本發(fā)明涉及淡水養(yǎng)殖動物病原檢測技術，具體是涉及一種氣單胞菌的核酸等溫擴增檢測試劑盒及其檢測方法。
背景技術：
氣單胞菌是條件致病菌，廣泛分布在淡水水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境中。迄今已被報道過的淡水養(yǎng)殖動物病原氣單胞菌有很多種。其中，嗜水氣單孢菌(Aeromonas hydrophila)、豚鼠氣單胞菌(A.caviae)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、維氏氣單胞菌(A.veronii)、等多種氣單胞菌被認為是淡水水產(chǎn)動物的重要致病菌,可以引起如甲殼類(Sung等,2001；Soto-Rodrigu等,2010；Alagappan等,2010；Phumkhachom和Rattanachaikunsopon,2010；Ji等,2011；Raissy等,2011),雙殼類(Tubiase等,1970；Beaz-Hidalgo等,2010)，魚類(Toranzo等,2005；Wo等,2008；Pal和Das,2010；Frans等,2011)等有重要商業(yè)價值的動物疾??；其中嗜水氣單胞菌、溫和氣單胞菌等某些種類也是人類的食源性病原(Tracz等,2007)。這些細菌可以導致水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)巨大的經(jīng)濟損失，引起人體嚴重的并發(fā)癥。另外，近幾年我國出口的水產(chǎn)品也曾發(fā)生過多起因病原性氣單胞菌超標引起的退貨、銷毀、取消注冊代號事件，造成了巨大的經(jīng)濟損失。因此致病性氣單胞菌菌的快速檢測技術，對維持淡水養(yǎng)殖業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展、水產(chǎn)品衛(wèi)生質量監(jiān)督和保護公眾健康等方面都具有十分重要的意義。但現(xiàn)行的氣單胞菌檢測方法針對樣品單一，而且操作步驟繁瑣，不易實現(xiàn)現(xiàn)場批量檢測，很難滿足淡水養(yǎng)殖動物病害防治的需要?，F(xiàn)行檢測致病性氣單胞菌主要有三種方法：①生理生化鑒定法，該法操作步驟繁瑣，費時費力；②酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，該法雖檢測快速、靈敏度高、可用于大批量檢測等特點，但對新鮮樣品進行檢測時易出現(xiàn)假陽性問題，在一定程度上限制了在生產(chǎn)實踐中的應用；③聚合酶鏈式反應法(PCR)，該法快速、靈敏，但需要昂貴的核酸擴增儀，同樣限制了在生產(chǎn)實踐中的應用。
近年來發(fā)展起來的環(huán)介導等溫擴增法(LAMP)，是一種新型的恒溫核酸擴增方法，可以有選擇性地高效擴增靶基因序列，產(chǎn)物是一系列反向重復的靶序列構成的莖環(huán)結構和多環(huán)花椰菜樣結構的DNA片段混合物，電泳后在凝膠上顯現(xiàn)出不同大小區(qū)帶組成的階梯式圖譜。LAMP與其它致病性氣單胞菌檢測方法相比優(yōu)點明顯：①雖然反應原理、引物設計比較復雜，但是在恒溫條件下擴增，只需要一個恒溫裝置(如水浴鍋、保溫杯等)就可以進行；②高效靈敏，模板僅需要10個拷貝或更少；③特異性強，應用包含了六個區(qū)段的四條引物按嚴格順序進行擴增；④檢測時間短，擴增可以在60min內(nèi)完成；⑤產(chǎn)物可以通過直接在反應管中加入熒光染料染色，結果形象直觀。通過比對常見氣單胞菌16S RNA發(fā)現(xiàn)有多處高度保守序列，根據(jù)這些高度保守序列設計特異性引物，即可快速檢測氣單胞菌屬細菌的存在。因此將LAMP技術應用于致病性氣單胞菌的通用檢測可實現(xiàn)現(xiàn)場樣本的大批量快速檢測。CN 102140512 B公開了致病性嗜水氣單胞菌的LAMP檢測試劑盒，根據(jù)靶基因序列設計了致病嗜水氣單胞菌檢測用引物組，能特異性識別靶序列上的八個獨立區(qū)域，增強了致病嗜水氣單胞菌檢測的特異性，所以該發(fā)明僅能針對嗜水氣單胞菌這一單個氣單胞菌來進行特異性檢測。
