一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法與試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，包括：(1)將鉛完全抗原包被至固相載體表面，4?6℃包被14?16h，洗滌固相載體，隨后加入封閉緩沖液封閉固相載體表面的空白位置，37?40℃封閉1?3h，隨后洗滌固相載體；(2)取待測(cè)樣品和酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，加入至步驟(1)獲得的固相載體中；37?40℃避光環(huán)境中反應(yīng)30?50min；隨后用洗滌緩沖液洗滌固相載體；(3)在步驟(2)得到的固相載體中加入辣根過(guò)氧化物酶顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)并測(cè)定光密度值或通過(guò)加入辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)并測(cè)定光信號(hào)，根據(jù)光密度值或光信號(hào)與鉛濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中鉛的含量。本發(fā)明提供的方法簡(jiǎn)便、快速且能夠高通量檢測(cè)。本發(fā)明還提供了一種可快速檢測(cè)鉛的試劑盒。
【專利說(shuō)明】
一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法與試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及免疫分析方法，尤其涉及一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法與試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]鉛在自然界中多以硫化物形式存在，是土壤和水體污染中較普遍的元素。鉛污染源主要來(lái)自汽油里添加抗爆劑一烷基鉛，在公路邊進(jìn)行汽車尾氣的監(jiān)測(cè)表明，有50%的鉛降落在公路兩側(cè)數(shù)百米范圍內(nèi)，余下的50%則以極細(xì)的顆粒飄塵向遠(yuǎn)處擴(kuò)散另外。此外鉛字印刷廠、金屬冶煉、礦山開采、鉛蓄電池工業(yè)等也是重要的污染源。
[0003]鉛對(duì)動(dòng)物的危害則是慢性累積中毒。人體中鉛能與多種酶結(jié)合從而干擾有機(jī)體多方面的生理活動(dòng)，對(duì)成人神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)及心血管系統(tǒng)造成損害，其中神經(jīng)系統(tǒng)比其它系統(tǒng)更谷易遭受鉛毒害。
[0004]目前，在食品安全檢測(cè)和環(huán)境監(jiān)測(cè)中，重金屬鉛的檢測(cè)大都采用儀器法，如原子吸收光譜法、電感耦合等離子體質(zhì)譜分析法等，以及化學(xué)顯色法。儀器法，其檢測(cè)結(jié)果精確，但是普遍存在儀器昂貴、對(duì)檢測(cè)樣品要求高、需專業(yè)技術(shù)人員操作和在大量樣品檢測(cè)時(shí)耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)等問(wèn)題。而化學(xué)顯色法，其靈敏度不夠高、較易受樣品中其他物質(zhì)的干擾，在檢測(cè)大量樣品時(shí)，存在所需耗材較多和所需時(shí)間較長(zhǎng)等問(wèn)題。因此，在突發(fā)性食品安全和環(huán)境污染問(wèn)題以及需要大規(guī)模食品安全普查和環(huán)境狀況監(jiān)測(cè)時(shí)，需要一種更簡(jiǎn)便、快速和高通量的檢測(cè)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，該方法簡(jiǎn)便、快速以及能夠高通量的檢測(cè)環(huán)境中的鉛含量。本發(fā)明還提供了一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析檢測(cè)試劑盒。
[0006]本發(fā)明第一方面提供了一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，包括以下步驟:
[0007](I)取濃度為100_200ng/ml的鉛完全抗原，將所述鉛完全抗原包被至固相載體表面，4-6 °C包被14-16h，洗滌所述固相載體，隨后加入封閉緩沖液封閉所述固相載體表面的空白位置，37-40 °C封閉l_3h，隨后洗滌所述固相載體；
[0008](2)取待測(cè)樣品和濃度為50-100ng/ml的酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，所述待測(cè)樣品中的鉛離子與螯合劑通過(guò)化學(xué)鍵連接，加入至步驟(I)獲得的固相載體中，輕輕振蕩混勻，然后在37-40 °(:避光環(huán)境中反應(yīng)30-50min;隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體;所述酶標(biāo)記抗體復(fù)合物為辣根過(guò)氧化物酶和單克隆抗體的偶聯(lián)復(fù)合物；
[0009](3)在步驟(2)得到的固相載體中加入辣根過(guò)氧化物酶顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)并測(cè)定光密度值或通過(guò)加入辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)并測(cè)定光信號(hào)，根據(jù)光密度值或光信號(hào)與鉛濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所述待測(cè)樣品中鉛的含量。
