本發(fā)明屬于醫(yī)學檢驗技術領域，具體涉及一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒及其應用。
背景技術：
β2-微球蛋白(β2-microglobin，β2-MG)，是人體組織相容抗原(HLA)的一個β輕鏈，由淋巴細胞及有核細胞合成和分泌。β2-微球蛋白的分子內含一對二硫鍵，不含糖，其血清蛋白電泳位于β2區(qū)域。人體內幾乎所有的有核細胞均能合成β2-微球蛋白，但是主要由淋巴細胞合成。β2-微球蛋白廣泛存在于人血清、腦脊液、尿液、初乳、唾液等體液中，而且含量微小。
糖尿病腎病在長期糖尿病患者中非常多見，長期發(fā)展可更嚴重損害腎功能，嚴重影響糖尿病患者的生存質量即加重這些患者的經濟負擔。早期診斷糖尿病腎病并對其進行干預可以提高糖尿病患者的生存質量。目前，在臨床常用的腎功能檢測指標為尿素和肌酐，尿素和肌酐在檢測的過程中存在操作簡單，價格低廉的優(yōu)點而被廣泛應用于腎功能的檢測中。然而上述這兩個檢測指標容易受年齡、性別、肌肉組織含量和蛋白質攝入等因素的影響，其對腎功能的評估存在準確度低、穩(wěn)定差的缺陷。
β2-微球蛋白的代謝僅依賴域腎臟，有細胞表面脫落或釋放入血的β2-微球蛋白，從腎小球自由濾過，幾乎所有的近端腎小管重新收并分解代謝，不再反流入血，因而在正常情況下血清β2-微球蛋白可以保持著穩(wěn)定的水平。而且β2-微球蛋白分子量小，因而能夠從腎小球自由地濾過，而且β2-微球蛋白除了由腎臟排泄外極少有腎外的分解代謝，因此，其在體內的產生速率恒定，不會受年齡、性別、機體肌肉組織的影響而影響其血清水平含量。在體內β2-微球蛋白生成不增加的情況下，血清β2-微球蛋白水平升高是反映腎小球濾過功能損傷極靈敏的指標。
李麗波等發(fā)表了一篇題目為“β2-微球蛋白酶聯免疫分析試劑盒的研制”的論文，該論文以β2-微球蛋白抗體包被微孔板，四甲基聯苯胺為底物，用辣根過氧化物酶標記β2-微球蛋白，建立了β2-微球蛋白酶聯免疫分析試劑盒。該試劑盒與放射性免疫分析法的相關系數為0.9000，而且還具有操作簡單、快速的優(yōu)點。但是，該試劑盒檢測靈敏度較低，無法滿足對含量微小的β2-微球蛋白的臨床檢測要求，大大的影響臨床腎臟疾病的診斷。
專利文獻CN101813700B在2010年3月31日公開了一種納米微球免疫比濁法檢測β2-微球蛋白試劑盒，該試劑盒包括試劑R1、試劑R2以及參考校準品；所述試劑R1由三羥甲基氨基甲烷、廣譜殺菌劑、乙二胺四乙酸二鈉、NaCl、吐溫-20、PEG-6000，純化水組成；所述試劑R2由三羥甲基氨基甲烷、結合有抗人β2-微球蛋白抗體的納米微球、防腐劑組成，所述納米微球直徑為50-150nm，制備得到的試劑盒無需稀釋、操作簡單、準確度高、重復性好，適用于各種類型的全自動生化分析儀。但是，該試劑盒靈敏度較低，影響臨床腎臟疾病的診斷，大大限制了該試劑盒的應用。
因此，研究和開發(fā)出一種靈敏度高、穩(wěn)定性好的β2-微球蛋白檢測試劑盒仍是當前亟需解決的難題。
技術實現要素：
為了克服現有技術中β2-微球蛋白檢測試劑盒存在檢測靈敏度較低、穩(wěn)定性差的缺陷，本發(fā)明的目的在于提供一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒及其應用，以解決上述問題。
本發(fā)明提供了一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒，所述試劑盒包括試劑R1和試劑R2，所述試劑R1由以下組分及其濃度組成：
磷酸二氫鉀100-160mmol/L、十二烷基葡萄糖苷40-70mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚50-100mmol/L、單十二烷基九乙二醇醚80-120mmol/L、氯化鈣2-4mmol/L和對羥基苯甲酸酯1-5mmol/L，余量為水；
所述試劑R2由以下組分及其濃度組成：單十二烷基九乙二醇醚80-120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷40-70mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗體膠乳5-20g/L和對羥基苯甲酸酯1-5mmol/L，余量為水；所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為130-150nm。
進一步地，所述試劑盒包括試劑R1和試劑R2，所述試劑R1由以下組分及其濃度組成：
磷酸二氫鉀120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚80mmol/L、單十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、氯化鈣3mmol/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；
所述試劑R2由以下組分及其濃度組成：單十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗體膠乳12g/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為130-150nm。
進一步地，所述試劑R1的pH值為7.5-7.8。
進一步地，所述試劑R1的pH值為7.6。
進一步地，所述試劑R1與試劑R2的體積比為4:1。
進一步地，所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為142nm。
進一步地，所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的制備方法為：
用0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液在室溫下稀釋抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物，在磁力攪拌器上混勻，所述抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體與膠乳的重量比為1:2-4，所述磷酸鉀緩沖液的加入量為膠乳重量的1-2倍；接著放在37℃的恒溫條件下攪拌，所述轉速為300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液中封閉1小時，離心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液，即得。
進一步地，所述抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體與膠乳的重量比為1:3。
進一步地，所述磷酸鉀緩沖液的加入量為膠乳重量的1.5倍。
