用于快速檢測食用向日葵雜交種sh338真實性的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，所述試劑盒包括各自獨立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，所述引物液部分含有如下引物SR-123、引物SR-889和引物SR-1114中的至少一種。所述試劑盒可以在短時間內(nèi)對大量待測向日葵檢測，且檢測結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定可靠。
【專利說明】
用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明屬于鑒定農(nóng)作物種子真實性和品種純度領(lǐng)域，具體設(shè)及一種基于SSR分子 標(biāo)記技術(shù)建立的可快速檢測向日葵雜交種S冊38真實性的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 向日葵化elianthus annuus L.)為菊科（Composicae)向日葵屬的雙子葉植物。 向日葵分為油用型、食用型和兼用型向日葵，染色體基數(shù)均為17,有二倍、四倍、六倍不同 倍數(shù)水平，其中栽培種為二倍體，屬蟲媒異花授粉作物，野生種在二倍、四倍、六倍等不同倍 數(shù)水平均有發(fā)現(xiàn)。自上世紀(jì)60年代W來，向日葵在世界各地得到迅速發(fā)展，其油脂產(chǎn)量僅 次于大豆。向日葵屬喜光性短日植物，全生育期有效積溫> 1800-2600°C ;耐旱耐鹽堿，耐 瘡薄，對±壤有極廣的適應(yīng)性，最適宜的±壤為壤±和沙壤±。因此，在我國北方干旱、降 雨少、±壤鹽堿化嚴(yán)重的地區(qū)，向日葵成為當(dāng)?shù)剞r(nóng)民脫貧致富、增產(chǎn)增收的經(jīng)濟作物。然而 優(yōu)良雜交種的推廣應(yīng)用需要大量優(yōu)質(zhì)種子，雜交種的真實性和純度的高低直接影響著雜交 向日葵的產(chǎn)量和農(nóng)民種植的積極性。為保護新品種和農(nóng)民的利益，降低因假種子和純度低 而導(dǎo)致的損失，迫切需要進行向日葵雜交種真實性和純度的檢驗工作，并建立一種準(zhǔn)確、簡 單、快捷的雜交種真實性和純度鑒定方法。
[0003] 傳統(tǒng)的向日葵雜交種的真實性與品種純度鑒定采用形態(tài)學(xué)鑒定法。形態(tài)學(xué)鑒定法 是依靠種子或植株的表型性狀來鑒別不同的個體，該方法比較直觀、簡便，但由于可直接觀 測的農(nóng)藝性狀十分有限，有些性狀要在特定的生育期才能檢測，有些性狀易受環(huán)境條件的 影響，從而受到很大限制，且形態(tài)鑒定法工作量大、鑒定周期長、成本高、受季節(jié)限制。關(guān)鍵 是如果混雜的材料在表型上與被鑒定雜交種的性狀完全一致，采用運種方法就無法鑒定出 偽雜種。
[0004] 隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，分子標(biāo)記技術(shù)越來越多的應(yīng)用于農(nóng)作物種子的真實 性與品種純度鑒定。分子標(biāo)記鑒定技術(shù)是W DNA分子多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標(biāo)記，能穩(wěn) 定遺傳，可W反映生物的個體和群體特征。由于分子標(biāo)記可W直接反映 DNA水平上的差 異，具有高度的專一性和特異性，用于鑒定種子純度的分子標(biāo)記主要的方法有RAPD、SSR和 SCAR。其中SSR(simple sequence repeats)標(biāo)記技術(shù)具有數(shù)量豐富、多態(tài)性高、共顯性遺 傳、擴增穩(wěn)定、易于檢測等方面的優(yōu)點，已在許多農(nóng)作物遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、遺傳多樣性、 標(biāo)記和定位基因 W及分子標(biāo)記輔助方面的應(yīng)用。SSR標(biāo)記通常具有共顯性的特點，F(xiàn)i雜交 種具有雙親等位基因的互補帶型。鑒于不育系和其同型保持系遺傳背景基本一致，只在不 育基因、保持基因等特征基因上存在差異，據(jù)此特征基因選擇DNA分子標(biāo)記進行分析，從而 實現(xiàn)有效地區(qū)別和鑒定。SSR標(biāo)記已成為現(xiàn)階段用于鑒定種子純度的常用方法，已廣泛應(yīng) 用于玉米、水稻、大豆的新品種純度鑒定。但是目前在食用向日葵雜交種使用SSR分子標(biāo)記 技術(shù)鑒定其真實性和純度的報道鮮有，建立一套適于食用向日葵雜交種真實性和純度鑒定 的SSR分子標(biāo)記技術(shù)具有重要意義，可W克服傳統(tǒng)的田間小區(qū)種植鑒定所帶來的不足。 陽0化]SH338是北京=瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司2014年選育的食用向日葵中熟雜交種，其親 本組合為A03-6 X 06R-2,生育期105天左右，長勢旺，植株整齊度好；幼苗綠色，幼莖綠帶紫 色；葉片呈屯、臟形，葉脈明顯，葉片較大，植株呈塔形，舌狀花和管狀花為黃色，花藥為紫色； 株高223厘米，花盤直徑20. 3厘米，巧粒排列緊密度中等，群體生長整齊度中等，平均不育 株率〇%，平均分枝株率0.3% ;百粒重17. 5克，巧仁率51. 1%，結(jié)實率73. 5%，單盤粒重 106. 9克4子粒長度2. 27厘米，寬0. 84厘米4子粒長卵形，顏色為褐底白邊稍有白紋4子粒 排列緊密中等，花盤傾斜度4-5級，盤面形狀平；盤腐型菌核病、褐斑病、黑斑病0-2級，根 莖腐型菌核病、誘病、霜霉病0-1級，黃萎病0-3級，莖腐病株率0. 2%，平均倒伏（含倒折） 率3. 4%，平均折莖率1. 6 %?？剐詮?，耐鹽堿，產(chǎn)量高而穩(wěn)定，較大面積生產(chǎn)的同類品種增 產(chǎn)9. 1%-13.3%，商品性好。為保證該優(yōu)質(zhì)品種的最大經(jīng)濟效益及其產(chǎn)業(yè)化的發(fā)展，需要 一種權(quán)威的、高效準(zhǔn)確的檢測方法來鑒定所述食用向日葵雜交種甜338的真實性和品種純 度，加快雜交種的質(zhì)量檢測進程。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為此，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于提供一種可快速鑒定食用向日葵雜交種 SH338真實性的試劑盒，所述試劑盒使用方便、快捷，能夠在短時間內(nèi)對大量的待測食用向 日葵雜交種S冊38樣品進行快速鑒定，測定結(jié)果準(zhǔn)確穩(wěn)定可靠。
[0007] 為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種用于快速檢測食用向日葵雜交種S冊38 真實性的試劑盒，所述試劑盒包括各自獨立包裝的引物液、PCR反應(yīng)液和DNA聚合酶部分， 其中，所述引物液部分含有如下SR-123、SR-889和SR-1114引物中的至少一種：
[0008] SR-123-F: 5' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，；
[0009] SR-123-R:5'-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,；