在水產(chǎn)養(yǎng)殖的病害檢測、食品安全檢驗等實踐中，第一時間確定是否有氣單胞菌感染比知道具體由哪種氣單胞菌感染的意義更大。而現(xiàn)有技術中由于對不同氣單胞菌(如嗜水氣單孢菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌等)要進行逐一特異性檢測，費時費力，不能使用一次檢測確定是否有氣單胞菌感染。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是，針對以上現(xiàn)有技術的缺點，提供一種氣單胞菌的核酸等溫擴增檢測試劑盒及其檢測方法，能夠一次檢測確定是否有氣單胞菌。
本發(fā)明的技術方案是：一種氣單胞菌的核酸等溫擴增檢測試劑盒，它包括：
1)研磨液管：內(nèi)裝研磨液，
2)核酸提取液A管：內(nèi)裝乙酸鈉溶液；
3)核酸提取液B管：內(nèi)裝無水乙醇；
4)核酸提取液C管：內(nèi)裝質量濃度70％的乙醇溶液；
5)TE緩沖液管：內(nèi)裝TE緩沖液；
6)UNG酶管：內(nèi)裝尿嘧啶DNA糖基化酶；
7)LAMP反應液管：內(nèi)裝LAMP反應液；
8)Bst DNA聚合酶管：內(nèi)裝Bst DNA聚合酶；
9)顯色劑管：內(nèi)裝核酸染料SYBR Green I；
10)陽性對照核酸管：內(nèi)裝氣單胞菌陽性DNA；
11)陰性對照管：內(nèi)裝滅菌的雙蒸水。
優(yōu)選地，所述研磨液由以下體積百分數(shù)的組分組成：三羥甲基氨基甲烷5～10％、乙二胺四乙酸二鈉0.5～2.0％、十二烷基磺酸鈉5～10％、巰基乙醇0.01～1.0％、8-羥基喹啉0.01～0.02％、平衡酚5～10％、氯仿5～10％，余量為雙蒸水；所述三羥甲基氨基甲烷的濃度為1～2M；所述乙二胺四乙酸二鈉的濃度為0.25～1.0M；所述十二烷基磺酸鈉的質量分數(shù)為5～10％。
優(yōu)選地，所述LAMP反應液由以下濃度的組分組成：LAMP引物Aeromonas-FIP和Aeromonas-BIP各1～4μM，LAMP引物Aeromonas-F3和Aeromonas-B3各0.1～0.5μM，dATP、dGTP和dCTP各0.5～2mM，dTTP、dUTP各0.25～1mM，Tris-HCl 10～40mM，KCl 10～20mM，(NH4)2SO4 5～15mM，MgSO4 1～4mM，Triton X-100 0.05％～1.0％，Betaine 0.8～1.2M，溶劑為雙蒸水。
進一步優(yōu)選地，LAMP引物的核酸序列如下：
Aeromonas-FIP[SEQ ID NO.1]：
GCAATATTCCCCACTGCTGCCTAGGATCAGCCACACTGGAACTG；
Aeromonas-BIP[SEQ ID NO.2]：
CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGTTTGCTACCAACCTTTCCTCCTC；
Aeromonas-F3[SEQ ID NO.3]：
CCCTAGCTGGTCTGAGAGG；
Aeromonas-B3[SEQ ID NO.4]：
TCTTCTGCGAGTAACGTCAC。
