本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，涉及醫(yī)學(xué)和生物技術(shù)，具體涉及循環(huán)腫瘤細胞快速檢測試劑盒及其制備和應(yīng)用方法。
背景技術(shù)：
生活環(huán)境的惡化，不良生活習(xí)慣和遺傳因素使人類患癌癥的幾率越來越高，癌癥已成為人類健康“第一殺手”，是全球關(guān)注的焦點。然而隨著醫(yī)學(xué)的不斷進步，癌癥已經(jīng)不是人們眼中的絕癥，大部分癌癥如能早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、正確治療是可以治愈的，即使癌癥中晚期患者經(jīng)過治療也可減輕痛苦、延長生命。近年來，盡管隨著早期診斷和預(yù)防、手術(shù)治療、化療、放療等治療方式的出現(xiàn)，癌癥的生存率已經(jīng)有了很大的改善，但是目前這些療法對于解救全球上千萬的癌癥患者還是遠遠不夠的。
循環(huán)腫瘤細胞(Circulating tumour cells，CTCs)指自發(fā)或因診療操作由實體瘤或轉(zhuǎn)移灶釋放進入外周血循環(huán)的腫瘤細胞。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，CTC快速檢測技術(shù)在癌癥治療緊迫的形式下應(yīng)運而生，該技術(shù)是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ哪[瘤無創(chuàng)診斷和實時療效監(jiān)測手段。外周血中的CTC數(shù)量極少，因此如何從幾百萬白細胞及幾十億紅細胞中快速、特異性的、不遺漏的分選富集出CTC成為制約其為臨床腫瘤早期診斷的主要問題。
隨著CTC臨床應(yīng)用價值凸顯，許多研發(fā)團隊都在推出不同的CTC檢測技術(shù)。目前CTC捕獲原理通常是基于CTC表面標(biāo)志物和細胞尺寸。基于CTC表面標(biāo)志物原理捕獲CTC的技術(shù)有：Cell Search系統(tǒng)、MACS(通過免疫磁珠標(biāo)記的捕獲)、CTC-chip(CTC-芯片)、iFISH-CTC(免疫熒光染色結(jié)合FISH技術(shù))等，這些技術(shù)的存在最大的缺點是：容易產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果，操作復(fù)雜，成本高，普及難度大?；诩毎叽绱笮≡聿东@CTC的技術(shù)有Screen Cell等，該技術(shù)原理最大的缺點是：體積較小，形態(tài)變化好的CTC容易漏檢，染色過程復(fù)雜，易丟失CTC。此外，國內(nèi)外許多研究團隊還推出了CTC表面標(biāo)志物和細胞尺寸原理相結(jié)合的技術(shù)方案，如免疫磁珠陰性富集結(jié)合過濾法，這種技術(shù)方案較好的集合了兩種原理的優(yōu)勢，CTC純度較高、CTC團塊富集效果好、便于后續(xù)分析、適合所有類型腫瘤，但該技術(shù)也存在著較大的局限性，如：體積較小，形態(tài)變化好的CTC容易漏檢；表達白細胞表面標(biāo)志物的CTC漏檢(如：CTC相關(guān)性巨噬細胞，具有白細胞特性的CTC)；樣品處理時間長，費用高。因此，如今迫切需要建立 一種快速、準(zhǔn)確、價格適中的CTC檢測和分離技術(shù)，作為癌癥常規(guī)篩查手段。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有循環(huán)腫瘤細胞富集和檢測技術(shù)存在的上述不足，提供一種操作簡單、處理時間短、結(jié)果可靠、價格適中的循環(huán)腫瘤細胞快速檢測試劑盒及其制備和應(yīng)用方法。
