本發(fā)明涉及核酸恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的快速檢測方法，利用核酸薄膜層析檢測試紙條檢測目標(biāo)序列，應(yīng)用在食源性致病菌的檢測過程中，具體涉及一種沙門氏菌解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增及核酸薄膜層析檢測試紙條。

技術(shù)背景

分析以往發(fā)生的食品安全事件，細(xì)菌性污染引發(fā)的食物中毒情況發(fā)生頻率高，影響程度大，涉及范圍廣。食源性致病菌導(dǎo)致人類及動物感染疾病的發(fā)病率仍居高不下，常見的病原體主要為沙門氏菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌、李斯特氏菌等。沙門氏菌作為能夠?qū)е氯诵蠊不疾≈虏【谧匀唤鐝V泛存在，目前已經(jīng)鑒定的沙門氏菌血清型有2500多種，其中致使食源性的沙門氏菌病發(fā)生主要的血清型為腸炎、鼠傷寒和豬霍亂沙門氏菌三種，菌體裂解后釋放的內(nèi)毒素侵襲腸道黏膜、神經(jīng)及血管，引起頭痛、嘔吐、腹瀉、發(fā)熱等中毒癥狀。由此可見食品安全形勢依然嚴(yán)峻，有效監(jiān)控細(xì)菌性污染問題成為避免食品污染事件發(fā)生的主要解決途徑。因此，快速、敏感、特異的檢測方法對于臨床診斷和保障食品安全是必不可少的。常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)檢測采取傳統(tǒng)培養(yǎng)的方法，待測致病菌需按照規(guī)定的檢測步驟單獨(dú)進(jìn)行檢測，檢測周期長，操作復(fù)雜，工作量大，檢驗(yàn)人員需要具備專業(yè)經(jīng)驗(yàn)，檢測結(jié)果易受人為因素影響從而出現(xiàn)誤判。

應(yīng)用免疫學(xué)基本原理的檢測方法主要依據(jù)其抗原與抗體的特異性免疫結(jié)合反應(yīng)。通過微生物本身特異性抗原物質(zhì)刺激生物體得到相應(yīng)的特異性抗體。其中采用酶聯(lián)免疫試劑盒及膠體金試紙條在檢測食源性致病菌方面已發(fā)展成相當(dāng)成熟的技術(shù)，涉及檢測范圍廣泛。該類產(chǎn)品憑借其操作簡便、方便快捷、價(jià)格低廉和結(jié)果準(zhǔn)確等特點(diǎn)，已經(jīng)逐步進(jìn)入基層檢測及醫(yī)療部門甚至被應(yīng)用于普通家庭自主檢測，給人們?nèi)粘Ｔ\斷疾病帶來許多便利之處。然而免疫技術(shù)在目前研究階段及實(shí)際應(yīng)用中仍存在一些不足之處，主要原因在于單克隆抗體的制備程序繁瑣，耗費(fèi)大量人力及物質(zhì)資源，由于多方面因素共同作用可能導(dǎo)致得到的抗體特異性并不理想，直接影響檢測結(jié)果的特異性和靈敏度。在實(shí)際檢測過程中時(shí)常發(fā)生假陽性或假陰性的報(bào)告，表現(xiàn)出該方法穩(wěn)定性有待進(jìn)一步提高。

近年來隨著分子生物學(xué)的深入研究與快速發(fā)展，實(shí)際檢驗(yàn)中細(xì)菌等病原體測定方法已經(jīng)由傳統(tǒng)的單一生化實(shí)驗(yàn)水平轉(zhuǎn)移到分子生物學(xué)的方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)、基因芯片、探針雜交等技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)通過特定引物有選擇性的進(jìn)行體外模擬細(xì)胞內(nèi)部擴(kuò)增DNA或RNA片段的方法，該DNA復(fù)制方法可以實(shí)現(xiàn)將極少量基因組中的特定基因片段在短暫幾小時(shí)內(nèi)呈現(xiàn)指數(shù)擴(kuò)增，顯著提高檢測的靈敏度已成為目前研究水平上最靈敏的檢測技術(shù)，具有精確度高和特異性強(qiáng)的優(yōu)勢，在微生物檢測、感染性和遺傳性疾病的診斷及基因突變的檢測等諸多領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。然而，PCR技術(shù)需要精確的熱循環(huán)過程，局限于反應(yīng)過程必需依賴精密儀器設(shè)備，因而限制了其在設(shè)施缺乏的現(xiàn)場檢測和基層地區(qū)應(yīng)用。