優(yōu)選地，氣單胞菌陽性DNA的制備方法如下：用位于LAMP目標片段上下游的PCR引物(Aeromonas-Pf[SEQ ID NO.5]:5'-GAGGAAAGGTTGGTAGCGAA；Aeromonas-Pr[SEQ ID NO.6]:5'-ACCCCCCTCTACAAGACTC)，對嗜水氣單孢菌基因組DNA進行擴增，擴增條件為：92～96℃預變性5～10min，92～96℃變性20～40s，56～60℃退火20～40s，70～74℃延伸50～70s完成一個擴增循環(huán)，重復循環(huán)35～35輪，最后70～75℃延伸8～12min，2～6℃保存，得到474bp的條帶，得到陽性DNA片段(所述陽性DNA片段的序列為SEQ ID NO.7)；回收陽性DNA片段，將其連接到載體pMD-18T-Vector，并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109，經(jīng)PCR驗證后，提取質粒，得到氣單胞菌陽性DNA，稀釋后作為氣單胞菌陽性對照。該嗜水氣單胞菌來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心菌種，菌種編號：1.1027。所述陽性DNA片段的序列為：GAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGCTGTGTCCTTGAGACGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCTTGACATGTCTGGAATCCCTAAGAGATTGGGGAGTGCCTTCGGGAATCAGAACACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCCTGTCCTTTGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGAACTCAAGGGAGACTGCCGGTGATAAACCGGAGGAAGGT。在此試劑盒中，此段序列被連接到JM109質粒上，一同作為氣單胞菌陽性DNA。
在本發(fā)明的試劑盒中，原料以市購的方式獲得，其中乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷、十二烷基磺酸鈉、乙酸鈉、氯仿、平衡酚、巰基乙醇、8-羥基喹啉、Tris-HCl、KCl、(NH4)2SO4、MgSO4、dATP(三磷酸脫氧腺苷)、dGTP(三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸)、dCTP(三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸)、dTTP(三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸)購自上海生物工程有限責任公司，dUTP購自上海閃晶分子生物科技有限公司，尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)、Bst DNA聚合晦等購自美國NEB公司，核酸染料SYBR Green I購自北京鼎國生物科技有限公司，Betaine、Triton X-100購自Sigma公司。
LAMP引物Aeromonas-FIP、Aeromonas-BIP、Aeromonas-F3和Aeromonas-B3以及PCR引物Aeromonas-Pf、Aeromonas-Pr是根據(jù)本發(fā)明的設計，委托上生工生物工程(上海)股份有限公司合成。本發(fā)明的引物可以檢測常見的致病性氣單胞菌，只要檢出氣單胞菌則說明動物或養(yǎng)殖環(huán)境中有氣單胞菌的存在，即可采取相應的措施。因為氣單胞菌病的治療機預防手段是相似的，生產(chǎn)上并不需要第一時間知道具體的氣單胞菌的種類。
一種利用權利要求1～3中任意一種氣單胞菌的核酸等溫擴增檢測試劑盒的致病性氣單胞菌的檢測方法，包括下列步驟：
1)取待測樣品組織于離心管I中，加入研磨液，用研磨棒充分磨碎至漿狀，
2)將上述研磨所得的漿狀樣品煮沸后以8000～12000r/min離心5～10min，取上清液置于離心管II中；