本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒的試劑R1中的十二烷基葡萄糖苷的分子式為C18H36O6，CAS號為110615-47-9；八(乙二醇)一(十二烷基)醚的分子式為C28H58O9，CAS號為3055-98-9；單十二烷基九乙二醇醚的分子式為C30H62O10，CAS號為3055-99-0。
校準品，購置利德曼公司的多項高值免疫標準液，標準值見說明書。
質控品，購置利德曼公司的多項免疫質控血清，質控值見說明書。
進一步地，所述抗人β2-微球蛋白多克隆抗體包括羊抗抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體或兔抗抗人β2-微球蛋白多克隆抗體或鼠抗抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體，上述β2-微球蛋白多克隆抗體均購于北京阿匹斯生物科技有限公司，上述抗體僅與人β2-微球蛋白反應，與其它抗原無免疫交叉反應，效價能夠滿足本試劑要求。膠乳購于BangsLaboratories公司。
本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒的檢測原理為：人血清中β2-微球蛋白與抗血清試劑中的β2-微球蛋白抗體形成抗原抗體復合物，使反應出現濁度，在600nm下檢測吸光度的變化與校準品比較測得血清中β2-微球蛋白的濃度。具體為：先加入試劑R1(樣本稀釋液)，解除樣本中抗原周圍的電子層和水化層，使抗原位點充分暴露；然后加入試劑R2(抗人β2-微球蛋白抗體膠乳溶液)，使抗人β2-微球蛋白抗體膠乳與樣本中相應的β2-微球蛋白抗原反應，形成不溶性的抗原-抗體復合物，產生一定的濁度，其濁度高低與樣本中的β2-微球蛋白含量成正比；在規(guī)定波長下測定該不溶性抗原-抗體復合物的吸光度值，與已知濃度的β2-微球蛋白參考校準品進行比較，則可計算出樣本中β2-微球蛋白的含量。
進一步地，經試驗發(fā)現，本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒檢測高、中、低值三個濃度β2-微球蛋白的血清樣本的批內變異系數分別為2.35％、2.44％和3.38％，批間變異系數分別為3.70％，2.80％和3.07％，均低于5％，說明本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒具有較高的精密度。
進一步地，本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒的檢測限為0.2mg/L，其在20℃分別放置6個月和12個月后靈敏度和線性方程的R2值基本無變化，在4℃下保存36個月后，試劑盒靈敏度及線性良好，與剛制備的試劑盒無明顯差別，說明本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒具有較高的穩(wěn)定性和較好的靈敏性。
另外，本發(fā)明還提供了所述β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒在檢測β2-微球蛋白中的應用。
總之，與現有技術相比，本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒具有測定靈敏度高、檢測結果準確度高、重復性好和穩(wěn)定性高的優(yōu)點，是一種較為理想的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒，有利于該試劑盒的推廣和應用。
具體實施方式
以下通過具體實施例進一步描述本發(fā)明，本發(fā)明不僅僅限于以下實施例。在本發(fā)明的范圍內或者在不脫離本發(fā)明的內容、精神和范圍內，對本發(fā)明進行的變更、組合或替換，對于本領域的技術人員來說是顯而易見的，且包含在本發(fā)明的范圍之內。
實施例1、一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒
所述β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒包括體積比為4:1的試劑R1和試劑R2
所述試劑R1由以下組分及其濃度組成：磷酸二氫鉀100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷40mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚50mmol/L、單十二烷基九乙二醇醚80mmol/L、氯化鈣2mmol/L和對羥基苯甲酸酯1mmol/L，余量為水；所述試劑R1的pH值為7.5。
試劑R1制備方法為：將上述磷酸二氫鉀、十二烷基葡萄糖苷、八(乙二醇)一(十二烷基)醚、單十二烷基九乙二醇醚、氯化鈣和對羥基苯甲酸酯加入適量的水溶解，接著加水調節(jié)pH至7.5，即得。
所述試劑R2由以下組分及其濃度組成：單十二烷基九乙二醇醚80mmol/L、十二烷基葡萄糖苷40mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗體膠乳5g/L和對羥基苯甲酸酯1mmol/L，余量為水；所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為130nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的制備方法為：
用0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液在室溫下稀釋抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物，在磁力攪拌器上混勻，所述抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體與膠乳的重量比為1:2，所述磷酸鉀緩沖液的加入量為膠乳重量的1倍；接著放在37℃的恒溫條件下攪拌，所述轉速為300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液中封閉1小時，離心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液，即得。
試劑R2制備方法為：將上述單十二烷基九乙二醇醚、十二烷基葡萄糖苷、抗人β2-微球蛋白抗體膠乳和對羥基苯甲酸酯加入水中攪拌均勻，即得。
實施例2、一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒
所述β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒包括體積比為4:1的試劑R1和試劑R2，
所述試劑R1由以下組分及其濃度組成：磷酸二氫鉀120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚80mmol/L、單十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、氯化鈣3mmol/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；所述試劑R1的pH值為7.6；所述試劑R1的制備方法如實施例1。