[0010]其中，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過(guò)化學(xué)鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯(lián)。
[0011]其中，所述具有硫氰基的雙功能螯合劑為1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸或p-SCN-Bn-DTPA，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
[0012]其中，步驟(I)中所述鉛完全抗原的制備方法為:
[0013]將含有鉛離子的溶液逐滴加入到所述1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N_四乙酸溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)3_5h，超濾除去未反應(yīng)的1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸和鉛離子，重懸后，制得鉛離子-雙功能螯合劑復(fù)合物；
[0014]將所述鉛離子-雙功能螯合劑復(fù)合物逐滴加入到含有載體蛋白的緩沖體系中制得反應(yīng)混合液，室溫下反應(yīng)24h，反應(yīng)結(jié)束后離心超濾或透析除去未反應(yīng)的鉛離子和雙功能螯合劑，制得鉛完全抗原，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過(guò)化學(xué)鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯(lián)。其中，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為:
[0015]將所述雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA與所述載體蛋白反應(yīng)24h，反應(yīng)后超濾除去未反應(yīng)的P-SCN-Bn-DTPA，重懸后，制得雙功能螯合劑-載體蛋白復(fù)合物；
[0016]在所述雙功能螯合劑-載體蛋白復(fù)合物中逐滴加入含有鉛離子的溶液反應(yīng)l-3h，超濾去除未螯合的鉛離子，制得鉛完全抗原，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過(guò)化學(xué)鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯(lián)。
[0017]其中，所述酶標(biāo)記抗體復(fù)合物的制備方法為:
[0018](I)稱取辣根過(guò)氧化物酶，溶解制得辣根過(guò)氧化物酶溶液;將Na14溶液逐滴加入到辣根過(guò)氧化物酶溶液中，室溫避光攪拌30-40min后，透析過(guò)夜；
[0019](2)收集透析液，調(diào)節(jié)所述透析液的pH值至9.0-9.5，然后加入溶有單克隆抗體的碳酸鹽緩沖液，室溫避光條件下，緩慢攪拌反應(yīng)2-4h;隨后加入NaBH4溶液，充分混勻后，于4°C靜置2-4h;透析過(guò)夜，純化后制得所述酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。
[0020]其中，所述辣根過(guò)氧化物酶顯色劑為3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺，所述辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑為3-氨基鄰苯二甲酰肼或4-氨基鄰苯二甲酰肼。
[0021]其中，步驟(2)中加入100-200μ1濃度為100ng/ml的所述酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。
[0022]其中，在步驟(I)之前，采用棋盤滴定法確定抗原抗體的最佳反應(yīng)濃度。
[0023]本發(fā)明第一方面提供的一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，首次通過(guò)待測(cè)樣品與鉛完全抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體并通過(guò)顯色反應(yīng)放大信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品中鉛含量的檢測(cè)，以單克隆抗體為基礎(chǔ)建立的免疫分析方法，具有特異性高，穩(wěn)定性好的特點(diǎn)，本發(fā)明實(shí)施例提供的檢測(cè)鉛的免疫分析方法為一步法競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法，簡(jiǎn)便、快速且能夠高通量檢測(cè)。
[0024]本發(fā)明第二方面提供了一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析檢測(cè)試劑盒，包括:包被有鉛完全抗原的固相載體、鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鉛的單克隆抗體，以及包括辣根過(guò)氧化物酶顯色劑或辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑。
[0025]本發(fā)明實(shí)施例第二方面中所述鉛完全抗原、所述固相載體、所述辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鉛的單克隆抗體、所述辣根過(guò)氧化物酶顯色劑和所述辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑均如第一方面所述。
[0026]本發(fā)明第二方面提供的快速檢測(cè)鉛的免疫分析檢測(cè)試劑盒，能夠用于快速檢測(cè)鉛，應(yīng)用較為簡(jiǎn)便。