3)向裝有上清液的離心管II內(nèi)加入核酸提取液A管內(nèi)的乙酸鈉溶液混勻，再加入-20℃預冷的核酸提取液B管內(nèi)的無水乙醇混合，靜置5～20min，以10000～14000r/min離心5～10min，棄上清液，保留沉淀物；乙酸鈉溶液與上清液的體積比為1:12～1:8；無水乙醇與沉淀物的體積比為4:1～4:3；
4)用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟3)所得的沉淀物，然后10000～14000r/min離心5～10min，棄上清液，保留沉淀物；
5)用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟4)所得的沉淀物，然后10000～14000r/min離心5～10min，棄上清液，保留沉淀物；
6)將上述步驟5)所得的沉淀物于室溫晾干，加入TE緩沖液溶解沉淀物，得到樣品核酸；
7)分別將上述樣品核酸、陰性對照管內(nèi)的雙蒸水、陽性對照核酸管內(nèi)的陽性對照核酸，加至LAMP反應液中，再加入UNG酶，分別得檢測管、陰性對照管和陽性對照管；對上述檢測管、陰性對照管和陽性對照管均于36～38℃保溫5～20min進行酶解；
8)將上述檢測管、陰性對照管和陽性對照管酶解后的反應體系先于90～100℃保溫5～10min，然后再迅速置于碎冰塊中；
9)向步驟8)所得的檢測管、陰性對照管和陽性對照管的反應體系中再分別加入Bst DNA聚合酶；
10)將上述步驟9)所得的檢測管、陰性對照管和陽性對照管分別進行如下操作：先于63～65℃保溫40～50min，然后于85～95℃保溫2～5min完成LAMP反應；
11)LAMP反應結束后，加入核酸染料SYBR Green I，觀察檢測管內(nèi)LAMP反應產(chǎn)物的顏色。如果檢測管內(nèi)LAMP反應產(chǎn)物的顏色與陰性對照管反應產(chǎn)物的顏色均呈橙色，則待測品致病性氣單胞菌檢測結果為陰性；如果檢測管內(nèi)LAMP反應產(chǎn)物的顏色同陽性對照管反應產(chǎn)物的顏色均呈綠色，則待測品致病性氣單胞菌檢測結果為陽性。
本發(fā)明具有以下有益的技術效果：
1)在試劑盒中匯集了氣單胞菌檢測所需的研磨液、核酸提取液等十種試劑和三種器材，使得氣單胞菌檢測能有序地進行，實現(xiàn)了檢測過程現(xiàn)場化、程序化和標準化，使得操作規(guī)范、不易出錯，能夠有效檢測多種常見的氣單胞菌屬細菌，即一次檢測確定是否有氣單胞菌；
2)用專門設計的研磨液進行樣品的處理，使得樣品的處理過程極其簡單；
3)UNG酶能消除多次檢測過程中的核酸污染，采用尿嘧啶DNA糖基化酶消除LAMP擴增產(chǎn)物的污染，避免了因LAMP產(chǎn)物擴增量大造成的假陽性結果,解決了限制LAMP技術廣泛應用的易被污染干擾的問題；
4)實現(xiàn)了可不開蓋檢測，從源頭上避免了污染的產(chǎn)生，進一步避免了假陽性結果的出現(xiàn)；
5)檢測方法根據(jù)氣單胞菌屬保守的16s RNA基因區(qū)，優(yōu)選了目的基因區(qū)段來設計LAMP特異性引物，使得該引物能有效檢測常見的氣單胞菌屬細菌，并且氣單胞菌檢測完全具有了LAMP技術靈敏、快速、簡便、準確的特點，檢測特異性好，檢測結果非常容易判別；
6)優(yōu)化了整個操作過程的技術參數(shù)，并將其標準化、配套化，形成檢測試劑盒，便于現(xiàn)場大批量應用；
7)使用本發(fā)明的試劑盒及檢測方法在2小時內(nèi)就可完成致病性氣單胞菌的檢測，檢測過程無需昂貴的儀器設備如PCR儀和凝膠成像系統(tǒng)，僅需有水浴鍋或金屬浴和普通離心機即可；
8)與氣單胞菌屬細菌已有的檢測技術相比，本發(fā)明的試劑盒及相應檢測方法不僅實現(xiàn)了氣單胞菌的通用檢測，而且成本低、靈敏度高、操作簡單，可實現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測；
