肺炎支原體抗體免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種肺炎支原體抗體免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法，是將肺炎支原體抗原及膠體金標(biāo)記肺炎支原體抗原，分別固定在硝酸纖維素膜和玻璃纖維素膜上，組成肺炎支原體抗體雙抗原夾心法免疫膠體金檢測試紙條。試紙條由樣品墊、包被有膠體金標(biāo)記肺炎支原體抗原膠體金墊、包被肺炎支原體抗原硝酸纖維素膜及PVC底板4個部分組成，樣品墊用玻璃纖維素膜。在PVC底板中央貼上包被好的硝酸纖維素膜，以純化肺炎支原體抗原在硝酸纖維素膜上劃線作為測試線，以抗肺炎支原體單克隆抗體在硝酸纖維素膜上劃線作為控制線。檢測時取抗凝血或血清1滴，滴加在樣品墊上，根據(jù)測試線和控制線是否出現(xiàn)色帶來判斷血清中是否存在肺炎支原體抗體。本發(fā)明建立了敏感快速的檢測血清中肺炎支原體抗體的方法，主要供肺炎支原體流行病學(xué)調(diào)查使用。
【專利說明】
肺炎支原體抗體免疫膠體金檢測試紙條及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001] 本發(fā)明設(shè)及肺炎支原體抗體的檢測，具體是一種肺炎支原體抗體雙抗原夾屯、法免 疫膠體金檢測試紙條及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎支原體(M. Pneumonia)是人類支原體肺炎的病原體。支原體肺炎的病理改變 W間質(zhì)性肺炎為主，有時并發(fā)支氣管肺炎，稱為原發(fā)性非典型性肺炎。主要經(jīng)飛沫傳染，潛 伏期2~3周，發(fā)病率W青少年最高。臨床癥狀較輕，甚至根本無癥狀，若有也只是頭痛、咽 痛、發(fā)熱、咳嗽等一般的呼吸道癥狀，但也有個別死亡報道。一年四季均可發(fā)生，但多在秋冬 時節(jié)。
[0003] 自肺炎支原體疫苗研制成功W后，極大地減少了兒童的發(fā)病率。然而，確定人群流 行病學(xué)情況需要進(jìn)行抗體的動態(tài)觀察。因此研制肺炎支原體抗體檢測試劑盒是客觀急需 的。膠體金免疫層析試紙條法因其檢測時不需要特殊設(shè)備，結(jié)果出現(xiàn)快速、方法簡便易掌 握，可實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場快速檢測等特點(diǎn)，已成為目前傳染病快速檢測的研究熱點(diǎn)。本試劑條的技術(shù) 特殊之處是采用了雙抗原夾屯、法，大大降低了非特異性反應(yīng)，提高了對抗體檢測的特異性 和靈敏度。該檢測結(jié)果與德國VIRI0N/SERI0N公司肺炎支原體IgG抗體檢測試劑盒一致率高 達(dá) 96.5%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種肺炎支原體抗體雙抗原夾屯、法免疫膠體金檢測試紙條及其制 備方法。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：
[0006] 肺炎支原體抗體雙抗原夾屯、法免疫膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于： 包括W下步驟：
[0007] (1)包被有肺炎支原體抗原的膠體金墊的制備:采用巧樣酸Ξ鋼還原法，制備30皿 的膠體金。用0.2mol/L Κ2〇)3將膠體金溶液調(diào)到抑8.0。然后將溶液置于磁力攬拌器上緩慢 攬拌，按每100ml溶液加入Img肺炎支原體抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攬拌 2h，再滴加入到終濃度為0.1 %的PEG3000、1 %薦糖和1 %的酪蛋白進(jìn)行封閉60min，標(biāo)記結(jié) 束后W 120(K)r/m離屯、，棄上清，沉淀物用0.Olmol/L PBS溶液重懸，將沉淀重懸為原體積的 1/10,再經(jīng)2000r/min離屯、20min，取上清加至葡聚糖凝膠層析柱純化，最終純度達(dá)95%W 上。然后將標(biāo)記膠體金溶液加樣于玻璃纖維素膜上，在溫度20°C~25°C干燥地，制成膠體金 墊，干燥備用。
