本發(fā)明涉及食品檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種快速檢測左旋肉堿的方法及其試劑盒。
背景技術(shù)：
：左旋肉堿又稱L-肉堿，是一種促使脂肪轉(zhuǎn)化為能量的內(nèi)氨基酸，紅色肉類是左旋肉堿的主要來源，對人體無毒副作用，左旋肉堿也是條件性嬰兒必需的營養(yǎng)物質(zhì)，在嬰兒利用脂肪作為能量來源的代謝中起重要作用。左旋肉堿在嬰幼兒食品、飲料、餅干以及一些減肥產(chǎn)品中普遍存在。目前文獻報道中測定左旋肉堿的方法有高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法和質(zhì)譜分析法等，但分光光度法仍是最主要的檢測方法。分光光度法檢測左旋肉堿大多需要先發(fā)生一步化學(xué)反應(yīng)，例如樣品中游離的左旋肉堿在乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶的催化作用下與乙酰輔酶A反應(yīng)，生成游離的輔酶A，輔酶A被進一步氧化后產(chǎn)生有色物質(zhì)或具有紫外吸收的物質(zhì)，顏色深淺與左旋肉堿的含量成正比，進而間接檢測游離的左旋肉堿的含量。國標(biāo)GB29989中對嬰幼兒食品和乳品中左旋肉堿的檢測原理和方法做了明確規(guī)定，主要采用比色法，測試樣經(jīng)過水提取，用高氯酸沉淀蛋白質(zhì)后過濾，濾液經(jīng)堿皂化后，結(jié)合態(tài)的左旋肉堿游離出來，左旋肉堿與乙酰輔酶A在乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶的催化下反應(yīng)生成乙酰肉堿和游離的輔酶A。游離的輔酶A和2-硝基苯甲酸反應(yīng)生成黃色物質(zhì)，其顏色深淺與游離的輔酶A含量成正比。因游離的輔酶A與左旋肉堿是等摩爾反應(yīng)關(guān)系，可間接求出試樣中左旋肉堿含量。目前國標(biāo)法檢測左旋肉堿含量，采用紫外分光光度計，主要有以下幾個方面的缺點：(1)乙酰輔酶A和肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶費用昂貴，檢測成本很大；(2)所耗費的體積較大，采用傳統(tǒng)比色皿進行測試，需要2-3mL體積的用量，在比色階段比較耗時；(3)所用到的酶以水溶液形式保存，其有效期有限，酶活力會受到很大程度影響，嚴(yán)重影響實驗的穩(wěn)定性；(4)樣品處理需要稱量5g，后期樣品處理消耗試劑量大，在對某些基質(zhì)處理上不能透明，影響后續(xù)的檢測效果。發(fā)明專利申請(CN106198531A)：檢測左旋肉堿含量的方法：將待測樣品與顯色液和乙酰輔酶A進行第一接觸和第一酶標(biāo)檢測；將第一接觸后樣品與肉堿乙酰轉(zhuǎn)移酶進行第二接觸和第二酶標(biāo)檢測；以及基于第二酶標(biāo)檢測與第一酶標(biāo)檢測的差值，確定待測樣品中左旋肉堿的含量。國標(biāo)GB29989中，樣品處理方法復(fù)雜、耗時長，并且試劑用量大，檢測過程繁瑣，重復(fù)性差；而現(xiàn)有的左旋肉堿檢測試劑盒試劑配制和保存繁瑣，反應(yīng)體系復(fù)雜。發(fā)明專利申請CN106198531A實際上就是GB29989檢測體系的縮小版，改變試劑的用量實現(xiàn)在酶標(biāo)板上的檢測，在技術(shù)上沒實質(zhì)創(chuàng)新，仍不能解決酶的保存有效期和實驗穩(wěn)定性問題。BioVision及Sigma等公司已有針對左旋肉堿的檢測試劑盒，其原理是將一個乙?；鶊F從乙酰輔酶A轉(zhuǎn)運到肉堿上，生成的游離輔酶A隨后參與到Oxi-Red探針的氧化過程，使其發(fā)出熒光，并用酶標(biāo)儀讀取在570nm處的吸收峰，目前市場上存在的試劑盒大多基于該原理。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有方法的不足，可以快速高效地檢測試樣中的左旋肉堿含量，本發(fā)明提供快速檢測左旋肉堿的方法及試劑盒，不僅能大大縮短試樣中左旋肉堿的提取時間，避免了復(fù)雜的反應(yīng)體系，減少在微孔板中的加樣步驟，而且使用酶標(biāo)儀可以快速批量地檢測試樣中左旋肉堿的含量。首先，本發(fā)明提供一種快速檢測左旋肉堿的方法，包括：一種快速高效檢測左旋肉堿含量的方法，其特征在于，包括：(1)、準(zhǔn)備包含凍干乙酰輔酶A和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶的微孔板A、包含沉淀劑包被的微孔板B；(2)、在微孔板A上設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、質(zhì)控孔、樣品孔，先將顯色溶液加入各個孔，再將標(biāo)準(zhǔn)品、質(zhì)控、及待測樣品分別加入到相應(yīng)的微孔中反應(yīng)，進行酶顯色檢測，獲得其光吸收值(OD)；(3)、參照步驟(2)在微孔板B同樣操作，反應(yīng)后進行酶顯色檢測，獲得其光吸收值(OD空白)；(4)、基于兩次酶顯色的光吸收值的差值(OD-OD空白)，通過構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線來確定待測樣品中左旋肉堿的含量。