目前國內(nèi)外核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)迅速發(fā)展，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用的有環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增、鏈替代擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、切口酶核酸恒溫?cái)U(kuò)增、依賴解旋酶的恒溫?cái)U(kuò)增等。其反應(yīng)過程只需在恒定的溫度下進(jìn)行且能夠?qū)崿F(xiàn)DNA或RNA的特異性擴(kuò)增，并且靈敏度能夠達(dá)到PCR技術(shù)的檢測水平。

發(fā)明專利“可避免假陰性的沙門氏菌恒溫?zé)晒鈾z測引物組、試劑盒及檢測方法”(公開號CN105219870A)及“腸炎沙門氏菌的鏈置換恒溫?cái)U(kuò)增(SDA)快速檢測試劑盒及其檢測方法”(公開號：CN102382884A)描述依據(jù)不同擴(kuò)增原理均以恒溫條件實(shí)現(xiàn)對沙門氏菌DNA核酸序列的擴(kuò)增，但該類方法仍需結(jié)合凝膠電泳及成像系統(tǒng)對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，沒有明顯簡化檢驗(yàn)操作步驟和無法在公共衛(wèi)生突發(fā)事件中體現(xiàn)其優(yōu)勢。

在恒溫?cái)U(kuò)增過程中利用分別修飾有特定標(biāo)記物的上、下游引物將擴(kuò)增產(chǎn)物中導(dǎo)入兩種不同類型的核酸標(biāo)記物能夠被特異性結(jié)合的抗體或其配體捕獲，檢測原理依據(jù)近似雙抗體夾心法膠體金免疫層析分析方法，該方法已應(yīng)用在針對多種食源性致病菌及病毒基因的恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物檢測中，關(guān)于沙門氏菌的核酸檢測，公開號為CN102329790A的發(fā)明專利“雙標(biāo)記核酸恒溫?cái)U(kuò)增方法及檢測試紙條”提供一種利用標(biāo)記生物素和異硫氰酸熒光素的探針的方法對LAMP反應(yīng)產(chǎn)物實(shí)現(xiàn)快速檢測。但由于該擴(kuò)增體系需要多條內(nèi)外引物共同參與，難以避免形成引物二聚體等非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的形成，故該類型擴(kuò)增結(jié)果不適用于試紙條的檢測。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足之處，提供一種利用解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增檢測具有危害性食源性致病菌-沙門氏菌(Salmonella)的快速檢測技術(shù)，特別是一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的沙門氏菌核酸快速檢測試劑盒、試紙及檢測方法。

本發(fā)明實(shí)現(xiàn)目的的技術(shù)方案如下：

一種沙門氏菌核酸快速檢測試劑盒，包括正向引物invA-F:序列5’-ATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACC-3’,反向引物invA-R:序列：5’-ATGTAGAACGACCCCATAAACACCAA-3’，用地高辛和生物素分別標(biāo)記上、下游引物的5’端，金標(biāo)抗體，抗金標(biāo)抗體種屬的抗體，顯色物生物素的配體物質(zhì)。

而且，還包括擴(kuò)增體系，所述擴(kuò)增體系包括10×Annealing Buffer、dNTP、MgSO₄、NaCl、Enzyme Mix。

而且，所述金標(biāo)抗體為地高辛和生物素。

而且，所述顯色物生物素的配體物質(zhì)鏈霉親合素。

而且，所述金標(biāo)抗體為鼠抗地高辛抗體，抗金標(biāo)抗體為羊抗鼠二抗。

一種沙門氏菌核酸快速檢測試紙，包括樣品墊、金標(biāo)墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，樣品墊一端與金標(biāo)墊一端端部重疊，金標(biāo)墊另一端與硝酸纖維素膜端部重疊硝酸纖維素膜另一端部與吸水紙重疊，在硝酸纖維素膜間隔平行嵌裝有檢測線和質(zhì)控線，檢測線在金標(biāo)墊一側(cè)，質(zhì)控線在檢測線與吸水紙端部之間；

