本發(fā)明涉及一種利用環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification of DNA，LAMP）技術(shù)進(jìn)行菌樣快速檢測(cè)的試劑盒，具體涉及一種抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
農(nóng)作物病害是制約農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的一個(gè)重要因素，生產(chǎn)中主要通過選育抗病品種和化學(xué)農(nóng)藥防治。但由于化學(xué)農(nóng)藥的非生物源性容易使有害生物產(chǎn)生抗性，再加上濫用化學(xué)農(nóng)藥，導(dǎo)致了化學(xué)農(nóng)藥在自然界和食物鏈中長(zhǎng)期殘留造成了環(huán)境污染、生態(tài)平衡破壞、社會(huì)公害等嚴(yán)重后果。而微生物農(nóng)藥具有對(duì)非靶標(biāo)生物安全、毒副作用小、對(duì)環(huán)境兼容性好等特點(diǎn)， 在控制植物病害方面倍受青睞?？股厥俏⑸锏奶烊淮x產(chǎn)物。溶桿菌屬細(xì)菌是一類重要的微生物資源，已成為各國(guó)開發(fā)新型抗生素的重要來源。在國(guó)外該屬細(xì)菌產(chǎn)生的抗生素在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)病害控制方面都有一定的研究。
溶桿菌（Lysobacte）革蘭氏染色陰性，桿狀，兩端鈍圓，單生，無鞭毛，滑行運(yùn)動(dòng)，好氣性，代謝為呼吸型，無芽孢，氧化酶陽(yáng)性，過氧化氫酶陽(yáng)性，G+C含量為65.4%-70.1%。在自然界，從海洋到河流、土壤中廣泛分布，為腐生性，通過降解有機(jī)物和其他微生物獲取營(yíng)養(yǎng)來生存。溶桿菌屬共有4個(gè)種，分別為產(chǎn)酶溶桿菌、抗生素溶桿菌、變棕溶桿菌和膠狀溶桿菌。溶桿菌對(duì)多種病原真菌、細(xì)菌和線蟲具有溶菌活性等典型特征?？股厝軛U菌（Lysobater antibioticus）對(duì)多種植物病原菌具有明顯抑制作用，同時(shí)在田間對(duì)多種細(xì)菌病害表現(xiàn)出良好的防病效果。通過進(jìn)一步研究，有望開發(fā)為一種能防治植物病害的新型微生物農(nóng)藥。
目前針對(duì)抗生素溶桿菌有多種檢測(cè)方法。傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)方法一般需要10天以上，周期較長(zhǎng)，并且需要使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，成本較高；免疫學(xué)檢測(cè)（Immunoassay，IA）是一種根據(jù)抗原、抗體反應(yīng)的原理，利用已知的抗原檢測(cè)未知抗體或利用已知的抗體檢測(cè)未知抗原的技術(shù)，主要包括酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）、放射免疫（RIA）、反向間接血凝法（RPHA）和反向乳膠凝集實(shí)驗(yàn)（RPLA）等，此類方法周期短，一次可檢測(cè)大量樣本，并且不需實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但其缺點(diǎn)是必須有高親和性的抗體；實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法能夠用于病原菌的檢測(cè)，但對(duì)儀器設(shè)備和人員的專業(yè)技術(shù)水平要求較高，并且操作復(fù)雜，耗時(shí)較長(zhǎng)，限制了該技術(shù)的推廣。
DNA環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種新型的恒溫核酸擴(kuò)增方法，此技術(shù)克服了以往基因擴(kuò)增方法的不足，能夠在恒溫條件下進(jìn)行核酸的擴(kuò)增，具有簡(jiǎn)單、快速、成本低和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，適于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，有較好的應(yīng)用性。目前，還沒有專門針對(duì)抗生素溶桿菌的環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法的相關(guān)記載。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是提供了一種快速靈敏準(zhǔn)確的抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的采用如下技術(shù)方案：抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，其特征在于包括：
（1）反應(yīng)液1：由10mmol/L脫氧核苷三磷酸、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂、5mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水組成；
（2）反應(yīng)液2：由10μmol/L外引物1、10μmol/L外引物2、40μmol/L內(nèi)引物1和40μmol/L內(nèi)引物2組成，引物序列如下：
外引物1：GCGAGCATGCAGCAGC，
外引物2：GGCAAGGTCGCGAGGAT，
內(nèi)引物1：CACCGGCAAGGTCGACGAGG-CGATTCCGGCCTGGGA，
內(nèi)引物2：CGCGCCATGTCTTCGTGGG-GCGCAGGTCGGGTTTCA；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）顯色劑：質(zhì)量濃度為10%的SYBR Green I熒光染料；
