本發(fā)明涉及微生物檢測領(lǐng)域，具體的說，涉及了一種伏馬毒素B1的快速檢測方法及試劑盒。

背景技術(shù)：

伏馬毒素 (Fumonisins) 是由串珠鐮刀菌產(chǎn)生的真菌毒素，目前已發(fā)現(xiàn)有11種結(jié)構(gòu)類似物，其中伏馬毒素B1（FB1）是伏馬毒素的主要組成，約占毒素總量的70%，是導(dǎo)致伏馬毒素毒性作用的主要原因。自 1989 年發(fā)現(xiàn)伏馬毒素以來，受到世界各國的普遍重視，許多國家對其進(jìn)行了系統(tǒng)的研究。伏馬毒素能夠?qū)τ衩准捌渲破吩斐晌廴?，而且在以谷物為原料的一些產(chǎn)品中如面條、啤酒、調(diào)味品，甚至在蘆筍中也檢測到了伏馬毒素。研究證實(shí)伏馬毒素可引發(fā)馬的白腦軟化癥，神經(jīng)性中毒而呈現(xiàn)意識障礙、失明和運(yùn)動失調(diào)，甚至導(dǎo)致死亡。引發(fā)豬的肺水腫綜合癥，并可誘發(fā)人類的食道癌和肝癌、胃癌等疾病，從而對畜牧業(yè)和人類的健康構(gòu)成危害。

目前，伏馬毒素B1有多種測定方法，如薄層色譜法TLC，高效液相色譜法HPLC，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)等。但由于費(fèi)事、靈敏度低、儀器設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜且不適用于大批量樣品檢測等缺點(diǎn)，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。免疫分析方法興起于上世紀(jì) 80 年代，基于抗原抗體的特異性結(jié)合，具有靈敏、快速、特異、簡便等優(yōu)點(diǎn)，近年來已廣泛應(yīng)用到毒素殘留的檢測中。通常檢測伏馬毒素B1的酶聯(lián)免疫試劑盒所需實(shí)驗(yàn)時(shí)間為1小時(shí)左右，若能縮短反應(yīng)時(shí)間，簡化實(shí)驗(yàn)步驟，可有效提高批量檢測速度，增快企業(yè)檢測伏馬毒素B1的效率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，從而提供一種靈敏度高、檢測快速、成本低、效率高的伏馬毒素B1的檢測方法。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種實(shí)現(xiàn)上述伏馬毒素B1檢測方法的試劑盒。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是：一種快速檢測伏馬毒素B1的方法，包括以下步驟：（1）伏馬毒素B1酶標(biāo)板洗滌：在伏馬毒素B1酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加入洗滌液，放置1分鐘洗滌，去除反應(yīng)孔中洗滌液至干，重復(fù)洗滌0-2次；

（2）伏馬毒素B1酶標(biāo)板加樣：向洗滌后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板反應(yīng)孔分為伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液孔和待測樣品溶液孔，在伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液孔中分別加入不同濃度的伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液，在待測樣品溶液孔中加入待測樣品溶液；

（3）加伏馬毒素B1酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液：在加樣后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中分別先后加入伏馬毒素B1工作溶液和抗體工作溶液，混合均勻后，將伏馬毒素B1酶標(biāo)板放入37℃培養(yǎng)箱中孵育8-15分鐘；

（4）洗滌：取出孵育后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板，去除反應(yīng)孔中的孵育溶液至干，后在反應(yīng)孔中加入洗滌液，放置1分鐘洗滌，去除反應(yīng)孔中洗滌液至干，重復(fù)洗滌3-4次；

（5）顯色：在洗滌后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中分別加入底物液和顯色液，混合均勻后，放入37℃培養(yǎng)箱孵育8-15分鐘；

（6）讀取數(shù)值：取出顯色孵育后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板，在各個(gè)反應(yīng)孔分別加入終止液，混合均勻后，放入酶標(biāo)儀中讀取各孔的吸光度數(shù)值，用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理得出濃度值。

一種快速檢測伏馬毒素B1的試劑盒，其特征在于，包括伏馬毒素B1酶標(biāo)板、伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液、伏馬毒素B1酶標(biāo)工作溶液、抗體工作溶液、底物液、顯色液、終止液。

基于上述，所述伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液分別為0.5 ppb、1.5 ppb、4.5 ppb、13.5 ppb、40.5 ppb的伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液。

本發(fā)明的有益效果為：

（1）本申請伏馬毒素B1的檢測時(shí)間縮短到30分鐘以內(nèi)，提高檢測速度，滿足企業(yè)批量檢測效率的要求；

（2）合并酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液的加樣步驟，簡化實(shí)驗(yàn)洗滌步驟，加快了實(shí)驗(yàn)反應(yīng)進(jìn)程，縮短檢測時(shí)間，提高檢測效率；

（3）在滿足縮短反應(yīng)時(shí)間，提高檢測效率的同時(shí)，保證了檢測的靈敏度和準(zhǔn)確度。

具體實(shí)施方式

下面通過具體實(shí)施方式，對本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

實(shí)施例1

一種快速檢測伏馬毒素B1的試劑盒，包括伏馬毒素B1酶標(biāo)板、伏馬毒素B1標(biāo)準(zhǔn)溶液、伏馬毒素B1酶標(biāo)工作溶液、抗體工作溶液、底物液、顯色液、終止液。采用該試劑盒快速檢測伏馬毒素B1的方法，包括以下檢測步驟：（1）伏馬毒素B1酶標(biāo)板洗滌：伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中分別加入250 μL（約5滴）洗滌液，放置1分鐘洗滌，甩干，在吸水紙上拍干。