所述金標(biāo)墊上噴涂金標(biāo)抗體，檢測線上包被顯色物生物素的配體物質(zhì)，質(zhì)控線上包被抗金標(biāo)抗體種屬的抗體。

而且，所述金標(biāo)墊上噴涂標(biāo)抗地高辛抗體的膠體金，檢測線上包被鏈霉親合素，鏈霉親合素濃度為2mg/mL，質(zhì)控線上包被稀釋80倍的羊抗鼠二抗。

而且，所述樣品墊為玻璃纖維，各部分重疊部分為2-10mm，在檢測試紙下部安裝PVC背板。

而且，快速檢測試紙使用上樣展開液為添加0.1％BSA和0.1％Tween 20的PBS緩沖液pH 7.4。

一種沙門氏菌核酸快速檢測方法，其包括如下步驟：

⑴將單克隆抗體如鼠抗地高辛抗體作為金標(biāo)抗體吸附于顯色物質(zhì)膠體金顆粒上，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的結(jié)合體固定在金標(biāo)墊上，金標(biāo)墊就是一個(gè)玻璃纖維制成的墊；

⑵鏈霉親和素作為標(biāo)記物生物素的配體物質(zhì)以線狀形式包被在硝酸纖維素膜上形成檢測線；

⑶選擇抗金標(biāo)抗體種屬的抗體如羊抗鼠抗體同樣以線狀形式包被在質(zhì)控線上結(jié)合過多的金標(biāo)抗體；

⑷設(shè)計(jì)特異性恒溫?cái)U(kuò)增的上游引物5’和下游引物5’上分別修飾抗原或半抗原物質(zhì)如地高辛和生物素，當(dāng)存在待測沙門核酸擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，在恒溫條件下進(jìn)行核酸的擴(kuò)增反應(yīng)得到同時(shí)連接兩種標(biāo)記物地高辛-目標(biāo)片段-生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物；

⑸將步驟⑷產(chǎn)生的地高辛-目標(biāo)片段-生物素首先與金標(biāo)墊(玻璃纖維)上膠體金顆粒包被的地高辛抗體結(jié)合，形成地高辛抗體-地高辛-目標(biāo)片段-生物素顯色顆粒復(fù)合體；

⑹步驟⑸得到的顯色顆粒復(fù)合物在上樣緩沖液中通過毛細(xì)管作用沿纖維素膜向上移動至檢測線被受體鏈霉親合素捕獲得到地高辛抗體-地高辛-目標(biāo)片段-生物素-鏈霉親合素復(fù)合體，在檢測線上沉降形成肉眼可視的顯色條帶，且未結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物的膠體金顆粒上包被的金標(biāo)抗體與質(zhì)控線上的羊抗鼠抗體結(jié)合，出現(xiàn)兩條顯色條帶即為陽性結(jié)果；

或者，當(dāng)不存在沙門核酸擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，不發(fā)生上述步驟⑶-⑹，不能與金標(biāo)墊(玻璃纖維)上膠體金顆粒包被的地高辛抗體結(jié)合，顯色物質(zhì)膠體金顆粒不能與檢測線上包被的物質(zhì)結(jié)合形成顯色條帶，質(zhì)控線上的羊抗鼠抗體與膠體金顆粒上包被的金標(biāo)抗體結(jié)合出現(xiàn)一條顯色條帶即為陰性結(jié)果。

本發(fā)明與其他技術(shù)相比具有以下優(yōu)勢：

本發(fā)明開發(fā)出以解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)并聯(lián)合核酸薄膜層析檢測試紙條檢測沙門氏菌的一種更為高效的分子檢測方法，引物的設(shè)計(jì)選擇最適擴(kuò)增片段位置及長度能夠有效避免非特異性擴(kuò)增的形成，并優(yōu)化得到最佳展開緩沖液使核酸試紙條達(dá)到最理想的顯色效果。該檢測方法不會污染實(shí)驗(yàn)室和周圍環(huán)境且不需要昂貴的儀器設(shè)備或?qū)I(yè)操作技能，從而可以在實(shí)驗(yàn)條件不完善的情況下應(yīng)對大規(guī)模樣品的檢測，具體有點(diǎn)體現(xiàn)在以下幾個(gè)方面：

1、本發(fā)明所述的檢測沙門氏菌解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的核酸薄膜層析檢測試紙條的特異性強(qiáng)，靈敏度高，操作簡便，穩(wěn)定性強(qiáng)；

