尿液胱抑素c半定量檢測膠體金試紙的制作方法
【專利摘要】尿液胱抑素C半定量檢測膠體金試紙，包括塑料底板和依次粘貼在底板上的樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測反應(yīng)部分及吸水部分。所述樣液吸收部分為濾紙或玻璃纖維膜，所述膠體金標(biāo)記部分包括玻璃纖維膜及其上標(biāo)記的物質(zhì)CysC單克隆抗體1，所述檢測反應(yīng)部分包括硝酸纖維素膜及其上具有一條截留帶、三條檢測帶和質(zhì)控帶，其中，檢測帶T1?T4結(jié)合有精確定量的CysC單克隆抗體2，質(zhì)控帶包被羊抗鼠IgG，所述吸水部分為濾紙或玻璃纖維膜。本發(fā)明的積極效果是能實(shí)現(xiàn)家庭檢測和現(xiàn)場檢測，具有特異性高，檢測程序簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，提供了一種簡便、直觀、快捷地對尿頁樣品中CysC進(jìn)行半定量的檢測方法。
【專利說明】
尿液胱抑素C半定量檢測膠體金試紙
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明屬于醫(yī)療器械，具體涉及一種尿液胱抑素C(CysC)半定量檢測膠體金試紙。
【背景技術(shù)】
[0002]現(xiàn)階段，患糖尿病、高血壓、高血脂等所謂“富貴病”的人越來越多，但人們發(fā)現(xiàn)這些患者病情逐漸惡化甚至死亡的原因并不是糖尿病、高血壓等諸多疾病，而是腎病。大量研究證實(shí)，腎小管損傷在腎損傷中具有重要的意義，所以如能腎小管的損傷及早診斷和治療，預(yù)防腎功能不全的發(fā)生發(fā)展，將對治愈患者疾病、控制疾病惡化、延長患者壽命有著舉足輕重的作用。
[0003]半胱氨酸蛋白酶(Cystatin)是一種淀粉生成酶，主要存在于小動(dòng)脈壁，產(chǎn)生淀粉樣物質(zhì)。而Cystatin C是半胱氨酸蛋白酶的細(xì)胞外抑制劑，對細(xì)胞內(nèi)蛋白的轉(zhuǎn)換起作用。Cystatin C是一種分子量為13.359KD的小分子蛋白屬管家基因，在所有有核細(xì)胞都可以表達(dá)，并且表達(dá)不受感染、炎癥、飲食、體重以及肝功能變化的影響，它在體內(nèi)唯一的代謝途徑是通過腎臟排泄，并且在腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)完全降解。人體內(nèi)主要分布在細(xì)胞外液如:腦脊液、血液、精液、唾液、尿液、胸水、羊水、關(guān)節(jié)液、淚液等，在細(xì)胞內(nèi)主要分布于神經(jīng)細(xì)胞、甲狀腺細(xì)胞、胰島細(xì)胞等。在腦脊液中濃度最高，尿液中最低，提示其合成部位主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)。
[0004]當(dāng)近端腎小管功能失常時(shí)，會(huì)阻礙CystatinC從腎小球超濾后的重吸收，同時(shí)尿中Cystatin C濃度將增加100倍之多，94%Cyst C從腎臟清除，腎外清除部分小于0.34ml/min，表明循環(huán)中Cyst C幾乎完全從腎小球?yàn)V過Cyst C與肌酐相比有很多生理優(yōu)點(diǎn)?？偟恼f來，在腎小管沒有嚴(yán)重受損情況下，Cyst C是不會(huì)直接從血液中進(jìn)入腎小管，說明Cyst C是評價(jià)腎小管損傷的內(nèi)源性標(biāo)志物。