本發(fā)明技術(shù)方案
一種循環(huán)腫瘤細胞快速檢測試劑盒，包括循環(huán)腫瘤細胞吸附劑、細胞核特異性探針、腫瘤細胞熒光納米探針、白細胞熒光納米探針、微孔濾膜、PBS緩沖液、裂解液、固定液、封閉液、空采血管、過濾裝置和染色池。
所述的特異性循環(huán)腫瘤細胞吸附劑；是載體通過偶聯(lián)劑與循環(huán)腫瘤細胞表面特異性單克隆抗體形成的載體-抗體復(fù)合物。所述的載體材料為聚乙烯醇、聚苯乙烯或聚丙烯酸酯類，形狀為球狀，粒徑為10-100μm，表面引入活性基團，所述活性基團包括氨基、羥基、羧基或醛基，具有良好的親水性和血液相容性。所述的偶聯(lián)劑為生物交聯(lián)劑或化學(xué)交聯(lián)劑，生物交聯(lián)劑具體為DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)或DPS(3,3’—二硫代二丙酸二(N-羥基丁二酰亞胺酯)，化學(xué)偶聯(lián)劑選自戊二醛或乙酸酐。所述的循環(huán)腫瘤細胞表面特異性單克隆抗體具體是EpCAM或EGFR單克隆抗體。
所述的細胞核特異性探針具體是DAPI(4',6-二脒基-2-苯基吲哚)或Hoechst 33258。
所述的腫瘤細胞熒光納米探針是由CK8/CK18/CK19、PanCK、Vimentin或plastin-3腫瘤細胞特異性抗體與熒光納米量子點通過偶聯(lián)劑偶聯(lián)制得。
所述的白細胞熒光納米探針是由CD45、CD15或CD33白細胞特異性抗體與熒光納米量子點通過偶聯(lián)劑偶聯(lián)制得。
進一步地，所述的熒光納米量子點材料是非金屬量子點熒光材料、或金屬量子點熒光材料、或貴金屬量子點熒光材料，熒光量子點粒徑為0.1-2.0μm，激發(fā)光波長為200-700nm，熒光發(fā)光色為藍色、綠色、橙色或者紅色，且表面帶有豐富的羧基、羥基或醛基活性基團，水溶性強。所述的偶聯(lián)劑具體是EDC(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)和NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)，可與帶有氨基的分子偶聯(lián)。
進一步地，所述的細胞核特異性探針、腫瘤細胞熒光納米探針、白細胞熒光納米探針三者熒光發(fā)光色不同；
所述的微孔濾膜材料為聚碳酸酯或纖維素，孔徑為5-10μm，有很好的強度和可操作 性。
所述的(紅細胞)裂解液主要成分為NH4Cl，在裂解紅細胞的同時幾乎不損傷有核細胞。如下述配方的裂解液：8.29-13g/L NH4CL、1-1.5g/L KHCO3和0.37-0.5g/L Na2EDTA。
所述的固定液為包含以下濃度組分的溶液：2wt％-4wt％多聚甲醛、0.5wt％-1wt％triton x-100。
所述的封閉液為5wt％BSA的PBS溶液。
本發(fā)明同時提供了一種上述試劑盒的制備方法，其步驟為：
①循環(huán)腫瘤細胞吸附劑制備
a、取粒徑為10-100μm，材料為聚乙烯醇、聚苯乙烯或聚丙烯酸酯類的載體微球5ml，加入10ml 10mol/L的NaOH，60ml環(huán)氧氯丙烷，于50℃水浴震蕩活化1-2小時，用蒸餾水洗滌3次，每次1min，加入8ml 3mol/L的NaOH，30ml的1，6-己二胺，于60℃水浴震蕩反應(yīng)12h，用蒸餾水洗滌3次，每次3min，備用。
b、取上述處理后的微球，加入20ml PBS(磷酸緩沖液，PH 7.2)，溶脹微球，加入過量預(yù)先配制好的DCC、DPS、戊二醛或乙酸酐溶液，攪拌混勻，室溫反應(yīng)1h，吸棄反應(yīng)液，PBS洗滌3次，每次5min，備用。