[0027]綜上，本發(fā)明有益效果包括以下幾個(gè)方面:
[0028]1、本發(fā)明提供的一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，通過(guò)待測(cè)樣品與鉛完全抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的單克隆抗體并通過(guò)顯色反應(yīng)放大信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品中鉛含量的檢測(cè)，方法簡(jiǎn)便、快速且能夠高通量檢測(cè)待測(cè)樣品中的鉛；
[0029]2、本發(fā)明還提供了一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析檢測(cè)試劑盒，能夠用于快速檢測(cè)鉛，應(yīng)用較為簡(jiǎn)便。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下所述是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031]本發(fā)明第一方面提供了一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，包括以下步驟:
[0032](I)取濃度為100-200ng/ml的鉛完全抗原，將鉛完全抗原包被至固相載體表面，4-6°C包被14-16h，洗滌固相載體，隨后加入封閉緩沖液封閉固相載體表面的空白位置，37-40°C封閉l_3h，隨后洗滌固相載體；
[0033](2)取待測(cè)樣品和濃度為50-100ng/ml的酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，待測(cè)樣品中的鉛離子與螯合劑通過(guò)化學(xué)鍵連接，加入至步驟(I)獲得的固相載體中，輕輕振蕩混勻，然后在37-40°(:避光環(huán)境中反應(yīng)30-50min;隨后用洗滌緩沖液洗滌固相載體;酶標(biāo)記抗體復(fù)合物為辣根過(guò)氧化物酶和單克隆抗體的偶聯(lián)復(fù)合物；
[0034](3)在步驟(2)得到的固相載體中加入辣根過(guò)氧化物酶顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)并測(cè)定光密度值或通過(guò)加入辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)并測(cè)定光信號(hào)，根據(jù)光密度值或光信號(hào)與鉛濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算待測(cè)樣品中鉛的含量。
[0035]本發(fā)明一實(shí)施方式中，在步驟(I)之前，采用棋盤滴定法確定抗原抗體的最佳反應(yīng)濃度。
[0036]本發(fā)明一實(shí)施方式中，棋盤滴定法的操作方法，包括以下步驟:
[0037](I)用包被緩沖液，將鉛完全抗原梯度稀釋為2000，1000，500，250，100，50ng/ml，每孔10yL加入到96-微孔板中；該包被緩沖液為濃度為0.05M，pH 9.6的碳酸鹽緩沖液；
[0038](2)將微孔板置于密封袋中，防止孔內(nèi)液體揮發(fā)，4°C包被16h;
[0039](3)傾去孔內(nèi)液體，加入PBS-T(PBS-T為濃度為0.015M，pH 7.4的磷酸鹽緩沖液，其中含0.05 % Tween 20)，放置I Os，然后棄板孔液并置于干凈的吸水紙上使板孔內(nèi)液體吸干，重復(fù)3次；
[0040](4)每孔中加入200yL封閉緩沖液，將微孔板密封后，置于37 °C封閉Ih;
[0041 ] (5)重復(fù)洗板操作(3);
[0042](6)取出需要數(shù)目的微孔，將梯度稀釋的酶標(biāo)記抗體復(fù)合物(濃度分別為1000，500，250，100,50,25,10,5ng/ml)加入到相應(yīng)地微孔板中，輕輕振蕩混勻，密封后置于37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min;
[0043](7)重復(fù)操作(3);
[0044](8)依次加入TMB底物顯色液A液與底物液B液各50yL于微孔中，振蕩混勻，置室溫避光環(huán)境中反應(yīng)1min;
[0045](9)每孔中加入50yL終止液(2M硫酸溶液)，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔OD值，根據(jù)每孔OD值，確定抗原抗體的最佳反應(yīng)濃度。
[0046]本發(fā)明一實(shí)施方式中，鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，雙功能螯合劑的一端與鉛離子通過(guò)化學(xué)鍵連接，雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與載體蛋白的氨基偶聯(lián)。
[0047]本發(fā)明一實(shí)施方式中，具有硫氰基的雙功能螯合劑為1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸(iEDTA)或p-SCN-Bn-DTPA，載體蛋白為牛血清白蛋白(BSA)或卵清蛋白(OVA)0
[0048]本發(fā)明一實(shí)施方式中，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為:
[0049]將含有鉛離子的溶液逐滴加入到1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N_四乙酸溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)3-5h，超濾除去未反應(yīng)的1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸和鉛離子，重懸后，制得鉛離子-雙功能螯合劑復(fù)合物；
