基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條及其應(yīng)用
【專利摘要】基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條及其應(yīng)用，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。在PVC底板上依次設(shè)置樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊；當(dāng)基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬時(shí)，所述金標(biāo)抗體為抗體2H8的膠體金溶液；當(dāng)基于單克隆抗體的檢測食品中單增李斯特菌時(shí)，金標(biāo)抗體為抗體A號(hào)的膠體金溶液。本發(fā)明開發(fā)了基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條。適用于食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的高特異性、高準(zhǔn)確性、較高靈敏度、簡便快速分析。
【專利說明】
基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單増李斯特菌的膠體金試紙條及其應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條及其應(yīng)用，屬于免疫分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]單增李斯特菌是一種兼性厭氧性革蘭氏陽性細(xì)菌，屬于李斯特菌屬。它主要以食物為傳染媒介，是全球范圍內(nèi)的最致命的食源性致病菌之一。李斯特菌在環(huán)境中分布廣泛，肉類、蛋類、禽類、乳制品、蔬菜等均已被證實(shí)是李斯特菌的感染源。感染李斯特菌后會(huì)引起肌肉疼痛、惡心、腹瀉等癥狀，嚴(yán)重的可引起血液和腦組織感染，而且由于該菌在4 °C冷藏溫度下仍可生長繁殖，被污染的冷藏食品對(duì)人類健康具有很大威脅。因此很多國家都已經(jīng)采取措施來控制食品中的李斯特菌，并制定了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)。
[0003]李斯特菌屬共分為10個(gè)種，包括單增李斯特菌(L.monocytogenes)、綿羊李斯特菌(L.1vanovii)、英諾克李斯特菌(L.1nnocua)、威爾李斯特菌(L.welshimeri)等。其中的單增李斯特種又分為13種亞型，種類較為繁多，而單增李斯特菌是引起人類致病的主要原因。然而，作為食品衛(wèi)生學(xué)的指標(biāo)，李斯特菌常常被要求專門進(jìn)行檢測。因此，檢測食品中的李斯特菌和單增李斯特菌均具有十分重要的意義。目前檢測李斯特菌屬和單增李斯特菌主要有平板培養(yǎng)法、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法(PCR)和酶聯(lián)免疫方法(ELISA)。
[0004]膠體金試紙條作為檢測微生物的常用方法具有簡便、快速、較靈敏、特異性好、不需要大型儀器、易于推廣的特點(diǎn)。然而ELISA配對(duì)抗體并不一定可以建立膠體金試紙條，這是由于膠體金試紙條反應(yīng)時(shí)間很短(lOmin)，對(duì)抗體親和力等的要求更高。目前已有李斯特菌和單增李斯特菌膠體金試紙方法的研究，但面臨的問題主要是所采用的單克隆抗體或多克隆抗體以及建立的檢測方法的交叉反應(yīng)難以達(dá)到要求，即對(duì)李斯特菌屬內(nèi)不同種的細(xì)菌或單增李斯特菌種內(nèi)不同的血清型均可識(shí)別，同時(shí)對(duì)其它雜菌不存在交叉反應(yīng)，這對(duì)于實(shí)際應(yīng)用于樣品檢測十分重要。而且，如何實(shí)現(xiàn)對(duì)李斯特菌屬和單增李斯特菌的準(zhǔn)確性、特異性檢測是目前膠體金試紙條方法仍需要解決的問題。