9)具有比以往檢測方法更高的靈敏度和便捷性，可以替代致病性氣單胞菌之前的相關檢測方法如生理生化法、PCR法、酶聯(lián)免疫吸附法等。
【具體實施方式】
以下結合具體實施例，對本發(fā)明做進一步描述。
以下所提供的實施例并非用以限制本發(fā)明所涵蓋的范圍，所描述的步驟也不是用以限制其執(zhí)行順序。本領域技術人員結合現(xiàn)有公知常識對本發(fā)明做顯而易見的改進，亦落入本發(fā)明要求的保護范圍之內(nèi)。
實施例一
一種氣單胞菌核酸等溫擴增檢測試劑盒(5樣份，即可用于5樣次的檢測)，由以下內(nèi)容物組成：
1)研磨液管，1管，3ml；研磨液配制：1M的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl，pH8.0)10份，0.25M的乙二胺四乙酸二鈉溶液(EDTANa2)2份，質量分數(shù)為5％的十二烷基磺酸鈉溶液(SDS)10份，巰基乙醇0.5份，8-羥基喹啉0.01份，平衡酚7份，氯仿8份，用雙蒸水定容到100份而成。以上份數(shù)均為體積份數(shù)；
2)核酸提取液A管，1管，內(nèi)裝400μl 3M乙酸鈉溶液(pH5.2)；
3)核酸提取液B管，l管，內(nèi)裝10ml無水乙醇；
4)核酸提取液C管，1管，內(nèi)裝10ml質量濃度70％的乙醇溶液；
5)TE緩沖液管，1管，內(nèi)裝400μl TE緩沖液(含10mM Tris-HCl和1mM EDTA，pH8.0，其余為雙蒸水)；
6)UNG酶管，1管，內(nèi)裝6U尿嘧啶DNA糖基化酶(UNG酶)；
7)LAMP反應液管，1管，內(nèi)裝150μl LAMP反應液，
LAMP反應液的組成成分如下：LAMP引物Aeromonas-FIP和Aeromonas-BIP各2μM，LAMP引物Aeromonas-F3和Aeromonas-B3各0.3μM，dATP、dGTP和dCTP各1mM,dTTP、dUTP各0.5mM,Tris-HCl 20mM,KCl 15mM,(NH4)2SO4 10mM,MgSO4 2mM,Triton X-100 0.5％,Betaine 1M；溶劑為雙蒸水；
上述LAMP引物根據(jù)氣單胞菌屬保守的16s RNA基因序列設計的，LAMP引物設計的首選軟件是PrimerExplore 4.0(http://primerexplorer.jp/elamp4.0.0/index.html)，也可以使用常用的引物設計軟件(如Primer Primier 5.0或Omiga 2.0)按照LAMP引物的設計要求進行設計。本發(fā)明中利用軟件PrimerExplore 4.0在線設計的—套LAMP引物的DNA序列如下：
Aeromonas-FIP[SEQ ID NO.1]：
GCAATATTCCCCACTGCTGCCTAGGATCAGCCACACTGGAACTG；
Aeromonas-BIP[SEQ ID NO.2]：
CATGCCGCGTGTGTGAAGAAGTTTGCTACCAACCTTTCCTCCTC；
Aeromonas-F3[SEQ ID NO.3]：
CCCTAGCTGGTCTGAGAGG；
Aeromonas-B3[SEQ ID NO.4]：
TCTTCTGCGAGTAACGTCAC。
8)Bst DNA聚合酶管，1管，內(nèi)裝5μl Bst DNA聚合酶；
9)顯色劑管，1管，內(nèi)裝5μl的液體染料，該液體染料由核酸染料SYBR Green I和雙蒸水按照1:100的體積比混合而得；