c、取上述b步處理后的微球，加入預(yù)先配制好的15μg/ml的EpCAM或EGFR抗體溶液2-5ml，攪拌混勻，于37℃反應(yīng)3h，即得到吸附劑溶液，4℃保存。
②腫瘤細胞熒光納米探針制備
a、取粒徑為0.1-2μm的熒光量子點1mg溶于0.5ml PBS，制成熒光量子點溶液；
b、稱取5mg EDC和5mg NHS，分別加入5ml PBS溶解，配制成濃度為1mg/ml的EDC溶液和濃度為1mg/ml的NHS溶液，取300μl EDC溶液加入上述熒光量子點溶液，于4℃震蕩反應(yīng)15min，再加入300μl NHS溶液，混勻反應(yīng)30min，用PBS快速洗滌兩次，備用。
c、將5-10μg的CK8/CK18/CK19、PanCK、Vimentin或plastin-3抗體加入到上述熒光量子點中，室溫下震蕩反應(yīng)4h；用PBS洗滌3次，去除未反應(yīng)的抗體，最后分散于100μL PBS(含有0.05％NaN3和1％BSA)中，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
③白細胞熒光納米探針制備
a、取粒徑為0.1-2μm的熒光量子點1mg溶于0.5ml PBS，制成熒光量子點溶液；
b、稱取5mg EDC和5mg NHS，分別加入5ml PBS溶解，配制成濃度為1mg/ml的EDC溶液和濃度為1mg/ml的NHS溶液，取300μl EDC溶液加入上述熒光量子點溶液，于4℃震蕩反應(yīng)15min， 再加入300μl NHS溶液，混勻反應(yīng)30min，用PBS快速洗滌兩次，備用。
c、將5-10μg的CD45、CD15或CD33抗體加入到上述熒光量子點中，室溫下震蕩反應(yīng)4h；用PBS洗滌3次，去除未反應(yīng)的抗體，最后分散于100μL PBS(含有0.05％NaN3和1％BSA)中，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
本發(fā)明同時還提供了一種上述試劑盒的應(yīng)用方法。
本試劑盒適用于人或動物的外周循環(huán)血，胸/腹腔積液，腦脊液，乳頭抽吸液，羊水，或培養(yǎng)的腫瘤細胞懸浮液中腫瘤細胞的檢測，其中外周循環(huán)血樣品需紅細胞裂解過程，其它類型樣品無需紅細胞裂解過程。
其步驟為：
a、紅細胞裂解：取7.5ml血液樣品，加入30ml緩沖液，800rpm離心5分鐘，棄去上清液，按1:5-10的比例向細胞沉淀中加入4℃預(yù)冷的裂解液，輕輕吹打混勻，4℃裂解5min；800rpm離心5分鐘，棄去上層紅色清液，沉淀部分加入5ml緩沖液重懸細胞，800rpm離心5分鐘，去上清，加入7.5ml緩沖液重懸細胞。
b、腫瘤細胞吸附：上述重懸液中加入5-10μl吸附液，37℃孵育45min。
c、過濾：將上述孵育后的混懸液加入過濾裝置中，抽濾處理使液體緩慢通過濾器和濾膜，加入5ml緩沖液沖洗上樣管管壁和濾膜。
d、濾膜染色：取出微孔濾膜放入染色池，加入3ml固定液，37℃固定5min，棄去固定液，加入5ml封閉液，4℃封閉45min，棄去封閉液，用5ml緩沖液輕柔漂洗濾膜2次，每次1min，依次加入2μl細胞核特異性探針，2μl白細胞熒光納米探針，2μl腫瘤細胞熒光納米探針，37℃孵育45min，棄去上清，加入5ml緩沖液輕柔漂洗2次，除去附著于濾膜上的染色劑。
e、腫瘤細胞鑒定和計數(shù)：將濾膜從染色池取出，固定于載玻片上，在熒光顯微鏡下觀察，按照判定標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤細胞進行鑒定和計數(shù)。
腫瘤細胞和白細胞的判定標(biāo)準(zhǔn)為：