上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒中反應(yīng)液1折合每樣品19μL，其組成為：10mmol/L脫氧核苷三磷酸4μL、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、150mmol/L硫酸鎂1μL、5mol/L甜菜堿5μL和滅菌雙蒸水6.5μL；反應(yīng)液2折合每樣品3μL，其組成為：10μmol/L外引物1 0.5μL、10μmol/L外引物2 0.5μL、40μmol/L內(nèi)引物1 1μL和40μmol/L內(nèi)引物2 1μL。
本發(fā)明所述的抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法，其特征在于具體步驟為：
步驟（1），提取待檢樣品基因組DNA，采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA；
步驟（2），環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)，取2μL待檢樣品基因組DNA溶液，加入19μL反應(yīng)液1、3μL反應(yīng)液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶，將配制好的反應(yīng)體系在65℃擴(kuò)增反應(yīng)50-70min后取出待檢；
步驟（3），分析判斷反應(yīng)結(jié)果，在反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，混勻，靜置2min，若反應(yīng)液顯現(xiàn)綠色即為陽(yáng)性，橙色則為陰性。
本發(fā)明根據(jù)抗生素溶桿菌的吩嗪合成基因phz F設(shè)計(jì)了四條特異性引物，該基因序列為抗生素溶桿菌所共有，以保證檢測(cè)不同來源的抗生素溶桿菌的可靠性。本發(fā)明采用LAMP技術(shù)，針對(duì)抗生素溶桿菌建立了快速靈敏準(zhǔn)確的檢測(cè)方法，并構(gòu)建用于該方法的快速檢測(cè)試劑盒。使用本發(fā)明的快速檢測(cè)試劑盒和檢測(cè)方法，在反應(yīng)后可通過肉眼觀察鑒定，無需電泳等其它任何分析設(shè)備，具有檢測(cè)時(shí)間短、特異性強(qiáng)、儀器設(shè)備要求低和操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，可用于抗生素溶桿菌的快速檢測(cè)。
附圖說明
圖1是不同菌株的陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果對(duì)比圖，其中1號(hào)反應(yīng)管內(nèi)樣品為綠色，2-7號(hào)反應(yīng)管內(nèi)樣品為橙色。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明中試劑盒及檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用作進(jìn)一步說明，但并不以任何形式限制本發(fā)明的內(nèi)容。
實(shí)施例1
抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法的建立
步驟（1），引物的設(shè)計(jì)、合成試劑盒的組裝
本實(shí)施例確定用于檢測(cè)的引物序列如下：
外引物1：GCGAGCATGCAGCAGC，
外引物2：GGCAAGGTCGCGAGGAT，
內(nèi)引物1：CACCGGCAAGGTCGACGAGG-CGATTCCGGCCTGGGA，
內(nèi)引物2：CGCGCCATGTCTTCGTGGG-GCGCAGGTCGGGTTTCA；
在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)用于抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括以下試劑：
（1）反應(yīng)液1：由10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂（MgSO4）、5 mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水（ddH2O）組成；
（2）反應(yīng)液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）組成；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）顯色劑：質(zhì)量濃度為10%的SYBR Green I熒光染料；
上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒中反應(yīng)液1折合每樣品19μL，其組成為：10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、150mmol/L硫酸鎂（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜堿5μL和滅菌雙蒸水（ddH2O）6.5μL；反應(yīng)液2折合每樣品3μL，其組成為：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）1μL和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）1μL。
步驟（2），待檢樣品的制備
采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA
檢測(cè)菌種抗生素溶桿菌（Lysobater antibioticus）來源于北納生物，編號(hào)BNCC222260。使用北京天根生物工程公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取樣品基因組DNA。