[0005]本發(fā)明采用可組合配對(duì)的2株李斯特菌屬特異性單克隆抗體及I株單增李斯特菌特異性抗體，成功建立起李斯特菌屬特異性及單增李斯特菌特異性的膠體金試紙條方法，為食品中李斯特菌屬及單增李斯特菌的監(jiān)測與控制提供了切實(shí)有效的快速分析手段。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是克服上述不足之處，建立一種具有高特異性、高準(zhǔn)確性、較高靈敏度、操作簡便的膠體金試紙條方法用于食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的快速檢測。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:
1、開發(fā)李斯特菌屬特異性的膠體金試紙條:基于李斯特菌屬特異性的配對(duì)單克隆抗體2G7(撿測抗體)和2H8(金標(biāo)抗體)，該配對(duì)抗體特異性識(shí)別李斯特菌屬菌體表面的P60蛋白，因而具有均一性、特異性檢測李斯特菌屬的可能。經(jīng)測試表明通過該配對(duì)抗體建立的膠體金試紙條成功檢測了 12株李斯特菌，陽性率100%，同時(shí)與其它測試菌無交叉反應(yīng)。
[0008]2、開發(fā)單增李斯特菌特異性的膠體金試紙條:首先，建立了可特異性檢測單增李斯特菌的配對(duì)抗體。實(shí)驗(yàn)測試表明，單增李斯特菌特異性的單克隆抗體A號(hào)(金標(biāo)抗體)可與李斯特菌屬特異性的單克隆抗體2G7(撿測抗體)形成配對(duì)檢測單增李斯特菌表面的P60蛋白，并在ELISA體系中特異性檢測單增李斯特菌的培養(yǎng)上清。
[0009]在此基礎(chǔ)上，基于李斯特菌屬特異性的單克隆抗體2G7(檢測抗體)和單增李斯特菌特異性的單克隆抗體A號(hào)(金標(biāo)抗體)開發(fā)了膠體金試紙條。經(jīng)測試表明該膠體金試紙條成功檢測了 8株單增李斯特菌的培養(yǎng)上清，同時(shí)與4株李斯特菌及其它測試菌無交叉反應(yīng)。
[0010]具體機(jī)理是金標(biāo)抗體A號(hào)識(shí)別P60蛋白上單增李斯特菌特異性的多肽，可特異性與單增李斯特菌分泌在上清中的P60蛋白結(jié)合，并被檢測線上可特異識(shí)別李斯特菌屬P60蛋白的抗體2G7捕獲。
[0011]基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條，包括吸水墊、硝酸纖維素膜、質(zhì)控線、檢測線、樣品墊和PVC底板，另配有金標(biāo)抗體；
在PVC底板上依次設(shè)置樣品墊、硝酸纖維素膜和吸水墊;硝酸纖維素膜直接設(shè)置于PVC底板上;樣品墊一端搭接于硝酸纖維素膜上，另一端直接設(shè)置于PVC底板上;吸水墊一端設(shè)置于PVC底板上，另一端搭接于硝酸纖維素膜上；
所述硝酸纖維素膜上依次設(shè)有質(zhì)控線和檢測線;所述質(zhì)控線上包被羊抗鼠IgG 二抗，檢測線上包被檢測抗體2G7 ；
當(dāng)基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬時(shí)，所述金標(biāo)抗體為抗體2H8的膠體金溶液;當(dāng)基于單克隆抗體的檢測食品中單增李斯特菌時(shí)，金標(biāo)抗體為抗體A號(hào)的膠體金溶液。
[0012]所述基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條的制備方法，步驟為:
(I)金標(biāo)抗體的制備:
a、膠體金溶液的合成:采用檸檬酸還原法合成30nm的金納米粒子，在洗凈的燒瓶中加入300mL質(zhì)量濃度0.01%的氯金酸溶液，在磁力攪拌下加熱至完全沸騰，向溶液中快速加入4.8mL質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液，將溶液煮沸1min直至顏色變?yōu)橥噶恋木萍t色，將燒瓶置于室溫冷卻，并在4°C保藏；
b、金標(biāo)抗體的偶聯(lián):分別采用抗體2H8或抗體A號(hào)標(biāo)記膠體金顆粒，具體過程為:用0.1M碳酸鉀溶液將ImL步驟a制備的膠體金溶液pH調(diào)至7.5;加入單克隆抗體2H8或抗體A號(hào)1yg并在室溫下反應(yīng)2h;隨后，加入50yL質(zhì)量體積比為10%的牛血清白蛋白BSA的超純水溶液，室溫下繼續(xù)反應(yīng)2 h;4°C、6000g、20min條件下離心膠體金溶液，去除未偶聯(lián)的BSA和單克隆抗體；用含有質(zhì)量濃度為0.1%的NaN3、0.2% Tween,0.2%蔗糖的0.0lM的1mM磷酸鹽緩沖液重懸金標(biāo)抗體，4°C保藏，即得抗體2H8膠體金溶液或抗體A號(hào)膠體金溶液；