[0010] SR-889-F: 5，-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，；
[0011] SR-889-R: 5 > -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3 > ;
[0012] SR-1114-F: 5> -AGATGGTGGCAGGAGAGTTMAG-3> ;
[0013] SR-1114-R: 5' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3，。
[0014] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，所述引物液部分 中的引物為引物SR-123、引物SR-889和引物SR-1114中的任意兩種。
[0015] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，所述PCR反應(yīng)液 部分含有用于進行PCR擴增的含Mg 2+擴增緩沖液、dNTPs W及d地2〇。
[0016] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種甜338真實性的試劑盒，所述DNA聚合酶 為化q DNA聚合酶。
[0017] 所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，每支所述試劑盒 的配方為： 陽0化]引物液，0. 2yM，1化；
[0019] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ;
[0020] 10 X 含 Mg2+擴增緩沖液，2mM，2. 5 y L ;
[0021] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ；
[0022] (1地2〇，17化。
[0023] 本發(fā)明提供了一種利用所述試劑盒快速檢測食用向日葵雜交種甜338真實性的 方法，包括如下步驟，
[0024] (1)分別取由待測食用向日葵雜交種甜338、W及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和06R-2 種植得到的向日葵真葉為材料，利用常規(guī)CTAB法提取上述各食用向日葵的基因組DNA ;
[00對 似取步驟（1)獲得的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1-5任一所述的試劑盒分 別對各所述基因組DNA進行PCR擴增；
[00%] (3)分別將步驟（2)獲得的各樣本PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳處理，獲得所述待測 食用向日葵雜交種甜338 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵A03-6和06R-2的電泳圖譜；
[0027] (4)對比上述雜交種甜338 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，若所 述雜交種S冊38同時具有其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的特征譜帶，則判定所述待測食 用向日葵雜交種甜338為真實；反之，為假。
[0028] 所述的快速檢測食用向日葵雜交種甜338真實性的方法，所述DNA模板的加入量 為30ng配制1 Ji L。
[0029] 所述的快速檢測食用向日葵雜交種甜338真實性的方法，所述步驟似中，PCR擴 增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s，之后每個循環(huán)退 火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s，進行30個循環(huán)， 最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴增產(chǎn)物4°C或-20°C保存，備用。
[0030] 本發(fā)明提供了一種所述的試劑盒在鑒定優(yōu)質(zhì)食用向日葵雜交種甜338真實性領(lǐng) 域中的用途。
[0031] 本發(fā)明提供了一種所述的快速檢測優(yōu)質(zhì)食用向日葵雜交種甜338的方法在鑒定 食用向日葵雜交種甜338真實性領(lǐng)域中的用途。
[0032] 本發(fā)明的上述技術(shù)方案相比現(xiàn)有技術(shù)具有W下優(yōu)點：
[0033] (1)本發(fā)明所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，通過 大量引物篩選研究，篩選出了引物SR-123、引物SR-889和引物SR-1114，使用上述引物中的 至少一種對待測食用向日葵雜交種SH338進行品種的鑒定，電泳圖譜清晰，在短時間內(nèi)進 行大量的食用向日葵雜交種S冊38的品種鑒定，鑒定結(jié)果穩(wěn)定、準(zhǔn)確可靠；
[0034] (2)本發(fā)明所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，操作 步驟簡單、易操作，可W高效的對食用向日葵雜交種SH338的品種鑒定，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。
【附圖說明】
[0035] 為了使本發(fā)明的內(nèi)容更容易被清楚的理解，下面根據(jù)本發(fā)明的具體實施例并結(jié)合 附圖，對本發(fā)明作進一步詳細(xì)的說明，其中
[0036] 圖1是本發(fā)明實施例1的食用向日葵雜交種甜338的電泳圖譜；
[0037] 圖2是本發(fā)明實施例2的食用向日葵雜交種甜338的電泳圖譜；
[0038] 圖3是本發(fā)明實施例3的食用向日葵雜交種甜338的電泳圖譜。
【具體實施方式】
[0039] 本發(fā)明所使用的主要試劑如下：
[0040] RNase A生產(chǎn)廠家為北京全式金生物技術(shù)有限公司，型號為GElOl ;
[0041] GelSafe核酸染料生產(chǎn)廠家為北京原平瞧生物技術(shù)有限公司，型號為EP106-01 ;
[0042] 所使用的SSR引物生產(chǎn)廠家為生工生物工程（上海）股份有限公司；
[0043] Eas^ap Buffer化r PAGE生產(chǎn)廠家為北京全式金生物技術(shù)有限公司，型號為 APl12-02 ；
[0044] dNTPs生產(chǎn)廠家為北京全式金生物技術(shù)有限公司，型號為APl 12-02 ;
[0045] ￡日3升耶DNA Polymerase化r PAGE生產(chǎn)廠家為北京全式金生物技術(shù)有限公司、型 號為 AP112-02 ;
[0046] TEMED生產(chǎn)廠家為SIGMA，型號為T8133 ;
[0047] 本發(fā)明所使用的主要設(shè)備如下：
[0048] 高速冷凍離屯、機生產(chǎn)廠家為SIGMA、型號為3K15 ;
[0049] 電泳儀生產(chǎn)廠家為北京市六一儀器廠，型號為DYY-8C ;
[0050] 水平電泳槽生產(chǎn)廠家為北京市六一儀器廠，型號為DYCP-31E ;
[0051] 凝膠成像系統(tǒng)生產(chǎn)廠家為北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，型號為化ampGel5000。 陽0巧實施例1
