本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)沙眼衣原體和淋病的試劑盒及其應(yīng)用，屬于醫(yī)療檢測(cè)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis，Ct)具有獨(dú)特的發(fā)育周期，有原體(Elementary Body)和網(wǎng)狀體(Reticulate Body)兩種形式。其獨(dú)特的生命周期是原體感染細(xì)胞發(fā)育為網(wǎng)狀體，網(wǎng)狀體再分裂為原體釋放，進(jìn)而再次感染細(xì)胞的循環(huán)過程。Ct是一種在人體內(nèi)長期生存并又廣泛傳播的病原體，是我國性傳播疾病(sexually transmitted diseases，STDs)的主要病原之一，它在一定條件下能引起異位妊娠、早產(chǎn)、流產(chǎn)及尿道感染等多種疾病。研究發(fā)現(xiàn)，Ct感染尚與許多自身免疫疾病發(fā)病有關(guān)，如衣原體感染后可引起反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎、Reiter綜合征等。Ct主要外膜蛋白(major outer membrane protein,MOMP)具有5個(gè)保守區(qū)和4個(gè)可變區(qū)。由于其保守結(jié)構(gòu)和好的免疫原性，MOMP是檢測(cè)Ct的最理想的抗原之一。
實(shí)驗(yàn)室檢查衣原體的方法有：衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法、血清學(xué)方法和核酸擴(kuò)增法。其中以衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法最敏感、最可靠，但由于操作繁瑣、費(fèi)用高、培養(yǎng)時(shí)間長且受標(biāo)本采集、運(yùn)送、保存及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的影響，一般實(shí)驗(yàn)室難以開展。核酸擴(kuò)增法由于應(yīng)用特異性引物，大大增強(qiáng)了檢測(cè)的敏感性和特異性，但對(duì)實(shí)驗(yàn)室條件、儀器設(shè)備、人員專業(yè)素質(zhì)要求很高，且容易因?yàn)楹怂釘U(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染而出現(xiàn)假陽性。血清學(xué)檢查簡(jiǎn)便快速的特性使其在臨床上得到廣泛應(yīng)用。
淋病(gonorrhea)是淋病奈瑟菌(簡(jiǎn)稱淋菌)引起的以泌尿生殖系統(tǒng)化膿性感染為主要表現(xiàn)的性傳播疾病，是一種古老而又常見的性病。近年來發(fā)病率居我國(中國)性傳播疾病首位，淋菌為革蘭氏陰性雙球菌，呈腎型，成雙排列，離開人體不易生存，一般消毒劑容易將其殺滅，淋病的病原體即奈瑟菌，是1879年由Neisseria首次分離出的淋病雙球菌，因而淋病雙球菌又稱為奈瑟雙球菌(Neisseria gon-orrhoeas)。淋病雙球菌呈腎形，兩個(gè)凹面相對(duì)，大小一致，長約0.7微米，寬0.5微米。它是嗜二氧化碳的需氧菌，革蘭染色陰性，最適宜在潮濕，含2.5-5％二氧化碳的環(huán)境中生長。常存在多核白細(xì)胞內(nèi)，橢圓或球形，常成雙排列，無鞭毛、無莢膜、不存在芽孢，對(duì)外界理化條件的抵抗力差，最怕干燥，在干燥環(huán)境中1-2小時(shí)即可死亡。在高溫或低溫條件下都易致死。對(duì)各種化學(xué)消毒劑的抵抗力也很弱。
目前，沙眼衣原體和淋病的檢測(cè)方法耗費(fèi)時(shí)間較長，由于STD疾病患者的隱私性考慮，很難獲得患者的足夠配合。而膠體金免疫層析技術(shù)得到了廣泛應(yīng)用，其檢測(cè)方法最為簡(jiǎn)便、快捷；但是膠體金免疫層析技術(shù)僅能獲得定性檢測(cè)結(jié)果，而用于定量檢測(cè)時(shí)往往精密度和準(zhǔn)確度較差，并且穩(wěn)定性不佳。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種快速定量檢測(cè)沙眼衣原體和淋病的試劑盒，其具體是在PVC板上順次相互搭接經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記抗體的結(jié)合墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后形成的試紙卡。
在一個(gè)實(shí)施方案中，稀土熒光微球標(biāo)記抗體由稀土熒光微球標(biāo)記淋病抗原單克隆抗體和稀土熒光微球標(biāo)記沙眼衣原體抗原單克隆抗體組成。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述稀土熒光微球摻雜有銪元素；所述稀土熒光微球的直徑為50-100nm。
在本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施方案中，所述吸附熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊通過以下方法制備：