[000引（2)肺炎支原體抗原包被硝酸纖維素膜：用生理鹽水將肺炎支原體抗原稀釋成 Img/ml，然后用噴膜儀將肺炎支原體抗原在硝酸纖維素膜上按1.化1/cm進(jìn)行劃線包被，同 時在硝酸纖維素膜上按1.化1/cm包被鼠抗肺炎支原體單克隆抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控線，包 被完成后將硝酸纖維素膜在干燥間室溫干燥化，備用。
[0009] (3)試紙條的組裝:在干燥間內(nèi)準(zhǔn)備好吸水濾紙、樣品墊、PVC底板，在PVC底板中央 貼上包被好的肺炎支原體抗原硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上緣粘貼吸水濾紙，硝酸纖維 素膜下緣粘貼包被肺炎支原體抗原膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼樣品墊，完成后用裁切機(jī) 將貼好的試紙板切成5mm寬的試紙條。再將試紙條密封于侶錐袋中，完成產(chǎn)品的組裝。
[0010] 本發(fā)明試劑盒的檢測結(jié)果與德國VIRI0N/SERI0N公司肺炎支原體IgG抗體檢測試 劑盒一致率高達(dá)96.5 %，表明本發(fā)明試劑盒靈敏度和特異性高。
【具體實(shí)施方式】
[0011] (1)本發(fā)明檢測試紙條結(jié)構(gòu)如下
[0012] 在PVC底板中央貼上包被好的肺炎支原體抗原硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上緣 粘貼吸水濾紙，硝酸纖維素膜下緣粘貼包被肺炎支原體抗原膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼 樣品墊，完成后用裁切機(jī)將貼好的試紙板切成5mm寬的試紙條。
[0013] (2)肺炎支原體抗體雙抗原夾屯、法免疫膠體金檢測試紙條生產(chǎn)工藝
[0014] 肺炎支原體純化膜蛋白抗原的膠體金標(biāo)記:采用巧樣酸Ξ鋼還原法，制備30nm的 膠體金。用0.2mol/L Κ2〇)3將膠體金溶液調(diào)到抑8.0。然后將溶液置于磁力攬拌器上緩慢攬 拌，按每100ml溶液加入Img肺炎支原體抗原(購自Abeam公司，貨號ab 124007)將蛋白緩慢滴 加到膠體金溶液中，繼續(xù)攬拌化，再滴加入到終濃度為0.1 %的PEG3000、1 %薦糖和1 %的酪 蛋白進(jìn)行封閉60min，標(biāo)記結(jié)束后W1200化/m離屯、，棄上清，沉淀物用O.Olmol/L PBS溶液重 懸，將沉淀重懸為原體積的1/10，再經(jīng)2000r/min離屯、20min，取上清加至葡聚糖凝膠層析柱 純化，最終純度達(dá)95 % W上。然后將標(biāo)記膠體金溶液加樣于玻璃纖維素膜上，在溫度2(TC~ 25 °C干燥4h，制成膠體金墊，干燥備用。
[0015] 肺炎支原體抗原包被硝酸纖維素膜：用生理鹽水將肺炎支原體抗原（購自 Meridian Life Science公司，貨號3肥1715)稀釋成Img/ml，然后用噴膜儀將肺炎支原體抗 原在硝酸纖維素膜上按1.化1/cm進(jìn)行劃線包被，同時在硝酸纖維素膜上按1.化1/cm包被鼠 抗肺炎支原體單克隆抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控線，包被完成后將硝酸纖維素膜在干燥間室溫 干燥化，備用。
[0016] 試紙條的組裝:在干燥間內(nèi)準(zhǔn)備好吸水濾紙、樣品墊、PVC底板，在PVC底板中央貼 上包被好的肺炎支原體抗原硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上緣粘貼吸水濾紙，硝酸纖維素 膜下緣粘貼包被肺炎支原體抗原膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼樣品墊，完成后用裁切機(jī)將 貼好的試紙板切成5mm寬的試紙條。再將試紙條密封于侶錐袋中，完成產(chǎn)品的組裝。
[0017] (3)利用上述試紙條檢現(xiàn)恤清中肺炎支原體抗體：
[0018] 取下單人份檢測條包裝，抓住未密封的一端，撕開侶泊包裝，盡快檢測。
[0019] 將檢測條水平放置，準(zhǔn)確滴加1滴(約50μ1)血清或血漿樣本在試紙條的樣品墊。
[0020] 5分鐘內(nèi)讀取結(jié)果。
[0021] 結(jié)果判斷：