[0053] 本實施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，包括各自 獨立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0054] 所述引物液部分中的引物為引物SR-123,所述SR-123引物為： 陽化5] SR-123-F: 5，-GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，； 陽化6] SR-123-R: 5' -ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,。
[0057] 每支所述試劑盒的配方為： 陽0郎]引物液，0. 1化；
[0059] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ; W60] 10 X 含 Mg2+擴增緩沖液，2mM，2. 5 y L ;
[0061] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ；
[0062] (1地2〇，17化。
[0063] 利用上述試劑盒快速檢測食用向日葵雜交種甜338真實性的方法，包括如下步 驟： W64] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜338及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A03-6和06R-2種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下， W65] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用；
[0066] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次；
[0067] C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機中，于12000巧m下離屯、IOmin后，吸 取上清600 y L至離屯、管中，并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu) 成的混合液，震蕩混勻，放入4°C離屯、機中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清500 y L至 2mL離屯、管中，備用； W側(cè) d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機，12000巧111離屯、10111111，吸取上清300 ^1至1.5血離屯、管中，備用；
[0069] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀； 陽070] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0071] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0072] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0073] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔中， 180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型彌 散，則表明DNA已降解不可用；
[0074] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述DNA模板的加入量為30ng配制1 y L， 利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進行PCR擴增： 陽0巧]PCR擴增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 進行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴增產(chǎn)物4°C保存，備用；
[0076] 做分別將步驟似獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到 所述食用向日葵雜交種S冊38及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，所述 凝膠電泳包括如下步驟：
[0077] 所述凝膠電泳體系包括：
[0078] 尿素（Urea)，420g ; 陽0 巧]5 X TBE ,IOOmL;
[0080] 丙締酷胺，57g 陽0川 N、N'-亞甲基雙丙締酷胺，3g ;
[0082] (1地2〇 定容至 IL ;
[0083] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和d地2〇混合均勻制成膠混合液，待充 分溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃 度為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱； W84] B)取步驟似獲得的PCR擴增產(chǎn)物加入IOiiL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。 陽0財 （4)對比上述雜交種甜338 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，如圖 1所示，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pi A為食用向日葵雜交種甜338的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和 06R-2, Fi為食用向日葵雜交種甜338,從圖中可W看到所述待測食用向日葵雜交種甜338 同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種SH338為真實的。
[0086] 實施例2
[0087] 本實施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，包括各自 獨立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0088] 所述引物液部分中的引物為引物SR-889,所述SR-889引物：
[0089] SR-889-F: 5，-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，；
[0090] SR-889-R: 5 > -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3 >。
[0091] 每支所述試劑盒的配方為： 陽〇9引 引物液，0. 1化；
[0093] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ;
[0094] 10 X 含 Mg2+擴增緩沖液，2mM，2. 5 y L ;
[00巧]dNTPs, 2. 5mM, 2 Ji L ;
[0096] (1地2〇，17化。
[0097] 利用上述試劑盒快速檢測食用向日葵雜交種甜338真實性的方法，包括如下步 驟：