1)稀土熒光微球的活化；
2)稀土熒光微球標(biāo)記的抗體制備：
a、將沙眼衣原體抗原單克隆抗體與上述活化的稀土熒光微球混合，反應(yīng)過夜；然后加入硼氫化鈉反應(yīng)；封閉液封閉，封閉液組成為pH8.5的100mM Tris-HCl緩沖液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.1％木質(zhì)素磺酸鈉)，離心洗滌3遍，重懸于的pH8.5的100mM Tris-HCl緩沖液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.2％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>
b、將淋病抗原單克隆抗體與上述活化的稀土熒光微球混合，反應(yīng)過夜；然后加入硼氫化鈉反應(yīng)；封閉液封閉，封閉液組成為pH8.5的100mM Tris-HCl緩沖液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.1％木質(zhì)素磺酸鈉)，離心洗滌3遍，重懸于的pH8.5的100mM Tris-HCl緩沖液中(含0.5％OVA、0.5％BSA和0.2％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>
c、將步驟a和步驟b制備的稀土熒光微球微球標(biāo)記抗體按體積比1：1混合備用。
3)將玻璃纖維膜浸泡于含1.5％木質(zhì)素磺酸鈉、0.5％BSA和0.5％OVA(卵清白蛋白)的100mM Tris-HCl緩沖液中，pH8.5；浸泡，然后取出并烘箱烘干，將玻璃纖維膜置于噴臺(tái)上，用微定量噴頭將稀土熒光微球標(biāo)記抗體溶液噴到玻璃纖維膜，即得。
在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備方法如下：
用包被稀釋液分別將淋病抗原單克隆抗體、沙眼衣原體抗原單克隆抗體和羊抗小鼠IgG抗體制成溶液，將淋病抗原單克隆抗體和沙眼衣原體抗原單克隆抗體溶液作為檢測(cè)線噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，羊抗小鼠IgG抗體制成溶液作為質(zhì)控線噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，然后置于烘箱中烘干。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，所述包被稀釋液為含0.5％OVA、0.5％BSA和0.5％木質(zhì)素磺酸鈉的100mM Tris-HCl緩沖液，pH8.5。
在本發(fā)明又一個(gè)實(shí)施方案中，所述樣品墊的制備方法如下：
將玻璃纖維膜浸泡于0.25M Tris緩沖液(pH7.5)，含1.2％Triton X-100，2.5％BSA的處理液中，于4℃浸泡4個(gè)小時(shí)，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時(shí)。
在本發(fā)明中，所述試紙卡的組裝過程如下：在PVC板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。
所述試劑盒，檢測(cè)方法為：1)將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡，平放；2)精確吸取100μl血清樣本，樣本為全血時(shí)吸取150μl樣本，加入到樣本孔中，15-30分鐘內(nèi)用熒光免疫層析分析儀定量判定結(jié)果；3)設(shè)置好儀器相關(guān)參數(shù)后將試紙卡放入倉內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)，儀器將顯示出樣品濃度的定量測(cè)定結(jié)果。
在本發(fā)明的快速定量檢測(cè)試劑盒的制備過程中，在封閉液和噴涂液中添加了木脂素磺酸鈉，其作為表面活性劑時(shí)，不僅抗體穩(wěn)定性效果極佳，并且由于其配體作用導(dǎo)致對(duì)銪元素?zé)晒馕⑶虬l(fā)光強(qiáng)度隨著時(shí)間延長沒有出現(xiàn)減弱現(xiàn)象。另外，考慮到淋病抗原單克隆抗體和沙眼衣原體抗原單克隆抗體可能會(huì)導(dǎo)致的相互影響，因此本發(fā)明對(duì)封閉液及噴涂液中所使用的封閉蛋白進(jìn)行了詳細(xì)篩選，最終發(fā)現(xiàn)OVA和BSA的組合效果最佳，其與木質(zhì)素磺酸鈉組合可以達(dá)到最佳的穩(wěn)定效果，保證試劑盒中所使用的單抗的穩(wěn)定性。
具體實(shí)施方式
還可進(jìn)一步通過實(shí)施例來理解本發(fā)明，其中所述實(shí)施例說明了一些制備或使用方法。然而，要理解的是，這些實(shí)施例不限制本發(fā)明。現(xiàn)在已知的或進(jìn)一步開發(fā)的本發(fā)明的變化被認(rèn)為落入本文中描述的和以下要求保護(hù)的本發(fā)明范圍之內(nèi)。