優(yōu)選地，步驟(1)中微孔板A還包括沉淀劑，微孔板A的制備過程如下：(a)乙酰輔酶A溶液的制備稱取20.0mg乙酰輔酶A溶于2.0mL水中，取400μL-600μL與5-50μL甘油和25-100mgD-海藻糖混勻；(b)乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液的制備吸取100μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液，經(jīng)1500r/min離心10min，棄去上層清液，沉淀用2mL水溶解，取400μL-800μL與5-50μL甘油和25-100mgD-海藻糖混勻；(c)凍干處理在微孔板的微孔中加入5-10μL乙酰輔酶A溶液和5-10μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液，并將該含乙酰輔酶A和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶的微孔板放入-80℃下預(yù)凍30-60min，之后于凍干機中-70～-80℃下凍干6～8h，使乙酰輔酶A和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶得以固定并干燥于微孔中，將凍干后獲得微孔板A，將其置于低溫干燥條件下保存?zhèn)溆?。?yōu)選地，所述步驟(2)中顯示液采用5x濃縮顯色溶液，其配置方法如下：分別稱取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二鈉溶于30mL去離子水中，用10mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL，5倍稀釋使用。優(yōu)選地，待測樣品制備方法如下：準(zhǔn)確稱取1.0g混合均勻的試樣于燒杯中，用5-10mL水在35-45℃溶解，加入2mL13％高氯酸溶液，混合均勻后放置5-10min，使試樣中的蛋白質(zhì)變性沉淀，用蒸餾水定容至20mL，混勻，離心。取濾液0.8mL，加入0.08mL4mol/L氫氧化鉀溶液置于35—45℃水浴震蕩10-15min，使結(jié)合態(tài)的左旋肉堿游離出來。冷卻后用13％高氯酸調(diào)節(jié)pH為6.0～8.0，加入15-30μL氯化鈣，加水至2mL，混勻后4000-15000rpm離心，取上清液檢測。最后上清液一定要保證澄清。按該過程，樣品稀釋倍數(shù)為50倍。優(yōu)選地，待測樣品制備方法如下：稱取5.0g試樣于三角瓶中，加入20-40mL0.1mol/LHCl，超聲提取15-30min，用4％NaOH將pH值調(diào)至7.0～7.5，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中定容后混勻，用濾紙過濾或離心后取濾液檢測。優(yōu)選地，待測樣品制備方法如下：取試樣5.0g，用溫水溶解樣品并轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中后加入5-15mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6％的亞鐵氰化鉀、5—15mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.2％的硫酸鋅以及15-30mL100mMNaOH溶液，每次加入都要混勻。定容，混合，過濾，取濾液檢測。優(yōu)選地，步驟(2)中，設(shè)置7個標(biāo)準(zhǔn)孔，左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品配制濃度分別為：0、1.6、3.2、6.4、9.6、16、22.4μg/mL。優(yōu)選地，步驟(2)、(3)中的酶顯色檢測均采用酶標(biāo)儀在波長410-420nm測試吸光度，以二者的吸光度差作縱坐標(biāo)，濃度值為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品濃度，所得濃度乘以稀釋倍數(shù)為待測樣品中最終所含左旋肉堿濃度。本發(fā)明的有益效果如下：通過96孔板反應(yīng)，減少反應(yīng)體積和試劑的使用量，進而節(jié)約了成本；通過直接將乙酰輔酶A和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶凍干固定于微孔板上，與其他檢測試劑盒相比，減少了檢測過程中試劑的配制并且減少了加樣步驟，使操作更為簡便，方法檢出限達1mg/100g；通過酶標(biāo)儀讀數(shù)，可以實現(xiàn)批量檢測，使檢測過程更加高效，大大降低了時間成本并且具有高重現(xiàn)性；改良了試樣的處理方法，使操作更為簡便，且操作時間大為縮短。附圖說明圖1為本發(fā)明實施例檢待測樣品左旋肉堿濃度與吸光度的工作曲線。具體實施方式以下結(jié)合附圖和具體實施例，對發(fā)明進行詳細(xì)說明。本發(fā)明實施例中試劑盒組成包括96孔微孔板A、96孔微孔板B、5x濃縮顯色溶液、左旋肉堿對照品。其中，微孔板A包含乙酰輔酶A和左旋肉堿轉(zhuǎn)移酶及沉淀劑；微孔板B為沉淀劑包被。本發(fā)明中，微孔板A板的制備包括以下步驟：(1)乙酰輔酶A溶液的配制稱取20.0mg乙酰輔酶A溶于2.0mL水中。臨用時取490μL乙酰輔酶A溶液與7.6μL甘油和30mgD-海藻糖混勻。(2)乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液的配制：吸取100μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶懸浮液，經(jīng)1500r/min離心10min，棄去上層清液，沉淀用2mL水溶解。