一種聯(lián)合檢測nse、cea的免疫層析檢測試紙條及其制備方法和應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條，采用雙抗夾心法，包括背襯板和依次相互重疊地鋪設(shè)在背襯板上的樣品墊、結(jié)合墊、層析墊、吸水墊；結(jié)合墊上設(shè)置有第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針；第一納米磁珠免疫探針包括羧基納米磁珠和抗NSE的單克隆抗體，第二納米磁珠免疫探針包括羧基納米磁珠和抗CEA的單克隆抗體；層析墊上依次設(shè)置有第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線，其中質(zhì)控線相比于第一檢測線更靠近吸水墊；第一檢測線上設(shè)置有鼠源NSE檢測抗體，第二檢測線上設(shè)置有鼠源CEA檢測抗體；質(zhì)控線上設(shè)置有羊抗鼠二抗。本發(fā)明能大大提高檢測NSE、CEA的靈敏度和準確性。
【專利說明】
一種聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條及其制備方法和應(yīng)用方法
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及一種試紙條及其制備方法和應(yīng)用方法，具體地涉及一種聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條及其制備方法和應(yīng)用方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近免疫層析技術(shù)是將免疫標記技術(shù)與層析技術(shù)結(jié)合起來的一種新型檢測技術(shù)，可以利用標記物的顯色特性，實現(xiàn)對待測物的定性、半定量、定量分析。它是以微孔濾膜為固相載體，以待測液為流動相，利用微孔濾膜的毛細作用及虹吸作用引導(dǎo)待測液體向前流動，同時待測液中的相關(guān)成分和固定在濾膜上的抗原或抗體發(fā)生反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物后，滯留在檢測線上，通過對標記物顏色的深淺或熒光的光密度分析，從而得到直觀的檢測結(jié)果。
[0003]目前，大多數(shù)商業(yè)化的定點即時檢測手段主要是以免疫層析試驗(ICA)居多，該試驗也被稱之為橫向測流檢測(LFT)。免疫層析試驗操作非常簡單，結(jié)合了免疫學(xué)實驗的原理與薄層色譜技術(shù)，加樣后即可在規(guī)定時間內(nèi)如10分鐘或20分鐘左右得到檢測結(jié)果。免疫層析試紙條主要包括5個部分:加樣區(qū)(樣品墊)、標記區(qū)(結(jié)合墊)、顯示區(qū)(硝酸纖維素膜)、吸水區(qū)(吸水墊)以及背襯板。樣品墊可以是纖維素、玻璃纖維、人造纖維等等濾過性介質(zhì)，主要目的是過濾樣本中的顆粒、調(diào)節(jié)樣本的PH以及結(jié)合樣本中干擾隨后層析反應(yīng)的成分;結(jié)合墊可以是玻璃纖維、聚酯纖維或者人造纖維，主要目的是裝載標記物如納米金標記單抗、二抗等并在層析檢測中穩(wěn)定地釋放這些標記物;硝酸纖維素膜的主要作用是固化抗原或者抗體等并提供層析檢測反應(yīng)的場所，在免疫層析實驗中主要用接觸式或非接觸式點樣儀在膜上線狀固化抗原或抗體等形成檢測線(T線)和質(zhì)控線(C線)；吸水墊一般為高密度的纖維素，是層析反應(yīng)的動力源，控制著層析反應(yīng)中待檢樣品持續(xù)流動的方向；背襯則為聚苯乙烯或者其他塑料材料，用于為免疫層析試紙條的層疊結(jié)構(gòu)提供剛性支持。當樣品墊加入待檢樣品如血清、尿液等，如果待檢樣品中有靶分子，則與結(jié)合墊中的標記物反應(yīng)形成復(fù)合物，在毛細作用下通過硝酸纖維素膜向吸收墊方向流動，并被硝酸纖維素膜上固化的相應(yīng)的抗原或抗體等配體分子捕獲(捕獲位置分別在檢測線和質(zhì)控線上)而被肉眼或者與標記物對應(yīng)的設(shè)備檢測到。