[0098] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜338及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A03-6和06R-2種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下，
[0099] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨株珠值=0. 6mm不誘鋼 珠）的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條 件下研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽100] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽W] C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機中，于1200化pm下離屯、IOmin后，吸 取上清750 y L至離屯、管中，并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu) 成的混合液，震蕩混勻，放入4°C離屯、機中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清500 y L至 2mL離屯、管中，備用； 陽102] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清400 Ji L至1. 5血離屯、管中，備用；
[0103] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀；
[0104] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得； 陽1化]將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0106] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0107] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積eXLoading Buffer混 合，并加入到含有體積比為萬分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔 中，180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型 彌散，則表明DNA已降解不可用；
[0108] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述DNA模板的加入量為30ng配制1 y L， 利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進行PCR擴增： 陽109] PCR擴增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 進行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴增產(chǎn)物-20°C保存，備用； [0110] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種S冊38及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，所述凝膠 電泳包括如下步驟： 陽111 ] 所述凝膠電泳體系包括：
[0112]尿素 OJrea)，420g ; 陽11引 5 X T邸，100血；
[0114] 丙締酷胺，57g
[0115] N、N'-亞甲基雙丙締酷胺，3g ; 陽116] (1地2〇，比；
[0117] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和d地2〇混合均勻制成膠混合液，待充 分溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃 度為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱； 陽118] B)取步驟似獲得的PCR擴增產(chǎn)物加入IOiiL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。
[0119] (4)對比上述雜交種甜338 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，如圖 2所示，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pi、Pz為食用向日葵雜交種甜338的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和 06R-2, Fi為食用向日葵雜交種甜338,從圖中可W看到所述待測食用向日葵雜交種甜338 同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種SH338為真實的。 陽120] 實施例3 陽121] 本實施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種甜338真實性的試劑盒，包括各自 獨立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0122] 所述引物液部分中的引物為引物SR-1114,所述SR-1114引物：
[0123] SR-1114-F: 5> -AGATGGTGGCAGGAGAGTTMAG-3> ;
[0124] SR-1114-R: 5' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3'。 陽1巧]每支所述試劑盒的配方為： 陽126] 引物液，0. 2yM，1化； 陽 127] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ; 陽12引 10 X含Mg2+擴增緩沖液，2mM，2. 5 y L ; 陽 129] dNTPs,2. 5mM,2iiL ； 陽 130] ddH2〇, ITiiLo 陽131] 利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種甜338真實性的方法，包括如下步 驟：
[0132] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜338及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A03-6和06R-2種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下， 陽13引 a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽134] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽13引 C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機中，于1200化pm下離屯、IOmin后，吸 取上清800 y L至離屯、管中，并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu) 成的混合液，震蕩混勻，放入4°C離屯、機中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清600 y L至 2mL離屯、管中，備用；