2、擴(kuò)增過程在封閉的反應(yīng)體系中進(jìn)行有效的避免擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；

3、反應(yīng)速度快，完成樣品的全部檢測步驟只需1小時(shí)左右；

4、檢測過程不需要復(fù)雜昂貴的儀器設(shè)備及專業(yè)技術(shù)人員操作；

5、適應(yīng)于食品致病菌的現(xiàn)場快速檢測的初步判斷。

附圖說明

圖1為沙門氏菌引物特異性驗(yàn)證。圖中M：DNA分子量標(biāo)記DL2000；1：空白對照；2：腸炎沙門氏菌；3：甲型副傷寒沙門氏菌；4：腸沙門氏菌腸亞種；5：豬霍亂沙門氏菌；6：腸沙門氏菌腸亞種傷寒血清型；7：大腸桿菌O157:H7；8：大腸桿菌(非O157:H7)；9：宋內(nèi)氏志賀氏菌；10：福氏志賀氏菌；11：產(chǎn)氣腸桿菌；12：單增李斯特菌；13：金黃色葡萄球菌；14：空腸彎曲桿菌。

圖2為核酸薄膜層析檢測試紙條結(jié)構(gòu)。圖中1：樣品墊；2：硝酸纖維素膜；3：背板；4：金標(biāo)墊(玻璃纖維)；5：檢測線；6：質(zhì)控線；7：吸水紙。

圖3為沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條特異性驗(yàn)證。圖中1：腸炎沙門氏菌；2：甲型副傷寒沙門氏菌；3：腸沙門氏菌腸亞種；4：豬霍亂沙門氏菌；5：腸沙門氏菌腸亞種傷寒血清型；6：大腸桿菌O157:H7；7：大腸桿菌(非O157:H7)；8：宋內(nèi)氏志賀氏菌；9：福氏志賀氏菌；10：產(chǎn)氣腸桿菌；11：單增李斯特菌；12：金黃色葡萄球菌；13：空腸彎曲桿菌。

具體的實(shí)施方式

為了理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明：下述實(shí)施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。

本發(fā)明結(jié)合解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)和核酸薄膜層析檢測技術(shù)，建立沙門氏菌核酸快速檢測的方法。本發(fā)明旨在利用核酸薄膜層析檢測試紙條檢測的解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增產(chǎn)物，從而實(shí)現(xiàn)核酸的快速檢測。設(shè)計(jì)分別標(biāo)記生物素和地高辛的沙門氏菌的特異性引物，目標(biāo)核酸經(jīng)過解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增形成修飾有兩種標(biāo)記物的擴(kuò)增產(chǎn)物，該擴(kuò)增產(chǎn)物能夠被包被有特異性識別的配體和抗體核酸薄膜層析檢測試紙條檢出。應(yīng)用抗原或半抗原生物小分子標(biāo)記的核酸分子能夠被其特異性的抗體或配體識別免疫學(xué)檢測原理實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)核酸的檢測。常用的核酸標(biāo)記物中生物素能夠特異性結(jié)合其配體鏈霉親合素，而地高辛易于獲得其特異性抗體。因此選擇上述兩種物質(zhì)作為引物標(biāo)記物。

1、本發(fā)明提供兩條沙門氏菌的特異性擴(kuò)增引物，選擇沙門氏菌特異性invA基因設(shè)計(jì)正向引物invA-F:序列5’-ATTTCTATGTTCGTCATTCCATTACCTACC-3’,反向引物invA-R:序列：5’-ATGTAGAACGACCCCATAAACACCAA-3’，地高辛和生物素分別標(biāo)記上、下游引物的5’端，當(dāng)目標(biāo)核酸存在時(shí)，經(jīng)過解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增能夠得到大小為101bp的DNA片段；若沒有目標(biāo)核酸存在時(shí)，則無擴(kuò)增產(chǎn)物形成，如圖1所示。

2、本發(fā)明提供沙門氏菌的解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增方法：沙門氏菌的解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系包括正向、反向引物(75nM)、10×Annealing Buffer(7μL)、dNTP(3.5μL)、MgSO₄(2μL)、NaCl(4μL)、Enzyme Mix(3.5μL)，用無菌超純水補(bǔ)充到50μL。將提取得到的1μL沙門氏菌DNA作為陽性對照的模板，等量的無菌超純水作為陰性對照加入含有沙門氏菌解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)液的PCR管中，將上述反應(yīng)體系置于68℃下反應(yīng)90min進(jìn)行沙門氏菌的恒溫?cái)U(kuò)增。