[0004]根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)形式的不同可以將免疫層析試紙條分為兩種類型:三明治夾心檢測和競爭檢測。前者利用檢測線上固化的捕獲抗體或者抗原對分析物進行捕獲固定，同時標記抗體或者抗原對分析物進行標記，由此形成夾心結(jié)構(gòu)復(fù)合物，主要用于檢測具有多個結(jié)合位點的較大分析物，人們熟知的早早孕自檢試紙條就是利用這種技術(shù)。而競爭檢測是待檢分析物與檢測線上固化的同等分析物競爭結(jié)合結(jié)合墊上的抗體或者其他配體標記物，結(jié)果的判定與三明治夾心檢測法正好相反，主要用于檢測只有單個結(jié)合位點的小分子分析物。免疫層析試紙條結(jié)果的判讀主要有以下兩種:一是直接肉眼觀察檢測線是否顯色來判斷待測物的有無;二是用相關(guān)儀器讀取試紙條檢測線上的信號強度，給出一個定量或半定量的待測物含量，其信號強度和待測物含量呈正相關(guān)關(guān)系。
[0005]免疫層析檢測法這種檢測模式由于其簡便、有效、廉價等優(yōu)點，在目前的定點即時檢測中的市場需求依然十分旺盛，基于此檢測模式的各種標記分析方式還在不斷被開發(fā)并應(yīng)用到如蛋白檢測、核酸檢測、病毒學(xué)、細菌學(xué)、抗生素等領(lǐng)域中。由于傳統(tǒng)的基于納米金的免疫層析試紙條靈敏度有限，許多研究人員開始把目光轉(zhuǎn)向新的標記方式如酶法、銀染增強法、化學(xué)發(fā)光法或是熒光法，希望能以此增加免疫層析檢測的靈敏度。
[0006]血清神經(jīng)元特異性稀醇化酶(neuron-specific enolase，NSE)為小細胞肺癌的一種腫瘤標志物。其在正常人血液中的含量在12.5ng/ml以下，在肺癌組織中的含量是正常肺組織中的3?35倍，是小細胞肺癌(SCLC)敏感特異的腫瘤標志物。和非小細胞肺癌相比，NSE在小細胞肺癌病人血清中有明顯的增加。癌胚抗原(carcino-embryonic antigen，CEA)是一種人類胚胎抗原決定簇的酸性糖蛋白，正常成人血清中CEA含量極低，小于5ng/mlXEA存在于多種腫瘤組織，是目前應(yīng)用最廣泛的腫瘤標記物之一，約有30%?70%的肺癌CEA水平明顯升高，目前的研究結(jié)果顯示CEA的水平與疾病預(yù)后及治療效果密切相關(guān)。對NSE、CEA兩種肺癌腫瘤標志物進行聯(lián)合檢測，可以進一步提高確診肺癌的可能性。對上述兩種腫瘤標志物的傳統(tǒng)檢測方法是ELISA，這種檢測方法每次只能檢測一種標志物，不能滿足多種標志物同時檢測的需要。
[0007]磁性免疫層析技術(shù)是以超順磁性顆粒代替?zhèn)鹘y(tǒng)的標記物來進行免疫層析，通過檢測結(jié)合在超順磁性納米顆粒上的目標物來提供對生物樣本的定量檢測數(shù)據(jù)，再利用被磁顆粒標記抗體所捕獲的免疫復(fù)合物與磁信號之間的線性關(guān)系即可實現(xiàn)對生物樣本的快速定量檢測目的，此方法借助于磁強度檢測儀來捕捉檢測線上的磁信號強度，磁信號的捕捉不受膜厚度的影響，所有的陽性信號都能被檢測，因而能大大提高檢測的靈敏度和準確性。磁性免疫層析檢測技術(shù)具有靈敏度高、穩(wěn)定性強、線性范圍寬、操作簡便、快速等優(yōu)點。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題:
[0009]1、傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫吸附試驗及成熟的免疫層析檢測，每次只能檢測一種標志物，不能滿足多種標志物同時檢測的需要。
[0010]2、現(xiàn)有檢測技術(shù)，由于只能靠目測來判斷檢測結(jié)果，主觀性很大;所以只能實現(xiàn)定性檢、半定量或不準確的定量檢測;免疫層析的檢測靈敏度也有待提高。