腫瘤細胞：同時出現(xiàn)細胞核特異性探針發(fā)光色和腫瘤細胞熒光納米探針發(fā)光色；
白細胞：同時出現(xiàn)細胞核特異性探針發(fā)光色和白細胞熒光納米探針發(fā)光色。
本試劑盒的主要優(yōu)點和積極效果
1)本試劑盒引入循環(huán)腫瘤細胞的吸附劑，使腫瘤細胞與吸附劑形成復(fù)合體，增加腫瘤細胞的體積，同時也可降低細胞形態(tài)學(xué)的可塑性，使之利于被濾膜捕獲，極大地降低 了體積小的腫瘤細胞漏檢率；
2)本試劑盒聯(lián)合免疫捕獲和膜過濾的方法分離循環(huán)腫瘤細胞，極大地避免了最具轉(zhuǎn)移潛力的腫瘤細胞癌栓、上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程中腫瘤細胞的漏檢；
3)本試劑盒采用納米熒光量子顆粒技術(shù)，減少了后續(xù)染色步驟，巧妙地避免了染色過程中腫瘤細胞的丟失和深背景顏色對操作人判定結(jié)果的影響；
4)本試劑盒無需要購置專用設(shè)備，操作簡單，生產(chǎn)成本低，適用于多種類型癌細胞富集和檢測，易于推廣。
具體實施方式
以下實施例進一步說明本發(fā)明，但不作為對本發(fā)明的限制。
實施例1
本發(fā)明試劑盒的制備，試劑盒包含以下組分：循環(huán)腫瘤細胞吸附劑、細胞核特異性探針、腫瘤細胞熒光納米探針、白細胞熒光納米探針、微孔濾膜、緩沖液、裂解液、固定液、封閉液、空采血管、過濾裝置和染色池，如表1所示。
表1 循環(huán)腫瘤細胞快速檢測試劑盒主要組分
循環(huán)腫瘤細胞吸附劑的制備
a、取粒徑為10μm的聚苯乙烯微球5ml，加入10ml 10mol/L的NaOH，60ml環(huán)氧氯丙烷，于50℃水浴震蕩活化1h，用蒸餾水洗滌3次，每次1min，加入8ml 3mol/L的NaOH，30ml的1，6-己二胺，于60℃水浴震蕩反應(yīng)12h，用蒸餾水洗滌3次，每次3min，備用。
b、取上述處理后的微球，加入20ml PBS(磷酸緩沖液，PH 7.2)，溶脹微球，加入1ml預(yù)先配制好的2.0mg/ml濃度的DCC，室溫反應(yīng)1h，吸棄反應(yīng)液，PBS洗滌3次，每次5min，備用。
c、取上述微球，加入2ml預(yù)先配制好的15μg/ml的EpCAM抗體溶液，攪拌混勻，于37℃反應(yīng)3h，即得到吸附劑溶液，4℃保存。
腫瘤細胞熒光納米探針的制備
a、取粒徑為1.0μm發(fā)光色為紅色的熒光量子點1mg溶于0.5ml PBS，制成熒光量子點溶液。
b、稱取5mg EDC和5mg NHS，分別加入5ml PBS溶解，配制成濃度為1mg/ml的EDC溶液和濃度為1mg/ml的NHS溶液，取300μl EDC溶液加入上述熒光量子點溶液，于4℃震蕩反應(yīng)15min，再加入300μlNHS溶液，混勻反應(yīng)30min，用PBS快速洗滌兩次，備用。
c、將5μg PanCK抗體加入到上述熒光量子點中，室溫下震蕩反應(yīng)4h；用PBS洗滌3次，去除未反應(yīng)的抗體，最后分散于100μL PBS(含有0.05％NaN3和1％BSA)中，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
白細胞熒光納米探針的制備
a、取粒徑為0.1μm發(fā)光色為綠色的熒光量子點1mg溶于0.5ml PBS，制成熒光量子點溶液。
b、稱取5mg EDC和5mg NHS，分別加入5ml PBS溶解，配制成濃度為1mg/ml的EDC溶液和濃度為1mg/ml的NHS溶液，取300μl EDC溶液加入上述熒光量子點溶液，于4℃震蕩反應(yīng)15min，再加入300μlNHS溶液，混勻反應(yīng)30min，用PBS快速洗滌兩次，備用。