[0022] 陽性:控制線出現(xiàn)紅色條帶，測試線出現(xiàn)紅色條帶，為肺炎支原體抗體陽性；
[0023] 陰性:控制線出現(xiàn)紅色條帶，測試線不出現(xiàn)紅色條帶，為肺炎支原體抗體陰性。
[0024] 失效:控制線不出現(xiàn)紅色條帶，或控制線、測試線均不出現(xiàn)紅色條帶，為試劑條失 效。
[0025] (4)肺炎支原體抗體檢測試紙條特異性試驗：
[0026] W肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)IgG陽性血清、衣原體標(biāo)準(zhǔn)IgG陽性血清、腺病毒標(biāo)準(zhǔn)IgG陽性血 清、呼吸道合胞病毒病毒標(biāo)準(zhǔn)IgG陽性血清和肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)IgG陰性血清采用肺炎支原體 抗體免疫膠體金檢測試紙條檢測，只有肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)IgG陽性血清檢測結(jié)果為陽性，其它 均為陰性，說明該試劑條特異性良好。
[0027] (5)肺炎支原體抗體免疫膠體金檢測試紙條重復(fù)性試驗：
[00%]隨機(jī)抽取20份肺炎支原體標(biāo)準(zhǔn)IgG陽性血清、陰性血清分別于不同的時間進(jìn)行重 復(fù)檢測，變異系數(shù)均巧％，證明該試劑盒具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性。
[0029] (6)肺炎支原體抗體免疫膠體金檢測試紙條臨床標(biāo)本檢測：
[0030] 試紙條與德國VIRI0N/SERI0N公司試劑盒肺炎支原體IgG抗體檢測試劑盒的比較：
[0031] 對228份標(biāo)本用兩種試劑盒檢測比較陰性與陽結(jié)果，如表1所示：
[0032] 表1與VIRI0N/SERI0N試劑盒的比較結(jié)果
[0033]
[0034] 對228份標(biāo)本用兩種試劑盒檢測共有220例相符(96.5 % )，有8例不符(3.5 % )，運(yùn) 種差別不符，估計可能是與兩種試劑盒原理不同有關(guān)，德國VIRI0N/SERI0N公司試劑盒是 ELISA法，我們的試劑盒是膠體金免疫層析法。
【主權(quán)項】
1.肺炎支原體抗體免疫膠體金檢測試紙條的制備方法，其特征在于:包括以下步驟： (1) 包被有肺炎支原體抗原的膠體金墊的制備:采用檸檬酸三鈉還原法，制備30nm的膠 體金。用0.2mol/L K2C03將膠體金溶液調(diào)到pH8.0。然后將溶液置于磁力攪拌器上緩慢攪拌， 按每100ml溶液加入lmg肺炎支原體抗原將蛋白緩慢滴加到膠體金溶液中，繼續(xù)攪拌2h，再 滴加入到終濃度為0.1 %的PEG3000、1 %蔗糖和1 %的酪蛋白進(jìn)行封閉60min，標(biāo)記結(jié)束后以 12000r/m離心，棄上清，沉淀物用0.0 lmol/L PBS溶液重懸，將沉淀重懸為原體積的1/10，再 經(jīng)2000r/min離心20min，取上清加至葡聚糖凝膠層析柱純化，最終純度達(dá)95%以上。然后將 標(biāo)記膠體金溶液加樣于玻璃纖維素膜上，在溫度20°C~25°C干燥4h，制成膠體金墊，干燥備 用。 (2) 肺炎支原體抗原包被硝酸纖維素膜:用生理鹽水將肺炎支原體抗原稀釋成lmg/ml， 然后用噴膜儀將肺炎支原體抗原在硝酸纖維素膜上按1.2yl/cm進(jìn)行劃線包被，同時在硝酸 纖維素膜上按1.2yl/cm包被鼠抗肺炎支原體單克隆抗體，用于產(chǎn)品的質(zhì)控線，包被完成后 將硝酸纖維素膜在干燥間室溫干燥8h，備用。 (3) 試紙條的組裝:在干燥間內(nèi)準(zhǔn)備好吸水濾紙、樣品墊、PVC底板，在PVC底板中央貼上 包被好的肺炎支原體抗原硝酸纖維素膜，硝酸纖維素膜上緣粘貼吸水濾紙，硝酸纖維素膜 下緣粘貼包被肺炎支原體抗原膠體金墊，膠體金墊下緣粘貼樣品墊，完成后用裁切機(jī)將貼 好的試紙板切成5_寬的試紙條。再將試紙條密封于鋁箱袋中，完成產(chǎn)品的組裝。
【文檔編號】G01N33/532GK105823875SQ201610148335
【公開日】2016年8月3日
【申請日】2016年3月15日
【發(fā)明人】程明
【申請人】威尚生物技術(shù)（合肥）有限公司