[0050]將鉛離子-雙功能螯合劑復(fù)合物逐滴加入到含有載體蛋白的緩沖體系中制得反應(yīng)混合液，室溫下反應(yīng)24-26h，反應(yīng)結(jié)束后離心超濾或透析除去未反應(yīng)的鉛離子和雙功能螯合劑，制得鉛完全抗原，鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，雙功能螯合劑的一端與鉛離子通過(guò)化學(xué)鍵連接，雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與載體蛋白的氣基偶聯(lián)。
[0051 ]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，鉛離子與1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N_四乙酸(iEDTA)的摩爾比為1:1。
[0052]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N_四乙酸溶液為將1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸溶解在二甲基亞砜中制得。
[0053]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，攪拌速度為125rpm。
[0054]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，加入三乙胺溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)混合液的pH為9.0-9.5。
[0055]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，含有載體蛋白的緩沖體系為載體蛋白溶解于pH值為7.4的Tris-HCl緩沖液中制得，Tris-HCl緩沖液的摩爾濃度為0.lmol/L。
[0056]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，牛血清白蛋白與鉛離子的摩爾比為1:44-50。
[0057]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，卵清蛋白與鉛離子的摩爾比為1:17-20。
[0058]本發(fā)明一實(shí)施方式中，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為:
[0059]將雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA與載體蛋白反應(yīng)24_26h，反應(yīng)后超濾除去未反應(yīng)的p-SCN-Bn-DTPA，重懸后，制得雙功能螯合劑-載體蛋白復(fù)合物；
[0060]在雙功能螯合劑-載體蛋白復(fù)合物中逐滴加入含有鉛離子的溶液反應(yīng)l-3h，超濾去除未螯合的鉛離子，制得鉛完全抗原，鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，雙功能螯合劑的一端與鉛離子通過(guò)化學(xué)鍵連接，雙功能螯合劑的另一端的硫氛基與載體蛋白的氣基偶聯(lián)。
[0061 ]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，將雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA與載體蛋白在緩沖體系中反應(yīng)，緩沖體系為pH值為9.4的HEPES緩沖液。
[0062]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，超濾條件為4°C且6000r/min。
[0063]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。
[0064]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，牛血清白蛋白與鉛離子的摩爾比為1:44-50。
[0065]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，卵清蛋白與鉛離子的摩爾比為1:17-20。
[0066]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，雙功能螯合劑p-SCN-Bn-DTPA和卵清蛋白的質(zhì)量比為1:3-4。
[0067]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，固相載體為聚苯乙烯酶標(biāo)板、聚苯乙烯珠、尼龍膜、聚偏氟乙烯膜、硝酸纖維素膜或磁性微珠。
[0068]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(I)中的封閉緩沖液為含有質(zhì)量濃度為3%的小牛血清白蛋白或質(zhì)量濃度為5 %的脫脂奶粉，封閉緩沖液的pH值為7.4。
[0069]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(I)中洗滌緩沖液為濃度為0.015M且pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液，該磷酸鹽緩沖液中還含有質(zhì)量濃度為0.05 %的吐溫20。
[0070]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，待測(cè)樣品為含有鉛離子的環(huán)境樣品。
[0071]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，將環(huán)境樣品進(jìn)行常規(guī)的預(yù)處理，然后加入EDTA螯合形成Pb2+-EDTA,將該待測(cè)樣品進(jìn)行免疫分析以檢測(cè)待測(cè)樣品中的鉛含量。
[0072]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為:
[0073]稱取0.5mg iEDTA，用10yLDMSO溶解；隨后將10yL含有I.ΟμΜ Pb2+的溶液逐滴加入到iEDTA溶液中，25 °C、125rpm反應(yīng)3h，形成金屬-螯合劑復(fù)合物;然后將金屬-螯合劑復(fù)合物逐滴加入到5mg OVA溶液(用800yL，0.lM，pH7.4Tris-HCl緩沖液)中，加入三乙胺溶液，調(diào)節(jié)反應(yīng)混合液的pH為9.0-9.5；250C、125rpm反應(yīng)24h；反應(yīng)結(jié)束后，用反應(yīng)液加入到已經(jīng)用
0.1M EDTA.2Na預(yù)處理的超濾管中，5000g離心超濾5次，每次lOmin，除去未偶聯(lián)上的金屬和螯合劑;最后用PBS緩沖液重懸截留物，得到總體積為ImL的抗原溶液，經(jīng)鑒定后分裝，置于-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0074]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，加入100_200μ1濃度為100ng/ml的酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。
[0075]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，單克隆抗體為小鼠制備的抗Pb2+-EDTA的單克隆抗體4B7。
[0076]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，酶標(biāo)記抗體復(fù)合物的制備方法為:
[0077](I)稱取辣根過(guò)氧化物酶，溶解制得辣根過(guò)氧化物酶溶液;將Na14溶液逐滴加入到辣根過(guò)氧化物酶溶液中，室溫避光攪拌30-40min后，透析過(guò)夜；
[0078](2)收集透析液，調(diào)節(jié)透析液的pH值至9.0-9.5，然后加入溶有單克隆抗體的碳酸鹽緩沖液，室溫避光條件下，緩慢攪拌反應(yīng)2-4h;隨后加入NaBH4溶液，充分混勻后，于4°C靜置2-4h;透析過(guò)夜，純化后制得酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。
[0079]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，上述步驟(2)純化的步驟為:收集透析液，置于4°C層析柜中，在攪拌狀態(tài)下，逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻后，靜置過(guò)夜;4°C，7500rpm離心30min后，棄上層清液，用磷酸鹽緩沖液重懸沉淀;將重懸后的溶液裝入透析袋，用磷酸鹽緩沖液，4°C透析，以去除小分子物質(zhì)，將收集的透析液于4°C，1000rpm離心30min后，收集上層清液即為酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。
[0080]本發(fā)明一實(shí)施方式中，步驟(5)中，辣根過(guò)氧化物酶顯色劑為3，3’，5，5’_四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑為3-氨基鄰苯二甲酰肼或4-氨基鄰苯二甲酰肼。顯色反應(yīng)為先加入辣根過(guò)氧化物酶顯色劑再加入終止液終止顯色，隨后用酶標(biāo)儀測(cè)定光密度。發(fā)光反應(yīng)為先加入辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑再加入終止液終止發(fā)光，隨后用熒光檢測(cè)儀測(cè)定發(fā)光強(qiáng)度。
[0081 ]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，對(duì)TMB的來(lái)源不做特殊限定，可購(gòu)買得到。
[0082]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法和本發(fā)明第一方面提供的檢測(cè)鉛的免疫分析方法相同，區(qū)別僅在于步驟(2)中在固相載體加入按濃度梯度稀釋的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液而不是待測(cè)樣品；根據(jù)鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度和光密度值或光信號(hào)的線性關(guān)系，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0083]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液為鉛離子-螯合劑復(fù)合物(Pb2+-EDTA)。
[0084]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度梯度為200,100,50,25,10,5,2.5,
I,Ong/mlo
[0085]本發(fā)明一實(shí)施方式中，碳酸鹽緩沖液的濃度為0.05M且pH值為9.6，洗滌緩沖液含有濃度為0.015M且pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液和質(zhì)量濃度為0.05%的吐溫20，稀釋緩沖液為pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液。
[0086]本發(fā)明第一方面提供的本發(fā)明實(shí)施例提供了一種檢測(cè)鉛的免疫分析方法，通過(guò)待測(cè)樣品與鉛完全抗原競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鉛的單克隆抗體并通過(guò)顯色反應(yīng)放大信號(hào)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)樣品中鉛含量的檢測(cè)。本發(fā)明實(shí)施例提供的一種檢測(cè)鉛的免疫分析方法為一步法競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫分析方法，簡(jiǎn)便、快速且能夠高通量檢測(cè)。