c、將5μg CD45抗體加入到上述熒光量子點中，室溫下震蕩反應(yīng)4h；用PBS洗滌3次，去除未反應(yīng)的抗體，最后分散于100μL PBS(含有0.05％NaN3和1％BSA)中，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
細胞核特異性探針的制備
5mg DAPI固體粉末溶于10ml PBS，4℃保存，用時稀釋100倍。
緩沖液的制備
NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO40.24g，Na2HPO4·2H2O 1.56g，溶于800ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1000ml，高壓滅菌，4℃保存。
裂解液的制備
NH4CL 10.0g，KHCO31.2g，Na2EDTA0.45g，溶于800ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢?，蒸餾水定容至1000ml，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
固定液的制備
2.0g多聚甲醛，1.0ml triton x-100，溶于80ml PBS中，充分?jǐn)嚢?，PBS定容至100ml，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
封閉液的制備
5g BSA，溶液80ml PBS中，充分?jǐn)嚢?，PBS定容至100ml，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
真空采血管
外購真空采血管，內(nèi)含EDTA(乙二胺四乙酸)，可防止血液標(biāo)本凝固。
過濾裝置
外購微孔濾膜可取出的過濾裝置。
微孔濾膜
外購孔徑為5μm的醋酸纖維濾膜。
染色池
外購直徑為35mm的培養(yǎng)皿。
實施例2
本發(fā)明試劑盒的制備。
循環(huán)腫瘤細胞吸附劑的制備
a、取粒徑為100μm的聚丙烯酸酯微球5ml，加入10ml 10mol/L的NaOH，60ml環(huán)氧氯丙烷，于50℃水浴震蕩活化1h，用蒸餾水洗滌3次，每次1min，加入8ml 3mol/L的NaOH，30ml的1，6-己二胺，于60℃水浴震蕩反應(yīng)12h，用蒸餾水洗滌3次，每次3min，備用。
b、取上述處理后的微球，加入20ml PBS(磷酸緩沖液，PH 7.2)，溶脹微球，加入0.5ml預(yù)先配制好的5.0mg/ml濃度的DPS，室溫反應(yīng)1h，吸棄反應(yīng)液，PBS洗滌3次， 每次5min，備用。
c、取上述微球，加入5ml預(yù)先配制好的15μg/ml的EpCAM抗體溶液，攪拌混勻，于37℃反應(yīng)3h，即得到吸附劑溶液，4℃保存。
腫瘤細胞熒光納米探針的制備
a、取粒徑為2.0μm發(fā)光色為紅色的熒光量子點1mg溶于0.5ml PBS，制成熒光量子點溶液。
b、稱取5mg EDC和5mg NHS，分別加入5ml PBS溶解，配制成濃度為1mg/ml的EDC溶液和濃度為1mg/ml的NHS溶液，取300μl EDC溶液加入上述熒光量子點溶液，于4℃震蕩反應(yīng)15min，再加入300μlNHS溶液，混勻反應(yīng)30min，用PBS快速洗滌兩次，備用。
c、將10μg Vimentin抗體加入到上述熒光量子點中，室溫下震蕩反應(yīng)4h；用PBS洗滌3次，去除未反應(yīng)的抗體，最后分散于100μL PBS(含有0.05％NaN3和1％BSA)中，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
白細胞熒光納米探針的制備