[0005]2006年曹華軍、王旭等采用膠乳增強(qiáng)免疫比濁法測定尿中的Cystatin C，同時(shí)采用速率散射比濁法測定尿中微量白蛋白、α?微球蛋白、免疫球蛋白G、轉(zhuǎn)鐵蛋白。實(shí)驗(yàn)證明:尿cystatin C是腎臟疾病時(shí)腎小管損傷的敏感指標(biāo)。
[0006]2010年，陳紅等對高血壓腎病患者進(jìn)行相關(guān)研究，發(fā)現(xiàn)尿Cystatin C是判斷高血壓腎病患者腎小管受損的早期敏感指標(biāo)。
[0007]膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)，有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。近年已在各種生物學(xué)研究中廣泛使用。在臨床使用的免疫印跡技術(shù)幾乎都使用其標(biāo)記。
[0008]1971年Faulk和Taytor將膠體金引入免疫化學(xué)，此后免疫膠體金技術(shù)作為一種新的免疫學(xué)方法，在生物醫(yī)學(xué)各領(lǐng)域得到了日益廣泛的應(yīng)用。目前在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中的應(yīng)用主要是免疫層析法(immunochromatogra-phy )和快速免疫金滲濾法(Dot-1mmuogo Idfiltrat1n assay DIGFA)，用于檢測蛋白質(zhì)、激素、藥物和抗雙鏈DNA抗體等，具有簡單、快速、準(zhǔn)確和無污染等優(yōu)點(diǎn)。
[0009]目前醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中應(yīng)用的免疫膠體金快速檢測技術(shù)主要有CGEIA和DIGFA兩種方法。這兩種方法都是以微孔濾膜為載體，包被已知抗原或抗體，加入待檢標(biāo)本后，經(jīng)濾膜的毛細(xì)管作用或滲濾作用使標(biāo)本中的抗原或抗體與膜上包被的抗體或抗原結(jié)合，再用膠體金結(jié)合物標(biāo)記而達(dá)到檢測目的。
[0010]CGEIA是20世紀(jì)90年代初在免疫滲濾技術(shù)的基礎(chǔ)上建立的一種簡易快速的檢測技術(shù)，由Beggs M等最先用于人絨毛膜促性腺激素(human chor1nic gonadothphin，HCG)的測定。免疫層析條主要由玻璃纖維膜、金標(biāo)墊、硝酸纖維膜，纖維膜組成，將4種膜從底部向上按順序粘在支持物上并切成條即成。檢測時(shí)，只需將層析條插入待檢液中，平放在桌面上，5min后觀察結(jié)果即可。試驗(yàn)原理以最常用的雙抗體夾心測抗原為例，當(dāng)將層析條插入待檢液中進(jìn)行檢測時(shí)，含有待測抗原的液體從免疫層析條的底部被吸收后迅速與金標(biāo)探針(Abl-Au)發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，形成的抗原抗體復(fù)合物(Abl-Au-Ag)通過毛細(xì)作用被運(yùn)送到上面的硝酸纖維膜上，復(fù)合物接著與硝酸纖維膜上的抗體發(fā)生反應(yīng)，形成另一個(gè)復(fù)合物(Abl-Au-Ag-Ab2)而富集在檢測區(qū)，由于膠體金自身顯色而形成紅色的質(zhì)控線。該方法由于簡便、快速、特異性、敏感性好，結(jié)果直觀等優(yōu)點(diǎn)，得到了空前廣泛的發(fā)展和應(yīng)用。