[0011]3、基于光電效應(yīng)的定量免疫檢測技術(shù)，由于只能檢測硝化纖維膜表面的免疫顆粒的光線，所以很難真實反映檢測線上免疫顆粒的總量，不利于定量檢測的準確性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]為了解決如上所述現(xiàn)有技術(shù)中的問題，本發(fā)明提供一種聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條，其特征在于，所用的免疫層析法的類型為雙抗夾心法;包括背襯板和依次相互重疊地鋪設(shè)在背襯板上的樣品墊、結(jié)合墊、層析墊和吸水墊;結(jié)合墊上設(shè)置有第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針；第一納米磁珠免疫探針包括羧基納米磁珠和抗NSE的單克隆抗體，第二納米磁珠免疫探針包括羧基納米磁珠和抗CEA的單克隆抗體;層析墊上依次設(shè)置有第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線，其中質(zhì)控線相比于第一檢測線更靠近吸水墊;第一檢測線上設(shè)置有鼠源NSE檢測抗體，第二檢測線上設(shè)置有鼠源CEA檢測抗體;質(zhì)控線上設(shè)置有羊抗鼠二抗。
[0013]進一步地，沿背襯板的長度方向各重疊部分的長度為0.5?2_。
[0014]進一步地，結(jié)合墊上設(shè)置的第一納米磁珠免疫探針與第二納米磁珠免疫探針的濃度比值為1:1.2。
[0015]進一步地，樣品墊和結(jié)合墊均采用玻璃纖維素膜，層析墊采用硝酸纖維素膜。進一步地，背襯板采用聚氯乙烯(PVC)材料。
[0016]進一步地，層析墊采用硝酸纖維素膜Millip0re95;第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線兩兩相鄰的線之間的間隔距離2 2mm;羧基納米磁珠的粒徑為〈lOOnm。
[0017]本發(fā)明還保護一種如上所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的制備方法，包括如下步驟:
[0018]步驟一，第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針的制備:在2嗎啉代乙磺酸(MES)緩沖液中，用EDC(N-C二甲/胺-3-丙基-N-乙基碳二亞胺)、NHS(N-羥基琥珀酰亞胺)活化羧基納米磁珠表面的羧基，分離磁珠，棄上清，洗滌未反應(yīng)的活化劑，然后分別加入抗NSE的單克隆抗體和抗CEA的單克隆抗體，分別制得第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針；
[0019]步驟二、結(jié)合墊和樣品墊的制備:將玻璃纖維素膜浸泡在含有蔗糖、海藻糖、聚乙二醇辛基苯基醚-1OO(TritonX-1OO)的硼酸鹽(BS)緩沖液中，潤濕后，干燥獲得空白結(jié)合墊，將步驟一得到的第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針混合后固定到空白結(jié)合墊得到結(jié)合墊；將玻璃纖維素膜浸泡在含NaCl、牛血清白蛋白(BSA)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)的硼酸鹽吐溫(BST)緩沖液中，潤濕后，干燥獲得樣品墊；
[0020]步驟三、第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線的制備:將NSE檢測抗體、CEA檢測抗體和羊抗鼠二抗依次包被到硝酸纖維素膜上分別制得第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線，而帶有第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜即為層析墊；
[0021]步驟四、試紙條的組裝:在背襯板上依次設(shè)置樣品墊、結(jié)合墊、層析墊和吸水墊，各相鄰墊之間相互重疊0.5?2mm，得到聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條，其中層析墊的設(shè)置方向為使得控制線相比于第一檢測線更靠近吸水墊。
[0022]優(yōu)選地，步驟一具體為:在pH5.5的0.0lM的MES緩沖液中，用EDC、NHS活化羧基納米磁珠表面的羧基30min;利用磁分離架分離磁珠，棄去上清后用pH9.0的0.005M的BS緩沖液洗滌未反應(yīng)的活化劑，分別加入抗NSE的單克隆抗體和抗CEA的單克隆抗體，分別在36 V搖床反應(yīng)3小時，再分別用含8% BSA的BS緩沖液封閉I小時，分別用磁分離架分離磁珠，分別棄上清后分別用BST清洗3遍，分別加入含0.05 %吐溫的BS保存液，分別制得第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針。