在本發(fā)明中，在無特殊說明的前提下，“％”代表重量百分比。
實(shí)施例1快速檢測(cè)試劑盒的制備
包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜的制備：
用包被稀釋液將淋病抗原單克隆抗體(鼠抗人單克隆抗體，購自艾美捷(abnova)科技有限公司)、沙眼衣原體抗原單克隆抗體(鼠抗人MOMP單克隆抗體，購自艾美捷(abnova)科技有限公司)和羊抗小鼠IgG抗體制成溶液，具體為：將2mg/ml的淋病抗原單克隆抗體和1.5mg/ml的沙眼衣原體抗原單克隆抗體分別用包被稀釋液制成檢測(cè)線噴涂液，將5mg/ml的羊抗小鼠IgG抗體用包被稀釋液制成質(zhì)控線噴涂液；膜液量為2μl/cm，將它們分別作為淋病檢測(cè)線、沙眼衣原體檢測(cè)線和質(zhì)控線平行噴灑于硝酸纖維素膜上進(jìn)行包被，兩條檢測(cè)線之間以及和質(zhì)控線間隔均為5mm，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時(shí)。包被稀釋液為含0.5％OVA、0.5％BSA和0.5％木質(zhì)素磺酸鈉的100mM Tris-HCl緩沖液，pH8.5。
吸附熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊制備：
1)稀土熒光微球的醛基化：
取15mg稀土熒光微球，用50mM，pH9.0的碳酸鹽緩沖液，采用離心法洗滌3遍，離心速度為12000rpm，時(shí)間為10分鐘，最后重懸于200μl的上述碳酸鹽緩沖液中。加入400μl醛基化的葡聚糖，混勻，室溫下暗反應(yīng)4小時(shí)。采用同樣的離心法洗滌和重懸到200μl的上述碳酸鹽緩沖液中，置于4℃?zhèn)溆谩?/p>
2)稀土熒光微球標(biāo)記的抗體的制備：
a、將2mg的沙眼衣原體抗原單克隆抗體用上述碳酸鹽緩沖液于4℃透析過夜，然后與上述醛基化的稀土熒光微球混合，4℃反應(yīng)過夜。然后，加入硼氫化鈉至終濃度15mM，4℃反應(yīng)6小時(shí)；再加入等體積的封閉液(100mM的Tris-HCl緩沖液，pH8.5，含0.5％OVA、0.5％BSA和0.1％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃封閉過夜；然后用50mM pH6.5的Tris-HCl緩沖液，采用離心法洗滌3遍，重懸于200μl的100mM Tris-HCl緩沖液中含0.5％OVA、0.5％BSA和0.2％木質(zhì)素磺酸鈉)，4℃避光保存?zhèn)溆谩?/p>
b、將2mg淋病抗原單克隆抗體與上述活化的稀土熒光微球混合，制備方法同步驟a；
c、將步驟a和步驟b制備的稀土熒光微球微球標(biāo)記抗體按體積比1：1混合備用。
3)將玻璃纖維膜浸泡于含1.5％木質(zhì)素磺酸鈉、0.5％BSA和0.5％OVA(卵清白蛋白)的100mM Tris-HCl緩沖液中，pH8.5；4℃浸泡4小時(shí)，然后取出37℃烘箱烘干4小時(shí)，備用。將玻璃纖維膜在Bio-DotXYZ3050三維噴點(diǎn)平臺(tái)上，用Bio-Jet Quanti300非接觸式微定量噴頭將步驟2制備的稀土熒光微球標(biāo)記的單克隆抗體溶液噴到玻璃纖維膜，37℃烘干4小時(shí)，即得。
在檢測(cè)線中涂布的單克隆抗體和結(jié)合墊中的熒光微球標(biāo)記用的單克隆抗體為配對(duì)抗體，購自艾美捷(abnova)科技有限公司。
所述樣品墊的制備：
將玻璃纖維膜浸泡于0.25M Tris緩沖液(pH7.5)，含1.2％TritonX-100，2.5％BSA的處理液中，于4℃浸泡4個(gè)小時(shí)，然后置于烘箱中，37℃烘干4小時(shí)。
試紙卡的組裝：在PVC板上依次粘貼經(jīng)過處理的樣品墊、吸附有稀土熒光微球標(biāo)記的抗體的結(jié)合墊、包被有檢測(cè)線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜和吸水墊，組裝后得到試紙大板，按照要求切割成4mm寬，將試紙裝入塑料卡內(nèi)形成試紙卡。
實(shí)施例2試劑盒線性范圍、精密度和靈敏度測(cè)試(淋病奈瑟菌)
將淋病奈瑟菌標(biāo)準(zhǔn)株(NC29400和NC29403，購自中國藥品生物制品檢定所)在培養(yǎng)基中擴(kuò)增提純，用PBS緩沖液制備成0.1、0.5、1、5、10、20和50mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用；
試紙卡進(jìn)行測(cè)定：
檢測(cè)方法：將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡(實(shí)施例1制備)，平放；精確吸取100μl標(biāo)準(zhǔn)品樣本，加入到試紙卡的樣本孔中，20分鐘后用熒光免疫層析分析儀進(jìn)行檢測(cè)。