[0087]本發(fā)明第二方面提供了一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析檢測(cè)試劑盒，包括:包被有鉛完全抗原的固相載體、鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鉛的單克隆抗體，以及包括辣根過(guò)氧化物酶顯色劑或辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑。
[0088]本發(fā)明實(shí)施例第二方面中鉛完全抗原、固相載體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗鉛的單克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶顯色劑和辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑均如第一方面。
[0089]本發(fā)明一優(yōu)選實(shí)施方式中，鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液為鉛離子-螯合劑復(fù)合物(Pb2+-EDTA)。
[0090]本發(fā)明第二方面提供的快速檢測(cè)鉛的免疫分析檢測(cè)試劑盒，能夠用于快速檢測(cè)鉛，應(yīng)用較為簡(jiǎn)便。
[0091 ] 實(shí)施例一
[0092]一種鉛完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0093]稱取0.5mgiEDTA，用10yL DMSO溶解，制得iEDTA溶液；隨后將10yL含有1.0ymolPb2+的溶液逐滴加入到iEDTA溶液中，25°C、125rpm反應(yīng)3h，制得Pb2+_iEDTA復(fù)合物。將1.5mgBSA溶解于800yL，0.1M，pH值為7.4Tris_HCl緩沖液中制得含有BSA的緩沖體系;然后將Pb2+-1EDTA復(fù)合物逐滴加入到含有BSA的緩沖體系中制得反應(yīng)混合液;加入三乙胺溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)混合液的pH值為9.0，25°C、125rpm反應(yīng)24h ；反應(yīng)結(jié)束后，用反應(yīng)混合液加入到已經(jīng)用0.1MEDTA.2Na預(yù)處理的超濾管中，5000g離心超濾5次，每次lOmin，除去未偶聯(lián)上的Pb2+和iEDTA。收集離心超濾的截留物即為鉛完全抗原。最后可用PBS緩沖液重懸截留物，得到總體積為ImL的鉛完全抗原溶液。鉛完全抗原溶液可經(jīng)鑒定后分裝，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0094]實(shí)施例二
[0095]一種鉛完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0096]稱取0.5mgiEDTA，用10yL DMSO溶解，制得iEDTA溶液；隨后將10yL含有1.0ymolPb2+的溶液逐滴加入到iEDTA溶液中，25°C、125rpm反應(yīng)3h，制得Pb2+-1EDTA復(fù)合物。將5mgOVA溶解于800yL，0.1M，pH值為7.4Tris_HCl緩沖液中制得含有BSA的緩沖體系;然后將Pb2+-1EDTA復(fù)合物逐滴加入到含有OVA的緩沖體系中制得反應(yīng)混合液;加入三乙胺溶液調(diào)節(jié)反應(yīng)混合液的pH值為9.0，25°C、125rpm反應(yīng)24h ；反應(yīng)結(jié)束后，用反應(yīng)液加入到已經(jīng)用0.1MEDTA.2Na預(yù)處理的超濾管中，5000g離心超濾5次，每次lOmin，除去未偶聯(lián)上的Pb2+和iEDTA;收集離心超濾的截留物即為鉛完全抗原;最后可用PBS緩沖液重懸截留物，得到總體積為ImL的鉛完全抗原溶液;鉛完全抗原溶液可經(jīng)鑒定后分裝，置于-20°C保存?zhèn)溆谩?br>[0097]實(shí)施例三
[0098]一種鉛完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0099]先將2mg的p-SCN-Bn-DTPA和4.0mg的BSA蛋白在pH值為9.4的HEPES緩沖液中反應(yīng)24h后，在4°C、6000r/min的條件下，超濾5min去除未偶聯(lián)上的p-SCN-Bn-DTPA，再用pH值為7.4的HEPES緩沖液洗取截留物，然后逐滴加入10yL含有3.0ymol Pb2+的溶液，室溫反應(yīng)Ih后，超濾去除未螯合的Pb2+;收集超濾的截留物即為鉛完全抗原;可再用反應(yīng)緩沖液稀釋截留物，最終得到2mL的溶液。使用前，用lOOmmol/L DTPA和0.lmol/L，pH7.4的HEPES緩沖液對(duì)超濾離心管預(yù)處理。
[0100]實(shí)施例四
[0101]—種鉛完全抗原的制備方法，包括以下步驟:
[0102]先將2mg的p-SCN-Bn-DTPA和6.5mg的OVA蛋白在pH值為9.4的HEPES緩沖液中反應(yīng)24h后，在4°C、6000r/min的條件下，超濾5min去除未偶聯(lián)上的p-SCN-Bn-DTPA，再用pH值為7.4的HEPES緩沖液洗取截留物，然后逐滴加入10yL含有3.0ymol Pb2+的溶液，室溫反應(yīng)Ih后，超濾去除未螯合的Pb2+;收集超濾的截留物即為鉛完全抗原;可再用反應(yīng)緩沖液稀釋截留物，最終得到2mL的溶液;使用前，用lOOmmol/L DTPA和0.lmol/L，pH7.4的HEPES緩沖液對(duì)超濾離心管預(yù)處理。