[0136] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清350 Ji L至1. 5血離屯、管中，備用；
[0137] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀；
[0138] f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0139] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0140] 所述定量檢測步驟具體包括：取DM樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用； 陽141] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔中， 180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型彌 散，則表明DNA已降解不可用； 陽1創(chuàng) 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述DNA模板的加入量為30ng配制1 y L， 利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進行PCR擴增， 陽143] PCR擴增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 進行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴增產(chǎn)物4°C保存，備用；
[0144] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種S冊38及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，所述凝膠 電泳包括如下步驟：
[0145] 所述凝膠電泳體系包括：
[0146] 尿素 OJrea)，420g ; 陽 147] 5 X T邸，100血；
[0148] 丙締酷胺，57g 陽149] N、N'-亞甲基雙丙締酷胺，3g ; 陽150] (1地2〇定容至IL ; 陽151] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和d地2〇混合均勻制成膠混合液，待充 分溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃 度為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱； 陽152] B)取步驟似獲得的PCR擴增產(chǎn)物加入IOiiL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。 陽153] (4)對比上述雜交種甜338 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，如圖 3所示，M為分子量標(biāo)準(zhǔn)，Pi、Pz為食用向日葵雜交種甜338的親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和 06R-2, Fi為食用向日葵雜交種甜338,從圖中可W看到所述待測食用向日葵雜交種甜338 同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種SH338為真實的。 陽154] 實施例4
[0K5] 本實施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，包括各自 獨立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中， 陽156] 所述引物液部分中的引物為引物SR-889和引物SR-1114,所述SR-889引物：
[0157] SR-889-F: 5' -ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，；
[0158] SR-889-R: 5 > -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3 > ; 陽159] 所述SR-1114引物：
[0160] SR-1114-F: 5> -AGATGGTGGCAGGAGAGTTMAG-3> ;
[0161] SR-1114-R: 5' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3'。
[0162] 每支所述試劑盒的配方為： 陽16引 引物液，0.2 yM，Iii L ;
[0164] Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. 5yL ; 陽1化]10 X含Mg2+擴增緩沖液，2mM，2. 5 y L ; 陽 166] dNTPs,2. 5mM,2iiL ； 陽 167] ddH2〇, 17 yLo
[0168] 利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種SH338真實性的方法，包括如下步 驟： 陽1例 （1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種SH338及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A03-6和06R-2種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下， 陽170] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽171] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽17引 C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機中，于1200化pm下離屯、IOmin后，吸 取上清600 y L至離屯、管中，并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu) 成的混合液，震蕩混勻，放入4°C離屯、機中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清500 y L至 2mL離屯、管中，備用；
[0173] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清300 yL至1.5血離屯、管中，備用；
[0174] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀； 陽1巧]f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌(1地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0176] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0177] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍I. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0178] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔中， 180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型彌 散，則表明DNA已降解不可用；