(Π)膠體金試紙條的制備:將硝酸纖維素膜固定于PVC底板上，將吸水墊粘附在硝酸纖維素膜與PVC底板靠近質(zhì)控線的一端，將樣品墊粘附在硝酸纖維素膜與PVC底板的靠近檢測線的另一端;將檢測抗體2G7稀釋到lmg/mL，用噴膜機(jī)噴至檢測線處;將0.5 mg/mL的羊抗鼠IgG二抗噴至質(zhì)控線處，37 °C烘干2h，即制得基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條。
[0013]所述基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條的應(yīng)用，當(dāng)金標(biāo)抗體為抗體2H8時(shí)，用于特異性檢測食品中李斯特菌屬；當(dāng)金標(biāo)抗體為抗體A號(hào)時(shí)，用于特異性檢測食品中單增李斯特菌。
[0014]所述李斯特菌屬包括4種李斯特菌和8種單增李斯特菌。
[0015]所述8種單增李斯特菌為:ATCC19111(l/2a)、ATCC 19115 (4b)、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002(l/2c)、CMCC 54003^CMCC 54004^CMCC 54007和凍牛肉分離株；
所述4種李斯特菌為:ATCC 19119(Listeria ivanovii )、ATCC 33090(Listeriainnocua, 6a)、ATCC 35897(Listeria welshimeri, 6b)和ATCC 25400(Listeria grayi)。
[0016]樣品稀釋:P60蛋白均用1mMPBS稀釋到250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、10ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、lng/mL并用空白PBS做對(duì)照。采用李斯特菌屬試紙條檢測時(shí)，將培養(yǎng)的李斯特菌菌液用1mM PBS稀釋到17 CFU/mL、5 X 106CFU/mL、106CFU/mL、5 X 15CFU/mL、105CFU/mL、5 X 14 CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL并用空白 PBS做對(duì)照。采用單增李斯特菌試紙條檢測時(shí)，將單增李斯特菌培養(yǎng)上清用1mM PBS梯度稀釋3倍、9倍、27倍并用未稀釋的空白培養(yǎng)液做對(duì)照。
[0017]所述基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條的應(yīng)用，具體步驟為:
取7yL金標(biāo)抗體與47yL重懸液，即含質(zhì)量濃度為0.2% Tween、0.2%蔗糖的0.0lM的10mM磷酸鹽緩沖液，150yL待測樣品在微孔板中反應(yīng)5min，隨后將膠體金試紙條插入微孔板中，在層析作用下，與金標(biāo)抗體結(jié)合的目標(biāo)物，即李斯特菌屬或單增李斯特菌P60蛋白，從樣品墊與檢測線上捕獲抗體，與質(zhì)控線上的羊抗鼠IgG 二抗反應(yīng)，從而在質(zhì)控線和檢測線上出現(xiàn)紅色；1min后通過肉眼對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，質(zhì)控線和檢測線同時(shí)出現(xiàn)紅色即為陽性，檢測線不顯色而質(zhì)控線出現(xiàn)紅色即為陰性。
[0018]本發(fā)明方法的檢測分析原理是:李斯特菌屬膠體金試紙條分別采用李斯特菌屬特異性配對(duì)單克隆抗體2G7和2H8作為檢測線上的捕獲抗體及金標(biāo)檢測抗體，以羊抗鼠IgG 二抗作為質(zhì)控線上的包被抗體。金標(biāo)抗體識(shí)別李斯特菌表面的P60蛋白，先與樣品中的李斯特菌反應(yīng)，在層析作用下到檢測線被識(shí)別李斯特菌表面的P60蛋白另一位點(diǎn)的抗體2G7所捕獲，其余抗體被質(zhì)控線上的羊抗鼠IgG二抗捕獲，因而在檢測線和質(zhì)控線出現(xiàn)金納米粒子的紅色，被肉眼判讀為陽性，檢測線顏色深淺與樣品中李斯特菌含量呈正比。由于篩選的配對(duì)單克隆抗體均一性識(shí)別李斯特菌屬內(nèi)細(xì)菌，因此檢測具有李斯特菌屬特異性。同時(shí)由于其它菌不表達(dá)P60蛋白而不會(huì)在檢測線顯色，僅在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色。