[0103]實(shí)施例五
[0104]—種酶標(biāo)記抗體復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟:
[0105](I)稱取2mg辣根過(guò)氧化物酶，溶解于ImL去離子水中制得辣根過(guò)氧化物酶溶液;將200yL 0.1M Na14溶液(現(xiàn)配)逐滴加入到辣根過(guò)氧化物酶溶液中，室溫避光攪拌30min得到反應(yīng)液;隨后將反應(yīng)液裝入透析袋中，用lmM，pH值為4.4醋酸鈉緩沖液在4°C條件下透析過(guò)夜；
[0106](2)收集透析袋中的透析液，用0.05M，pH值為9.6的碳酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)透析液的pH值至9.0-9.5，然后立即加入ImL溶有50yg抗鉛的單克隆抗體的碳酸鹽緩沖液，室溫避光條件下，緩慢攪拌反應(yīng)2h;隨后加入10yL，4mg/mL NaBH4溶液(現(xiàn)配)，充分混勻后，于4 °C靜置2h;然后將反應(yīng)液裝入透析袋中，用0.015M pH值為7.4的磷酸鹽緩沖液在4°C條件下透析過(guò)夜；
[0107](3)收集透析液，置于4°C層析柜中，在攪拌狀態(tài)下，逐滴加入等體積的飽和硫酸銨溶液，混勻后，靜置過(guò)夜；4°C，7500rpm離心30min后，棄上層清液，用磷酸鹽緩沖液重懸沉淀;將重懸后的溶液裝入透析袋，用磷酸鹽緩沖液，4°C透析，以去除小分子物質(zhì)，將收集的透析液于4°C，1000rpm離心30min后，收集上層清液，制得酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。經(jīng)鑒定后分裝，置于-20°C保存。
[0108]實(shí)施例六[0109 ] —種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，包括以下步驟:
[0110](—)、棋盤滴定確定抗原抗體的最佳反應(yīng)濃度
[0111](I)用包被緩沖液(0.05M，pH 9.6碳酸鹽緩沖液)將檢測(cè)抗原梯度稀釋(2000，1000，500，250，100，50ng/ml)，每孔10yL加入到96-微孔板中；
[0112](2)將板置于密封袋中，防止孔內(nèi)液體揮發(fā)，4°C包被16h;
[0113](3)傾去孔內(nèi)液體，加入PBS-T(0.015M，pH 7.4磷酸鹽緩沖液，含0.05 % Tween20)，放置10s，然后棄板孔液并置于干凈的吸水紙上使板孔內(nèi)液體吸干，重復(fù)3次；
[0114](4)每孔中加入200yL封閉緩沖液(5%脫脂奶粉)，將板密封后，置于37°C封閉Ih;
[0115](5)重復(fù)洗板操作(3);
[0116](6)取出需要數(shù)目的微孔，將梯度稀釋的純化辣根過(guò)氧化物酶和單克隆抗體偶聯(lián)復(fù)合物(1000,500,250,100,50,25,10,5ng)加入到相應(yīng)地微孔板中，輕輕振蕩混勻，密封后置于37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min;
[0117](7)重復(fù)操作(3);
[0118](8)依次加入TMB底物顯色液A液與底物液B液各50yL于微孔中，振蕩混勻，置室溫避光環(huán)境中反應(yīng)1min;
[0119](9)每孔中加入50yL終止液(2M硫酸溶液)，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔OD值。
[0120](二)、快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法
[0121](I)用包被緩沖液(0.05M，pH 9.6碳酸鹽緩沖液)將最佳濃度的檢測(cè)抗原稀釋(200ng/ml)，每孔10yL加入到96-微孔板中；
[0122](2)將板置于密封袋中，防止孔內(nèi)液體揮發(fā)，4°C包被16h;
[0123](3)傾去孔內(nèi)液體，加入PBS_T(0.015M，pH 7.4磷酸鹽緩沖液，含0.05 % Tween20)，放置10s，然后棄板孔液并置于干凈的吸水紙上使板孔內(nèi)液體吸干，重復(fù)3次；
[0124](4)每孔中加入200yL封閉緩沖液(5%脫脂奶粉)，將板密封后，置于37°C封閉Ih;
[0125](5)重復(fù)洗板操作(3);
[0126](6)取出需要數(shù)目的微孔，將梯度稀釋的小分子抗原標(biāo)準(zhǔn)品(Pb2+-EDTA,200，100，50,25,10,5,2.5,1 ,Ong)加入到相應(yīng)地微孔板中，同時(shí)將樣品加入到樣品微孔板中，再往標(biāo)準(zhǔn)品和樣品微孔板中均加入ΙΟΟμΙ辣根過(guò)氧化物酶和單克隆抗體偶聯(lián)復(fù)合物(100ng/ml)輕輕振蕩混勻，密封后置于37°C避光環(huán)境中反應(yīng)30min;
[0127](7)重復(fù)操作(3);
[0128](8)依次加入TMB底物顯色液A液與底物液B液各50yL于微孔中，振蕩混勻，置室溫避光環(huán)境中反應(yīng)1min;
[0129](9)每孔中加入50yL終止液(2M硫酸溶液)，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處測(cè)定每孔OD值。
[0130](10)通過(guò)測(cè)得的OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中重金屬鉛的濃度。