[0023]優(yōu)選地，步驟二具體為:將玻璃纖維素膜浸泡在含有5%蔗糖、2 %海藻糖、0.025 %TritonX-100、0.02M BS緩沖液中，潤濕后，28°C干燥獲得空白結(jié)合墊，將步驟一得到的第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針混合后按照lml/15cm的用量均勻噴涂在空白結(jié)合墊上，靜置、干燥得到結(jié)合墊;將玻璃纖維素膜浸泡在含2 % NaCl、0.5 % BSA、0.4 % PVP、0.02M BST緩沖液中，潤濕后，干燥獲得樣品墊，結(jié)合墊和樣品墊均封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0024]優(yōu)選地，步驟三具體為:用pH7.4的I3BS緩沖液分別將NSE檢測抗體、CEA檢測抗體稀釋到2mg/ml，羊抗鼠二抗稀釋到lmg/ml;然后用B1 Dot噴膜機在硝酸纖維素膜上分別包被稀釋后的NSE檢測抗體、稀釋后的CEA檢測抗體和稀釋后的羊抗鼠二抗，分別制得第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線，各線之間間隔距離2-3.5mm，而帶有第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜即為層析墊。
[0025]優(yōu)選地，步驟四具體為:在背襯板上依次設(shè)置樣品墊、結(jié)合墊、層析墊和吸水墊，各相鄰墊之間相互重疊I?1.5_，其中層析墊的設(shè)置方向為使得控制線相比于第一檢測線更靠近吸水墊;然后用自動切膜機將背襯板及其上設(shè)置的樣品墊、結(jié)合墊、層析墊和吸水墊進行切割成寬度2.5-4mm的長條，將長條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封保存，長條即為聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條。
[0026]本發(fā)明還保護一種如上所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的應(yīng)用方法，包括以下步驟:
[0027]步驟一，將待測樣本加到聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的樣品墊上，通過層析作用待測樣本會從樣品墊出發(fā)依次經(jīng)過聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的結(jié)合墊、聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的層析墊和聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的吸水墊；
[0028]步驟二，待待測樣本進入吸水墊后，用磁強度檢測儀分別檢測分析層析墊上的第一檢測線和層析墊上的第二檢測線的磁信號強度和層析墊上的控制線的磁信號強度，實現(xiàn)對NSE和/或CEA的定量檢測。
[0029]本發(fā)明的有益效果是:
[0030]1、本發(fā)明不僅保留了傳統(tǒng)免疫層析檢測試紙條操作簡便、結(jié)構(gòu)簡單、低成本的優(yōu)點，還首次采用免疫層析方法聯(lián)合檢測人機體血清/血漿中的肺癌標記物NSE和CEA，利用雙檢測線同時對NSE、CEA進行聯(lián)合定量檢測，有效提高肺癌的篩查及診斷。
[0031]2、本發(fā)明所涉及的檢測試紙條，是利用納米磁珠作為標記物，通過抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)富集在檢測線上，再利用磁強度檢測儀探測檢測線上的磁信號強度，得到定量檢測結(jié)果。與膠體金試紙條相比，此方法不受膜厚度的影響，所有的陽性信號都能被檢測，結(jié)果數(shù)字化定量，可信程度高，因而能大大提高檢測的靈敏度和準確性。