10)陽性對照核酸管，1管，內(nèi)裝10μl氣單胞菌陽性DNA。氣單胞菌陽性DNA制備方法如下：提取嗜水氣單孢菌基因組DNA，用位于LAMP目標片段上下游的PCR引物(Aeromonas-Pf[SEQ ID NO.5]:5'-GAGGAAAGGTTGGTAGCGAA；Aeromonas-Pr[SEQ ID NO.6]:5'-ACCCCCCTCTACAAGACTC)，對嗜水氣單孢菌基因組DNA進行擴增。反應體系為：25μl體系包括2.5μl 10×PCR反應緩沖液、1.0μl dNTPs(10mM)、1.0μl Aeromonas-Pf和Aeromonas-Pr(20μM)、0.5μl Taq DNA聚合酶(5U/μl，北京鼎國生物科技有限公司)，其余為雙蒸水。擴增條件為：94℃預變性5min，94℃變性30s，58℃退火30s，72℃延伸60s完成一個擴增循環(huán)，重復循環(huán)30輪，最后72℃10min，4℃保存，得到474bp的條帶，回收該片段后，按T載體說明書要求連接到T載體(pMD-18T-Vector，購自大連寶生物公司)上，并按感受態(tài)細胞操作要求將重組質粒轉化至感受態(tài)細胞JM109(購自大連寶生物公司)內(nèi)，用藍白斑方法篩選陽性菌，并用引物VIBRIO-Pf和VIBRIO-Pr進行PCR驗證(程序同上)。最后用堿法提取陽性菌的質粒，得到氣單胞菌陽性DNA，稀釋至100拷貝/μl后作為氣單胞菌陽性對照。上述嗜水氣單胞菌來源于中國普通微生物菌種保藏管理中心菌種，菌種編號：1.1027；
11)陰性對照管，1管，內(nèi)裝10μl滅菌雙蒸水；
12)研磨棒，5支；
13)包裝盒(78×78×50mm)；
14)一塊泡沫板，泡沫板高22mm，有三列，共11個孔，第一列四個孔，孔徑5.5mm，第二列三個孔，孔徑10mm，第三列三個孔，孔徑15.5mm。上述1～11的各小管放置于這些小孔中，該泡沫板與上述包裝盒的底面大小相同，裝于包裝盒內(nèi)；
15)試劑盒使用說明書—份。
實施例二
一種氣單胞菌核酸等溫擴增檢測試劑盒(5樣份)，僅以下內(nèi)容不同于實施例一，其余均同實施例一。
研磨液配制：2M的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl，pH8.0)5份，0.5M的乙二胺四乙酸二鈉溶液(EDTANa2)1份，質量分數(shù)7％的十二烷基磺酸鈉溶液(SDS)7份，巰基乙醇0.01份，8-羥基喹啉0.02份，平衡酚5份，氯仿10份，以雙蒸水定容到100份而成。以上份數(shù)均為體積份數(shù)。
LAMP反應液的組成成分如下：LAMP引物Aeromonas-FIP和Aeromonas-BIP各4μM，LAMP引物Aeromonas-F3和Aeromonas-B3各0.5μM，dATP、dGTP和dCTP各2mM,dTTP和dUTP各1.0mM,Tris-HCl 40mM,KCl 20mM,(NH4)2SO4 15mM,MgSO44mM,Triton X-100 1.0％,Betaine 0.8M；溶劑為雙蒸水。
氣單胞菌陽性DNA制備方法如下：用位于LAMP目標片段上下游的PCR引物(Aeromonas-Pf[SEQ ID NO.5]:5'-GAGGAAAGGTTGGTAGCGAA；Aeromonas-Pr[SEQ ID NO.6]:5'-ACCCCCCTCTACAAGACTC)，對嗜水氣單孢菌基因組DNA進行擴增，擴增條件為：92℃預變性10min，92℃變性40s，56℃退火40s，70℃延伸70s完成一個擴增循環(huán)，重復循環(huán)25輪，最后70℃延伸8min，2℃保存，得到474bp的條帶，回收該片段后，將其連接到載體pMD-18T-Vector，并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109，經(jīng)PCR驗證后，提取質粒，得到氣單胞菌陽性DNA，稀釋至100拷貝/μl后作為氣單胞菌陽性對照。
實施例三
一種氣單胞菌核酸等溫擴增檢測試劑盒(5樣份)，僅以下內(nèi)容不同于實施例一，其余均同實施例一。