3、本發(fā)明提供的沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條的檢測方法，其包括如下步驟(原理如圖2所示)：

⑴將單克隆抗體如鼠抗地高辛抗體作為金標(biāo)抗體吸附于顯色物質(zhì)膠體金顆粒上，形成穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的結(jié)合體固定在金標(biāo)墊(就是一個(gè)玻璃纖維墊)上。

⑵鏈霉親和素作為標(biāo)記物生物素的配體物質(zhì)以線狀形式包被在硝酸纖維素膜上形成檢測線。

⑶選擇抗金標(biāo)抗體種屬的抗體如羊抗鼠抗體同樣以線狀形式包被在質(zhì)控線上結(jié)合過多的金標(biāo)抗體。

⑷設(shè)計(jì)特異性恒溫?cái)U(kuò)增的上游引物5’和下游引物5’上分別修飾抗原或半抗原物質(zhì)如地高辛和生物素，當(dāng)存在待測沙門核酸擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，在恒溫條件下進(jìn)行核酸的擴(kuò)增反應(yīng)得到同時(shí)連接兩種標(biāo)記物地高辛-目標(biāo)片段-生物素的擴(kuò)增產(chǎn)物。

⑸將步驟⑷產(chǎn)生的地高辛-目標(biāo)片段-生物素首先與金標(biāo)墊(玻璃纖維)上膠體金顆粒包被的地高辛抗體結(jié)合，形成地高辛抗體-地高辛-目標(biāo)片段-生物素顯色顆粒復(fù)合體。

⑹步驟⑸得到的顯色顆粒復(fù)合物在上樣緩沖液中通過毛細(xì)管作用沿纖維素膜向上移動至檢測線被受體鏈霉親合素捕獲得到地高辛抗體-地高辛-目標(biāo)片段-生物素-鏈霉親合素復(fù)合體，在檢測線上沉降形成肉眼可視的顯色條帶，且未結(jié)合擴(kuò)增產(chǎn)物的膠體金顆粒上包被的金標(biāo)抗體與質(zhì)控線上的羊抗鼠抗體結(jié)合，出現(xiàn)兩條顯色條帶即為陽性結(jié)果；

或者，當(dāng)不存在沙門核酸擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，不發(fā)生上述步驟⑶-⑹，不能與金標(biāo)墊(玻璃纖維)上膠體金顆粒包被的地高辛抗體結(jié)合，顯色物質(zhì)膠體金顆粒不能與檢測線上包被的物質(zhì)結(jié)合形成顯色條帶，質(zhì)控線上的羊抗鼠抗體與膠體金顆粒上包被的金標(biāo)抗體結(jié)合出現(xiàn)一條顯色條帶即為陰性結(jié)果。

4、本發(fā)明還提供沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條結(jié)構(gòu)如圖2所示：其包括PVC背板上依次為樣品墊、結(jié)合墊、硝酸纖維素膜(NC)和吸水紙，上述各部分重疊部分至少保留2mm，硝酸纖維素膜上分別設(shè)有檢測線(包含標(biāo)記物生物素的配體物質(zhì))和質(zhì)控線(包含鏈霉親和素)，所有的材料需在37℃下過夜干燥。

5、本發(fā)明對沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條優(yōu)化：首先對沙門氏菌解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增的反應(yīng)條件分別進(jìn)行優(yōu)化，其中包括引物濃度、MgSO₄濃度、dNTP濃度及反應(yīng)溫度，得到最佳的反應(yīng)條件使擴(kuò)增反應(yīng)達(dá)到最理想的效果。同時(shí)優(yōu)化膠體金檢測試紙條的設(shè)計(jì)，包括硝酸纖維素膜的類型、檢測線與質(zhì)控線包被濃度及上樣展開液，使試紙條呈現(xiàn)最佳的顯色效果。

以下實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。以下實(shí)施例中使用的試劑材料，如無特殊說明，均為常規(guī)生化試劑供應(yīng)商購買得到。