所述試劑R2由以下組分及其濃度組成：單十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗體膠乳12g/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為142nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的制備方法為：
用0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液在室溫下稀釋抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物，在磁力攪拌器上混勻，所述抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體與膠乳的重量比為1:3，所述磷酸鉀緩沖液的加入量為膠乳重量的1倍；接著放在37℃的恒溫條件下攪拌，所述轉速為300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液中封閉1小時，離心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液，即得。
所述試劑R1的制備方法如實施例1。
實施例3、一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒
所述β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒包括體積比為4:1的試劑R1和試劑R2
所述試劑R1由以下組分及其濃度組成：磷酸二氫鉀160mmol/L、十二烷基葡萄糖苷70mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚100mmol/L、單十二烷基九乙二醇醚120mmol/L、氯化鈣4mmol/L和對羥基苯甲酸酯3mmol/L，余量為水；所述試劑R1的pH值為7.8；所述試劑R1的制備方法如實施例1。
所述試劑R2由以下組分及其濃度組成：單十二烷基九乙二醇醚120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷70mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗體膠乳20g/L和對羥基苯甲酸酯3mmol/L，余量為水；所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為150nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的制備方法為：
用0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液在室溫下稀釋抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物，在磁力攪拌器上混勻，所述抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體與膠乳的重量比為1:4，所述磷酸鉀緩沖液的加入量為膠乳重量的1倍；接著放在37℃的恒溫條件下攪拌，所述轉速為300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液中封閉1小時，離心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液，即得。
所述試劑R2的制備方法如實施例1。
對比例1、一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒
所述β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒包括體積比為4:1的試劑R1和試劑R2，
所述試劑R1由以下組分及其濃度組成：磷酸二氫鉀120mmol/L、吐溫-2050mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚80mmol/L、單十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、氯化鈣3mmol/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；所述試劑R1的pH值為7.6；所述試劑R1的制備方法如實施例1。
所述試劑R2由以下組分及其濃度組成：單十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗體膠乳12g/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為142nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的制備方法與實施例2類似。
所述試劑R2的制備方法如實施例1。
與實施例2的區(qū)別在于：將十二烷基葡萄糖苷替換為吐溫-20。
對比例2、一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒
所述β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒包括體積比為4:1的試劑R1和試劑R2，
所述試劑R1由以下組分及其濃度組成：磷酸二氫鉀120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、單十二烷基九乙二醇醚180mmol/L、氯化鈣3mmol/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；所述試劑R1的pH值為7.6；所述試劑R1的制備方法如實施例1。
所述試劑R2由以下組分及其濃度組成：單十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗體膠乳12g/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為142nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的制備方法與實施例2類似。
所述試劑R2的制備方法如實施例1。
與實施例2的區(qū)別在于：沒有添加八(乙二醇)一(十二烷基)醚，增加單十二烷基九乙二醇醚的用量。
對比例3、一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒
所述β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒包括體積比為4:1的試劑R1和試劑R2，