研磨液配制：1.5M的三羥甲基氨基甲烷溶液(Tris-HCl，pH8.0)7份，1.0M的乙二胺四乙酸二鈉溶液(EDTANa2)0.5份，質量分數(shù)10％的十二烷基磺酸鈉溶液(SDS)5份，巰基乙醇0.01份，8-羥基喹啉0.015份，平衡酚10份，氯仿10份，以雙蒸水定容到100份而成。以上份數(shù)均為體積份。
LAMP反應液的組成成分如下：LAMP引物Aeromonas-FIP和Aeromonas-BIP各1μM，LAMP引物Aeromonas-F3和Aeromonas-B3各0.25μM，dATP、dGTP和dCTP各0.5mM,dTTP、dUTP各0.5mM,Tris-HCl 40mM,KCl 10mM,(NH4)2SO4 5mM,MgSO41mM,Triton X-100 0.05％,Betaine 0.8M；溶劑為雙蒸水。
氣單胞菌陽性DNA制備方法如下：用位于LAMP目標片段上下游的PCR引物(Aeromonas-Pf[SEQ ID NO.5]：5'-GAGGAAAGGTTGGTAGCGAA；Aeromonas-Pr[SEQ ID NO.6]：5'-ACCCCCCTCTACAAGACTC)，對嗜水氣單孢菌基因組DNA進行擴增，擴增條件為：96℃預變性5min，96℃變性20s，60℃退火20s，74℃延伸50s完成一個擴增循環(huán)，重復循環(huán)25輪，最后75℃延伸8min，6℃保存，得到474bp的條帶，回收該片段后，將其連接到載體pMD-18 T-Vector，并轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞JM109，經(jīng)PCR驗證后，提取質粒，得到氣單胞菌陽性DNA，稀釋至100拷貝/μl后作為氣單胞菌陽性對照。
實施例四
一種氣單胞菌的檢測方法，利用實施例一～實施例3的任意一種檢測試劑盒，依次進行如下步驟：
1)取待測患病鯽魚肝臟組織0.2g置于離心管I中，加入研磨液管內(nèi)的0.5ml研磨液，用研磨棒充分磨碎至漿狀，
2)將上述研磨所得的漿狀樣品煮沸(100℃，l0min)后以10000r/min離心5min，取上清液置于離心管II中；
3)向離心管II內(nèi)加入核酸提取液A管內(nèi)的乙酸鈉溶液混勻，乙酸鈉溶液與上清液的體積比為1：10；再加入-20℃預冷的核酸提取液B管內(nèi)的無水乙醇混合，靜置10min，以12000r/min離心5min，棄上清液，保留沉淀物，無水乙醇與沉淀物的體積比為2:1；
4)用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟3)所得的沉淀物，然后12000r/min離心5min，棄上清液，保留沉淀物；
5)用核酸提取液C管內(nèi)的乙醇溶液洗滌上述步驟4)所得的沉淀物，然后12000r/min離心5min，棄上清液，保留沉淀物；
6)將上述步驟5)所得的沉淀物(位于離心管II的底部)于室溫晾干，加入TE緩沖液管內(nèi)的20μl TE緩沖液溶解沉淀物，得到樣品核酸；
7)分別將上述樣品核酸、陰性對照管內(nèi)的雙蒸水、陽性對照核酸管內(nèi)的陽性對照核酸2μl，加至21μl LAMP反應液中，再加入1μl UNG酶，從而分別得檢測管、陰性對照管和陽性對照管；對上述檢測管、陰性對照管和陽性對照管均于37℃保溫10min進行酶解，目的是以酶解方法消除其中可能存在的污染模板；
8)將上述檢測管、陰性對照管和陽性對照管酶解后的反應體系先于95℃保溫5min，然后再迅速置于碎冰塊中5min；
9)向步驟8)所得的檢測管、陰性對照管和陽性對照管的反應體系中再分別加入1μl Bst DNA聚合酶；
10)將上述步驟9)所得的檢測管、陰性對照管和陽性對照管分別進行如下操作：先于64℃保溫45min，然后于90℃保溫2min完成LAMP反應；
11)LAMP反應結束后，加入1μl核酸染料SYBR Green I，觀察檢測管內(nèi)LAMP反應產(chǎn)物的顏色，如果檢測管與陽性對照管均顯示綠色，陰性對照管顯示橙色，表示該樣品的氣單胞菌檢測結果為陽性；如果檢測管與陰性對照管均顯示橙色，陽性對照管顯示綠色，表示該樣品的氣單胞菌檢測結果為陰性；如果陽性對照管顯示橙色，表示該檢測試劑已失效，需更換檢測試劑后重新檢測；如果陰性對照管顯示綠色，表示該檢測試劑已被污染，需更換檢測試劑及檢測地點后重新檢測。