[0179] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述DNA模板的加入量為30ng配制1 y L， 利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進行PCR擴增， 陽180] PCR擴增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s， 進行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴增產(chǎn)物-20°C保存，備用； 陽181] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種S冊38及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，所述凝膠 電泳包括如下步驟： 陽182] 所述凝膠電泳體系包括：
[0183]尿素 OJrea)，420g ; 陽化4] 5 XTBE, IOOmL ； 陽化日]丙締酷胺，57g 陽186] N、N'-亞甲基雙丙締酷胺，3g; 陽187] (1地2〇定容至1L;
[0188] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和(1地2〇混合均勻制成膠混合液，待充 分溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃 度為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱；
[0189] B)取步驟似獲得的PCR擴增產(chǎn)物加入IOyL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。
[0190] (4)對比上述雜交種甜338 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，若所 述待測食用向日葵雜交種SH338同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種 SH338為真實的。
[0191] 實施例5 陽192] 本實施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種甜338真實性的試劑盒，包括各自 獨立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中， 陽193] 所述引物液部分中的引物為引物SR-123和SR-889,所述SR-123引物：
[0194] SR-123-F: 5' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，； 陽 1 巧]SR-123-R:5'-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3'; 陽196] 所述SR-889引物包括：
[0197] SR-889-F: 5' -ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，；
[0198] SR-889-R: 5 > -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3 >。
[0199] 每支所述試劑盒的配方為： 陽2〇0] 引物液，0. 2yM，1化； 陽 2〇U Taq DNA聚合酶，2. 5units，0. 5yL ; 陽20引 10 X含Mg2+擴增緩沖液，2mM，2. 5 y L ; 陽20引 dNTPs，2. 5mM，2yL ; 陽204] ddH2〇, 17 yLo 陽205] 利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種S冊38真實性的方法，包括如下步 驟： 陽206] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜338及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A03-6和06R-2種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下，
[0207] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用；
[0208] b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽209] C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機中，于12000巧m下離屯、IOmin后，吸 取上清650 y L并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離屯、機中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清500 Ji L至2血離屯、管 中，備用；
[0210] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清400 yL至1. 5血離屯、管中，備用； 陽211] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀； 陽21引 f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 yL的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得；
[0213] 將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進行定量檢測和/或質(zhì)量檢測：
[0214] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算〇〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用；
[0215] 所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔中， 180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型彌 散，則表明DNA已降解不可用；
[0216] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述DNA模板的加入量為30ng配制1 y L， 利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進行PCR擴增， 陽217] PCR擴增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5 °C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72 °C延伸30s， 進行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴增產(chǎn)物4°C保存，備用；