[0011]與其他檢測技術(shù)比較，應(yīng)用免疫膠體金快速檢測技術(shù)時(shí)，樣品不需要特殊處理，試劑和樣本用量極小，樣本量可低至ILL?2LL;既可用于抗原檢測，也可用于抗體檢測，檢測時(shí)間大大縮短，也不需熒光顯微鏡、酶標(biāo)檢測儀等貴重儀器，試驗(yàn)結(jié)果可長期保存。但該技術(shù)一般作為定性，不易定量，大批量的集約性的操作，不如ELISA快而方便。膠體金免疫測定時(shí)，當(dāng)標(biāo)本中受檢物濃度超過試劑的敏感度時(shí)出現(xiàn)顯色的陽性反應(yīng)。這種測定較適用于檢測正常體液中不含有的或含量極低而疾病時(shí)明顯升高的物質(zhì)，例如感染性疾病病原體的抗原或其相應(yīng)抗體，妊娠時(shí)尿液中HCG等。但目前還未見在尿液CysC半定量檢測中使用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]本發(fā)明的目的是提供一種尿液胱抑素C半定量檢測膠體金試紙，通過對檢測區(qū)顯色條帶數(shù)目來判定尿液中CysC是否高于正常水平，從而實(shí)現(xiàn)了腎小管損傷的預(yù)警作用及早期輔助診斷?？朔F(xiàn)有技術(shù)存在的前述不足。
[0013]本發(fā)明的膠體金試紙包括塑料底板和依次粘貼在底板上的樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測反應(yīng)部分及吸水部分；
[0014]所述樣液吸收部分為濾紙或玻璃纖維膜，檢測時(shí)起吸收樣品溶液的作用，便于樣品溶液向上移動(dòng)。
[0015]所述膠體金標(biāo)記部分包括玻璃纖維膜及其上標(biāo)記的物質(zhì)CysC單克隆抗體I。
[0016]所述檢測反應(yīng)部分包括硝酸纖維素膜及其上具有一條截留帶、三條檢測帶和質(zhì)控帶，其中、檢測帶T1-T4結(jié)合有精確定量的CysC單克隆抗體2，質(zhì)控帶包被羊抗鼠IgG。依據(jù)顯色條帶數(shù)目來判斷腎小管損傷程度。
[0017]所述吸水部分為濾紙或玻璃纖維膜，用于引流樣品溶液。
[0018]本發(fā)明的原理是玻璃纖維膜上包被一定量金標(biāo)CysC單克隆抗體I，當(dāng)尿液中CysC含量低于正常量時(shí)，尿液中的CysC首先與金標(biāo)單抗I結(jié)合，S卩CysC+金標(biāo)單抗I復(fù)合物將隨同尿液在膜上運(yùn)行至檢測帶Tl，與其上精確定量的正常量的CysC單克隆抗體2發(fā)生結(jié)合，檢測帶Tl顯色，檢測帶Tl顯色，T2不顯色，砸標(biāo)單抗I繼續(xù)隨同尿液在膜上運(yùn)行至質(zhì)控帶，質(zhì)控帶顯色，此時(shí)為陰性結(jié)果。當(dāng)尿液中CysC含量高于正常量時(shí)，CysC與膠體金標(biāo)記的單抗I結(jié)合，SPCysC+金標(biāo)單抗I復(fù)合物將隨同尿液在膜上運(yùn)行至檢測帶I，與其上精確定量的正常量的CysC單克隆抗體2發(fā)生結(jié)合，檢測帶Tl顯色，多余的CysC+金標(biāo)單抗I復(fù)合物會(huì)與檢測帶T2-T4上的CysC單克隆抗體2發(fā)生結(jié)合，檢測帶T2—T4根據(jù)CysC多余程度顯色，金標(biāo)單抗I繼續(xù)隨同尿液在膜上運(yùn)行至質(zhì)控帶，質(zhì)控帶顯色，此時(shí)為陽性結(jié)果，并通過T2-T4顯色條帶多少大致確定腎小管損傷程度。