[0032]3.在試紙條的樣品墊和結(jié)合墊上添加適量的親水聚合物和封閉試劑，保證在試紙條層析過程中，固定在結(jié)合墊上的免疫磁珠納米探針能快速完全釋放，在硝酸纖維素膜上有較快的層析速度，而且不與硝酸纖維素膜發(fā)生非特異性吸附。
【附圖說明】
[0033]圖1是本發(fā)明所涉及的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。
[0034]圖2和3是本發(fā)明所涉及的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的檢測原理示意圖。
【具體實施方式】
[0035]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容做進一步的說明:下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0036]本發(fā)明提供一種聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條，如圖1所示，包括樣品墊1、結(jié)合墊2、層析墊7、吸水墊3和背襯板8，所用的免疫層析法的類型為雙抗夾心法，樣品墊1、結(jié)合墊2、層析墊7、吸水墊3依次相互重疊0.5?2mm粘貼在背襯板8上；結(jié)合墊2上設(shè)置有第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針。所述第一納米磁珠免疫探針包括羧基納米磁珠和抗NSE的單克隆抗體，所述第二納米磁珠免疫探針包括羧基納米磁珠和抗CEA的單克隆抗體。層析墊7上上依次設(shè)置有第一檢測線6、第二檢測線5和質(zhì)控線4。第一檢測線6上設(shè)置有鼠源NSE檢測抗體，第二檢測線5上設(shè)置有鼠源CEA檢測抗體;質(zhì)控線4上設(shè)置有羊抗鼠IgG，是一種羊抗鼠二抗。
[0037]如圖2和3所示，上述試紙條的檢測原理是:采用雙抗夾心法。當待測樣品加樣到樣品墊后，由于層析作用待測樣品隨層析液向吸水墊方向前進。若待測樣品中含有NSE則會在結(jié)合墊處被第一納米磁珠免疫探針(因為其包含抗NSE的單克隆抗體)捕獲，并一同向吸水墊方向前進。當前進到第一檢測線時，由于此處包被有鼠源NSE檢測抗體(該抗體是另一種抗體，不同于第一納米磁珠免疫探針中的抗NSE的單克隆抗體)，因此將捕獲結(jié)合有NSE的第一納米磁珠免疫探針。而未結(jié)合NSE的第一納米磁珠免疫探針則繼續(xù)向吸水墊方向前進，在質(zhì)控線處被包被了羊抗鼠IgG所捕獲。
[0038]若待測樣品中含有CEA則會在結(jié)合墊處被第二納米磁珠免疫探針(因為其包含抗CEA的單克隆抗體)捕獲，并一同向吸水墊方向前進。當前進到第二檢測線時，由于此處包被有鼠源CEA檢測抗體(該抗體是另一種抗體，不同于第二納米磁珠免疫探針中的抗CEA的單克隆抗體)，因此將捕獲結(jié)合有CEA的第二納米磁珠免疫探針。而未結(jié)合CEA的第二納米磁珠免疫探針則繼續(xù)向吸水墊方向前進，在質(zhì)控線處被包被了羊抗鼠IgG所捕獲。
[0039].如果樣品中存在兩種待測物(NSE和CEA)，兩條檢測線就都產(chǎn)生磁信號(Tl和T2)、質(zhì)控線出現(xiàn)磁信號條帶，判定為雙陽性結(jié)果;如果樣品中只存在一種待測物(NSE或CEA)，兩條檢測線中就只有與待測物對應(yīng)的那一條產(chǎn)生磁信號(Tl或T2)、質(zhì)控線出現(xiàn)磁信號條帶，判定為單個陽性結(jié)果和單個陰性結(jié)果;如果被檢樣品中沒有NSE、CEA，則兩條檢測線處均不出現(xiàn)磁信號條帶，只在質(zhì)控線處出現(xiàn)磁信號條帶，判定為陰性結(jié)果;如果質(zhì)控線不出現(xiàn)磁信號條帶，則試紙條判定為無效。
[0040]層析結(jié)束待結(jié)果穩(wěn)定后，借助于磁強度檢測儀(Magnetic Assay Reader，MagnaB1Sciences LLC)對檢測線和質(zhì)控線進行磁強度分析。隨著待測液中待測物濃度由零逐漸升高時，抗原、抗體在標記區(qū)反應(yīng)后，被捕獲在檢測線上的免疫復(fù)合物逐漸增多，信號數(shù)值增大。根據(jù)此現(xiàn)象，檢測顯示區(qū)質(zhì)控線、第一檢測線和第二檢測線的信號強度，并將檢測線和質(zhì)控線的信號強度比值(T/C)及其所對應(yīng)的抗原濃度作Log函數(shù)變換，以變換后的濃度值作X軸，以變換后的T/C作Y軸，繪制標準曲線圖，得出T/C與濃度對應(yīng)的二次函數(shù)公式。根據(jù)該公式可以準確的計算出待測液中待測物的濃度范圍及準確數(shù)值。實驗結(jié)果證實，該方法具有很高的檢測靈敏度，對NSE、CEA的實際最低檢測限值(LOD)分別為:0.7ng/ml，