[0131]以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，其特征在于，包括以下步驟: (1)取濃度為100-200ng/ml的鉛完全抗原，將所述鉛完全抗原包被至固相載體表面，4-6°C包被14-16h，洗滌所述固相載體，隨后加入封閉緩沖液封閉所述固相載體表面的空白位置，37-40 0C封閉l_3h，隨后洗滌所述固相載體； (2)取待測(cè)樣品和濃度為50-100ng/ml的酶標(biāo)記抗體復(fù)合物，所述待測(cè)樣品中的鉛離子與螯合劑通過(guò)化學(xué)鍵連接，加入至步驟(I)獲得的固相載體中，輕輕振蕩混勻，然后在37-40°(:避光環(huán)境中反應(yīng)30-50min;隨后用洗滌緩沖液洗滌所述固相載體;所述酶標(biāo)記抗體復(fù)合物為辣根過(guò)氧化物酶和單克隆抗體的偶聯(lián)復(fù)合物； (3)在步驟(2)得到的固相載體中加入辣根過(guò)氧化物酶顯色劑進(jìn)行顯色反應(yīng)并測(cè)定光密度值或通過(guò)加入辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑進(jìn)行發(fā)光反應(yīng)并測(cè)定光信號(hào)，根據(jù)光密度值或光信號(hào)與鉛濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算所述待測(cè)樣品中鉛的含量。2.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，其特征在于，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過(guò)化學(xué)鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯(lián)。3.如權(quán)利要求2所述的快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，其特征在于，所述具有硫氰基的雙功能螯合劑為1_( 4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸或p-SCN-Bn-DTPA，所述載體蛋白為牛血清白蛋白或卵清蛋白。4.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，其特征在于，步驟(I)中所述鉛完全抗原的制備方法為: 將含有鉛離子的溶液逐滴加入到所述1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸溶液中，室溫下攪拌反應(yīng)3-5h，超濾除去未反應(yīng)的1-(4-異硫氰芐基)乙烯基二胺-N，N，N，N-四乙酸和鉛離子，重懸后，制得鉛離子-雙功能螯合劑復(fù)合物； 將所述鉛離子-雙功能螯合劑復(fù)合物逐滴加入到含有載體蛋白的緩沖體系中制得反應(yīng)混合液，室溫下反應(yīng)24-26h，反應(yīng)結(jié)束后離心超濾或透析除去未反應(yīng)的鉛離子和雙功能螯合劑，制得鉛完全抗原，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過(guò)化學(xué)鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯(lián)。5.如權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，其特征在于，步驟(I)中鉛完全抗原的制備方法為: 將所述雙功能螯合劑P-SCN-Bn-DTPA與所述載體蛋白反應(yīng)24_26h，反應(yīng)后超濾除去未反應(yīng)的P-SCN-Bn-DTPA，重懸后，制得雙功能螯合劑-載體蛋白復(fù)合物； 在所述雙功能螯合劑-載體蛋白復(fù)合物中逐滴加入含有鉛離子的溶液反應(yīng)l_3h，超濾去除未螯合的鉛離子，制得鉛完全抗原，所述鉛完全抗原由具有硫氰基的雙功能螯合劑連接鉛離子與載體蛋白形成，所述雙功能螯合劑的一端與所述鉛離子通過(guò)化學(xué)鍵連接，所述雙功能螯合劑的另一端的硫氰基與所述載體蛋白的氨基偶聯(lián)。6.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，其特征在于，所述酶標(biāo)記抗體復(fù)合物的制備方法為: (I)稱取辣根過(guò)氧化物酶，溶解制得辣根過(guò)氧化物酶溶液;將Na14溶液逐滴加入到所述辣根過(guò)氧化物酶溶液中，室溫避光攪拌30-40min后，透析過(guò)夜； (2)收集透析液，調(diào)節(jié)所述透析液的pH值至9.0-9.5，然后加入溶有單克隆抗體的碳酸鹽緩沖液，室溫避光條件下，緩慢攪拌反應(yīng)2-4h;隨后加入NaBH4溶液，充分混勻后，于4°C靜置2-4h;透析過(guò)夜，純化后制得所述酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。7.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，其特征在于，所述辣根過(guò)氧化物酶顯色劑為3，3 ’，5，5 ’ -四甲基聯(lián)苯胺，所述辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑為3-氨基鄰苯二甲酰肼或4-氨基鄰苯二甲酰肼。8.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，其特征在于，步驟(2)中加入100-200μ1濃度為100ng/ml的所述酶標(biāo)記抗體復(fù)合物。9.如權(quán)利要求1所述的快速檢測(cè)鉛的免疫分析方法，其特征在于，在步驟(I)之前，采用棋盤滴定法確定抗原抗體的最佳反應(yīng)濃度。10.一種快速檢測(cè)鉛的免疫分析檢測(cè)試劑盒，其特征在于，包括包被有鉛完全抗原的固相載體、鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液和酶標(biāo)記抗體復(fù)合物、以及包括辣根過(guò)氧化物酶顯色劑或辣根過(guò)氧化物酶發(fā)光劑。
【文檔編號(hào)】G01N33/535GK105823881SQ201610329693
【公開日】2016年8月3日
【申請(qǐng)日】2016年5月18日
【發(fā)明人】王蒲, 鄭威, 盧曉華
【申請(qǐng)人】深圳先進(jìn)技術(shù)研究院