臨用時取490μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液與7.6μL甘油和30mgD-海藻糖混勻。(c)凍干處理在96孔微孔板的微孔中加入7.5μL乙酰輔酶A溶液和7.5μL乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶溶液，并將該含乙酰輔酶A和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶的微孔板放入-80℃下預(yù)凍40min，之后于凍干機中-80℃下凍干7h，使乙酰輔酶A和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶得以固定并干燥于微孔中，將凍干后獲得微孔板A，將其置于低溫干燥條件下保存?zhèn)溆谩１景l(fā)明中，5x濃縮顯色溶液配制方法如下：分別稱取50mg2-硝基苯甲酸、5.96gN-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸、185mg乙二胺四乙酸二鈉溶于30mL去離子水中，用10mol/LNaOH溶液調(diào)pH至7.4～7.6，然后用水定容至50mL。使用時5倍稀釋使用，例如吸取0.5mL濃縮液用水定容至2.5mL。本發(fā)明中，試樣的處理方法有三種，可任選一種：(1)方法一：準(zhǔn)確稱取1.0g(精確0.001g)混合均勻的試樣(如：奶粉、鮮奶、血清、細(xì)胞、組織、飼料、谷物等)于燒杯中，用6mL溫水(40℃)溶解。加入2mL13％高氯酸溶液，混合均勻后放置6min,用蒸餾水定容至20mL(約5.75mL)，混勻，離心。取0.8mL濾液，加入0.08mL4mol/L氫氧化鉀溶液置于40℃水浴震蕩15min。冷卻后用13％高氯酸(約75μL-85μL，以pH測試為準(zhǔn))調(diào)pH為7.0～7.2(檢測過程中6.0～8.0即可)，加入20μL氯化鈣，加水到2mL(約1.045mL)，混勻后7000-10000rpm離心，取上清液檢測。最后上清液一定要保證澄清。按該過程，樣品稀釋倍數(shù)為50倍。(2)方法二：稱取5.0g試樣于三角瓶中，加入30mL0.1mol/LHCl，超聲提取20min，用4％NaOH將pH值調(diào)至7.0～7.5，轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中定容后混勻，用濾紙過濾(或離心)后取濾液檢測。(3)方法三：取試樣5.0g(精確至0.1mg)，用溫水溶解樣品并轉(zhuǎn)入50mL容量瓶中后加入10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.6％的亞鐵氰化鉀、10mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7.2％的硫酸鋅以及20mL100mMNaOH溶液，每次加入都要混勻。定容，混合，過濾，取濾液檢測。在做好以上的準(zhǔn)備后，本發(fā)明的檢測方法如下：(1)、本發(fā)明左旋肉堿標(biāo)準(zhǔn)品濃度為320μg/mL，將其分別配制成0、1.6、3.2、6.4、9.6、16、22.4μg/mL。(2)、取微孔板A，設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔7個(0、1.6、3.2、6.4、9.6、16、22.4μg/ml)、質(zhì)控孔一個(75μL顯色液，不加樣品與標(biāo)準(zhǔn)品)、樣品孔；加入75μL顯色液到各個孔，輕輕混勻，使孔內(nèi)粉末充分溶解；取150μL標(biāo)品、質(zhì)控(已知含定量左旋肉堿的樣品)及樣品分別加入到相應(yīng)的微孔中；反應(yīng)10—20min，提前打開酶標(biāo)儀，立刻用酶標(biāo)儀410-420nm測試吸光度(OD)。(3)、取微孔板B為對照實驗組，按與(2)中相同的順序加樣，反應(yīng)10-20min，提前打開酶標(biāo)儀，立刻用酶標(biāo)儀410-420nm測試吸光度(OD空白)。14)用吸光度差(OD-OD空白)作縱坐標(biāo)，濃度值為橫坐標(biāo)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中讀出樣品濃度，所得濃度乘以稀釋倍數(shù)為樣品中最終所含左旋肉堿濃度。表1微孔板A/微孔板B的設(shè)置010203040506…ASTD1STD1T1T1T9T9…BSTD2STD2T2T2T10T10…CSTD3STD3T3T3T11T11…DSTD4STD4T4T4T12T12…ESTD5STD5T5T5T13T13…FSTD6STD6T6T6T14T14…GSTD7STD7T7T7T15T15…H質(zhì)控質(zhì)控T8T8T16T16…表1所示為本發(fā)明中微孔板A/微孔板B的設(shè)置，其中微孔板A為實驗板條，微孔板B為對照實驗組，加樣完全相同；質(zhì)控為已知左旋肉堿的樣品。圖1為本發(fā)明實施例檢測獲得的待測樣品左旋肉堿濃度與吸光度的工作曲線。測試結(jié)果見表2，從表2的結(jié)果得知，使用本發(fā)明提供的測試方法，與國標(biāo)方法檢測結(jié)果非常接近，證明本發(fā)明直接將乙酰輔酶A和乙酰肉堿轉(zhuǎn)移酶凍干固定于微孔板上的測試方法切實可行。表2測試結(jié)果以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實施方式，但本發(fā)明的保護范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁1 2 3