0.5ng/ml。而根據(jù)標準曲線計算出來的理論檢測限值會更低。
[0041 ]本發(fā)明所述的待檢物可以是基于抗原抗體反應(yīng)的任何一種或兩種。
[0042]實施例1:基于磁性納米粒子的肺癌標志物NSE和CEA的聯(lián)合檢測試劑條的制備
[0043]步驟一:第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針的制備
[0044]分別取211^粒徑為8011111的羧基磁珠置于500111活化緩沖液中(1^3，？!1 = 5.5，
0.01M)，先后加入EDC、NHS各5mg，活化30分鐘后;利用磁分離架分離磁珠，棄去上清后用偶聯(lián)緩沖液(BS，0.005M，pH=9.0)洗滌未反應(yīng)的活化劑。之后分別加入適量NSE、CEA的標記抗體，分別在36 °C搖床反應(yīng)3小時，分別再用封閉液(含8%BSA的BS緩沖液)封閉I小時，分別用磁分離架分離磁珠，分別棄上清后用BST清洗3遍，分別用保存液(含0.05 %吐溫的BS液)保存后即得第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針。
[0045]步驟二:結(jié)合墊和樣品墊的制備
[0046]1.將玻璃纖維素膜浸泡在含有5 %蔗糖、2 %海藻糖、0.025 % TritonX-100,0.02MBS緩沖液中I小時潤濕后，28 °C干燥I小時即得空白結(jié)合墊。
[0047]2.將步驟一所得的兩種納米磁珠免疫探針按一定比例(其最佳固化比例是濃度比NSE免疫標記抗體:CEA免疫標記抗體=1: 1.2)混合后，按照lml/15cm的用量均勾噴涂在空白結(jié)合墊上，靜置20分鐘后，置于28°C恒溫干燥箱干燥I小時，得到結(jié)合墊。將結(jié)合墊封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0048]3.將玻璃纖維素膜浸泡在含有2%他(:1、0.5%83六、0.4%?￥?、0.021 BST緩沖液中I小時潤濕后，37°C干燥I小時，得到樣品墊。將樣品墊封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0049]步驟三:第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線的制備
[0050]1.硝酸纖維素膜選自商品化的Mi 11 ipore95。
[0051 ] 2.用pH7.4的PBS緩沖液分別將NSE檢測抗體、CEA檢測抗體稀釋到2mg/ml，羊抗鼠IgG 稀釋到lmg/ml。
[0052]3.用B1 Dot噴膜機在硝酸纖維素膜上分別包被NSE檢測抗體、CEA檢測抗體制備出第一檢測線、第二檢測線，包被羊抗鼠IgG制備出質(zhì)控線。各線之間間隔距離約3mm，線條寬度約0.8_。噴膜完成后放在37 °(:恒溫干燥箱干燥30分鐘。如此得到的帶有第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜即為層析墊。將層析墊封袋置于4°C保存?zhèn)溆?br>[0053]步驟四:試紙條的組裝
[0054]在背襯板上依次粘貼所得樣品墊、結(jié)合墊、層析墊、吸水墊，各相鄰墊之間相互重疊約1.5mm。試紙條組裝完成后，用自動切膜機將完成組裝的試紙條進行切割，寬度約3mm，將做好的試紙條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封保存。
[0055]以上詳細描述了本發(fā)明的較佳具體實施例。應(yīng)當理解，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員無需創(chuàng)造性勞動就可以根據(jù)本發(fā)明的構(gòu)思作出諸多修改和變化。因此，凡本技術(shù)領(lǐng)域中技術(shù)人員依本發(fā)明的構(gòu)思在現(xiàn)有技術(shù)的基礎(chǔ)上通過邏輯分析、推理或者有限的實驗可以得到的技術(shù)方案，皆應(yīng)在由權(quán)利要求書所確定的保護范圍內(nèi)。