a、取粒徑為1.0μm發(fā)光色為綠色的熒光量子點1mg溶于0.5ml PBS，制成熒光量子點溶液。
b、稱取5mg EDC和5mg NHS，分別加入5ml PBS溶解，配制成濃度為1mg/ml的EDC溶液和濃度為1mg/ml的NHS溶液，取300μl EDC溶液加入上述熒光量子點溶液，于4℃震蕩反應(yīng)15min，再加入300μlNHS溶液，混勻反應(yīng)30min，用PBS快速洗滌兩次，備用。
c、將7.5μg CD33抗體加入到上述熒光量子點中，室溫下震蕩反應(yīng)4h；用PBS洗滌3次，去除未反應(yīng)的抗體，最后分散于100μL PBS(含有0.05％NaN3和1％BSA)中，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
細胞核特異性探針的制備
5mg Hoechst 33258固體粉末溶于10ml PBS，4℃保存，用時稀釋100倍。
緩沖液的制備
NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO40.24g，Na2HPO4·2H2O 1.56g，溶于800ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1000ml，高壓滅菌，4℃保存。
裂解液的制備
NH4CL 8.29g，KHCO31.0g，Na2EDTA0.37g，溶于800ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢瑁麴s水定容至1000ml，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
固定液的制備
3.0g多聚甲醛，0.75ml triton x-100，溶于80ml PBS中，充分?jǐn)嚢?，PBS定容至100ml，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
封閉液的制備
5g BSA，溶液80ml PBS中，充分?jǐn)嚢?，PBS定容至100ml，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
真空采血管
外購真空采血管，內(nèi)含EDTA(乙二胺四乙酸)，可防止血液標(biāo)本凝固。
過濾裝置
外購微孔濾膜可取出的過濾裝置。
微孔濾膜
外購孔徑為8μm的聚碳酸酯濾膜。
染色池
外購直徑為35mm的培養(yǎng)皿。
實施例3
本發(fā)明試劑盒的制備。
循環(huán)腫瘤細胞吸附劑的制備
a、取粒徑為50μm的聚乙烯醇微球5ml，加入10ml 10mol/L的NaOH，60ml環(huán)氧氯丙烷，于50℃水浴震蕩活化1h，用蒸餾水洗滌3次，每次1min，加入8ml 3mol/L的NaOH，30ml的1，6-己二胺，于60℃水浴震蕩反應(yīng)12h，用蒸餾水洗滌3次，每次3min，備用。
b、取上述處理后的微球，加入20ml PBS(磷酸緩沖液，PH 7.2)，溶脹微球，加入0.4ml預(yù)先配制好的5.0mg/ml濃度的戊二醛，室溫反應(yīng)1h，吸棄反應(yīng)液，PBS洗滌3次，每次5min，備用。
c、取上述微球，加入3ml預(yù)先配制好的15μg/ml的EGFR抗體溶液，攪拌混勻，于37℃反應(yīng)3h，即得到吸附劑溶液，4℃保存。
腫瘤細胞熒光納米探針的制備
a、取粒徑為0.1μm發(fā)光色為紅色的熒光量子點1mg溶于0.5ml PBS，制成熒光量子點溶液。
b、稱取5mg EDC和5mg NHS，分別加入5ml PBS溶解，配制成濃度為1mg/ml的EDC溶 液和濃度為1mg/ml的NHS溶液，取300μl EDC溶液加入上述熒光量子點溶液，于4℃震蕩反應(yīng)15min，再加入300μlNHS溶液，混勻反應(yīng)30min，用PBS快速洗滌兩次，備用。