所述試劑R1由以下組分及其濃度組成：磷酸二氫鉀120mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、八(乙二醇)一(十二烷基)醚80mmol/L、單十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、氯化鈣3mmol/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；所述試劑R1的pH值為7.6；所述試劑R1的制備方法如實施例1。
所述試劑R2由以下組分及其濃度組成：單十二烷基九乙二醇醚100mmol/L、十二烷基葡萄糖苷50mmol/L、抗人β2-微球蛋白抗體膠乳12g/L和對羥基苯甲酸酯2mmol/L，余量為水；所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為125nm；
所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的制備方法與實施例2類似。
所述試劑R2的制備方法如實施例1。
與實施例2的區(qū)別在于：所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的直徑為125nm。
對比例4、一種β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒
所述β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒包括體積比為4:1的試劑R1和試劑R2，
所述試劑R1和試劑R2的組分和濃度如實施例2。
所述試劑R1和試劑R2的制備方法如實施例1。
所述抗人β2-微球蛋白抗體膠乳的制備方法為：
用0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液在室溫下稀釋抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物，在磁力攪拌器上混勻，所述抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體與膠乳的重量比為1:1，所述磷酸鉀緩沖液的加入量為膠乳重量的1倍；接著放在37℃的恒溫條件下攪拌，所述轉速為300rpm，加入含有甘氨酸的0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液中封閉1小時，離心,去上清，再加入0.1mol/L的磷酸鉀緩沖液，即得。
與實施例2的區(qū)別在于：所述抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體和膠乳的混合物中抗人β2-微球蛋白抗體多克隆抗體與膠乳的重量比為1:1。
試驗例一、β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒的精密度試驗
1、試驗材料：實施例2制備的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒，高、中、低三種濃度的β2-微球蛋白的血清樣本。
2、試驗方法：參考美國國家臨床實驗室標準話研究所(CLSI)EP5A2文件的方法，采用實施例2制備的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒對高(4.65mg/L)、中(2.45mg/L)、低(0.65mg/L)值三個濃度的β2-微球蛋白的血清樣本分別進行重復性測定，將高、中、低值三個濃度β2-微球蛋白的血清樣本分別分裝成20管，放置-20℃中保存，采用日本HITACH的7600全自動生化分析儀每天測一管，連續(xù)測定20天，計算各濃度的批內和批間變異系數(CV％)。
3、試驗結果：
試驗結果如表1所示。
表1血清高中低三種水平β2-微球蛋白的精密度分析
由表1可知，本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒檢測高、中、低值三個濃度的β2-微球蛋白的血清樣本的批內變異系數分別為2.35％、2.44％和3.38％，批間變異系數分別為3.70％，2.80％和3.07％，均低于5％，說明本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒具有較高的精密度。
試驗例二、β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒的靈敏度試驗
1、試驗材料：實施例2制備的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒，利德曼公司的多項高值免疫標準液。
2、試驗方法：參考日本JJCLA文件規(guī)定的檢測限判斷標準，將β2-微球蛋白標準品準確稀釋成0.1-0.5mg/L的5個低濃度樣本，各測定10次，以測定結果與基質液的不重疊的最低值為檢測限。
3、試驗結果
試驗結果如表2所示。
表2 β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒的的靈敏度試驗
注：*為吸光度值×1000
由表2可知，本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒在0.2mg/L濃度的測定結果與基質液的不重疊，因此，說明本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒的檢測限為0.2mg/L，具有檢測限度低、靈敏度高的優(yōu)點。
試驗例三、β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒的穩(wěn)定性試驗
1、試驗材料：實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒。
2、試驗方法：
將實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒在20℃分別放置6個月和12個月后，按照試驗例二的方法測定試劑盒的靈敏度，并將實施例1、實施例2、實施例3、對比例1、對比例2、對比例3和對比例4制備的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒與利德曼試劑分別檢測血清β2-微球蛋白，然后將上述結果進行回歸分析，計算R2值。
3、試驗結果：
試驗結果如表3所示。
表3 β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒的穩(wěn)定性試驗
由表3可知，本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒在20℃分別放置6個月和12個月后靈敏度和線性方程的R2值基本無變化，說明本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒具有較高的穩(wěn)定性和較好的靈敏度。
另外，本發(fā)明提供的β2-微球蛋白的快速檢測試劑盒在4℃下保存36個月后，試劑盒靈敏度及線性良好，與剛制備的試劑盒無明顯差別。