【主權(quán)項】
1.一種聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條，其特征在于，所用的免疫層析法的類型為雙抗夾心法;包括背襯板和依次相互重疊地鋪設(shè)在所述背襯板上的樣品墊、結(jié)合墊、層析墊和吸水墊;所述結(jié)合墊上設(shè)置有第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針;所述第一納米磁珠免疫探針包括羧基納米磁珠和抗NSE的單克隆抗體，所述第二納米磁珠免疫探針包括羧基納米磁珠和抗CEA的單克隆抗體;所述層析墊上依次設(shè)置有第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線，其中所述質(zhì)控線相比于所述第一檢測線更靠近所述吸水墊;所述第一檢測線上設(shè)置有鼠源NSE檢測抗體，所述第二檢測線上設(shè)置有鼠源CEA檢測抗體;所述質(zhì)控線上設(shè)置有羊抗鼠二抗。2.如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條，其特征在于，所述結(jié)合墊上設(shè)置的所述第一納米磁珠免疫探針與所述第二納米磁珠免疫探針的濃度比值為1:1.2。3.如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條，其特征在于，所述樣品墊和所述結(jié)合墊均采用玻璃纖維素膜，所述層析墊采用硝酸纖維素膜。4.如權(quán)利要求3所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條，其特征在于，所述層析墊采用硝酸纖維素膜Millip0re95;所述第一檢測線、所述第二檢測線和所述質(zhì)控線兩兩相鄰的線之間的間隔距離I 2mm;所述羧基納米磁珠的粒徑為〈lOOnm。5.—種如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于，包括如下步驟: 步驟一，第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針的制備:在MES緩沖液中，用EDC、NHS活化羧基納米磁珠表面的羧基，分離磁珠，棄上清，洗滌未反應(yīng)的活化劑，然后分別加入抗NSE的單克隆抗體和抗CEA的單克隆抗體，分別制得第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針； 步驟二、結(jié)合墊和樣品墊的制備:將玻璃纖維素膜浸泡在含有蔗糖、海藻糖、TritonX-100的BS緩沖液中，潤濕后，干燥獲得空白結(jié)合墊，將步驟一得到的所述第一納米磁珠免疫探針和所述第二納米磁珠免疫探針混合后固定到所述空白結(jié)合墊得到結(jié)合墊;將玻璃纖維素膜浸泡在含NaCl、BSA、PVP的BST緩沖液中，潤濕后，干燥獲得樣品墊； 步驟三、第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線的制備:將NSE檢測抗體、CE A檢測抗體和羊抗鼠二抗依次包被到硝酸纖維素膜上分別制得第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線，而帶有所述第一檢測線、所述第二檢測線和所述質(zhì)控線的硝酸纖維素膜即為層析墊； 步驟四、試紙條的組裝:在背襯板上依次設(shè)置所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述層析墊和吸水墊，各相鄰墊之間相互重疊0.5?2mm，得到聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條，其中所述層析墊的設(shè)置方向為使得所述控制線相比于所述第一檢測線更靠近所述吸水墊。6.