[0019]單增李斯特菌膠體金試紙條分別采用配對(duì)的李斯特菌屬單克隆抗體2G7和單增李斯特菌特異性A號(hào)作為檢測線上的捕獲抗體及金標(biāo)抗體，以羊抗鼠IgG 二抗作為質(zhì)控線上的包被抗體。金標(biāo)抗體A號(hào)可特異性識(shí)別單增李斯特菌分泌到上清的P60蛋白，并在層析作用下到檢測線被識(shí)別李斯特菌屬P60蛋白的抗體2G7所捕獲，其余抗體被質(zhì)控線上的羊抗鼠IgG二抗捕獲，因而在測試線和質(zhì)控線出現(xiàn)金納米粒子的紅色，被肉眼判讀為陽性，檢測線顏色深淺與樣品中單增李斯特菌含量呈正比。由于該配對(duì)抗體中金標(biāo)抗體A號(hào)可特異性、均一性識(shí)別單增李斯特菌分泌的P60蛋白，因此檢測具有單增李斯特菌特異性，而不與其它李斯特菌產(chǎn)生交叉反應(yīng)。同時(shí)由于其它菌不表達(dá)P60蛋白而不會(huì)在檢測線顯色，僅在質(zhì)控線出現(xiàn)紅色。
[0020]本發(fā)明的有益效果:本發(fā)明開發(fā)了基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬的膠體金試紙條?；诶钏固鼐鷮偬禺愋耘鋵?duì)單克隆抗體2G7和2H8作為檢測線上的捕獲抗體及金標(biāo)檢測抗體，可均一性識(shí)別李斯特菌屬菌體表面的P60蛋白，測試表明成功檢測了 12株測試的李斯特菌，陽性率100%，同時(shí)與其它測試菌無交叉反應(yīng)。適用于食品中李斯特菌屬的高特異性、高準(zhǔn)確性、較高靈敏度、簡便快速分析。
[0021]還開發(fā)了基于單克隆抗體的檢測食品中單增李斯特菌特異性的膠體金試紙條。首先，建立了可特異性檢測單增李斯特菌的配對(duì)抗體。實(shí)驗(yàn)測試表明，基于李斯特菌屬特異性的單克隆抗體2G7(檢測線抗體)和單增李斯特菌特異性的單克隆抗體A號(hào)(金標(biāo)抗體)，建立的膠體金試紙條成功檢測了測試的8株單增李斯特菌，同時(shí)與4株李斯特菌及其它測試菌無交叉反應(yīng)。適用于食品中單增李斯特菌的高特異性、高準(zhǔn)確性、較高靈敏度、簡便快速分析。
[0022]生物材料樣品保藏:
單克隆細(xì)胞株2G7，保藏編號(hào)CGMCC N0.10875;單克隆細(xì)胞株2H8，保藏編號(hào)CGMCC N0.10876，公開于申請(qǐng)?zhí)?01610039900.6中；
抗體A號(hào)，保藏編號(hào):CGMCC N0.9301，公開于申請(qǐng)?zhí)?01410260781.8中。
【附圖說明】
[0023]圖1-1李斯特菌屬膠體金試紙條示意圖。
[0024]圖1-2單增李斯特菌膠體金試紙條示意圖。
[0025]1、吸水墊;2、硝酸纖維素膜;3、質(zhì)控線;4、檢測線;5、樣品墊;7、PVC底板;6、金標(biāo)抗體。
[0026]圖2-1李斯特菌屬膠體金試紙條檢測P60蛋白靈敏度示意圖。
[0027]圖2-2單增李斯特菌膠體金試紙條檢測P60蛋白靈敏度示意圖。
[0028]圖3李斯特菌屬膠體金試紙條檢測12種李斯特菌(菌液)結(jié)果示意圖。
[0029]圖4-1單增李斯特菌膠體金試紙條檢測8種單增李斯特菌(培養(yǎng)上清)結(jié)果示意圖。
[0030]圖4-2單增李斯特菌膠體金試紙條檢測4種李斯特菌(培養(yǎng)上清)結(jié)果示意圖。
[0031 ]圖5-1李斯特菌屬膠體金試紙條交叉反應(yīng)示意圖。
[0032]圖5-2單增李斯特菌膠體金試紙條交叉反應(yīng)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0033]實(shí)施例1膠體金試紙條
基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條，包括吸水墊1、硝酸纖維素膜2、質(zhì)控線3、檢測線4、樣品墊5、PVC底板7，另配有金標(biāo)抗體6;