c、將7.5μg plastin-3抗體加入到上述熒光量子點中，室溫下震蕩反應(yīng)4h；用PBS洗滌3次，去除未反應(yīng)的抗體，最后分散于100μL PBS(含有0.05％NaN3和1％BSA)中，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
白細胞熒光納米探針的制備
a、取粒徑為2.0μm發(fā)光色為綠色的熒光量子點1mg溶于0.5ml PBS，制成熒光量子點溶液。
b、稱取5mg EDC和5mg NHS，分別加入5ml PBS溶解，配制成濃度為1mg/ml的EDC溶液和濃度為1mg/ml的NHS溶液，取300μl EDC溶液加入上述熒光量子點溶液，于4℃震蕩反應(yīng)15min，再加入300μlNHS溶液，混勻反應(yīng)30min，用PBS快速洗滌兩次，備用。
c、將10μg CD15抗體加入到上述熒光量子點中，室溫下震蕩反應(yīng)4h；用PBS洗滌3次，去除未反應(yīng)的抗體，最后分散于100μL PBS(含有0.05％NaN3和1％BSA)中，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
細胞核特異性探針的制備
5mg DAPI固體粉末溶于10ml PBS，4℃保存，用時稀釋100倍。
緩沖液的制備
NaCl 8.0g，KCl 0.2g，KH2PO40.24g，Na2HPO4·2H2O 1.56g，溶于800ml蒸餾水中，用鹽酸調(diào)pH值為7.4，蒸餾水定容至1000ml，高壓滅菌，4℃保存。
裂解液的制備
NH4CL 13.0g，KHCO31.5g，Na2EDTA0.5g，溶于800ml蒸餾水中，充分?jǐn)嚢?，蒸餾水定容至1000ml，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
固定液的制備
4.0g多聚甲醛，0.5ml triton x-100，溶于80ml PBS中，充分?jǐn)嚢?，PBS定容至100ml，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
封閉液的制備
5g BSA，溶液80ml PBS中，充分?jǐn)嚢?，PBS定容至100ml，微孔濾膜過濾除菌，4℃保存。
真空采血管
外購真空采血管，內(nèi)含EDTA(乙二胺四乙酸)，可防止血液標(biāo)本凝固。
過濾裝置
外購微孔濾膜可取出的過濾裝置。
微孔濾膜
外購孔徑為10μm的聚碳酸酯濾膜。
染色池
外購直徑為35mm的培養(yǎng)皿。
實施例4
實施例1、2、3制備的循環(huán)腫瘤細胞吸附劑對腫瘤細胞捕獲效果的考察
(本實驗中，使用的MCF7-pEGFP在熒光顯微鏡下發(fā)出綠色熒光，因此染色過程無需加入特異性腫瘤細胞熒光納米探針)
1)取7.5ml的PBS，加入一定數(shù)量的MCF7-pEGFP細胞，攪拌混勻，加入5μl上述實施例中制備的循環(huán)腫瘤細胞吸附劑，37℃孵育45min。
2)將孵育后的混懸液加入過濾裝置中，抽濾使液體緩慢通過濾器和濾膜，加入5ml緩沖液沖洗上樣管管壁和濾膜。
3)取出微孔濾膜放入染色池，加入3ml對應(yīng)試劑盒中的固定液，37℃固定5min，棄去固定液，再加入5ml對應(yīng)試劑盒中的封閉液，4℃封閉45min，棄去封閉液，用5ml緩沖液輕柔漂洗濾膜2次，每次1min，37℃孵育45min，棄去上清，加入5ml緩沖液輕柔漂洗2次，除去附著于濾膜上的染色劑。
4)將濾膜從染色池取出，固定于載玻片上，在熒光顯微鏡下對腫瘤細胞進行鑒定和計數(shù)。結(jié)果如表2所示，可見本發(fā)明試劑盒法對腫瘤細胞捕獲效率高，效果理想。