步驟（3），進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)
（1）取2μL待檢樣品基因組DNA溶液，加入19μL反應(yīng)液1、3μL反應(yīng)液2和1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶；
（2）將配制好的反應(yīng)體系在65℃擴(kuò)增反應(yīng)50min后取出待檢。
步驟（4），分析判斷反應(yīng)結(jié)果
在反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，混勻，靜置2min，肉眼觀察顏色變化，反應(yīng)液顏色變?yōu)榫G色，說明待檢菌株為抗生素溶桿菌。
實(shí)施例2
陰性對(duì)照
步驟（1），引物的設(shè)計(jì)、合成試劑盒的組裝
本實(shí)施例確定用于檢測(cè)的引物序列同實(shí)施例1。
在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)用于抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括以下試劑：
（1）反應(yīng)液1：由10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液、150mmol/L硫酸鎂（MgSO4）、5mol/L甜菜堿和滅菌雙蒸水（ddH2O）組成；
（2）反應(yīng)液2：由10μmol/L外引物1（F3）、10μmol/L外引物2（B3）、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）組成；
（3）8U/μL Bst DNA聚合酶；
（4）顯色劑：質(zhì)量濃度為10%的SYBR Green I熒光染料；
上述環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒中反應(yīng)液1折合每樣品19μL，其組成為：10mmol/L脫氧核苷三磷酸（dNTP）4μL、10×ThermoPol Buffer反應(yīng)緩沖液2.5μL、150mmol/L硫酸鎂（MgSO4）1μL、5mol/L甜菜堿5μL和滅菌雙蒸水（ddH2O）6.5μL；反應(yīng)液2折合每樣品3μL，其組成為：10μmol/L外引物1（F3）0.5μL、10μmol/L外引物2（B3）0.5μL、40μmol/L內(nèi)引物1（FIP）1μL和40μmol/L內(nèi)引物2（BIP）1μL。
步驟（2），待檢樣品的制備
采用試劑盒提取法制備待檢樣品基因組DNA
使用北京天根生物工程公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組提取試劑盒提取產(chǎn)酶溶桿菌、變棕溶桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌等6種細(xì)菌的基因組DNA。
步驟（3），進(jìn)行環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)
（1）取2μL待檢樣品基因組DNA溶液，加入19μL反應(yīng)液1、3μL反應(yīng)液2、1μL 8U/μL Bst DNA聚合酶；
（2）將配制好的反應(yīng)體系在65℃擴(kuò)增反應(yīng)50min后取出待檢。
步驟（4），分析判斷反應(yīng)結(jié)果
在反應(yīng)產(chǎn)物中加入1μL顯色劑，混勻，靜置2min，肉眼觀察顏色變化，若反應(yīng)液顯現(xiàn)綠色即為陽(yáng)性，橙色則為陰性。
如圖1所示，編號(hào)為1-7的反應(yīng)管分別對(duì)應(yīng)抗生素溶桿菌、產(chǎn)酶溶桿菌、變棕溶桿菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎克雷伯菌。
實(shí)施例1與實(shí)施例2中各陰性對(duì)照組比較，實(shí)施例1中產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，如圖1中1號(hào)反應(yīng)管，而不攜帶phz F基因的實(shí)施例2陰性對(duì)照菌株沒有產(chǎn)生陽(yáng)性擴(kuò)增結(jié)果，如圖1中2-7號(hào)反應(yīng)管，從而證明本試劑盒及檢測(cè)方法具有較強(qiáng)的特異性，對(duì)不攜帶phz F基因的其它菌株不會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。
以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理，主要特征和優(yōu)點(diǎn)，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍。
SEQUENCE LISTING
<110> 河南師范大學(xué)
<120> 抗生素溶桿菌環(huán)介導(dǎo)恒溫基因擴(kuò)增快速檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gcgagcatgc agcagc 16
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ggcaaggtcg cgaggat 17
<210> 3
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caccggcaag gtcgacgagg cgattccggc ctggga 36
<210> 4
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgcgccatgt cttcgtgggg cgcaggtcgg gtttca 36