實施例五
一種氣單胞菌的檢測方法，利用實施例一、二、三的任意一種檢測試劑盒，對病樣用營養(yǎng)肉湯進行增菌后，按照以下步驟對致病性氣單胞菌進行檢測：
1)取待測患病鯽魚魚肝臟組織2g置于無菌勻漿器中勻漿，將勻漿液加到營養(yǎng)肉湯(5ml)中25℃～28℃搖床培養(yǎng)5h～6h。營養(yǎng)肉湯配方為：蛋白凍10g，牛肉膏3g，氯化鈉5g，蒸餾水1000ml，pH7.4。將上述成分混合、溶解后校正pH，121℃高壓滅菌15min；
2)取2ml菌液，10000r/m離心1min，棄上清，加入50μl雙蒸水，水浴煮沸10min；
3)10000r/m離心1min，取上清液；
4)使用實施例一～實施例3的任意一種檢測試劑盒，按照實施例4中步驟7)～步驟11)所述方法進行檢測。
如果檢測管顯示綠色則表示該樣品的氣單胞菌檢測結果為陽性，若檢測管顯示橙色則表示該樣品的氣單胞菌檢測結果為陰性。
這個實施例說明可以不用經(jīng)過相當復雜的DNA模板制備，結果細菌擴增之后只需煮沸即能制備DNA檢測模板，說明此方法簡便。
實施例六
一種氣單胞菌的檢測方法，以不同種細菌作為檢測對象，驗證檢測方法的特異性，按照以下步驟對細菌進行檢測：
1)將嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌、地衣芽孢桿菌、副溶血弧菌、大腸桿菌、硝化細菌分別于合適培養(yǎng)基中培養(yǎng)富集至OD600＝0.6。
2)取1ml菌液，10000r/m離心1min，棄上清，加入50μl雙蒸水，水浴煮沸10min；
3)10000r/m離心1min，取上清液，即得細菌DNA檢測模板；
4)使用實施例一～實施例3的任意一種檢測試劑盒，按照實施例4中步驟7)～步驟11)所述方法，分別對10-1-10-7模板進行檢測。
結果表明，LAMP反應能檢測出嗜水氣單胞菌、豚鼠氣單胞菌、溫和氣單胞菌、維氏氣單胞菌等致病性氣單胞菌，而對地衣芽孢桿菌、副溶血弧菌、大腸桿菌、硝化細菌等水環(huán)境中常見細菌的檢測結果呈現(xiàn)陰性。
上述結果說明：本發(fā)明的LAMP檢測試劑盒對致病性氣單胞菌具有很好的特異性。
對比實驗1：以同一患病動物樣品(已確認感染嗜水氣單孢菌)作為待測樣品，利用實施例一中的試劑盒，按實施例4中步驟1)～步驟6)的方法制備患病鯽魚的檢測模板(即樣品核酸)。將上述模板用TE緩沖液進行10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，10-7倍系列稀釋，分別作為LAMP和PCR檢測模板。
1)按照實施例4中步驟7)～步驟11)所述方法，分別對10-1-10-7模板進行檢查。
2)以同樣的模板進行PCR檢測，使用引物Aeromonas-Pf和Aeromonas-Pr。
結果表明，LAMP反應能檢測到10-6倍稀釋的模板，而PCR只能檢測至10-3倍稀釋的模板，LAMP檢測的靈敏度比PCR高1000倍，且用時更少，無需復雜設備。
對比實驗2：以同一只患病鯽魚作為待測樣品，利用實施例二中的試劑盒，實驗方式同對比實驗1。
結果表明：LAMP反應能檢測到10-6倍稀釋的模板，而PCR只能檢測至10-3倍稀釋的模板。
對比實驗3：以同一只患病鯽魚作為待測樣品，利用實施例三中的試劑盒，實驗方式同對比實驗1。
結果表明：LAMP反應能檢測到10-6倍稀釋的模板，而PCR只能檢測至10-3倍稀釋的模板。
SEQUENCE LISTING
<110> 浙江萬里學院
<120> 一種氣單胞菌的核酸等溫擴增檢測試劑盒及其檢測方法
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