在PVC底板7上依次設(shè)置樣品墊5、硝酸纖維素膜2和吸水墊I;硝酸纖維素膜2直接設(shè)置于PVC底板7上;樣品墊5—端搭接于硝酸纖維素膜2上，另一端直接設(shè)置于PVC底板7上;吸水墊I 一端設(shè)置于PVC底板7上，另一端搭接于硝酸纖維素膜2上；
所述硝酸纖維素膜2上依次設(shè)有質(zhì)控線3和檢測線4;所述質(zhì)控線3上包被羊抗鼠IgG 二抗，檢測線4上包被抗體2G7 ；
當(dāng)基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬時(shí)，所述金標(biāo)抗體6為抗體2H8的膠體金溶液;當(dāng)基于單克隆抗體的檢測食品中單增李斯特菌時(shí)，金標(biāo)抗體6為抗體A號(hào)的膠體金溶液。
[0034]實(shí)施例2
所述基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條的制備方法，步驟為:
(1)金標(biāo)抗體6的制備:
a、膠體金溶液的合成:采用檸檬酸還原法合成30nm的金納米粒子，在洗凈的燒瓶中加入300mL質(zhì)量濃度0.01%的氯金酸溶液，在磁力攪拌下加熱至完全沸騰，向溶液中快速加入4.8mL質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液，將溶液煮沸1min直至顏色變?yōu)橥噶恋木萍t色，將燒瓶置于室溫冷卻，并在4°C保藏；
b、金標(biāo)抗體的偶聯(lián):分別采用抗體2H8或抗體A號(hào)標(biāo)記膠體金顆粒，具體過程為:用0.1M碳酸鉀溶液將ImL步驟a制備的膠體金溶液pH調(diào)至7.5;加入單克隆抗體2H8或抗體A號(hào)1yg并在室溫下反應(yīng)2h;隨后，加入50yL質(zhì)量體積比為10%的牛血清白蛋白BSA的超純水溶液，室溫下繼續(xù)反應(yīng)2 h;4°C、6000g、20min條件下離心膠體金溶液，去除未偶聯(lián)的BSA和單克隆抗體；用含有質(zhì)量濃度為0.1%的NaN3、0.2% Tween,0.2%蔗糖的0.0lM的1mM磷酸鹽緩沖液重懸金標(biāo)抗體，4°C保藏，即得抗體2H8膠體金溶液或抗體A號(hào)膠體金溶液；
(2)膠體金試紙條的制備:將硝酸纖維素膜2固定于PVC底板7上，將吸水墊I粘附在硝酸纖維素膜2與PVC底板7靠近質(zhì)控線3的一端，將樣品墊5粘附在硝酸纖維素膜2與PVC底板7的靠近檢測線4的另一端;將檢測抗體2G7稀釋到lmg/mL，用噴膜機(jī)噴至檢測線4處;將0.5 mg/mL的羊抗鼠IgG二抗噴至質(zhì)控線3處，37°C烘干2h，即制得基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條。
[0035]當(dāng)金標(biāo)抗體為抗體2H8時(shí)，能夠用于特異性檢測食品中李斯特菌屬；當(dāng)金標(biāo)抗體為抗體A號(hào)時(shí)，能夠用于特異性檢測食品中單增李斯特菌。
[0036]實(shí)施例3濕法檢測P60蛋白
樣品稀釋:P60蛋白均用1mM PBS稀釋到250ng/mL、100ng/mL、50ng/mL、25ng/mL、1ng/mL、5ng/mL、2.5ng/mL、Ing/mL并用空白PBS做對(duì)照。分別采用李斯特菌屬膠體金試紙條及單增李斯特菌膠體金試紙條檢測。取7yL金標(biāo)抗體與47yL重懸液，即含質(zhì)量濃度為0.2%Tween、0.2%蔗糖的0.0IM的1 mM磷酸鹽緩沖液，150yL待測樣品在微孔板中反應(yīng)5min，隨后將膠體金試紙條插入微孔板中，反應(yīng)1min后判讀。判讀依據(jù):陽性樣品:質(zhì)控線、檢測線同時(shí)有顏色。陰性樣品:質(zhì)控線有顏色，檢測線無顏色。具體檢測結(jié)果如圖2所示。測試結(jié)果說明李斯特菌屬膠體金試紙條及單增李斯特菌試紙條可以識(shí)別李斯特菌及單增李斯特菌的P60蛋白。
[0037]實(shí)施例4濕法檢測李斯特菌屬或單增李斯特菌
采用李斯特菌屬膠體金試紙條檢測時(shí)，將培養(yǎng)的李斯特菌菌液用1mM PBS稀釋到17CFU/mL、5X106 CFU/mL、16 CFU/mL、5X105 CFU/mL、15 CFU/mL、5X104 CFU/mL、14 CFU/mL、13 CFU/mL并用空白PBS做對(duì)照。檢測過程同實(shí)施例3，測試表明李斯特菌屬膠體金試紙條與測試的12株李斯特菌屬細(xì)菌均有交叉反應(yīng)，結(jié)果具體如圖3所示。