[0218] (3)將步驟（2)獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種S冊38及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，所述凝膠 電泳包括如下步驟：
[0219] 所述凝膠電泳體系包括： 陽220]尿素（Urea)，420g ; 陽 22U 5 X T邸，100血； 陽222] 丙締酷胺，57g 陽扣引 N、N' -亞甲基雙丙締酷胺，3g; 陽224] (1地2〇定容至IL ; 陽225] A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和(1地2〇混合均勻制成膠混合液，待充 分溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃 度為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱；
[0226] B)取步驟似獲得的PCR擴增產(chǎn)物加入10化的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。 陽227] (4)對比上述雜交種甜338 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，若所 述待測食用向日葵雜交種SH338同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種 SH338為真實的。 陽22引 實施例6
[0229] 本實施例所述用于快速檢測食用向日葵雜交種甜338真實性的試劑盒，包括各自 獨立包裝的引物液、反應(yīng)液和DNA聚合酶部分，其中，
[0230] 所述引物液部分中的引物為引物SR-123、SR-889和SR-1114,所述SR-123引物： 陽231 ] SR-123-F: 5 ' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3，； 陽232] SR-123-R:5,-ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3,； 陽23引 所述SR-889引物：
[0234] SR-889-F: 5，-ATCAACTACGTCACGATACTCC-3，； 陽235] SR-889-R:5'-GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3' ； 陽236] 所述SR-114引物：
[0237] SR-1114-F: 5> -AGATGGTGGCAGGAGAGTTMAG-3> ; 陽2；38] SR-1114-R: 5' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3，。 陽239] 每支所述試劑盒的配方為： 陽24〇] 引物液，0. 2yM，1化； 陽241] Taq DNA 聚合酶，2. Sunits, 0. 5 Ji L ; 陽2創(chuàng) 10 X含Mg2+擴增緩沖液，2mM，2. 5 y L ;
[0243] dNTPs, 2. 5mM, 2 y L ；
[0244] (1地2〇，17化。
[0245] 本實施例利用所述試劑盒快速鑒定食用向日葵雜交種甜338真實性的方法，包括 如下步驟： 陽246] (1)采用改良的CTAB方法提取由食用向日葵雜交種甜338及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種 子A03-6和06R-2種植得到的向日葵的基因組DNA，所述步驟具體如下，
[0247] a)取所述食用向日葵真葉IOmg (約Icm2)置于裝有研磨珠值=0. 6mm不誘鋼珠） 的2mL離屯、管中，置于液氮中預(yù)冷凍，并將預(yù)冷凍過的離屯、管置于研磨器中在30化條件下 研磨30s，隨后迅速轉(zhuǎn)移所述離屯、管于液氮中待用； 陽24引 b)取出步驟a)的離屯、管并加入1000 y L預(yù)熱過的由體積比為20:1的CTAB緩沖 液和琉基乙醇構(gòu)成的混合液，震蕩混勻，然后65°C下水浴反應(yīng)50min，每IOmin取出所述離 屯、管上下顛倒混勻一次； 陽249] C)將步驟b)反應(yīng)后的離屯、管放入4°C離屯、機中，于12000巧m下離屯、IOmin后，吸 取上清800 y L并加入等體積的由體積比為1:1的=氯甲燒和Tris飽和酪構(gòu)成的混合液， 震蕩混勻，放入4°C離屯、機中，于1200化pm離屯、15min后，吸取上清600 y L至2血離屯、管 中，備用； 陽巧0] d)向步驟C)中的所述離屯、管中加入等體積S氯甲燒混勻，靜置3min后，放入4°C 離屯、機，12000巧m離屯、lOmin，吸取上清300 Ji L至1. 5血離屯、管中，備用； 陽巧1] e)向步驟d)中的所述離屯、管中加入等體積異丙醇，震蕩混勻并靜置3min，放入 4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液，并向剩余沉淀中加入1血質(zhì)量濃度為75%的乙 醇，搖晃離屯、管，充分洗涂所述沉淀，然后放入4°C離屯、機，750化pm離屯、7min，棄去上清液， 驚干沉淀； 陽巧引 f)向步驟e)中棄去上清液后的沉淀中加入30 y L的無菌d地2〇溶解DNA，再加入 1 y L的RNase A，37°C水浴30min，在4°C或-20°C條件下保存溶液，即得； 陽巧引將上述步驟f)提取得到的基因組DNA進行定量檢測和/或質(zhì)量檢測： 陽巧4] 所述定量檢測步驟具體包括：取DNA樣品2 y L用d地2〇稀釋400倍，用紫外分光 光度儀測定〇〇2日。、〇〇28。，并計算0〇2日。/0〇28。的比值；若所述比值在范圍1. 7-1. 9內(nèi)，則DNA純 且可用；若超出上述比值范圍，則DNA含雜質(zhì)多不可用； 陽巧日]所述質(zhì)量檢測步驟具體包括：取5 Ji L樣品DNA與等體積6 X Loadin濁Uffer混合， 并加入到含有體積比為萬分之一 lOOOOXGelSafe核酸染液的0. 7%瓊脂糖凝膠上樣孔中， 180V電泳30min，凝膠成像，若電泳條帶呈一致密亮，則DNA純且可用；若無帶出現(xiàn)，帶型彌 散，則表明DNA已降解不可用；
[0256] 似取步驟（1)的基因組DNA為模板，所述DNA模板的加入量為30ng配制1 y L， 利用所述的試劑盒分別對各所述基因組DNA進行PCR擴增， 陽巧7] PCR擴增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火30s，72°C延伸30s， 之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火30s，72°C延伸30s， 進行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴增產(chǎn)物4°C保存，備用； 陽巧引 （3)將步驟（2)獲得的PCR擴增產(chǎn)物進行6%變性聚丙締酷胺凝膠電泳，得到所述 食用向日葵雜交種S冊38及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，所述凝膠 電泳包括如下步驟： 陽巧9] 所述凝膠電泳體系包括：
[0260]尿素（Urea)，420g ; 陽 26U 5 X T邸，100血； 陽％2] 丙締酷胺，57g 陽％3] N、N'-亞甲基雙丙締酷胺，3g ;
[0264] (1地2〇 定容至 IL ;