（2）伏馬毒素B1酶標(biāo)板加樣：將洗滌后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板放在框架上，對反應(yīng)孔進(jìn)行編號，設(shè)定1~6號孔為FB1標(biāo)準(zhǔn)對照孔，其余孔為樣品孔。1~6號孔分別加入50 μL的FB1標(biāo)準(zhǔn)溶液0 ppb，0.5 ppb，1.5 ppb，4.5 ppb，13.5 ppb，40.5 ppb，其余孔加入相應(yīng)的待測樣液。

（3）加伏馬毒素B1酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液：加樣后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各反應(yīng)孔分別先后加入50μL的伏馬毒素B1（FB1）酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液，輕輕振搖伏馬毒素B1酶標(biāo)板框架，使加入的FB1酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液的充分混勻，蓋上蓋子，放入37℃培養(yǎng)箱，孵育10 min。

（4）洗滌：取出孵育后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板，甩干，拍干，再向該伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中加入250 μL（約5滴）的洗滌液，放置1 分鐘洗滌，甩干并拍干。按上述洗滌操作重復(fù)洗滌4次。

（5）顯色：將洗滌后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板拍干后，再向伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中分別加入50 μL的底物液和50 μL的顯色液，輕輕振搖伏馬毒素B1酶標(biāo)板框架，使底物液和顯色液充分混勻，蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育10 min。

（6）讀取數(shù)值：取出顯色孵育后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板，在伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中加入50 μL的終止液，輕輕振搖伏馬毒素B1酶標(biāo)板框架，使反應(yīng)板中的溶液充分混勻，放入450 nm酶標(biāo)儀中讀取各孔的吸光度（OD值）數(shù)值，用數(shù)據(jù)處理軟件進(jìn)行處理得出濃度值。

實(shí)施例2

本實(shí)施例是在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，對下列步驟作出改進(jìn)：（3）加伏馬毒素B1工作溶液和抗體工作溶液：加樣后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各反應(yīng)孔分別先后加入50μL的伏馬毒素B1（FB1）酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液，輕輕振搖伏馬毒素B1酶標(biāo)板框架，使加入的FB1酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液的充分混勻，蓋上蓋子，放入37℃培養(yǎng)箱，孵育8 min。

（4）洗滌：取出孵育后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板，甩干，拍干，再向該伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中加入250 μL（約5滴）的洗滌液，放置1 分鐘洗滌，甩干并拍干。按上述洗滌操作重復(fù)洗滌3次。

（5）顯色：將洗滌后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板拍干后，再向伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中分別加入50 μL的底物液和50 μL的顯色液，輕輕振搖伏馬毒素B1酶標(biāo)板框架，使底物液和顯色液充分混勻，蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育8min。

實(shí)施例3

本實(shí)施例是在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，對下列步驟作出改進(jìn)：（1）伏馬毒素B1酶標(biāo)板洗滌：伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中分別加入250 μL（約5滴）洗滌液，放置1分鐘洗滌，甩干，在吸水紙上拍干，按上述洗滌操作重復(fù)洗滌2次。

（3）加伏馬毒素B1工作溶液和抗體工作溶液：加樣后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各反應(yīng)孔分別先后加入50μL的伏馬毒素B1（FB1）酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液，輕輕振搖伏馬毒素B1酶標(biāo)板框架，使加入的FB1酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液的充分混勻，蓋上蓋子，放入37℃培養(yǎng)箱，孵育11 min。

（5）顯色：將洗滌后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板拍干后，再向伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中分別加入50 μL的底物液和50 μL的顯色液，輕輕振搖伏馬毒素B1酶標(biāo)板框架，使底物液和顯色液充分混勻，蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育11min。

實(shí)施例4

本實(shí)施例是在實(shí)施例1的基礎(chǔ)上，對下列步驟作出改進(jìn)：（3）加伏馬毒素B1工作溶液和抗體工作溶液：加樣后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各反應(yīng)孔分別先后加入50μL的伏馬毒素B1（FB1）酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液，輕輕振搖伏馬毒素B1酶標(biāo)板框架，使加入的FB1酶標(biāo)工作溶液和抗體工作溶液的充分混勻，蓋上蓋子，放入37℃培養(yǎng)箱，孵育15 min。

（5）顯色：將洗滌后的伏馬毒素B1酶標(biāo)板拍干后，再向伏馬毒素B1酶標(biāo)板的各個(gè)反應(yīng)孔中分別加入50 μL的底物液和50 μL的顯色液，輕輕振搖伏馬毒素B1酶標(biāo)板框架，使底物液和顯色液充分混勻，蓋上蓋子，放入37 ℃培養(yǎng)箱，孵育15min。

最后應(yīng)當(dāng)說明的是:以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對其限制；盡管參照較佳實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：依然可以對本發(fā)明的具體實(shí)施方式進(jìn)行修改或者對部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明請求保護(hù)的技術(shù)方案范圍當(dāng)中。