[0038]采用單增李斯特菌膠體金試紙條檢測時(shí)，先將待測樣品的培養(yǎng)液用5000g、10min進(jìn)行離心，將上清用1mM PBS梯度稀釋3倍、9倍、27倍并用未稀釋的空白培養(yǎng)液做對(duì)照，檢測過程同實(shí)施例3，測試表明單增李斯特菌膠體金試紙條與測試的8株單增李斯特菌的培養(yǎng)上清(18h培養(yǎng))均有交叉反應(yīng)，而與4株李斯特菌沒有交叉反應(yīng)，可檢測的稀釋倍數(shù)在3-27倍，結(jié)果具體如圖4-1、4-2所示。
[0039]所述李斯特菌屬包括4種李斯特菌和8種單增李斯特菌。所述8種單增李斯特菌為:ATCC 19111(l/2a)、ATCC 19115 (4b)、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002(l/2c)、CMCC 54003、CMCC 54004^CMCC 54007和凍牛肉分離株；所述4種李斯特菌為:ATCC 19119(Listeriaivanovii)、ATCC 33090(Listeria innocua, 6a)、ATCC 35897(Listeria welshimeri,6b)和ATCC 25400(Listeria grayi)0
[0040]實(shí)施例5交叉反應(yīng)實(shí)驗(yàn)
測試食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條與革蘭氏陽性菌，如金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌，如大腸桿菌、大腸桿菌0157、沙門氏菌、阪崎腸桿菌、空腸彎曲桿菌、結(jié)腸彎曲桿菌的交叉反應(yīng)。
[0041 ]測試食品中李斯特菌屬膠體金試紙條交叉時(shí)，用所測試細(xì)菌菌液進(jìn)行，測試濃度為5 X 18 CFU/mL。檢測過程同實(shí)施例3，結(jié)果表明僅與測試的12株李斯特菌屬細(xì)菌有反應(yīng)，而與其它測試細(xì)菌無交叉，具體如圖5-1所示。
[0042]測試食品中單增李斯特菌屬膠體金試紙條交叉時(shí)，用所測試細(xì)菌培養(yǎng)上清進(jìn)行(不稀釋)。沒有交叉反應(yīng)。檢測過程同實(shí)施例3，結(jié)果表明僅與測試的8株單增李斯特菌有反應(yīng)，而與4株李斯特菌以及其它測試細(xì)菌無交叉，具體如圖5-2所示。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條，其特征在于:包括吸水墊(I)、硝酸纖維素膜(2)、質(zhì)控線(3)、檢測線(4)、樣品墊(5)和PVC底板(7);另配有金標(biāo)抗體(6); 在PVC底板(7)上依次設(shè)置樣品墊(5)、硝酸纖維素膜(2)和吸水墊(I);硝酸纖維素膜(2)直接設(shè)置于PVC底板(7)上;樣品墊(5)—端搭接于硝酸纖維素膜(2)上，另一端直接設(shè)置于PVC底板(7)上;吸水墊(I)一端設(shè)置于PVC底板(7)上，另一端搭接于硝酸纖維素膜(2)上； 所述硝酸纖維素膜(2)上依次設(shè)有質(zhì)控線(3)和檢測線(4);所述質(zhì)控線(3)上包被羊抗鼠IgG 二抗，檢測線(4)上包被檢測抗體2G7 ； 當(dāng)基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬時(shí)，所述金標(biāo)抗體(6)為抗體2H8的膠體金溶液；當(dāng)基于單克隆抗體的檢測食品中單增李斯特菌時(shí)，金標(biāo)抗體(6)為抗體A號(hào)的膠體金溶液。2.權(quán)利要求1所述基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條的制備方法，其特征在于步驟為: (I)金標(biāo)抗體(6)的制備: a、膠體金溶液的合成:采用檸檬酸還原法合成30nm的金納米粒子，在洗凈的燒瓶中加入300mL質(zhì)量濃度0.01%的氯金酸溶液，在磁力攪拌下加熱至完全沸騰，向溶液中快速加入.4.8mL質(zhì)量濃度1%的檸檬酸三鈉溶液，將溶液煮沸1min直至顏色變?yōu)橥噶恋木萍t色，將燒瓶置于室溫冷卻，并在4°C保藏； b、金標(biāo)抗體的偶聯(lián):分別采用抗體2H8或抗體A號(hào)標(biāo)記膠體金顆粒，具體過程為:用0.1M碳酸鉀溶液將ImL步驟a制備的膠體金溶液調(diào)pH至7.5;加入單克隆抗體2H8或抗體A號(hào)1yg并在室溫下反應(yīng)2h;隨后，加入50yL質(zhì)量體積比為10%的牛血清白蛋白BSA的超純水溶液，室溫下繼續(xù)反應(yīng)2 