線性：以熒光強(qiáng)度值和對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，NC29400的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y(熒光強(qiáng)度)＝143.9X+5.2，R2值>0.999，NC29403的標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y(熒光強(qiáng)度)＝168.3X+6.1，R2值>0.999，說明本發(fā)明試紙卡在0.1-50mg/L范圍內(nèi)線性良好。
靈敏度：采用PBS緩沖液作為空白對(duì)照，以空白對(duì)照2倍熒光強(qiáng)度作為最低檢測(cè)濃度(即靈敏度)，結(jié)果表明：0.05mg/L標(biāo)準(zhǔn)品平行測(cè)定5次的平均熒光強(qiáng)度為12.7RLU(NC29400)和15.3RLU(NC29403)；而空白對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度為4.3RLU；說明試紙卡的靈敏度可達(dá)0.05mg/L。
精密度：將20mg/L標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用實(shí)施例1制備試紙卡重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算CV。結(jié)果表明CV為2.79％。
在整個(gè)測(cè)試中，沙眼衣原體檢測(cè)線一直為陰性，說明兩者不存在交叉影響。
實(shí)施例3試劑盒線性范圍、精密度和靈敏度測(cè)試(沙眼衣原體)
將沙眼衣原體膜蛋白用PBS緩沖液制備成0.01、0.05、0.1、1、5、10和20ng/ml的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，備用；
試紙卡進(jìn)行測(cè)定：
檢測(cè)方法：將檢測(cè)試劑及樣本平衡至室溫，取出試紙卡(實(shí)施例1制備)，平放；精確吸取100μl標(biāo)準(zhǔn)品樣本，加入到試紙卡的樣本孔中，20分鐘后用熒光免疫層析分析儀進(jìn)行檢測(cè)。
線性：以熒光強(qiáng)度值和對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)品濃度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體為Y(熒光強(qiáng)度)＝101.7X+3.8，R2值>0.999，說明本發(fā)明試紙卡在0.01-20ng/ml范圍內(nèi)線性良好。
靈敏度：采用PBS緩沖液作為空白對(duì)照，以空白對(duì)照2倍熒光強(qiáng)度作為最低檢測(cè)濃度(即靈敏度)，結(jié)果表明：0.01ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品平行測(cè)定5次的平均熒光強(qiáng)度為4.9RLU；而空白對(duì)照的平均熒光強(qiáng)度為2.2RLU。說明試紙卡的靈敏度可達(dá)0.01ng/ml。
精密度：將10ng/ml標(biāo)準(zhǔn)品溶液采用實(shí)施例1制備試紙卡重復(fù)測(cè)定10次，計(jì)算CV。結(jié)果表明CV為1.81％。
實(shí)施例4穩(wěn)定性測(cè)試
將實(shí)施例1制備的試紙卡在37℃環(huán)境下放置3個(gè)月，然后按照實(shí)施例2的方法測(cè)定試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)曲線及R2值，并采用20mg/L的NC29403和10ng/ml的沙眼衣原體膜蛋白對(duì)試劑盒進(jìn)行精密度考察(平行測(cè)定10次，計(jì)算CV％)，具體結(jié)果如下：
對(duì)比例1試紙卡制備同實(shí)施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中不添加木質(zhì)素磺酸鈉。
對(duì)比例2試紙卡制備同實(shí)施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中將木質(zhì)素磺酸鈉替換為等量的SDS。
對(duì)比例3試紙卡制備同實(shí)施例1，區(qū)別在于，在制備各步驟中將OVA替換為等量的BSA。
實(shí)施例5臨床測(cè)試
從醫(yī)院STD門診收集淋病奈瑟菌感染或沙眼衣原體感染及健康人的唾液或尿液樣本，采用實(shí)施例1試紙卡對(duì)樣本進(jìn)行測(cè)定，并且采用相同樣本通過ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，結(jié)果見下表：
本發(fā)明內(nèi)容僅僅舉例說明了要求保護(hù)的一些具體實(shí)施方案，其中一個(gè)或更多個(gè)技術(shù)方案中所記載的技術(shù)特征可以與任意的一個(gè)或多個(gè)技術(shù)方案相組合，這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案也在本申請(qǐng)保護(hù)范圍內(nèi)，就像這些經(jīng)組合而得到的技術(shù)方案已經(jīng)在本發(fā)明公開內(nèi)容中具體記載一樣。