[02化]A)配制6%變性聚丙締酷胺凝膠，Acr:Bis = 19:1 :按照上述凝膠電泳體系取 化ea、5XTBE、丙締酷胺、N、N'-亞甲基雙丙締酷胺和d地2〇混合均勻制成膠混合液，待充 分溶解后，采用雙層濾紙過濾，室溫保存，備用；向上述制備的膠混合液中加入適量質(zhì)量濃 度為10 %的APS (催化劑）和TEMED (加速劑）（取膠混合液30血，10 % APS 180 y L，TEMED 80 y L)，搖勻，灌膠，緩慢插入與膠厚度一致的梳子，同時避免梳齒下產(chǎn)生氣泡，待膠凝固 后，拔去梳子（注意不要將梳齒拔斷），并用水稍微沖洗點樣孔處，玻璃板放入電泳槽，固定 在電泳槽上，電泳槽中加入適量1 X TBE電泳緩沖液，在電壓300V，電流約50mA-60mA條件下 預(yù)電泳比，使凝膠預(yù)熱；
[0266] B)取步驟似獲得的PCR擴增產(chǎn)物加入IOiiL的IX上樣緩沖液（二甲苯菁 0.025g，漠酪藍0.025g，0.5M/L邸TA(PH = 8.0)2ml，去離子甲酯胺98ml)中混合均勻，95°C 變性5min，4°C冷卻，每上樣孔加入上述混合液5 Ji L，于恒定電壓300V，電流50mA-60mA下電 泳比，當(dāng)漠酪藍移動到距離膠板下沿約Icm時，停止電泳，取出膠板，用d地2〇沖洗干凈后， 經(jīng)3 X GelSafe核酸染液浸泡30min，將所述凝膠置于凝膠成像儀下，在波長為302nm紫外光 激發(fā)下并拍照。 陽％7] (4)對比上述雜交種甜338 W及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，若所 述待測食用向日葵雜交種SH338同時具有其雙親特征譜帶，則所述待測食用向日葵雜交種 SH338為真實的。
[0268] 顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而并非對實施方式的限定。對 于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在上述說明的基礎(chǔ)上還可W做出其它不同形式的變化或 變動。運里無需也無法對所有的實施方式予W窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或 變動仍處于本發(fā)明創(chuàng)造的保護范圍之中。
【主權(quán)項】
1. 一種用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，其特征在于，包括各 自獨立包裝的DNA聚合酶部分、PCR反應(yīng)液部分以及引物液部分；所述引物液部分含有如下 SR-123、SR-889和SR-1114引物中的至少一種； SR-123-F:5' -GAAAACCCATGCAGGCATAC-3' ； SR-123-R:5' -ACATCCATCACAGTCCATTTTG-3' ； SR-889-F:5' -ATCAACTACGTCACGATACTCC-3' ； SR-889-R:5' -GTTCTCATGGATTCTCACAACTC-3' ； SR-1114-F:5 ' -AGATGGTGGCAGGAGAGTTAAAG-3 ' ； SR-1114-R:5 ' -GCAGAAACAGATCAGGAGGGTAT-3 '。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑盒，其 特征在于，所述引物液部分中的引物為SR-123、SR-889和SR-1114引物中的任意兩種。3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑 盒，其特征在于，所述PCR反應(yīng)液部分含有用于進行PCR擴增的含Mg 2+擴增緩沖液、dNTPs 以及ddH20。4. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑 盒，其特征在于，所述DNA聚合酶部分含有Taq DNA聚合酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的用于快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的試劑 盒，其特征在于，每支所述試劑盒的配方為： 引物液，〇·2μΜ，lyL; Taq DNA 聚合酶，2. 5units，0· 5 μ L ; 10 X含Mg2+擴增緩沖液，2mM，2· 5 μ L ; dNTPs，2· 5mM，2 yL ; ddH20,17 μ L。6. -種快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的方法，其特征在于，包括如下步驟， (1) 分別取由待測食用向日葵雜交種SH338、以及標(biāo)準(zhǔn)向日葵種子A03-6和06R-2種植 得到的向日葵真葉為材料，利用常規(guī)CTAB法提取上述各食用向日葵的基因組DNA ; (2) 取步驟（1)獲得的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1-5任一所述的試劑盒分別對 各所述基因組DNA進行PCR擴增； (3) 分別將步驟（2)獲得的各樣本PCR擴增產(chǎn)物進行凝膠電泳處理，獲得所述待測食用 向日葵雜交種SH338以及其親本標(biāo)準(zhǔn)向日葵A03-6和06R-2的電泳圖譜； (4) 對比上述雜交種SH338以及其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的電泳圖譜，若所述雜 交種SH338同時具有其親本標(biāo)準(zhǔn)種子A03-6和06R-2的特征譜帶，則判定所述待測食用向 日葵雜交種SH338為真實；反之，為假。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的方法，其特征在 于，所述DNA模板的加入量為30ng配制1 μ L。8. 根據(jù)權(quán)利要求6或7所述的快速檢測食用向日葵雜交種SH338真實性的方法，其 特征在于，所述步驟（2)中，PCR擴增程序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性30s，64°C退火 30s，72°C延伸30s，之后每個循環(huán)退火溫度下降0. 5°C，直至54°C，94°C變性30s，54°C退火 30s，72°C延伸30s，進行30個循環(huán)，最終72°C延伸20min，最終降至4°C，獲得的擴增產(chǎn)物 4°C或-20°C保存，備用。9. 一種權(quán)利要求1-5任一所述的試劑盒在快速鑒定食用向日葵雜交種SH338真實性領(lǐng) 域中的用途。10. -種權(quán)利要求6-8任一所述的快速檢測食用向日葵雜交種SH338的方法在鑒定食 用向日葵雜交種SH338真實性領(lǐng)域中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK105861637SQ201510031829
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年1月22日
【發(fā)明人】司立平, 張永平, 馬德甯, 姚梅園, 萬縣貞
【申請人】內(nèi)蒙古三瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司, 北京三瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司, 甘肅德瑞農(nóng)業(yè)科技有限公司