h;4°C、6000g、20min條件下離心膠體金溶液，去除未偶聯(lián)的BSA和單克隆抗體；用含有質(zhì)量濃度為0.1%的NaN3、0.2% Tween,0.2%蔗糖的0.0lM的1mM磷酸鹽緩沖液重懸金標(biāo)抗體，4°C保藏，即得抗體2H8膠體金溶液或抗體A號(hào)膠體金溶液； (Π)膠體金試紙條的制備:將硝酸纖維素膜(2)固定于PVC底板上(7)上，將吸水墊(I)粘附在硝酸纖維素膜(2)與PVC底板(7)靠近質(zhì)控線(3)的一端，將樣品墊(5)粘附在硝酸纖維素膜⑵與PVC底板(7)的靠近檢測線(4)的另一端;將檢測抗體2G7稀釋到lmg/mL，用噴膜機(jī)噴至檢測線(4)處;將0.5 mg/mL的羊抗鼠IgG二抗噴至質(zhì)控線(3)處，37°C烘干2h，即制得基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條。3.權(quán)利要求1所述基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條的應(yīng)用，其特征在于:當(dāng)金標(biāo)抗體為抗體2H8時(shí)，用于特異性檢測食品中李斯特菌屬；當(dāng)金標(biāo)抗體為抗體A號(hào)時(shí)，用于特異性檢測食品中單增李斯特菌。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條的應(yīng)用，其特征在于:所述李斯特菌屬包括4種李斯特菌和8種單增李斯特菌。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬和單增李斯特菌的膠體金試紙條的應(yīng)用，其特征在于: 所述8種單增李斯特菌為:ATCC 19111(l/2a)、ATCC 19115 (4b)、ATCC 19118(4e)、CMCC 54002(l/2c)、CMCC 54003^CMCC 54004^CMCC 54007和凍牛肉分離株； 所述4種李斯特菌為:ATCC 19119(Listeria i vanovi i )、ATCC 33090(Listeriainnocua, 6a)、ATCC 35897(Listeria welshimeri, 6b)和ATCC 25400(Listeria grayi)。6.根據(jù)權(quán)利要求3所述基于單克隆抗體的檢測食品中李斯特菌屬或單增李斯特菌的膠體金試紙條的應(yīng)用，其特征在于具體步驟為: 取7yL金標(biāo)抗體(6)與47yL重懸液，即含質(zhì)量濃度為0.2% Tween、0.2%蔗糖的0.0lM的.10 mM磷酸鹽緩沖液，150yL待測樣品在微孔板中反應(yīng)5min，隨后將膠體金試紙條插入微孔板中，在層析作用下，與金標(biāo)抗體結(jié)合的目標(biāo)物，即李斯特菌屬或單增李斯特菌P60蛋白，從樣品墊(5)與檢測線(4)上捕獲抗體，與質(zhì)控線(3)上的羊抗鼠IgG 二抗反應(yīng)，從而在質(zhì)控線(3)和檢測線(4)上出現(xiàn)紅色；1min后通過肉眼對(duì)結(jié)果進(jìn)行判讀，質(zhì)控線(3)和檢測線(4)同時(shí)出現(xiàn)紅色即為陽性，檢測線(4)不顯色而質(zhì)控線(3)出現(xiàn)紅色即為陰性。
【文檔編號(hào)】G01N33/577GK106093410SQ201610396890
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月7日 公開號(hào)201610396890.1, CN 106093410 A, CN 106093410A, CN 201610396890, CN-A-106093410, CN106093410 A, CN106093410A, CN201610396890, CN201610396890.1
【發(fā)明人】胥傳來, 王文彬, 匡華, 徐麗廣, 馬偉, 劉麗強(qiáng), 吳曉玲, 宋珊珊, 胡擁明
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)