如權(quán)利要求5所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟一具體為:在PH5.5的0.0lM的MES緩沖液中，用EDC、NHS活化羧基納米磁珠表面的羧基30min;利用磁分離架分離磁珠，棄去上清后用pH9.0的0.005M的BS緩沖液洗滌未反應(yīng)的活化劑，分別加入抗NSE的單克隆抗體和抗CEA的單克隆抗體，分別在36 °C搖床反應(yīng)3小時，再分別用含8%BSA的BS緩沖液封閉I小時，分別用磁分離架分離磁珠，分別棄上清后分別用BST清洗3遍，分別加入含0.05 %吐溫的BS保存液，分別制得第一納米磁珠免疫探針和第二納米磁珠免疫探針。7.如權(quán)利要求5所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟二具體為:將玻璃纖維素膜浸泡在含有5 %蔗糖、2 %海藻糖、0.025 % TritonX-100、0.02M BS緩沖液中，潤濕后，28°C干燥獲得空白結(jié)合墊，將步驟一得到的所述第一納米磁珠免疫探針和所述第二納米磁珠免疫探針混合后按照lml/15cm的用量均勻噴涂在所述空白結(jié)合墊上，靜置、干燥得到結(jié)合墊;將玻璃纖維素膜浸泡在含2% NaCl、0.5% BSA、0.4%PVP、0.02M BST緩沖液中，潤濕后，干燥獲得樣品墊，所述結(jié)合墊和所述樣品墊均封袋置于4°C保存?zhèn)溆谩?.如權(quán)利要求5所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟三具體為:用PH7.4的PBS緩沖液分別將NSE檢測抗體、CEA檢測抗體稀釋到2mg/ml，羊抗鼠二抗稀釋到Img/ml;然后用B1 Dot噴膜機在硝酸纖維素膜上分別包被稀釋后的NSE檢測抗體、稀釋后的CEA檢測抗體和稀釋后的羊抗鼠二抗，分別制得第一檢測線、第二檢測線和質(zhì)控線，各線之間間隔距離2-3.5mm，而帶有所述第一檢測線、所述第二檢測線和所述質(zhì)控線的硝酸纖維素膜即為層析墊。9.如權(quán)利要求5所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的制備方法，其特征在于，所述步驟四具體為:在背襯板上依次設(shè)置所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述層析墊和吸水墊，各相鄰墊之間相互重疊I?1.5mm，其中所述層析墊的設(shè)置方向為使得所述控制線相比于所述第一檢測線更靠近所述吸水墊;然后用自動切膜機將所述背襯板及其上設(shè)置的所述樣品墊、所述結(jié)合墊、所述層析墊和所述吸水墊進行切割成寬度2.5-4mm的長條，將所述長條與干燥劑一起裝入鋁箔袋內(nèi)密封保存，所述長條即為聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條。10.—種如權(quán)利要求1所述的聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的應(yīng)用方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟一，將待測樣本加到所述聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的樣品墊上，通過層析作用所述待測樣本會從所述樣品墊出發(fā)依次經(jīng)過所述聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的結(jié)合墊、所述聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的層析墊和所述聯(lián)合檢測NSE、CEA的免疫層析檢測試紙條的吸水墊； 步驟二，待所述待測樣本進入所述吸水墊后，用磁強度檢測儀分別檢測分析所述層析墊上的第一檢測線和所述層析墊上的第二檢測線的磁信號強度和所述層析墊上的控制線的磁信號強度，實現(xiàn)對NSE和/或CEA的定量檢測。
【文檔編號】G01N33/574GK105866410SQ201610178622
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2016年3月25日
【發(fā)明人】王侃, 盧文婷, 崔大祥, 何井華
【申請人】上海交通大學(xué)