實(shí)施例1

沙門氏菌解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增體系的優(yōu)化

以引物濃度，MgSO₄，dNTP及反應(yīng)溫度為變量對沙門氏菌進(jìn)行正交試驗(yàn)，引物濃度分別為75nm、80nm和85nm；MgSO₄濃度分別為3mM、3.5mM和4mM；dNTP添加量分別2.5μL、3.5μL和4.5μL；反應(yīng)溫度分別為63℃、64℃和65℃。其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳擴(kuò)增后利用凝膠成像儀觀察擴(kuò)增效果，經(jīng)驗(yàn)證得出沙門氏菌擴(kuò)增50μL總反應(yīng)體系，其中包括DNA模板1μL，引物濃度為80nM，MgSO₄濃度為3.5mM，dNTP添加量為4.5μL，最后添加3.5μL Enzyme Mix，置于64℃溫度下反應(yīng)60min。

實(shí)施例2

沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條制備

1、膠體金標(biāo)記抗體的制備

⑴取1mL的10nm膠體金溶液置于1.5mL干凈的離心管中，滴加一定量的K₂CO₃溶液調(diào)節(jié)膠體金溶液至最適pH；

⑵取15μL的濃度為1μg/μL抗體滴加到膠體金溶液中，迅速震蕩5min，混勻后的溶液于4℃條件下靜置1h；

⑶滴加20μL 20％的BSA溶液，10μL 20％的PEG 20000溶液，混勻后的溶液于4℃條件下靜置30min；

⑷在2000rpm，4℃低溫條件下，離心15min，小心移取上清液至干凈的離心管中，棄去未標(biāo)記的膠體金沉淀物；

⑸將上清液在10000rpm，4℃低溫條件下，離心30min，棄上清液，保留標(biāo)記的膠體金顆粒沉淀，用金標(biāo)工作液復(fù)溶5倍，4℃保存。

2、沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條工作條件的優(yōu)化

⑴選取四種不同型號的硝酸纖維素膜AE 98、Milipore HF90s、Milipore HF135s、Milipore HF180s，驗(yàn)證試紙條顯色效果；

⑵檢測線包被鏈酶親和素濃度分別選取0.5、1.0、1.5、2mg/mL，質(zhì)控線包被的羊抗鼠二抗分別選取稀釋60、80、100、120倍，驗(yàn)證試紙條顯色效果；

⑶上樣展開液分別采用PBS緩沖液(pH 7.4)、含0.1％BSA的PBS緩沖液(pH 7.4)，0.1％Tween 20的PBS緩沖液(pH 7.4)以及Tris EDTA(TE，pH 8.0)，驗(yàn)證試紙條顯色效果；

其中選擇型號為Milipore HF 135s的硝酸硝酸纖維素膜，檢測線包被鏈酶親和素濃度2mg/mL，質(zhì)控線包被稀釋80倍的羊抗鼠二抗，采用Tris EDTA上樣緩沖液的條件下試紙條顯色效果最佳。

3、沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條組裝

⑴將膠體金標(biāo)記抗體按照30μL/cm逐滴均勻涂布在規(guī)格為83mm×3mm金標(biāo)墊上，室溫真空過夜烘干備用。

⑵檢測線(T線)包被鏈霉親合素，濃度為2mg/mL，質(zhì)控線(C線)包被羊抗鼠二抗，稀釋100倍，利用劃膜儀在硝酸纖維素膜(NC膜)上按照1μL/cm劃出C、T線，37℃過夜烘干備用。

⑶同樣將樣品墊和吸水紙?jiān)?7℃過夜烘干，與金標(biāo)墊，NC膜，吸水紙組裝成試紙條，利用切條機(jī)切割成規(guī)格為60mm×3.7mm的試紙條，固定在塑料外殼內(nèi)，室溫下密封、避光、干燥保存。

實(shí)施例3

沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條檢測方法的建立

⑴以1μL沙門氏菌DNA作為模板加入含有沙門氏菌解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系的PCR管中，同時(shí)以等量的無菌雙蒸水作為陰性對照，將上述反應(yīng)體系置于68℃下反應(yīng)60min進(jìn)行沙門氏菌的解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增。

⑵選擇0.1％BSA和0.1％Tween 20的PBS緩沖液(pH 7.4)作為上樣展開液，取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)上樣展開液稀釋10倍后滴加到膠體金試紙條上進(jìn)行檢測，試驗(yàn)需重復(fù)三次，5分鐘后觀察檢測結(jié)果。沙門氏菌的擴(kuò)增產(chǎn)物呈陽性結(jié)果檢測線與質(zhì)控線均顯紅色；空白對照成陰性只有質(zhì)控線顯紅色。