[0019]本發(fā)明的積極意義和效果在于:本發(fā)明的尿液CysC半定量檢測膠體金試紙通過金標(biāo)試劑的免疫層析作用進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)了對臨床檢測更有意義的半定量檢測。檢測全過程在10分鐘內(nèi)判定結(jié)果，可以方便地實(shí)現(xiàn)家庭檢測和現(xiàn)場檢測，具有特異性高，檢測程序簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，操作人員無需專業(yè)培訓(xùn)，按說明書指導(dǎo)即可得到檢測結(jié)果，從而有助于腎小管損傷的早期診斷和改善，還可以實(shí)現(xiàn)腎小管損傷的及時(shí)監(jiān)測與跟蹤。
[0020]使用Cysc半定量試紙條檢測尿液中Cysc含量[0021 ]采樣:收集新鮮尿液即可。
[0022]檢測:將試紙條放平，用一次性吸頭吸取0.1ml的尿液，滴加至樣品墊吸收部分，5?10分鐘后肉眼觀察結(jié)果。
[0023]觀察:如果檢測帶I顯色，檢測帶2不顯色，質(zhì)控帶顯色，為陰性結(jié)果，表明尿液中CysC的含量低于1.5yg/ml，正常。檢測帶I顯色，檢測帶2顯色，質(zhì)控帶顯色，為陽性結(jié)果，表明尿液中0}^(]的含量高于1.548/1]11，但低于5(^8/11^，為輕微患病。檢測帶1顯色，檢測帶2、3顯色，質(zhì)控帶顯色，為陽性結(jié)果，表明尿液中CysC的含量高于50yg/ml，但低于100yg/mL，為中度患病。檢測帶I顯色，檢測帶2、3、4顯色，質(zhì)控帶顯色，為陽性結(jié)果，表明尿液中CysC的含量不低于200yg/ml，為重度患病。檢測帶I和質(zhì)控帶均不顯色，表明試紙條失效。
【附圖說明】
[0024]圖1為本發(fā)明結(jié)構(gòu)的正面示意圖。
[0025]I是樣液吸收部分、2是膠體砸標(biāo)記部分、3是檢測反應(yīng)部分，由檢測帶Tl、檢測帶T2、質(zhì)控帶C組成;4是吸水部分。
[0026]圖2為本發(fā)明試紙條所配備的尿液滴管示意圖
[0027]圖3為本發(fā)明的使用結(jié)果說明圖。圖3中a檢測帶I顯色，檢測帶2不顯色，質(zhì)控帶顯色，為陰性結(jié)果，表明尿液中CysC的含量低于1.5yg/ml，正常。圖3中b檢測帶I顯色，檢測帶2顯色，質(zhì)控帶顯色，為陽性結(jié)果，表明尿液中CysC的含量高于1.5yg/ml，但低于50yg/mL，為輕微患病。圖3中c檢測帶I顯色，檢測帶2、3顯色，質(zhì)控帶顯色，為陽性結(jié)果，表明尿液中CysC的含量高于50yg/ml，但低于100yg/mL，為中度患病。圖3中d檢測帶I顯色，檢測帶2、3、4顯色，質(zhì)控帶顯色，為陽性結(jié)果，表明尿液中CysC的含量不低于200yg/ml，為重度患病。圖3中e檢測帶I和質(zhì)控帶均不顯色，表明試紙條失效。
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例尿液胱抑素C半定量檢測膠體金試紙
[0029]1.膠體金溶液的制備
[0030]在反應(yīng)器中加入0.01%氯金酸，煮沸后加入0.01%的檸檬酸三鈉，待顏色穩(wěn)定停止加熱，然后進(jìn)行光譜掃描，以510?560nm間出現(xiàn)最大吸收峰為宜，收集產(chǎn)物備用。[0031 ] 2.半定量檢測CysC膠體金試紙的制備及裝配
[0032]2.1膠體金標(biāo)記部分的制備和處理:
[0033]將CysC單克隆抗體I加入膠體金溶液，終濃度至5ug/ml，混勾，使其形成CysC單克隆抗體1-膠體金聚合物。
[0034]2.1.1待標(biāo)記CysC單克隆抗體I的預(yù)處理