表2.加入腫瘤細胞檢出率
實施例5
使用實施例1、2、3制備的試劑盒檢測體外模擬循環(huán)腫瘤細胞
1)將10個腫瘤細胞加入7.5ml健康志愿者的外周血中，模擬腫瘤患者外周血標(biāo)本。加入30ml緩沖液，800rpm離心5分鐘，棄去上清液，向細胞沉淀中加入37.5ml 4℃預(yù)冷的裂解液，輕輕吹打混勻，4℃裂解5min；800rpm離心5分鐘，棄去上層紅色清液，沉淀部分加入5ml緩沖液重懸細胞，800rpm離心5分鐘，去上清，加入7.5ml緩沖液重懸細胞。
2)上述細胞重懸液中加入10μl腫瘤細胞吸附劑，37℃孵育45min。
3)將孵育后的混懸液加入過濾裝置中，抽濾處理使液體緩慢通過濾器和濾膜，加入5ml緩沖液沖洗上樣管管壁和濾膜。
4)取出微孔濾膜放入染色池，加入3ml固定液，37℃固定5min，棄去固定液，加入5ml封閉液，4℃封閉45min，棄去封閉液，用5ml緩沖液輕柔漂洗濾膜2次，每次1min，依次加入2μl細胞核特異性探針，2μl白細胞熒光納米探針，2μl腫瘤細胞熒光納米探針，37℃孵育45min，棄去上清，加入5ml緩沖液輕柔漂洗2次，除去附著于濾膜上的染色劑。
5)將濾膜從染色池取出，固定于載玻片上，在熒光顯微鏡下，按照判定標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤細胞 進行鑒定和計數(shù)。腫瘤細胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細胞同時出現(xiàn)藍色和紅色熒光；白細胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細胞同時出現(xiàn)藍色和綠色熒光。
結(jié)果如表3所示，可見本發(fā)明試劑盒對體外模擬循環(huán)腫瘤細胞檢測效果理想。
表3.體外模擬循環(huán)腫瘤細胞檢測率
實施例6
使用實施例1、2、3制備的試劑盒對癌癥患者血液樣本進行檢測
1)選擇5例正常健康志愿者、10例肺癌患者、10例乳腺癌患者血液樣本7.5ml。加入30ml緩沖液，800rpm離心5分鐘，棄去上清液，向細胞沉淀中加入50ml 4℃預(yù)冷 的裂解液，輕輕吹打混勻，4℃裂解5min；800rpm離心5分鐘，棄去上層紅色清液，沉淀部分加入5ml緩沖液重懸細胞，800rpm離心5分鐘，去上清，加入7.5ml緩沖液重懸細胞。
2)上述重懸液中加入7.5μl腫瘤細胞吸附液，于37℃孵育45min。
3)將孵育后的混懸液加入過濾裝置中，抽濾處理使液體緩慢通過濾器和濾膜，加入5ml緩沖液沖洗上樣管管壁和濾膜。
4)取出微孔濾膜放入染色池，加入3ml固定液，37℃固定5min，棄去固定液，加入5ml封閉液，4℃封閉45min，棄去封閉液，用5ml緩沖液輕柔漂洗濾膜2次，每次1min，依次加入2μl細胞核特異性探針，2μl白細胞熒光納米探針，2μl腫瘤細胞熒光納米探針，37℃孵育45min，棄去上清，加入5ml緩沖液輕柔漂洗2次，除去附著于濾膜上的染色劑。
5)將濾膜從染色池取出，固定于載玻片上，在熒光顯微鏡下，按照判定標(biāo)準(zhǔn)對腫瘤細胞進行鑒定和計數(shù)。腫瘤細胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細胞同時出現(xiàn)藍色和紅色熒光；白細胞判定標(biāo)準(zhǔn)：細胞同時出現(xiàn)藍色和綠色熒光。
結(jié)果如表4所示，可見本發(fā)明試劑盒可成功檢測腫瘤患者循環(huán)腫瘤細胞數(shù)目，有望用于癌癥的早期診斷、療效評估、復(fù)發(fā)監(jiān)測。
表4 7.5ml癌癥患者血液樣本CTC檢測數(shù)