實(shí)施例4

沙門氏菌核酸薄膜層析檢測試紙條特異性實(shí)驗(yàn)

按照實(shí)例3中所述的方法檢測其他常見食源性致病菌包括大腸桿菌O157:H7、志賀氏菌、產(chǎn)氣腸桿菌、單增李斯特菌、金黃色葡萄球菌和空腸彎曲桿，并以等量無菌超純水作為陰性對照，除五株沙門氏菌結(jié)果成陽性，其他實(shí)驗(yàn)菌株結(jié)果均成陰性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，表明該檢測技術(shù)具備高特異性。

實(shí)施例5

沙門氏菌核酸薄膜檢測試紙條純培養(yǎng)物靈敏度實(shí)驗(yàn)

⑴純菌液靈敏度檢測沙門氏菌，將其接種于10mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)；

⑵各取1mL進(jìn)行細(xì)菌計(jì)數(shù)，用0.9％無菌生理鹽水對純菌液進(jìn)行10倍梯度稀釋，各取1mL用于DNA的提取作為做實(shí)驗(yàn)?zāi)０澹?/p>

⑶按照恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)，取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物用上樣展開液稀釋至100μL，滴加到試紙條樣品墊上，取試驗(yàn)重復(fù)三次，5min后觀察檢測結(jié)果，確定該方法在檢測純菌液的靈敏度。

將沙門氏菌純培液濃度養(yǎng)梯度稀釋至4.5×10¹CFU/mL，經(jīng)解旋酶恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)后滴加在試紙條上均能顯示出陽性結(jié)果，表明沙門氏菌核酸薄膜層析試紙條的靈敏度為4.5×10¹CFU/mL。

實(shí)施例6

沙門氏菌核酸薄膜試紙條實(shí)際樣品靈敏度實(shí)驗(yàn)

1、固態(tài)樣品靈敏度實(shí)驗(yàn)

⑴在無菌條件下稱取25g固體樣品置于無菌均質(zhì)袋中，均質(zhì)3min。

⑵將樣品注入225mL SC培養(yǎng)液中，將培養(yǎng)至濃度為10⁸CFU/mL的沙門氏菌，用0.9％無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后，添加1mL的菌液置于樣品增菌液中，使其終濃度為10¹CFU/mL，

⑶在37℃，200r/min條件下培養(yǎng)。期間每隔2h采集一次培養(yǎng)樣品，

⑷每份設(shè)定兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組熱處理法提取DNA，同時(shí)未添加菌的樣品作為空白對照，按照恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)，

⑸取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物用上樣展開液稀釋至100μL，滴加到試紙條樣品墊上，試驗(yàn)重復(fù)三次，5min后觀察檢測結(jié)果，確定檢測固體類樣品該方法的靈敏度。

2、液態(tài)樣品靈敏度實(shí)驗(yàn)

⑴在無菌條件下量取25mL液態(tài)或半固體樣品，將樣品注入225mL SC培養(yǎng)液中；

⑵將培養(yǎng)至濃度為10⁸CFU/mL的沙門氏菌，用0.9％無菌生理鹽水10倍梯度稀釋后，添加1mL的菌液置于樣品增菌液中，使其終濃度為10¹CFU/mL；

⑶在37℃，200r/min條件下培養(yǎng)。期間每隔2h采集一次培養(yǎng)樣品；

⑷每份設(shè)定兩個(gè)平行實(shí)驗(yàn)組熱處理法提取DNA，同時(shí)未添加菌的樣品作為空白對照，按照恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)體系進(jìn)行試驗(yàn)；

⑸取10μL擴(kuò)增產(chǎn)物用已優(yōu)化的上樣展開液稀釋至100μL，滴加到試紙條樣品墊上，試驗(yàn)重復(fù)三次，5min后觀察檢測結(jié)果，確定檢測液態(tài)類樣品該方法的靈敏度。

添加有濃度為10¹CFU/mL的沙門氏菌的實(shí)際樣品，在增菌2h后能檢出，同時(shí)未添菌的樣品未檢出，結(jié)果表明該方法可以應(yīng)用在實(shí)際樣品的快速檢測中。