[0035]將CysC單克隆抗體I預(yù)先在0.00511101/1他(:1，？!17.0溶液中4°(:透析過夜，除去多余的電解質(zhì)，然后6500?13000r/min 4°C離心60min，去除沉淀，調(diào)整蛋白質(zhì)濃度至2mg/mL即可用于標(biāo)記。
[0036]優(yōu)化膠體金標(biāo)記CysC單克隆抗體I的實(shí)驗(yàn)條件:
[0037]調(diào)整pH值:用0.2molK2C03將膠體金溶液調(diào)至8.2;通過目測法確定CysC單克隆抗體I的最適用量比:取膠體金溶液分裝至離心管中(Iml)，向其中加入不同量CysC抗體I，迅速混勻，然后，各加入200yL10 %NaCl溶液，搖勻，靜置5min后觀察各管。根據(jù)膠體金顯色區(qū)分，顏色未發(fā)生改變的最低蛋白量，為最適標(biāo)記濃度。
[0038]2.1.2抗體金探針的制備
[0039]當(dāng)單抗的最適穩(wěn)定量及標(biāo)記的最佳pH值被確定以后便可進(jìn)行標(biāo)記。具體步驟如下:
[0040]根據(jù)用以標(biāo)記的膠體金的總量計(jì)算出所需要的待標(biāo)記單抗的總量;在電磁攪拌下，將單抗溶液加入膠體金溶液中，單克隆抗體大約5min加完;30min后在磁性攪拌下加入10 %的牛血清白蛋白(BSA)使其終濃度為0.5%；繼續(xù)攪拌5min，加入10 %聚乙二醇20000(PEG20000)溶液使其終濃度為0.05%。制成的溶液即為膠體金標(biāo)記的CysC單克隆抗體I溶液，測量體積備用。
[0041 ] 2.1.3抗體金探針的純化
[0042]將膠體金標(biāo)記CysC單克隆抗體I溶液以4°C、5000r/min，離心30min，留下部分膠體金，定容至原體積的I /I O，4 0C保存?zhèn)溆谩?br>[0043]2.1.4膠體金標(biāo)記CysC單克隆抗體I部分處理
[0044]將純化好的膠體金標(biāo)記CysC單克隆抗體I溶液倒入一槽中，將玻璃纖維紙浸入Imin，取出，室溫干燥或真空冷凍干燥，即為膠體金標(biāo)記部分。
[0045]2.2檢測反應(yīng)部分處理
[0046]用膠體金劃膜儀包被4條單克隆抗體2作為檢測帶Τ1-Τ4，Τ1_Τ4為2yg的單克隆抗體2，質(zhì)控帶包被羊抗鼠IgG，即為檢測反應(yīng)部分。
[0047]2.3半定量檢測CysC膠體金試紙的裝配
[0048]在塑料底板上依次粘貼樣液吸收部分、膠體砸標(biāo)記部分、檢測反應(yīng)部分和吸水部分，即為半定量檢測Cy SC膠體金試紙。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.尿液胱抑素C半定量檢測膠體金試紙，包括塑料底板和依次粘貼在底板上的樣液吸收部分、膠體金標(biāo)記部分、檢測反應(yīng)部分及吸水部分； 所述樣液吸收部分為濾紙或玻璃纖維膜， 所述膠體金標(biāo)記部分包括玻璃纖維膜及其上標(biāo)記的物質(zhì)CysC單克隆抗體I， 所述檢測反應(yīng)部分包括硝酸纖維素膜及其上具有一條截留帶、三條檢測帶和質(zhì)控帶，其中、檢測帶T1-T4結(jié)合有精確定量的CysC單克隆抗體2，質(zhì)控帶包被羊抗鼠IgG， 所述吸水部分為濾紙或玻璃纖維膜。
【文檔編號】G01N33/577GK105929175SQ201610285527
【公開日】2016年9月7日
【申請日】2016年5月3日
【發(fā)明人】彭龍, 郭鳳云, 張軍, 楊文魁, 王寶泉, 王瀚
【申請人】長春圣金諾生物制藥有限公司