任何實施方案中，實時檢測和比較擴增速率的步驟包括檢測和比較來自每個反應(yīng)的熒光信號。

在本文所述的任何實施方案中，在第一擴增反應(yīng)之前，將引物和模板加熱至大約95℃的溫度持續(xù)約1分鐘至約15分鐘。在本文所述的任何實施方案中，第一和第二擴增反應(yīng)在約55℃至約65℃的溫度下進(jìn)行。

在本文所述的任何方法中，第一擴增反應(yīng)在第一反應(yīng)室中進(jìn)行，所述第一反應(yīng)室包括與多個第二反應(yīng)室單向流體連通的通道，且其中步驟(c)包括將近似相等體積的(b)經(jīng)由所述通道從第一反應(yīng)室運送到第二反應(yīng)室。

在本文所述的任何實施方案中，如權(quán)利要求1所述的方法，其中擴增反應(yīng)的相對反應(yīng)速率滿足以下條件：第二階段擴增反應(yīng)+位點特異性引物>>第一階段擴增反應(yīng)+錯配引物>/≈第一階段擴增反應(yīng)。

在本文所述的任何實施方案中，如權(quán)利要求1所述的方法，其中第二階段位點特異性或互補引物擴增反應(yīng)的Cq比第二階段錯配引物擴增反應(yīng)快至少25％。

在另一實施方案中，本發(fā)明還提供一種用于診斷或檢測疾病或感染的兩階段等溫核酸擴增方法，所述方法包括：a.提供包含來自患者的核酸樣品和至少一種引物的組合物，所述引物在靠近待擴增的目標(biāo)區(qū)域處與靶核酸模板退火；b.進(jìn)行第一等溫核酸擴增反應(yīng)以擴增所述目標(biāo)區(qū)域，由此形成初級擴增子；c.將(b)分成至少兩個反應(yīng)，并且位點特異性二級引物包括在至少一個所述反應(yīng)中，所述位點特異性二級引物與可存在于初級擴增子上并界定指示疾病或感染的目標(biāo)位點的位點特異性引物結(jié)合區(qū)互補；d.進(jìn)行第二等溫核酸擴增反應(yīng)，由此擴增所述目標(biāo)區(qū)域；e.實時檢測和比較所述二級反應(yīng)的擴增速率，其中相對于其他在位點特異性二級引物反應(yīng)中的提高的擴增速率指示存在所述目標(biāo)位點；以及f.診斷患者患有或不患有對應(yīng)于所述目標(biāo)位點的疾病或感染。

在本文所述的任何實施方案中，靶核酸模板來自于微生物或病毒。在本文所述的任何實施方案中，靶核酸模板來自于結(jié)核桿菌(MTB或TB)。

在本文所述的任何實施方案中，目標(biāo)位點是在rpoB基因中。在本文所述的任何實施方案中，目標(biāo)位點是在rpoB基因中的SNP。

在本文所述的任何實施方案中，所述方法包括通過施用有效量的適用于治療所述疾病或感染的治療劑來治療經(jīng)測試對目標(biāo)位點呈陽性的患者的步驟。在本文所述的任何實施方案中，所述治療劑是抗肺結(jié)核治療劑。

在另一實施方案中，本發(fā)明提供一種兩階段核酸擴增和實時檢測方法，所述方法包括：a.提供包含靶核酸模板和至少一種引物的組合物，所述引物與所述靶核酸模板在靠近待擴增的目標(biāo)區(qū)域處退火；b.進(jìn)行第一核酸擴增反應(yīng)以擴增所述目標(biāo)區(qū)域，由此形成初級擴增子；c.將(b)分成至少三個二級反應(yīng)，并且位點特異性二級引物包括在至少一個所述反應(yīng)中，所述位點特異性二級引物與可存在于初級擴增子內(nèi)并界定目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的目標(biāo)位點的位點特異性引物結(jié)合位點互補，并且在目標(biāo)位點處或附近退火但不與目標(biāo)位點互補的錯配二級引物包括在至少另一個所述反應(yīng)中；d.僅在二級引物結(jié)合位點與位點特異性引物互補時進(jìn)行第二核酸擴增反應(yīng)(第二階段反應(yīng))，由此加速目標(biāo)區(qū)域的擴增；以及e.實時檢測并比較所述二級反應(yīng)的擴增速率，其中在具有位點特異性二級引物的反應(yīng)中提高的相對擴增速率指示存在與位點特異性二級引物互補的目標(biāo)位點。

在本文所述的任何實施方案中，所述方法包括將(b)分成至少一個另外的二級反應(yīng)，其中所述另外的二級反應(yīng)包括錯配的二級引物。在本文所述的任何實施方案中，所述錯配引物包含3’端核苷酸錯配或與不同于位點特異性引物的等位基因、突變或多態(tài)性互補的3’端核苷酸。

在本文所述的任何實施方案中，步驟(e)包括實時檢測和比較所有二級反應(yīng)的擴增速率，其中與其他兩個反應(yīng)相比提高的相對擴增速率指示存在與二級引物互補的目標(biāo)位點。

在本文所述的任何實施方案中，所述方法包括將(b)分成至少一個另外的二級反應(yīng)，所述二級反應(yīng)包括第二位點特異性二級引物，所述第二位點特異性二級引物與可存在于初級擴增子內(nèi)并界定目標(biāo)區(qū)域內(nèi)的第二目標(biāo)位點的第二目標(biāo)位點互補。本領(lǐng)域技術(shù)人員只需使用常規(guī)的實驗便可以認(rèn)識或能夠確定諸多等同于本文所述的本發(fā)明的特定實施方案。這類等同方案旨在被以下權(quán)利要求書所涵蓋。應(yīng)當(dāng)理解，本文所述的詳細(xì)實施例和實施方案僅出于說明性目的作為實例給出，并且決不被視為限制本發(fā)明。其各種修改或變化將是本領(lǐng)域技術(shù)人員所能預(yù)見到的，并包含在本申請的精神和范圍內(nèi)，同時也在所附權(quán)利要求的保護范圍內(nèi)。例如，可以改變成分的相對量以優(yōu)化預(yù)期效果，可添加另外的成分，和/或類似的成分可用來取代所述的一種或多種成分。與本發(fā)明的系統(tǒng)、方法及工藝有關(guān)的另外有利的特征和功能將由所附權(quán)利要求書顯而易見。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員只需使用常規(guī)的實驗便可以認(rèn)識或能夠確定諸多等同于本文所述的本發(fā)明的特定實施方案。這類等同方案旨在被以下權(quán)利要求書所涵蓋。

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